Name: Skuteczna metoda przesiewania w celu odizolowania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z nerki dorosłego szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Poznaj metodę izolacji nienaruszonych kłębuszków nerkowych z nerki szczura z czystością powyżej 95%. Technika ta umożliwia badanie biologii kłębuszkowej i mechanizmów przewlekłej choroby nerek z białkomoczem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant FTF 16990086 American Heart Association, NIH P30 DK079307, American Society of Nephrology Gottschalk Award, University of Pittsburgh Medical Center Competitive Medical Research Fund Award oraz University of Pittsburgh Physicians Academic Foundation Award. Dziękujemy Gerardowi Apodaca za jego sugestie techniczne dotyczące konserwacji kłębuszków nerkowych do analizy histologicznej, Marze Sullivan i Ming Sunowi za pomoc w mikroskopii elektronowej oraz Yingjian Li i Youhua Liu za ich wkład techniczny w ten protokół. Dziękujemy również Cynthii St. Hilaire za przeciwciało CD31.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu w Pittsburghu.
1. Izolacja kłębuszków szczurzych
<ol>
	<li>Aby przygotować sterylny 1% bufor izolacyjny, dodaj 5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do zlewki o pojemności 600 ml.
	<ol>
		<li>Dodać 500 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do zlewki i mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego, aż cała BSA się rozpuści.</li>
		<li>Sterylny filtr 1% buforu BSA/PBS w kapturze do hodowli komórkowych. 
		UWAGA: Sterylny 1% bufor BSA/PBS można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zdobądź od 2 do 4 szczurów Sprague-Dawley o wadze od 150 do 200 g każdy.
	<ol>
		<li>Eutanazja szczurów poprzez wdychanie dwutlenku węgla przy użyciu komory, do której wprowadza się 100% dwutlenku węgla w tempie 10-30% objętości komory na minutę. Obserwuj zwierzęta pod kątem ustania oddychania i wyblakłego koloru oczu przed usunięciem z dwutlenku węgla.</li>
		<li>Przygotuj skórę nad przednią częścią brzucha za pomocą 70% etanolu i w razie potrzeby użyj maszynki do strzyżenia włosów, aby usunąć włosy. Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry za pomocą nożyczek chirurgicznych lub skalpela. Wykonaj kolejne nacięcie w linii środkowej przez warstwę mięśni, aby odsłonić narządy wewnętrzne. Przedłuż nacięcie górnie przez przeponę i mostek lub klatkę piersiową jako drugorzędną metodę eutanazji.</li>
		<li>Wyizoluj i usuń obie nerki i umieść w sterylnej plastikowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 30 ml buforowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) na lodzie. 
		UWAGA: Kilka szczurów może zostać poddanych eutanazji w tej samej komorze, a wszystkie nerki mogą zostać umieszczone w tej samej stożkowej rurce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trzymaj nerki na lodzie i transportuj do sterylnego kaptura do hodowli komórkowych. Przenieść nerki na sterylną szalkę Petriego zawierającą 5 ml HBSS, również z lodem, a następnie usunąć i wyrzucić tłuszcz okołonerkowy za pomocą nożyczek i ostrych kleszczy. Jeśli nadal jest obecna, wyjmij i wyrzuć kapsułkę otaczającą nerkę, wykonując małe powierzchowne nacięcie, a następnie użyj ostrych kleszczy, aby delikatnie odciągnąć ją od narządu. 
	UWAGA: Zawsze trzymaj izolaty nerek na lodzie i ćwicz sterylną technikę przez cały czas. Kawałek sterylnej gazy można umieścić na szalce Petriego jako teksturowaną powierzchnię, aby utrzymać nerkę na miejscu podczas manipulacji.
	<ol>
		<li>Przeciąć nerki wzdłuż na pół (odcinek strzałkowy), a następnie usunąć i wyrzucić rdzeń (który ma ciemniejszy kolor) za pomocą skalpela na drugiej szalce Petriego z 5 ml HBSS.</li>
		<li>Pozostałe kawałki, które są głównie korą nerkową, przenieść na trzecią szalkę Petriego z 5 ml HBSS i zmielić sterylną żyletką, aż kawałki będą miały mniej niż 1 mm wielkości lub aż powstanie pasta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zwilżyć górną i dolną część sita o wielkości 180 μm 1% BSA/PBS w zlewce o pojemności 500 ml. Ten krok ma kluczowe znaczenie, ponieważ powleka sito białkiem i zmniejsza przyleganie kłębuszków nerkowych, co poprawi wydajność.</li>
	<li>Umieść rozdrobnioną korę na małej krawędzi sita i użyj teksturowanego kołnierza tłoka (strona przeciwna do gumowej uszczelki) strzykawki o pojemności 10 ml, aby rozdrobnić tkankę przez sito do dolnej patelni siedzącej na lodzie. Okresowo płukać HBSS, ale używać jak najmniej, aby uniknąć rozcieńczenia próbki. 
	UWAGA: Nie przekraczaj 30 ml całkowitego buforu, więc można tutaj użyć tylko 25 ml więcej. Powodem umieszczania tkanki mielonej tylko na jednej krawędzi sita jest zmniejszenie przylegania kłębuszków nerkowych poprzez ograniczenie ekspozycji na część sita, a nie na całą powierzchnię sita.
	<ol>
		<li>Aby to ułatwić, ponownie wykorzystaj płyn zbierający się w dolnej misce do wypłukania sitka. Po zakończeniu przesiewania ostrożnie umyj dno sita ponownie 1% buforem BSA/PBS z dna naczynia, aby wychwycić wszelkie kłębuszki, które mogą być luźno przylegające.</li>
		<li>Zebrać cały płyn z dolnej miski do kilku strzykawek o pojemności 10 ml wyposażonych w igły 20 G i przepuścić go przez igłę co najmniej 2 dodatkowe razy. Podczas ostatniego zbierania należy przechowywać płyn zawierający kłębuszki nerkowe w strzykawce do momentu, gdy będzie on gotowy do przepuszczenia go przez sito o średnicy 90 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podczas przechowywania płynu w strzykawkach umyć dolną miskę, przepłukując ją 1% BSA/PBS do zlewki na odpady, a następnie zwilżyć górną i dolną część sita 90 μm 1% BSA/PBS. Umieść sitko na dolnej patelni na lodzie.
	<ol>
		<li>Nałożyć próbkę w strzykawkach na jedną krawędź sita i przetrzeć przez sito za pomocą innego kołnierza strzykawki, jak opisano powyżej. Umyj roztworem z dolnej miski, aby zebrać wszystko na jednej krawędzi sita.</li>
		<li>Po zakończeniu przesiewania ostrożnie umyj spód sita, jak w kroku 1.5.1. Zbierz cały płyn z dolnej miski do plastikowej stożkowej rurki o pojemności 50 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyć dolną miskę z 1% BSA/PBS do zlewki na odpady, a następnie zwilżyć górną i dolną część sita 75 μm 1% BSA/PBS. Umieść sitko na dolnej patelni na lodzie.
	<ol>
		<li>Nałożyć próbkę na jedną krawędź sita. Ciecz powinna łatwo przepływać. Przepłukać przez wierzch co najmniej 20 ml 1% BSA/PBS do zlewki na odpady. Ostrożnie umyj również spód sitka. Kłębuszki nerkowe pozostaną na wierzchu tego sita o wielkości 75 μm.</li>
		<li>Użyj HBSS, aby zebrać kłębuszki nerkowe na szalce Petriego, spłukując je przez sito do góry nogami. Użyj tutaj tyle HBSS, ile potrzeba. Zebrać do jednej lub więcej plastikowych stożkowych probówek o pojemności 50 ml na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirować przy 1800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad w 10 ml zimnego HBSS. Połączyć próbki, jeżeli pobrano wiele stożkowych probówek w ppkt 1.7.2. Powtórz etap wirowania.</li>
	<li>Ponownie zawiesić kłębuszki nerkowe w 5 ml HBSS, aż będą gotowe do przejścia do następnego kroku.</li>
	<li>W razie potrzeby policz całkowitą liczbę kłębuszków nerkowych. W tym celu należy pobrać pipetą próbkę o objętości 10 μl i umieścić kroplę na szkiełku podstawowym. Obejrzyj pod mikroskopem, policz kłębuszki nerkowe na polu i pomnóż przez 500, aby uzyskać całkowity plon. 
	UWAGA: Czystość można oznaczyć, licząc liczbę kanalików widocznych w terenie i dzieląc przez całkowitą liczbę kłębuszków nerkowych i struktur kanalików. W polu widzenia powinno znajdować się > 95% kłębuszków nerkowych.
	<ol>
		<li>W przypadku znacznego zanieczyszczenia przewodów należy powtórzyć kroki od 1.6.1 i należy upewnić się, że zostały dokładnie umyte po wykonaniu kroku 1.7.1. Jest to krok, w którym najbardziej prawdopodobne jest wystąpienie zanieczyszczenia przewodów rurowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Uszkodzenie kłębuszków nerkowych
<ol>
	<li>Zebrać kłębuszki nerkowe do plastikowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować w tempie 200 x g. Ponownie zawiesić w odpowiedniej ilości HBSS w oparciu o całkowitą wydajność, tak aby na studzienkę przypadało około 9 000 kłębuszków nerkowych. Pobrać pipetę 450 μl próbki do każdego dołka na płytce 24-dołkowej lub w dowolnym formacie płytki, który pasuje do wymaganych dalszych testów. 
	UWAGA: Pipetowanie w górę i w dół w celu wymieszania kłębuszków w buforze zapewnia jednorodny roztwór. Kłębuszki nerkowe są bardzo lepkie i ciężkie i sklejają się ze sobą, a także szybko osadzają się na dnie roztworu i po bokach probówki.</li>
	<li>Aby przygotować roztwór siarczanu protaminy (PS) o stężeniu 6 mg/ml, należy najpierw rozpuścić 1 g PS w 10 ml dH2O podgrzanego do 40 °C w plastikowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml i dokładnie przemieszać. Pobrać 30 μl roztworu i dodać do 470 μl dH2O. 
	UWAGA: W ten sposób otrzyma się roztwór o stężeniu 6 mg/ml, a po dodaniu 50 μl do studzienki, jak opisano poniżej, końcowe stężenie wynosi 0,6 mg/ml.
	<ol>
		<li>Po kolei dodać 50 μl siarczanu protaminy (jest to rozcieńczenie 1:10) do każdej studzienki jednej grupy, jednocześnie dostarczając innej grupie 50 μl HBSS (kontrola ujemna).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odwirować zawartość każdej studzienki w probówce do mikrowirówki (4000 x g, 4 °C, 10 - 15 s) i przemyć dwukrotnie po 1 ml PBS każdy.</li>
	<li>Odessać końcowe płukanie i ponownie zawiesić w 300 μl PBS. Podziel na trzy podwielokrotności, które należy przygotować do izolacji białka, wizualizacji transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) i barwienia immunofluorescencyjnego (IF).</li>
</ol>
3. Przygotowanie kłębuszków nerkowych do analizy
<ol>
	<li>Odwirować zawartość trzech podwielokrotności (4000 x g, 4 °C, 10-15 s) i odessać pozostały bufor i przystąpić do analizy próbki przez TEM, If lub izolację białka.</li>
	<li>Przetwarzanie dla TEM
	<ol>
		<li>Utrwalić granulki kłębuszkowe w 150 μl zimnego 2,5% aldehydu glutarowego w 0,01 M PBS. Ostrożnie usunąć utrwalacz z osadu za pomocą pipety Pasteura, uważając, aby nie naruszyć osadu, a następnie przepłukać go PBS i następnie utrwalić w 1% tetratlenku osmu z 1% żelazocyjankiem potasu.</li>
		<li>Odwodnić próbkę za pomocą stopniowanej serii etanolu (30, 50, 70, 90, 100, 100, 100%) i tlenku propylenu, a następnie zatopić w materiale do zatapiania epoksydu.</li>
		<li>Wytnij półcienkie (300 nm) odcinki na ultramikrotomie. Zabarwić 0,5% błękitem toluidynowym w 1% boranie sodu i zbadać je pod mikroskopem świetlnym.</li>
		<li>Wyciąć ultracienkie skrawki (65 nm), wybarwić je octanem uranylu i cytrynianem ołowiu Reynoldsa i zbadać pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie dla IF
	<ol>
		<li>Dodać 150 μl 12% żelatyny w roztworze PBS i natychmiast umieścić na suchym lodzie, aby uformować granulkę. Namoczyć granulat w 500 μl 2% paraformaldehydu/1x PBS w probówce mikrowirówkowej przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umieść granulat w formie bazowej i osadź go, dodając pożywkę o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na suchym lodzie. Wyciąć skrawki 5-10 μm na kriotomii i przystąpić do immunofluorescencji/immunohistochemii lub standardowych barwień histologicznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do izolacji białek
	<ol>
		<li>Dodać 150 μl buforu RIPA do odwirowanego osadu kłębuszkowego z 1,5 μl inhibitora proteazy i przemieszać z homogenizatorami tkankowymi.</li>
		<li>Przejdź do kwantyfikacji białek i immunoblottingu lub innej analizy białek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+understanding+of+the+slit+diaphragm%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Molecular understanding of the slit diaphragm.</a> Pediatric Nephrology. 28 (10), 1957-1962 (2013).</li>
<li>Tan, R. J., Zhou, L., Zhou, D., Lin, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+receptor+a+blockade+is+an+ineffective+treatment+for+adriamycin+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Endothelin receptor a blockade is an ineffective treatment for adriamycin nephropathy.</a> PLoS One. 8 (11), 79963(2013).</li>
<li>Wagner, N., Wagner, K. D., Xing, Y., Scholz, H., Schedl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+podocyte+protein+nephrin+is+transcriptionally+activated+by+the+Wilms%27+tumor+suppressor+WT1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The major podocyte protein nephrin is transcriptionally activated by the Wilms' tumor suppressor WT1.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 15 (12), 3044-3051 (2004).</li>
<li>Rogacka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+increases+filtration+barrier+permeability+via+TRPC6-dependent+activation+of+PKGIalpha+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Insulin increases filtration barrier permeability via TRPC6-dependent activation of PKGIalpha signaling pathways.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1312-1325 (2017).</li>
<li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li>
<li>Moller, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+TRPC6+channel+in+acquired+forms+of+proteinuric+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Induction of TRPC6 channel in acquired forms of proteinuric kidney disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 18 (1), 29-36 (2007).</li>
