Skuteczna metoda przesiewania w celu odizolowania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z nerki dorosłego szczura
1 listopada 2018
Głównym celem tego protokołu jest efektywne izolowanie żywotnych pierwotnych kultur kłębuszków nerkowych z minimalnymi zanieczyszczeniami do wykorzystania w różnych dalszych zastosowaniach. Wyizolowane kłębuszki nerkowe zachowują relacje strukturalne między typami komórek składowych i mogą być hodowane ex vivo przez krótki czas.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób nerek. Szczególnie w zrozumieniu kłębuszków nerkowych w stanach normalnych i chorobowych. Biologia kłębuszków nerkowych może być trudna do zbadania ze względu na różnorodność obecnych typów komórek i ich unikalną strukturę.
Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie łatwo dostępnego źródła nienaruszonych kłębuszków nerkowych przy użyciu prostych metod i sprzętu. Technika ta ma implikacje dla naszego zrozumienia bariery filtracyjnej w prawidłowej i chorej nerce. W szczególności może rzucić światło na naszą wiedzę na temat przewlekłej choroby nerek białkomoczowych, w której uszkodzenie kłębuszków nerkowych prowadzi do nienormalnie wysokiego wydzielania białek surowicy do moczu.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają stosować tę technikę, będą miały trudności z uzyskaniem odpowiedniej wydajności i czystości w próbce końcowej. Procedurę zademonstruje Brittney Rush, technik z mojego laboratorium. Na początek użyj maszynki do strzyżenia włosów, aby usunąć włosy z przedniej części brzucha szczura, który został poddany eutanazji.
Użyj 70% etanolu do oczyszczenia odsłoniętej skóry. Następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry. Aby odsłonić narządy wewnętrzne, wykonaj nacięcie w linii środkowej przez warstwę mięśni.
Zlokalizuj i wyizoluj nerki i umieść je w sterylnej 50-mililitrowej plastikowej stożkowej probówce z 30 mililitrami buforowanego roztworu soli Hanka lub HBSS umieszczonego na lodzie. Przenieść probówkę na lodzie do sterylnego kaptura do hodowli komórkowych. Przenieść nerki na sterylną szalkę Petriego zawierającą pięć mililitrów HBSS umieszczoną na lodzie.
Użyj nożyczek i ostrych kleszczy, aby usunąć i wyrzucić tłuszcz okołonerkowy. Aby usunąć i wyrzucić kapsułki otaczające nerkę, wykonaj małe powierzchowne nacięcie, a następnie użyj ostrych kleszczy, aby delikatnie odciągnąć je od nerki. Umieść nerki na sterylnej gazie na drugiej szalce Petriego z pięcioma mililitrami HBSS i podziel każdą nerkę na pół przez środkowy odcinek strzałkowy.
Użyj skalpela, aby usunąć i wyrzucić rdzeń, który można rozpoznać po ciemniejszym kolorze i centralnym położeniu. Pozostałe kawałki zawierające głównie korę nerkową przenieść na trzecią szalkę Petriego z pięcioma mililitrami HBSS. Użyj sterylnej żyletki, aby je zmielić, aż kawałki będą mniejsze niż jeden milimetr lub aż powstanie pasta.
Użyj 1% BSA PBS, aby zwilżyć górną i dolną część sita o średnicy 180 mikrometrów nad 500-mililitrową zlewką na odpady. Ten krok ma kluczowe znaczenie, ponieważ pokrywa sito białkiem i zmniejsza przyleganie kłębuszków nerkowych, co z kolei poprawi wydajność. Umieść wymieszaną korę na małym brzegu sita.
Użyj teksturowanego kołnierza tłoka jednorazowej strzykawki o pojemności 10 mililitrów, aby przetrzeć tkankę przez sito do dolnej miski umieszczonej na lodzie. Okresowo płukać HBSS, używając jak najmniej, aby uniknąć rozcieńczenia próbki, i ponownie użyć płynu zbierającego się w dolnej misce do przepłukania sita. Po zakończonym przesiewaniu ostrożnie umyj dno sita HBSS od dna patelni, aby uchwycić luźno przylegające kłębuszki nerkowe.
