Izolacja kłębuszków nerkowych i znakowanie in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszków nerkowych
18 stycznia 2019
Tutaj prezentujemy protokół do mysiego znakowania in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszkowych za pomocą biotyny. Protokół ten zawiera informacje o tym, jak perfuzja nerek myszy, izolowanie kłębuszków nerkowych i przeprowadzanie endogennej immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nefrologii dotyczące roli transportu białek powierzchniowych komórek w białkomoczowej, a nie białkomoczowej chorobie nerek. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że ułatwia ona badanie transportu białek powierzchniowych komórek in vivo oraz to, że w jednym eksperymencie można analizować więcej niż jedno białko. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat transportu powierzchni komórek kłębuszkowych, może być również stosowana do innych układów narządów, które są perfundowane i są dostępne za pomocą technik izolacji.
Zacznij od potwierdzenia braku reakcji na szczypanie palca u nogi i zdezynfekuj brzuszną stronę znieczulonej myszy za pomocą 70% izopropylu. Wykonaj środkowe przecięcie skóry od miednicy do mostka i za pomocą pęsety usuń skórę z powięzi brzusznej. Przetnij skórę po obu stronach linii środkowej brzucha i wykonaj podłoże przez warstwę mięśni brzucha od pęcherza do mieczykowatej.
Użyj nożyczek i kleszczy, aby podzielić mięśnie na cztery ćwiartki I użyj dwóch zacisków chirurgicznych, aby przymocować dwie górne ćwiartki w kierunku szyi zwierząt. Umieść zwierzę pod mikroskopem preparacyjnym i użyj sterylnej zamiany, aby odsunąć na bok narządy trzewne. Za pomocą cienkich nożyczek przetnij więzadło przeponowe wątroby.
Za pomocą cienkiej pęsety chirurgicznej umieść jeden szew wokół wątrobowej tętnicy krezkowej tętnic nerkowych. I wokół aorty, proksymalnie do tętnic nerkowych, w nadnerczach. Uwolnij dystalną aortę od powięzi, tłuszczu i innych tkanek.
Następnie zaciśnij żyłę główną i aortę na wysokości rozwidlenia i umieść kolejny szew wokół aorty dystalnej tętnic nerkowych. Za pomocą pęsety zaciśnij proksymalny szew aorty, osłabiając przepływ krwi i wytnij mały otwór o połowie średnicy aorty w aorcie, dystalnie do tętnic nerkowych. Wprowadzić do aorty 10-centymetrowy cewnik przymocowany do 10-mililitrowej strzykawki zawierającej pięć mililitrów lodowatego PBS oraz wapnia i magnezu.
I zamocuj cewnik za pomocą przygotowanych ligatur. Następnie rozpocznij perfuzję nerek z szybkością przepływu dwóch mililitrów na minutę. Za pomocą cienkich nożyczek wyciąć otwór w żyle nerkowej w tętnicach nerkowych i zacisnąć szew wokół tętnic wątrobowych i krezkowych.
Po dostarczeniu całej objętości PBS zastąp perfuzat pięcioma mililitrami lodowatego PBS oraz wapnia i magnezu uzupełnionymi 0,5 miligrama na mililitr biotyny w celu etykietowania powierzchni. Kontynuuj perfuzję nerek z szybkością przepływu dwóch mililitrów na minutę. Po dostarczeniu całej objętości podłączyć do cewnika strzykawkę zawierającą pięć mililitrów lodowatego PBS oraz wapń i magnez uzupełnionych 100-milimolową glicyną.
Ugasić kłębuszki nerkowe wszystkimi pięcioma mililitrami roztworu glicyny przy natężeniu przepływu dwóch mililitrów na minutę. Następnie przeprowadź perfuzję nerek pięcioma mililitrami lodowatego PBS oraz wapnia i magnezu uzupełnionymi 200 mikrolitrami kulek magnetycznych na mililitr przy natężeniu przepływu dwóch mililitrów na minutę. Embolizacja kłębuszków nerkowych za pomocą brązowych kulek magnetycznych będzie widoczna na powierzchni nerki.