<li>Tian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+regulation+of+actin+dynamics+and+cell+motility+by+TRPC5+and+TRPC6+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Antagonistic regulation of actin dynamics and cell motility by TRPC5 and TRPC6 channels.</a> Science Signaling. 3 (145), 77(2010).</li>
<li>Shankland, S. J., Pippin, J. W., Reiser, J., Mundel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes+in+culture%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Internationalernational%22%5BJournal%5D)">Podocytes in culture: past, present, and future.</a> Kidney Internationalernational. 72 (1), 26-36 (2007).</li>
<li>Cook, W. F., Pickering, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+separating+glomeruli+from+rabbit+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A rapid method for separating glomeruli from rabbit kidney.</a> Nature. 182 (4642), 1103-1104 (1958).</li>
<li>Misra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+glomeruli+from+mammalian+kidneys+by+graded+sieving%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Isolation of glomeruli from mammalian kidneys by graded sieving.</a> American Journal of Clinical Pathology. 58 (2), 135-139 (1972).</li>
<li>Burlington, H., Cronkite, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+cell+cultures+derived+from+renal+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Characteristics of cell cultures derived from renal glomeruli.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 142 (1), 143-149 (1973).</li>
<li>Harper, P. A., Robinson, J. M., Hoover, R. L., Wright, T. C., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+culturing+rat+glomerular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Improved methods for culturing rat glomerular cells.</a> Kidney International. 26 (6), 875-880 (1984).</li>
<li>Kreisberg, J. I., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+rat+glomerular+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of rat glomerular epithelial cells in vitro.</a> Kidney International. 14 (1), 21-30 (1978).</li>
<li>Weinstein, T., Cameron, R., Katz, A., Silverman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+glomerular+epithelial+cells+in+culture+express+characteristics+of+parietal%2C+not+visceral%2C+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Rat glomerular epithelial cells in culture express characteristics of parietal, not visceral, epithelium.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 3 (6), 1279-1287 (1992).</li>
<li>Yaoita, E., Kurihara, H., Sakai, T., Ohshiro, K., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+modulation+of+parietal+epithelial+cells+of+Bowman%27s+capsule+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic modulation of parietal epithelial cells of Bowman's capsule in culture.</a> Cell and Tissue Research. 304 (3), 339-349 (2001).</li>
<li>Meezan, E., Brendel, K., Ulreich, J., Carlson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+a+pure+metabolically+active+glomerular+preparation+from+rat+kidneys.+I.+Isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Properties of a pure metabolically active glomerular preparation from rat kidneys. I. Isolation.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187 (2), 332-341 (1973).</li>
<li>Piwkowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+increases+glomerular+filtration+barrier+permeability+through+PKGIalpha-dependent+mobilization+of+BKCa+channels+in+cultured+rat+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Insulin increases glomerular filtration barrier permeability through PKGIalpha-dependent mobilization of BKCa channels in cultured rat podocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1852 (8), 1599-1609 (2015).</li>
<li>Kotyk, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+glomerulus+diameter+and+Bowman%27s+space+width+of+renal+albino+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Computer+Methods+and+Programs+in+Biomedicine%22%5BJournal%5D)">Measurement of glomerulus diameter and Bowman's space width of renal albino rats.</a> Computer Methods and Programs in Biomedicine. 126, 143-153 (2016).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+glomeruli+from+mice%3A+A+practical+approach+for+beginners%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Ther+Med%22%5BJournal%5D)">Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners.</a> Exp Ther Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).</li>
<li>Leeuwis, J. W., Nguyen, T. Q., Dendooven, A., Kok, R. J., Goldschmeding, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20828590">Targeting podocyte-associated diseases.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (14), 1325-1336 (2010).</li>
<li>Subramanian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+with+mutant+Inf2+show+impaired+podocyte+and+slit+diaphragm+integrity+in+response+to+protamine-induced+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Mice with mutant Inf2 show impaired podocyte and slit diaphragm integrity in response to protamine-induced kidney injury.</a> Kidney International. 90 (2), 363-372 (2016).</li>
<li>Takemoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+large+scale+isolation+of+kidney+glomeruli+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice.</a> American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).</li>
<li>Steinmetz, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pitfall+of+glomerular+sieving%3A+profibrotic+and+matrix+proteins+derive+from+the+Bowman%27s+capsule+and+not+the+glomerular+tuft+in+rats+with+renovascular+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology+Dialysis+Transplantation%22%5BJournal%5D)">A pitfall of glomerular sieving: profibrotic and matrix proteins derive from the Bowman's capsule and not the glomerular tuft in rats with renovascular hypertension.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 22 (10), 3055-3060 (2007).</li>
<li>Ishikawa, Y., Kitamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+apoptosis+of+podocytes+in+explanted+glomeruli.+Technical+note%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Spontaneous apoptosis of podocytes in explanted glomeruli. Technical note.</a> Kidney International. 54 (6), 2008-2013 (1998).</li>
<li>Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17502717">Culture methods of glomerular podocytes.</a> Kidney and Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).</li>
<li>Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+differentiation+in+cultured+rat+and+human+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).</li>
<li>McCarthy, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+increases+albumin+permeability+of+isolated+rat+glomeruli+through+the+generation+of+superoxide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha increases albumin permeability of isolated rat glomeruli through the generation of superoxide.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 9 (3), 433-438 (1998).</li>
<li>Desideri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+provides+sensitive+measurement+of+physiologically+relevant+changes+in+albumin+permeability+in+isolated+human+and+rodent+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">A novel assay provides sensitive measurement of physiologically relevant changes in albumin permeability in isolated human and rodent glomeruli.</a> Kidney International. 93 (5), 1086-1097 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jest to skuteczna metoda odzyskiwania kłębuszków nerkowych z nerki szczura przy użyciu niedrogiego sprzętu wielokrotnego użytku z prostym protokołem. Podobnie jak w przypadku wszystkich procedur, istnieją ograniczenia co do ich użyteczności. Po pierwsze, chociaż uzyskujemy czystość > 95%, ze względu na przesiewający charakter protokołu i materiału wyjściowego nie można wykluczyć wszystkich zanieczyszczeń, a w kulturze będzie obecnych kilka czerwonych krwinek i sporadycznie segment rurkowy. Nie przewidujemy, aby te małe zanieczyszczenia stanowiły problem w zdecydowanej większości zastosowań. Po drugie, protokół przesiewania opiera się na wykorzystaniu nerek szczurów, w których kłębuszki nerkowe są znacznie większe niż u myszy. Jeśli potrzebne są kłębuszki mysie, opublikowano technikę wykorzystującą komercyjne kulki magnetyczne (np. Dynabeads)22 . Po trzecie, wykazano, że specyficzne mRNA (inhibitor aktywatora plazminogenu-1 i kolagen I) w izolowanych kłębuszkach nerkowych pochodzą prawie całkowicie z torebki Bowmana, a nie z komórek wewnątrzkłębuszkowych23. Może to prowadzić do niewłaściwych wniosków, jeśli zostanie podjęta próba izolacji mRNA z tych kłębuszków nerkowych. Należy zauważyć, że w naszych rękach większość kłębuszków nerkowych jest zdekapsulowana i dlatego nie powinno mieć znaczącego wkładu kapsułek Bowmana. Po czwarte, śmierć komórki zaczyna zachodzić stosunkowo szybko w warunkach hodowli.
Stwierdziliśmy, że program apoptozy, o czym świadczy pojawienie się rozszczepionej kaspazy-3, był aktywowany począwszy od 2 godzin hodowli. Jest to ogólnie zgodne z wcześniejszymi doniesieniami pokazującymi, że apoptoza, oceniana za pomocą fragmentacji DNA, TUNEL i analizy histologicznej, zaczyna wystąpić w ciągu 1-2 godzin po izolacji24. Należy jednak również zauważyć, że wczesne obserwacje wykazały, że aktywność metaboliczną można wykryć na podstawie izolowanych przesianych kłębuszków nerkowych, gdy są hodowane przez co najmniej 3 godziny, co sugeruje znaczną żywotność komórkową w tym punkcie czasowym16. Niemniej jednak, w oparciu o wyniki, uważamy, że rozsądne byłoby natychmiastowe wykorzystanie izolowanych kłębuszków nerkowych w zamierzonych eksperymentach w celu uzyskania najlepszych wyników. Zalecamy, aby wszystkie eksperymenty były wykonywane przed upływem 72 godzin, ponieważ zaobserwowaliśmy, że cała struktura kłębuszków nerkowych zaczyna się pogarszać po upływie tego czasu.
O wiele łatwiej jest uzyskać wyższe plony, gdy zaczynasz od 4-8 nerek, a nie tylko 2, ponieważ pewna liczba kłębuszków nerkowych jest tracona z powodu przylegania do różnych sit, ale gdy sita są maksymalnie pokryte, nie ma dodatkowych strat. Z tego samego powodu ważne jest, aby przed użyciem namoczyć sita w buforze BSA/PBS, ponieważ kłębuszki nerkowe z większym prawdopodobieństwem przylegają do suchego sita i ograniczyć narażenie tkanek na jedną krawędź sita. Sugerujemy zacząć od nie mniej niż 6 nerek (3 szczury), aby uzyskać rozsądną wydajność.
Niektórzy badacze wyizolowali pierwotne kultury podocytów z izolowanych kłębuszków nerkowych, które mają tendencję do wyrastania z kłębuszków nerkowych podczas hodowli17. Zauważyliśmy, że niektóre izolowane kłębuszki nerkowe będą przylegać do plastiku naczynia hodowlanego, a komórki zaczną migrować ze struktury kłębuszkowej w późnych punktach czasowych (72 godziny po izolacji). Badanie tych komórek wykracza poza zakres tego protokołu izolacji i istnieją pewne kontrowersje co do tego, czy komórki te są podocytami, komórkami nabłonka ciemieniowego, czy też obiema tymi komórkami. Warto zauważyć, że Mundel i in. stwierdzili, że komórki brukowe zebrane z przesianych kłębuszków nerkowych mogą być indukowane do różnicowania się w dojrzałe podocyty w określonych warunkach hodowli26. Niektóre niejasności dotyczące tożsamości komórek mogą zależeć od tego, czy izolowane kłębuszki nerkowe są zamknięte w kapsułkach (w tym torebka Bowmana, która jest wypełniona komórkami nabłonka ciemieniowego), czy też zdekapsulowane w procedurze przesiewania. W naszych rękach zastosowanie sit o rozmiarach sekwencyjnych 180, 90 i 75 μm doprowadziło do dekapsulacji większości kłębuszków nerkowych.
Większość postaci białkomoczowej przewlekłej choroby nerek jest spowodowana wzrostem przepuszczalności kłębuszków nerkowych. Kilku autorów wykorzystało izolowane kłębuszki nerkowe w eksperymentach przepuszczalności ex vivo . W jednej z metod do oszacowania przepuszczalności wykorzystano zmianę objętości kłębuszków nerkowych po zmianie zawartości osmotycznej otaczających ośrodków27. Niedawno ustalono, że wyciek sondy fluorescencyjnej z izolowanych kłębuszków nerkowych może być określony ilościowo w celu pomiaru przepuszczalności i może być przeprowadzony u gryzoni narażonych na chorobę kłębuszków nerkowych w modelach eksperymentalnych28.
Zauważyliśmy, że w procesie przygotowania TEM czasami widzimy, jak procesy stopy podocytów odrywają się od błony podstawnej. Nie uważamy, że dzieje się to w kulturze i jest bardziej prawdopodobne, że jest to artefakt podczas przygotowywania próbki TEM. Warto zauważyć, że nawet gdy tak się dzieje, jasne jest, czy procesy stopy wyglądają "normalnie", czy są zatarte.
Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten zapewnia metodę, za pomocą której można ocenić zmiany morfologiczne i komórkowe w odpowiedzi na uraz. Przewidujemy, że może być stosowany jako technika towarzysząca izolowanym kulturom podocytów, zwłaszcza gdy rozważane są interakcje z macierzą zewnątrzkomórkową lub innymi natywnymi typami komórek. Jest to nadzieja na pogłębienie wiedzy na temat białkomoczowej PChN, co poprawi zdolność do opracowywania przyszłych metod leczenia tej wyniszczającej choroby.