Podziel cały płyn z dolnej miski na 10-mililitrowe strzykawki wyposażone w igły o rozmiarze 20. Przepuść płyn przez igłę co najmniej trzy razy do dolnej miski. W przypadku ostatniego zebrania należy przechowywać kłębuszki zawierające płyn w strzykawce do czasu, aż będą gotowe do przepuszczenia go przez sito o grubości 90 mikrometrów.
W międzyczasie umyj dolną miskę, przepłukując ją 1% BSA PBS i przelej do zlewki na odpady. Użyj 1% BSA PBS, aby zwilżyć górną i dolną część sita o grubości 90 mikrometrów, a następnie umieść je na górze dolnej miski. Nałożyć próbkę w strzykawkach na jedną krawędź sita.
Użyj teksturowanego kołnierza tłoka, aby przetrzeć tkankę przez sito, tak jak poprzednio. Użyj roztworu z dolnej miski, aby umyć chusteczkę i zebrać wszystko z jednej krawędzi sita. Po zakończeniu przesiewania ostrożnie umyj dno sita buforem HBSS od dna patelni, aby wychwycić wszelkie kłębuszki nerkowe, które mogą być luźno przylegające.
Zbierz cały płyn z dolnej miski do 50-mililitrowej plastikowej stożkowej rurki. Użyj 1%BSA PBS, aby umyć dolną miskę do zlewki na odpady. Następnie użyj 1%BSA PBS, aby zwilżyć górną i dolną część sita o grubości 75 mikrometrów.
Umieść sitko na dolnej patelni umieszczonej na lodzie. Nałożyć próbkę na jedną krawędź sita, przez którą płyn łatwo przepływa. Opłucz górną część sita z co najmniej 20 mililitrami 1%BSA PBS do zlewki na odpady i dokładnie umyj spód sita.
Aby zebrać kłębuszki nerkowe, które pozostały na wierzchu sita o średnicy 75 mikrometrów, przepłucz sito do góry nogami taką ilością HBSS, jaka jest potrzebna do zebrania kłębuszków na szalce Petriego. Zbierz przesiane kłębuszki nerkowe do 50-mililitrowej plastikowej stożkowej rurki na lodzie. Po odwirowaniu w temperaturze 1800 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety.
Ponownie zawiesić granulat w 10 mililitrach zimnego HBSS. Połączyć próbki i powtórzyć wirowanie. Ponownie zawiesić kłębuszki nerkowe w pięciu mililitrach HBSS.
Aby policzyć całkowite kłębuszki nerkowe, umieść 10-mikrolitrową kroplę próbki na szklanym szkiełku, policz pod mikroskopem i pomnóż przez 500, aby uzyskać całkowitą wydajność. Izolowane struktury powinny składać się z prawie wszystkich kłębuszków nerkowych bez struktur rurowych. Jeśli kanaliki są obecne i wpłynęłyby na dalszą aplikację, można je usunąć, nakładając całą próbkę na sito o grubości 90 mikrometrów i powtarzając protokół od tego momentu.
Opisany tutaj protokół jest skuteczny w izolowaniu kłębuszków nerkowych, a końcowa zawiesina jest gęsto wypełniona kłębuszkami o czystości większej niż 95% i minimalnym zanieczyszczeniu segmentami kanalików lub innymi typami komórek. Te kłębuszki nerkowe można wybarwić barwnikami hematoksyliny i eozyny, aby zobaczyć ich morfologię. Co więcej, zachowują swoją strukturę przez cały protokół, nawet po przetworzeniu.
Zachowują nienaruszone i żywotne podocyty, komórki mezangialne i komórki śródbłonka. Wyizolowane kłębuszki nerkowe zostały wystawione na urazy chemiczne w celu symulacji patologii in vivo. W szczególności siarczan protaminy, który zaburza ładunek kłębuszkowej bariery filtracyjnej.
W przeciwieństwie do zdrowych kłębuszków nerkowych, kłębuszki nerkowe traktowane siarczanem protaminy mają wyraźną redukcję nefronu i liczbę jąder dodatnich dla WT1. Oglądane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, zdrowe kłębuszki nerkowe wykazują typowe procesy stopy. Po leczeniu siarczanem protaminy wyrostki stopy są wydłużone lub zatarte, co wskazuje na uszkodzenie podocytów.
Aby określić żywotność komórek w izolowanych kłębuszkach nerkowych, zaobserwowano rozszczepioną kaspazę trzy jako marker apoptozy. Nie stwierdzono rozszczepionej kaspazy trzy godziny po godzinie zero i jednej godzinie po wyizolowaniu kłębuszków nerkowych. Kilka komórek wykazywało oznaki apoptozy po dwóch i czterech godzinach z postępującym wzrostem w czasie.
Największą liczbę komórek apoptotycznych odnotowano po 24 i 48 godzinach. Na podstawie tych wyników zalecamy, aby w większości eksperymentów izolowane kłębuszki nerkowe były stosowane natychmiast po izolacji. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować szybko i wydajnie.
Od momentu wyizolowania nerki kłębuszki nerkowe zaczynają się pogarszać. Im szybciej wyizolujesz kłębuszki nerkowe, tym więcej czasu będziesz miał na pozowanie, izolację, manipulację. Po izolacji izolowane kłębuszki nerkowe mogą być wystawione na działanie czynników chemicznych lub biologicznych w celu stymulacji stanów fizjologicznych lub patologicznych.
Próbki mogą być przetwarzane do izolacji białek lub RNA, histologii lub immunofluorescencji i mikroskopii elektronowej. Od czasu jej rozwoju w latach 50. XX wieku technika ta pomogła naukowcom w badaniu biologii kłębuszków nerkowych. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten zapewnia metodę oceny cech morfologicznych i komórkowych nienaruszonych kłębuszków nerkowych w stanach normalnych i chorobowych.
Metoda ta może pomóc w zrozumieniu białkomoczowej przewlekłej choroby nerek i pomóc w opracowaniu przyszłych terapii.
Przegląd
Niniejszy protokół koncentruje się na wydajnej izolacji żywotnych pierwotnych kultur kłębuszków z minimalną ilością zanieczyszczeń. Izolowane kłębuszki zachowują zależności strukturalne między typami komórek i mogą być hodowane ex vivo przez krótki czas.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nefrologia
- Biologia komórki
- Badania nad chorobami nerek
Wstęp
- Badanie biologii kłębuszków jest trudne ze względu na różnorodność typów komórek i struktur.
- Zrozumienie budowy kłębuszków jest kluczowe dla poznania mechanizmów działania barier filtracyjnych nerek.
- Technika ta wspomaga badanie białkomocznej przewlekłej choroby nerek.
- Nowi użytkownicy mogą mieć trudności z uzyskaniem odpowiedniej wydajności i czystości podczas izolacji kłębuszków.
Cel badania
- Aby zapewnić niezawodną metodę izolowania nienaruszonych kłębuszków nerkowych.
- Aby pogłębić zrozumienie mechanizmów chorób nerek.
- Aby ułatwić dalsze zastosowania w badaniach nad nerkami.
Wykorzystane metody
- Przygotowanie nerek szczura z wykorzystaniem technik chirurgicznych.
- Izolacja kory nerek i kłębków nerkowych metodą przesiewania.
- Wirowanie i resuspensja kłębków nerkowych w HBSS.
- Liczenie i ocena czystości izolowanych kłębków nerkowych.
Główne wyniki
- Wyizolowane kłębki nerkowe wykazują czystość powyżej 95% przy minimalnym zanieczyszczeniu.