Kłębuszek nerkowy to wysoce wyspecjalizowana kępka naczyń włosowatych odpowiedzialnych za filtrację krążącego osocza. Stanowi początek nefronu, który jest podstawową jednostką funkcjonalną nerki. Funkcja kłębuszków nerkowych jest definiowana przez wyjątkowo fenestrowany śródbłonek naczyń włosowatych, szczelinową membranę podocytów i pośrednią błonę podstawną. Warstwy te tworzą półprzepuszczalną barierę, która umożliwia selektywne wydalanie substancji do filtratu. Woda, jony i inne małe cząsteczki na ogół przechodzą, podczas gdy większe cząsteczki są zatrzymywane w plazmie. Podocyty to wyspecjalizowane komórki nabłonkowe, które rozprzestrzeniają się po błonie podstawnej, otaczając naczynia włosowate wypustkami cytoplazmatycznymi znanymi jako wyrostki stopy. Wyrostki stopy sąsiednich podocytów krzyżują się ze sobą i są przecinane przez membrany szczelinowe składające się z białek takich jak nefryna, podocyna, P-kadheryna i ZO-11. W przekroju poprzecznym te wyrostki stopy są równomiernie ułożone na membranie podstawnej. W chorych kłębuszkach nerkowych wyrostki stopy stają się rażąco nieprawidłowe lub "zatarte", co prowadzi do nieprawidłowego wycieku treści osocza do filtratu. W związku z tym uszkodzenie kłębuszków nerkowych charakteryzuje się na ogół obecnością nienormalnie dużych ilości białka (np. białkomoczu) i/lub czerwonych krwinek (np. krwiomoczu) w moczu. Ponadto uszkodzone podocyty tracą ekspresję nefryny, a także jej regulatora Wilms Tumor 1 (WT1), kluczowego białka odpowiedzialnego za utrzymanie różnicowania2,3. Kłębuszki nerkowe są głównym celem uszkodzeń w nefropatii cukrzycowej i innych kłębuszkowych nerkowcach, takich jak choroba minimalnych zmian, nefropatia błoniasta i ogniskowe segmentowe stwardnienie kłębuszków nerkowych. Choroby te są głównymi przyczynami postępującej niewydolności nerek i rozwoju schyłkowej niewydolności nerek, stanu, w którym przeżycie zależy od dializ lub przeszczepu nerki. Dlatego ważne jest, aby badać kłębuszki nerkowe, aby lepiej zrozumieć patologię przewlekłej choroby nerek (PChN).
System hodowli komórkowych jest kluczowy dla badania biologii kłębuszków nerkowych. Ze względu na jego centralną rolę w generowaniu membrany szczelinowej, a także istnienie specyficznych chorób białkomoczowych spowodowanych mutacjami białka przepony szczelinowej, wiele badań, co zrozumiałe, wykorzystywało podocyty w izolacji. Doprowadziło to do wytworzenia pierwotnych linii komórkowych podocytów do wykorzystania in vitro. Komórki te mogą być hodowane w różnych warunkach, a nawet mogą być hodowane na przepuszczalnych podporach w celu oceny przepuszczalności4. Jednak izolacja proliferujących komórek często wybiera odróżnicowane komórki, które utraciły część markerów podocytów. Doprowadziło to do wygenerowania warunkowo unieśmiertelnionych podocytów pochodzących z transgenicznego szczepu myszy przenoszącego wrażliwego na temperaturę mutanta dużego genu T SV40 (np. immortomouse), który może być hodowany w kulturze, ale także różnicowany w celu ekspresji pełnego zestawu markerów podocytów5. Te metody hodowli pierwotnej odegrały kluczową rolę w zrozumieniu biologii podocytów4,6,7.
Niemniej jednak, kultury zawierające pojedyncze typy komórek nie mają relacji międzykomórkowych, które występują in vivo, jak również struktury podporowej i matryc, a monowarstwy tych komórek niekoniecznie odzwierciedlają trójwymiarową architekturę kłębuszków nerkowych. Unieśmiertelnione podocyty mogą być również kłopotliwe i trudne do wyhodowania8 i wymagają posiadania albo immortomy, albo początkowej porcji komórek od uznanych badaczy, aby rozpocząć. Ponadto kłębuszek nerkowy składa się nie tylko z podocytów, ale także z komórek śródbłonka naczyń włosowatych i błony podstawnej, a także komórek mezangialnych, które zapewniają podparcie dla struktury. Dlatego przydatne jest opracowanie podejścia ex vivo dostępnego dla wszystkich badaczy do badania nienaruszonych kłębuszków nerkowych, które zachowują swoją natywną architekturę, jak również wszystkie komórki tworzące normalne kłębuszki nerkowe.
W 1958 roku Cook i Pickering opisali pierwszą izolację kłębuszków nerkowych z nerki królika. Po obserwacjach, że zatory tłuszczowe zagnieżdżają się w kłębuszkach nerkowych, postulowali, że cząstki tej samej wielkości mogą być użyte do specyficznej izolacji tych struktur. Rzeczywiście, wlew cząstek tlenku żelaza do nerki doprowadził do uwięzienia tych cząstek w kłębuszkach nerkowych. Po mechanicznej dysocjacji i przesianiu nerki, kłębuszki nerkowe mogą zostać wyizolowane w stanie nienaruszonym i czystym dzięki zastosowaniu separacji magnetycznej9. W 1971 roku Misra wykazał, że napary z tlenku żelaza można pominąć, a izolację kłębuszków nerkowych osiągnąć poprzez przesiewanie zmielonej tkanki nerkowej człowieka, psa, królika lub szczura10. Od tego czasu technika ta była modyfikowana w zależności od celu badaczy, ale zasadniczo zaowocowała oczyszczonymi preparatami, które można było dalej badać lub na podstawie których można było ustalić pierwotne hodowle komórek11,12,13,14,15,16,17.
Tutaj opisujemy protokół izolacji nienaruszonych żywotnych kłębuszków nerkowych z nerki szczura. Cały protokół trwa zaledwie kilka godzin. Chociaż nie rozmnażają się, plany eksperymentalne dowolnej wielkości mogą być wspierane po prostu przez zwiększenie liczby nerek jako materiału wyjściowego. Chociaż istnieją opublikowane protokoły separacji kulek magnetycznych kłębuszków nerkowych, wymagają one dożylnego wstrzyknięcia kulek, są droższe i mogą zmienić biologię, ponieważ kulki są albo zatrzymywane przez kłębuszki nerkowe w hodowli, albo wymagają "lizy" kłębuszków nerkowych i usuwania przez wirowanie19. W porównaniu z kłębuszkami myszymi, większy rozmiar kłębuszków nerkowych szczurów (prawie 100 μm u dwumiesięcznych szczurów18) znacznie ułatwia oddzielenie ich od innych struktur nerkowych za pomocą prostej techniki przesiewania.
Jako dowód ich użyteczności, scharakteryzowaliśmy kłębuszki nerkowe, aby zademonstrować różne typy komórek. Mogą być również narażone na działanie czynników, o których wiadomo, że uszkadzają kłębuszki nerkowe in vivo, a my wykazujemy niekorzystny wpływ siarczanu protaminy (PS) na te kultury. PS to polikacja, która neutralizuje miejsca anionowe wzdłuż ściany naczyń włosowatych kłębuszków nerkowych20. Ta neutralizacja ma dramatyczny wpływ na barierę filtracyjną kłębuszków nerkowych, a tym samym zwiększa białkomocz i zanikanie procesu stopy. Kłębuszki te można ocenić za pomocą immunoblotów dla kluczowych białek, takich jak nefryna i WT1, w celu oceny ogólnego stanu zdrowia. Ponadto ich strukturę można ocenić za pomocą mikroskopii świetlnej, immunofluorescencyjnej i elektronowej.
Ogólnie rzecz biorąc, ten protokół jest dostępny dla większości badaczy (wystarczy dostęp do zwierząt i prostego sprzętu). Z nieuszkodzonymi cechami morfologicznymi badacz jest w stanie przeanalizować kłębuszki nerkowe i zobaczyć, jak inne ważne typy komórek i zachowanie macierzy w kłębuszkach nerkowych wpływają na funkcję i postęp choroby, co jest wadą kultur podocytów.