- Kłębki nerkowe zachowują żywotność i integralność strukturalną przez cały czas trwania protokołu.
- Metoda umożliwia barwienie oraz ocenę morfologiczną kłębków nerkowych.
- Protokół jest wydajny i powtarzalny w zastosowaniach badawczych.
Wnioski
- Opisana metoda jest skuteczna w izolowaniu żywotnych kłębuszków nerkowych.
- Stanowi ona cenne narzędzie do badania funkcji nerek oraz chorób nerek.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować badanie mechanizmów uszkodzeń kłębuszków.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wydajna izolacja nienaruszonych kłębuszków nerkowych z nerek dorosłego szczura umożliwia wierne modelowanie uszkodzeń kłębuszków oraz dysfunkcji bariery filtracyjnej, co jest kluczowe w początkowych etapach poszukiwania leków w nefrologii. Metoda ta wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka oraz walidację celów terapeutycznych, dostarczając strukturalnie zachowanych, żywych kłębuszków nadających się do ilościowych i translacyjnych analiz. Powtarzalność protokołu oraz wysoka wydajność ułatwiają rzetelną ocenę przedkliniczną kandydatów na leki ukierunkowane na patologie kłębuszków nerkowych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów uszkodzeń kłębków nerkowych w kontrolowanych warunkach ex vivo.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez zachowanie integralności podocytów, komórek kłębuszkowych i śródbłonka.
- Ułatwia mechanistyczną ocenę ryzyka dla celów związanych z białkomoczem i barierą filtracyjną.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowany, wysokiej czystości preparat kłębków nerkowych do powtarzalnego przesiewu związków.
- Umożliwia ilościową ocenę uszkodzeń za pomocą immunofluorescencji, western blottingu i mikroskopii elektronowej.
- Wspiera opracowanie testów dla nefryny i WT1 jako biomarkerów translacyjnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami uszkodzenia kłębuszków i białkomocu istotnymi w przebiegu chorób.
- Umożliwia zachowanie ciągłości od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną z wykorzystaniem nienaruszonych systemów kłębuszkowych.
- Ułatwia dostosowanie postępów w rozwoju zasobów nefrologicznych do poziomu ryzyka poprzez dostarczanie predykcyjnych odczytów uszkodzeń.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ta metoda przesiewowa integruje się z wczesnym etapem przejścia od odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając testowanie hipotez, walidację celów oraz ocenę biomarkerów translacyjnych w badaniach nad chorobami kłębków nerkowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez zerowych w zakresie mechanizmów uszkodzeń kłębków nerkowych i zaangażowania konkretnych szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki do oceny związków w systemach kłębkowych.
- Analityka: Zapewnia wiarygodne odczyty morfologiczne i molekularne do analiz porównawczych w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z modelami chorób in vivo dzięki zachowaniu architektury kłębków nerkowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Oferuje skalowalną, adaptacyjną platformę dla różnorodnych zastosowań w obszarze B+R w nefrologii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów kłębuszkowych oraz w badaniach mechanistycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację kłębuszków w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności w różnych zespołach badawczych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez umożliwienie solidnej, ilościowej oceny uszkodzeń.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów nefrologicznych w oparciu o analizę ryzyka dzięki wiarygodnym danym przedklinicznym.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza techniczna w zakresie sekcji tkanek i przesiewania w celu uzyskania optymalnej wydajności i czystości.
- Niezbędny jest dostęp do podstawowej hodowli komórkowej, mikroskopii oraz aparatury analitycznej.
- Wymagane jest szybkie przetwarzanie materiału po wycięciu, aby zachować żywotność i strukturę kłębków nerkowych.
- Adaptacyjność protokołu umożliwia jego zastosowanie w różnych modelach uszkodzenia nefronów oraz w dalszych analizach.
- Żywotność izolowanych kłębków nerkowych spada z czasem, co wymaga ich natychmiastowego wykorzystania w eksperymentach.