<table><tbody><tr><td>Roztwory, chemikalia i zwierzęta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczury Sprague-Dawley</td><td>Envigo</td><td>207M</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Fisher</td><td>BP1605100</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka z Ca2+ i Mg2+</td><td>Thermo</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>VWR</td><td>97063-660</td><td></td></tr><tr><td>Protamina siarczan</td><td>MP Bio</td><td>ICN15197105</td><td></td></tr><tr><td>Utrwalacz Karnovsky'ego Żelatyna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>EMD</td><td>EM-PX0055-3</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Scigen</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Halt Inhibitory proteazy</td><td>Thermo</td><td>PI78442</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało nefryny</td><td>Fitzgerald</td><td>2OR-NP002</td><td></td></tr><tr><td>WT-1 Przeciwciało</td><td>Abcam</td><td>ab89901-10ul</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR-&beta; </td><td>Sygnalizacja komórkowa</td> przeciwciała<td>#3169S</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CD31</td><td>LSBio</td><td>LS-C348736</td><td></td></tr><tr><td>Rozszczepione przeciwciało kaspazy-3</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9661S</td><td></td></tr><tr><td>Poly/Bed 812 (Luft) epoksydowa</td><td>Polysciences</td><td>08792-1</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora</td><td></td><td></td><td></td>dwutlenku węgla</tr><tr><td>Rurki stożkowe, 15 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe, 50 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td><td></td>chirurgiczne</tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td>chirurgiczne</tr><tr><td>Sterylna gaza szalki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petriego, 100 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalpele</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylny aparat</td><td></td><td></td><td></td>filtracyjny</tr><tr><td>Sito Pan</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA39999ON</td><td></td></tr><tr><td>180um Sito</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA39996ON</td><td></td></tr><tr><td>90um Sito</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA39990ON</td><td></td></tr><tr><td>75um Sito</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA39991ON</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki</td><td></td><td></td><td></td>10</tr><tr><td>mL Zlewki</td> <td>600 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td><td></td>do hodowli komórkowych</tr><tr><td>Picofuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizatory tkankowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>50550226</td><td></td></tr><tr><td>Igły</td><td></td><td></td><td></td>20 G</tr><tr><td>Leica Reichart Ultracut</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

skuteczna metoda przesiewania w celu odizolowania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z nerki dorosłego szczura

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Zachowanie struktury i funkcji kłębuszków nerkowych jest kluczowe w zapobieganiu kłębuszkowemu zapaleniu nerek, kategorii choroby nerek charakteryzującej się białkomoczem, który może ostatecznie prowadzić do przewlekłej i schyłkowej choroby nerek. Kłębuszek nerkowy to złożony aparat odpowiedzialny za filtrację osocza z organizmu. W chorobie dochodzi do utraty integralności strukturalnej, co pozwala na nieprawidłowy wyciek treści osocza do moczu. Metoda izolowania i badania kłębuszków nerkowych w kulturze ma kluczowe znaczenie dla badania tych chorób. W niniejszym protokole opisano skuteczną metodę odzyskiwania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z nerek dorosłych szczurów przy jednoczesnym zachowaniu cech strukturalnych i morfologicznych. Proces ten jest w stanie wygenerować wysokie plony kłębuszków nerkowych na nerkę przy minimalnym zanieczyszczeniu innymi segmentami nefronu. W przypadku tych kłębuszków nerkowych stany urazu można naśladować, inkubując je z różnymi toksynami chemicznymi, w tym siarczanem protaminy, który powoduje zacieranie wyrostka stopy i białkomocz w modelach zwierzęcych. Stopień uszkodzenia można ocenić za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, barwienia immunofluorescencyjnego i western blotting. Poziomy nefryny i guza Wilmsa 1 (WT1) można również ocenić na podstawie tych kultur. Ze względu na łatwość i elastyczność tego protokołu, izolowane kłębuszki nerkowe mogą być wykorzystywane zgodnie z opisem lub w sposób, który najlepiej odpowiada potrzebom badacza, aby pomóc lepiej badać zdrowie i strukturę kłębuszków nerkowych w stanach chorych.

Protokół od momentu eutanazji do izolacji kłębuszków można zrealizować w czasie zaledwie 2 h, a charakteryzuje się on wysoką wydajnością i przepustowością. Przy prawidłowym zastosowaniu tej techniki, wydajność kłębuszków z nerki szczura wynosi od 6,000 do 10,000 kłębuszków przy użyciu 8 nerek. Końcowa zawiesina jest gęsto wypełniona kłębuszkami i wykazuje ogólną czystość &gt; 95%, z minimalnym zanieczyszczeniem segmentami kanalików lub innymi typami komórek (Rysunek 1A, B). Ponadto, kłębuszki zatopione w OCT można barwić hematoksyliną i eozyną (H &amp; E) w celu oceny morfologii (Rysunek 1C). Kłębuszki te zachowują swoją strukturę przez cały protokół, nawet po obróbce. Wykazujemy, że izolowane kłębuszki posiadają nienaruszone i żywe podocyty (Rysunek 2A), komórki mezangium (Rysunek 2B) oraz komórki śródbłonka (Rysunek 2C).
Po wyizolowaniu kłębuszki mogą zostać poddane znanym uszkodzeniom chemicznym w celu symulacji in vivo patologia. W tym przypadku wybrano siarczan protaminy (PS) ze względu na jego zdolność do zaburzenia ładunku bariery filtracyjnej kłębka nerkowego, co ostatecznie prowadzi do zatarcia procesów stopowych. W kłębuszkach traktowanych PS stwierdzono wyraźny spadek poziomu nefryny (czerwony) oraz liczby jąder komórkowych wykazujących dodatni wynik dla WT1 (zielony) poprzez immunofluorescencja (Rycina 3A, B). Kłębuszki mogą być również przygotowane do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Rycina 3C). Próbki kontrolne wykazują prawidłową morfologię podocytów i wypustek stóp, podczas gdy kłębuszki traktowane PS wykazują zatarcia wypustek stóp (Rycina 3D), co jest oznaką dysfunkcji podocytów i obserwuje się w in vivo modele z wykorzystaniem PS21Odpowiadało to również spadkowi poziomu nefryny wykrytemu za pomocą immunoblottingu (Rycina 3E, F).
W celu oceny żywotności jako markeru apoptozy wykorzystano rozszczepioną kaspazę-3. W badaniu immunofluorescencyjnym rozszczepiona kaspaza-3 pojawia się początkowo w kilku komórkach, zaczynając od 2 h po izolacji (Rysunek 4). Liczba komórek wykazujących ekspresję tej proteazy zwiększała się z czasem, a najwyższe poziomy odnotowano w 24 i 48 h. Sugeruje to, że apoptoza zachodzi stosunkowo wcześnie w hodowli i że w celu uzyskania najlepszych wyników kolejne etapy aplikacji powinny być przeprowadzane wkrótce po izolacji.
<img alt="Histologia: tkanka wątroby pod mikroskopem; analiza struktury komórkowej; obraz mikroskopowy; widoczne paski skali." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58162/58162fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Typowy wygląd hodowli kłębuszków szczurzych po izolacji. (A) Obraz w świetle przechodzącym hodowli kłębuszków. Chociaż na tej mikrofotografii wybrano pole, w którym znajduje się pojedynczy kanalik nerkowy (grot strzałki), otrzymane hodowle są zazwyczaj czyste w &gt; 95%. Pasek skali odpowiada 100 µm. (B) Powiększony obraz pojedynczego kłębuszka. (C) Barwienie hematoksyliną i eozyną pojedynczego kłębuszka. Paski skali w B i C odpowiadają 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58162/58162fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej pokazujące ekspresję nefryny, WT1, PDGFR-β i CD-31 w kłębuszkach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58162/58162fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Typy komórek konstytutywnych zostają zachowane w wyizolowanych kłębuszkach. Wykonano konfokalną mikroskopię immunofluorescencyjną dla nefryny (czerwony, podocyty) oraz markerów specyficznych dla komórek w celu identyfikacji podocytów, komórek mezanialnych i śródbłonka. (A) Podwójne barwienie na nefrynę i WT1 (zielony, podocyty). (B) Podwójne barwienie na nefrynę i PDGFR-β (zielony, komórki mezanialne, strzałka). (C) Podwójne barwienie na nefrynę i CD31 (zielony, komórki śródbłonka, naczynia w przekroju poprzecznym zaznaczone grotami strzałek). Pasek skali = 25 µm na wszystkich panelach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58162/58162fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna i TEM nefryny oraz WT1, kontrola vs siarczan protaminy; western blot nefryny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58162/58162fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Uszkodzenie podocytów można wywołać in vitro z wykorzystaniem izolowanych kłębuszków szczura. (A) Konfokalna mikroskopia immunofluorescencyjna dla nefryny i WT1 w nieleczonej kulturze kłębuszkowej. Zauważalny jest liniowe barwienie nefryny (czerwone) oraz obecność jąder WT1-dodatnich (zielone), co jest typowe dla zdrowych podocytów. (B) Po traktowaniu siarczanem protaminy ekspresja nefryny jest zmniejszona i nieliniowa, a WT1 nie występuje, co wskazuje na uszkodzenie podocytów. (C) Obraz z transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) przedstawiający wypustki stopowe, błonę podstawną i fenestrowane śródbłonie typowe dla normalnej struktury kłębuszka. Pasek skali wynosi 500 nm. (D) Po podaniu siarczanu protaminy wypustki stopowe są wydłużone lub zatarte (groty strzałek), co wskazuje na uszkodzenie podocytów. (E) Western blot dla nefryny wykazujący zmniejszoną ilość nefryny po traktowaniu siarczanem protaminy. (F) Przedstawiono kontrolę ładowania aktyny dla western blotu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58162/58162fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna dla rozszczepionej kaspazy-3 i nefryny w ciągu 48 godzin; analiza postępu apoptozy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58162/58162fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Ocena żywotności komórek w wyizolowanych kłębuszkach. Wykonano konfokalną mikroskopię immunofluorescencyjną dla rozszczepionej kaspazy-3 (zielony). Przeprowadzono barwienie współobecności nefryny, aby ułatwić lokalizację kłębuszków. Podczas gdy w 0 i 1 h po izolacji kłębuszków nie stwierdzono pozytywności na rozszczepioną kaspazę-3, w 2 h odnotowano sygnał fluorescencyjny w kilku komórkach. Im dłuższy czas po izolacji, tym progresywnie więcej komórek stawało się pozytywnych. Największą liczbę komórek pozytywnych pod kątem kaspazy-3 odnotowano w 24 i 48 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58162/58162fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Głównym celem tego protokołu jest efektywne izolowanie żywotnych pierwotnych kultur kłębuszków nerkowych z minimalnymi zanieczyszczeniami do wykorzystania w różnych dalszych zastosowaniach. Wyizolowane kłębuszki nerkowe zachowują relacje strukturalne między typami komórek składowych i mogą być hodowane ex vivo przez krótki czas.

Skuteczna metoda przesiewania w celu odizolowania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z nerki dorosłego szczura

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób nerek. Szczególnie w zrozumieniu kłębuszków nerkowych w stanach normalnych i chorobowych. Biologia kłębuszków nerkowych może być trudna do zbadania ze względu na różnorodność obecnych typów komórek i ich unikalną strukturę.Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie łatwo dostępnego źródła nienaruszonych kłębuszków nerkowych przy użyciu prostych metod i sprzętu. Technika ta ma implikacje dla naszego zrozumienia bariery filtracyjnej w prawidłowej i chorej nerce. W szczególności może rzucić światło na naszą wiedzę na temat przewlekłej choroby nerek białkomoczowych, w której uszkodzenie kłębuszków nerkowych prowadzi do nienormalnie wysokiego wydzielania białek surowicy do moczu.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają stosować tę technikę, będą miały trudności z uzyskaniem odpowiedniej wydajności i czystości w próbce końcowej. Procedurę zademonstruje Brittney Rush, technik z mojego laboratorium. Na początek użyj maszynki do strzyżenia włosów, aby usunąć włosy z przedniej części brzucha szczura, który został poddany eutanazji.Użyj 70% etanolu do oczyszczenia odsłoniętej skóry. Następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry. Aby odsłonić narządy wewnętrzne, wykonaj nacięcie w linii środkowej przez warstwę mięśni.Zlokalizuj i wyizoluj nerki i umieść je w sterylnej 50-mililitrowej plastikowej stożkowej probówce z 30 mililitrami buforowanego roztworu soli Hanka lub HBSS umieszczonego na lodzie. Przenieść probówkę na lodzie do sterylnego kaptura do hodowli komórkowych. Przenieść nerki na sterylną szalkę Petriego zawierającą pięć mililitrów HBSS umieszczoną na lodzie.Użyj nożyczek i ostrych kleszczy, aby usunąć i wyrzucić tłuszcz okołonerkowy. Aby usunąć i wyrzucić kapsułki otaczające nerkę, wykonaj małe powierzchowne nacięcie, a następnie użyj ostrych kleszczy, aby delikatnie odciągnąć je od nerki. Umieść nerki na sterylnej gazie na drugiej szalce Petriego z pięcioma mililitrami HBSS i podziel każdą nerkę na pół przez środkowy odcinek strzałkowy.Użyj skalpela, aby usunąć i wyrzucić rdzeń, który można rozpoznać po ciemniejszym kolorze i centralnym położeniu. Pozostałe kawałki zawierające głównie korę nerkową przenieść na trzecią szalkę Petriego z pięcioma mililitrami HBSS. Użyj sterylnej żyletki, aby je zmielić, aż kawałki będą mniejsze niż jeden milimetr lub aż powstanie pasta.Użyj 1% BSA PBS, aby zwilżyć górną i dolną część sita o średnicy 180 mikrometrów nad 500-mililitrową zlewką na odpady. Ten krok ma kluczowe znaczenie, ponieważ pokrywa sito białkiem i zmniejsza przyleganie kłębuszków nerkowych, co z kolei poprawi wydajność. Umieść wymieszaną korę na małym brzegu sita.Użyj teksturowanego kołnierza tłoka jednorazowej strzykawki o pojemności 10 mililitrów, aby przetrzeć tkankę przez sito do dolnej miski umieszczonej na lodzie. Okresowo płukać HBSS, używając jak najmniej, aby uniknąć rozcieńczenia próbki, i ponownie użyć płynu zbierającego się w dolnej misce do przepłukania sita. Po zakończonym przesiewaniu ostrożnie umyj dno sita HBSS od dna patelni, aby uchwycić luźno przylegające kłębuszki nerkowe.Podziel cały płyn z dolnej miski na 10-mililitrowe strzykawki wyposażone w igły o rozmiarze 20. Przepuść płyn przez igłę co najmniej trzy razy do dolnej miski. W przypadku ostatniego zebrania należy przechowywać kłębuszki zawierające płyn w strzykawce do czasu, aż będą gotowe do przepuszczenia go przez sito o grubości 90 mikrometrów.W międzyczasie umyj dolną miskę, przepłukując ją 1% BSA PBS i przelej do zlewki na odpady. Użyj 1% BSA PBS, aby zwilżyć górną i dolną część sita o grubości 90 mikrometrów, a następnie umieść je na górze dolnej miski. Nałożyć próbkę w strzykawkach na jedną krawędź sita.Użyj teksturowanego kołnierza tłoka, aby przetrzeć tkankę przez sito, tak jak poprzednio. Użyj roztworu z dolnej miski, aby umyć chusteczkę i zebrać wszystko z jednej krawędzi sita. Po zakończeniu przesiewania ostrożnie umyj dno sita buforem HBSS od dna patelni, aby wychwycić wszelkie kłębuszki nerkowe, które mogą być luźno przylegające.Zbierz cały płyn z dolnej miski do 50-mililitrowej plastikowej stożkowej rurki. Użyj 1%BSA PBS, aby umyć dolną miskę do zlewki na odpady. Następnie użyj 1%BSA PBS, aby zwilżyć górną i dolną część sita o grubości 75 mikrometrów.Umieść sitko na dolnej patelni umieszczonej na lodzie. Nałożyć próbkę na jedną krawędź sita, przez którą płyn łatwo przepływa. Opłucz górną część sita z co najmniej 20 mililitrami 1%BSA PBS do zlewki na odpady i dokładnie umyj spód sita.Aby zebrać kłębuszki nerkowe, które pozostały na wierzchu sita o średnicy 75 mikrometrów, przepłucz sito do góry nogami taką ilością HBSS, jaka jest potrzebna do zebrania kłębuszków na szalce Petriego. Zbierz przesiane kłębuszki nerkowe do 50-mililitrowej plastikowej stożkowej rurki na lodzie. Po odwirowaniu w temperaturze 1800 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety.Ponownie zawiesić granulat w 10 mililitrach zimnego HBSS. Połączyć próbki i powtórzyć wirowanie. Ponownie zawiesić kłębuszki nerkowe w pięciu mililitrach HBSS.Aby policzyć całkowite kłębuszki nerkowe, umieść 10-mikrolitrową kroplę próbki na szklanym szkiełku, policz pod mikroskopem i pomnóż przez 500, aby uzyskać całkowitą wydajność. Izolowane struktury powinny składać się z prawie wszystkich kłębuszków nerkowych bez struktur rurowych. Jeśli kanaliki są obecne i wpłynęłyby na dalszą aplikację, można je usunąć, nakładając całą próbkę na sito o grubości 90 mikrometrów i powtarzając protokół od tego momentu.Opisany tutaj protokół jest skuteczny w izolowaniu kłębuszków nerkowych, a końcowa zawiesina jest gęsto wypełniona kłębuszkami o czystości większej niż 95% i minimalnym zanieczyszczeniu segmentami kanalików lub innymi typami komórek. Te kłębuszki nerkowe można wybarwić barwnikami hematoksyliny i eozyny, aby zobaczyć ich morfologię. Co więcej, zachowują swoją strukturę przez cały protokół, nawet po przetworzeniu.Zachowują nienaruszone i żywotne podocyty, komórki mezangialne i komórki śródbłonka. Wyizolowane kłębuszki nerkowe zostały wystawione na urazy chemiczne w celu symulacji patologii in vivo. W szczególności siarczan protaminy, który zaburza ładunek kłębuszkowej bariery filtracyjnej.W przeciwieństwie do zdrowych kłębuszków nerkowych, kłębuszki nerkowe traktowane siarczanem protaminy mają wyraźną redukcję nefronu i liczbę jąder dodatnich dla WT1. Oglądane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, zdrowe kłębuszki nerkowe wykazują typowe procesy stopy. Po leczeniu siarczanem protaminy wyrostki stopy są wydłużone lub zatarte, co wskazuje na uszkodzenie podocytów.Aby określić żywotność komórek w izolowanych kłębuszkach nerkowych, zaobserwowano rozszczepioną kaspazę trzy jako marker apoptozy. Nie stwierdzono rozszczepionej kaspazy trzy godziny po godzinie zero i jednej godzinie po wyizolowaniu kłębuszków nerkowych. Kilka komórek wykazywało oznaki apoptozy po dwóch i czterech godzinach z postępującym wzrostem w czasie.Największą liczbę komórek apoptotycznych odnotowano po 24 i 48 godzinach. Na podstawie tych wyników zalecamy, aby w większości eksperymentów izolowane kłębuszki nerkowe były stosowane natychmiast po izolacji. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować szybko i wydajnie.Od momentu wyizolowania nerki kłębuszki nerkowe zaczynają się pogarszać. Im szybciej wyizolujesz kłębuszki nerkowe, tym więcej czasu będziesz miał na pozowanie, izolację, manipulację. Po izolacji izolowane kłębuszki nerkowe mogą być wystawione na działanie czynników chemicznych lub biologicznych w celu stymulacji stanów fizjologicznych lub patologicznych.Próbki mogą być przetwarzane do izolacji białek lub RNA, histologii lub immunofluorescencji i mikroskopii elektronowej. Od czasu jej rozwoju w latach 50. XX wieku technika ta pomogła naukowcom w badaniu biologii kłębuszków nerkowych. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten zapewnia metodę oceny cech morfologicznych i komórkowych nienaruszonych kłębuszków nerkowych w stanach normalnych i chorobowych.Metoda ta może pomóc w zrozumieniu białkomoczowej przewlekłej choroby nerek i pomóc w opracowaniu przyszłych terapii.

an-efficient-sieving-method-to-isolate-intact-glomeruli-from-adult

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przeszczepianie wyizolowanych wysepek zostało zaproponowane jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu 1. W niniejszym materiale opisujemy metodę izolacji wysepek z trzustek myszy oraz ich transplantacji do przestrzeni podtorebkowej nerki.

Metoda izolacji wysepek mysich i przeszczepiania podtorebkowego do nerki

W tym filmie opisujemy procedurę pobierania nerki z przestrzeni zaotrzewnowej myszy. Wyekstrahowaną nerkę można następnie poddać mikrosekcji w celu uzyskania nienaruszonej nerki bez torebki nerkowej i otaczającej warstwy tłuszczu.

Ekstrakcja nienaruszonej nerki od myszy: technika uzyskiwania nerki bez torebki nerkowej z modeli mysich

Ten film opisuje metodę izolowania nienaruszonych kłębuszków nerkowych od nerek myszy. Otrzymane w ten sposób kapsułkowane i zdecapsulowane kłębuszki nerkowe mogą być dalej wykorzystywane do hodowli komórek nabłonka ciemieniowego z mysiej nerki.

Izolacja kłębuszków nerkowych: technika uzyskiwania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z mysiej nerki

Technika wykorzystująca mikroskopię 2-fotonową intavital o wysokiej rozdzielczości do bezpośredniej wizualizacji i ilościowego określenia filtracji gloemrarnej w kłębuszkach nerkowych na powierzchni. Metoda ta pozwala na bezpośrednie określenie charakterystyk przepuszczalności makrocząsteczek zarówno w stanie normalnym, jak i chorobowym.

Kwantyfikacja przepuszczalności kłębuszkowej makrocząsteczek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii 2-fotonowej u szczurów Wistar w Monachium

Zmiany w wewnątrzkomórkowym poziomie wapnia w podocytach są jednym z najważniejszych sposobów kontrolowania funkcji filtracji kłębuszków nerkowych. W tym miejscu wyjaśniamy podejście o wysokiej przepustowości, które umożliwia wykrywanie obchodzenia się z wapniem w czasie rzeczywistym i aktywności pojedynczych kanałów jonowych w podocytach świeżo wyizolowanych kłębuszków nerkowych.

Analiza jednokanałowa i obrazowanie wapnia w podocytach świeżo wyizolowanych kłębuszków nerkowych

Ten protokół opisuje pełne badanie nerek, które powinno być przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

Tutaj prezentujemy protokół do mysiego znakowania in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszkowych za pomocą biotyny. Protokół ten zawiera informacje o tym, jak perfuzja nerek myszy, izolowanie kłębuszków nerkowych i przeprowadzanie endogennej immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Izolacja kłębuszków nerkowych i znakowanie in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszków nerkowych

Ten artykuł opisuje metodę hodowli i analizy wyrostków komórek kłębuszkowych nabłonków ciemieniowych zamkniętych kłębuszków wyizolowanych z nerki myszy. Metoda ta może być stosowana do badania szlaków zaangażowanych w proliferację i migrację komórek nabłonka okładzinowego.

Rozrost kłębuszków nerkowych jako test ex vivo do analizy szlaków zaangażowanych w aktywację komórek nabłonka ciemieniowego

Artykuł opisuje metodę izolowania warunkowo unieśmiertelnionych komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych z nerek transgenicznych myszy wykazujących ekspresję termolabilnego wirusa małp 40 i fotoaktywowalnych mitochondriów,PhAM wyciętych. Opisujemy procedurę izolacji kłębuszków nerkowych z całych nerek za pomocą kulek, etapów trawienia, wysiewu i hodowli GECs-CD31 dodatnich.

Izolacja warunkowo unieśmiertelnionych komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych myszy z fluorescencyjnymi mitochondriami

To badanie przedstawia łatwy w użyciu, kompletny i prosty zestaw metod do oznaczania i analizowania kłębuszków nerkowych z mysich nerek oczyszczonych metodą CUBIC. Dane, takie jak liczba i objętość kłębuszków nerkowych, można łatwo i niezawodnie uzyskać za pomocą dekstranu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-Dextran, mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych (LSFM) lub popularnej mikroskopii konfokalnej i oprogramowania, takiego jak Imaris.

Wydajna i szybka metoda etykietowania i analizy kłębuszków mysich

To badanie opracowało zoptymalizowany protokół izolacji mysich komórek mezangialnych (MC) i ich hodowli komórkowej ex vivo. Komórki te mogą być wielokrotnie pasażowane, zamrażane, ożywiane i hodowane bez uszczerbku dla wzrostu komórek lub ekspresji białek.

Optymalizacja izolacji i oczyszczania mysich komórek mezangialnych kłębuszków nerkowych

Poznaj metodę izolacji nienaruszonych kłębuszków nerkowych z nerki szczura z czystością powyżej 95%. Technika ta umożliwia badanie biologii kłębuszkowej i mechanizmów przewlekłej choroby nerek z białkomoczem.

Skuteczna metoda przesiewania w celu odizolowania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z nerki dorosłego szczura

Przeglądaj więcej filmów