Kiedy wszystkie koraliki zostaną dostarczone, usuń torebkę nerki i zbierz nerki z wnęki. Umieść nerki w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej zawierającym 15 mililitrów PBS oraz wapń i magnez. Użyj nowego obosiecznego ostrza, aby pociąć nerki na najmniejsze możliwe kawałki.
Przenieś tkankę do dwumililitrowej probówki zawierającej jeden mililitr kolagenazy A przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie mieszając roztwór tkankowy przed i po trawieniu za pomocą zmodyfikowanej końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów. Pod koniec inkubacji przefiltrować strawioną tkankę przez sitko do komórek o wielkości 100 mikronów. Użyj skrobaka do komórek i lodowatego PBS oraz wapnia i magnezu, aby przetrzeć pozostałą tkankę przez sitko komórkowe.
Doprowadzić końcową objętość zawiesiny jednokomórkowej nerki do 50 mililitrów za pomocą świeżego, lodowatego PBS oraz wapnia i magnezu i zebrać komórki nerki przez odwirowanie. Usuń supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad z nieco mniej niż 1,5 mililitra lodowatego PBS oraz wapnia i magnezu podczas wirowania i przenieś zawiesinę kłębuszkową do nowej dwumililitrowej probówki. Aby umyć kłębuszki nerkowe, umieść rurkę w magnesie, aby zagregować kłębuszki.
Po jednej minucie użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby usunąć supernatant. I wyjmij rurkę z magnesu. Dodaj jeden mililitr PBS oraz wapń i magnez do tkanek.
Jednorazowo pipetować kłębuszki nerkowe w górę i w dół i wirować komórki. Umieść rurkę z powrotem na magnesie i ponownie umyj kłębuszki nerkowe, jak właśnie pokazano. Dopóki czystość próbki nie osiągnie co najmniej 90% za pomocą analizy mikroskopem świetlnym w powiększeniu od 40 do 100 razy.
Następnie zbierz oczyszczone kłębuszki magnetyczne przez odwirowanie. Aby osiągnąć czystość większą niż 95%, kłębuszki nerkowe musiały zostać dokładnie umyte, jak wykazano. Perfuzja biotyny ułatwia znakowanie pętli naczyń włosowatych w biotynie, ale nie kontrolowanych perfundowanych nerkach myszy.
Precypitacja immunologiczna frakcji biotyny ekstraktów kłębuszkowych ujawnia, że białka transbłonowe kłębuszków nerkowych nefryna i podokaliksyna są immunoprecypitowane biotyną, ale nie frakcją kontrolną. Barwienie frakcji immunoprecypitowanej streptawidyną dodatkowo potwierdza obecność nefryny obciążonej biotyną w zwierzętach perfundowanych biotyną, ale nie kontrolnych. Białko śródbłonka, kadheryna śródbłonka naczyniowego i wewnątrzkomórkowa cząsteczka adhezyjna dwie są również immunoprecypitowane we frakcji biotyny.
We wczesnej fazie nefrotoksycznego zapalenia nerek u zwierząt z nefrotoksycznym zapaleniem nerek obserwuje się zmniejszoną ekspresję nefryny na powierzchni komórek w porównaniu z grupą kontrolną. Rzeczywiście, analiza densytometyczna wykazuje znaczne zmniejszenie nefryny obciążonej biotyną u zwierząt z nefrotoksycznym zapaleniem nerek w porównaniu z osobami kontrolującymi. Analiza ilościowa całkowitego stosunku nefryny do aktyny nie wykazuje istotnych różnic między myszami z kontrolnym i nefrotoksycznym zapaleniem nerek.
Ponadto równe ilości podocytów obserwuje się u zwierząt z nefrotoksycznym zapaleniem nerek i kontrolnych. W późnym nefrotoksycznym zapaleniu nerek nefrotoksyczne zwierzęta nefrytyczne wykazują odzyskanie ekspresji nefryny bez istotnych różnic w powierzchni komórek mierzonej między myszami nefrytycznymi z grupy kontrolnej i nefrotoksycznej oraz ogólnej całkowitej redukcji nefryny u zwierząt nefrotoksycznych. Co więcej, liczba podocytów jest zmniejszona w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby strzykawki nie pozostawiały pęcherzyków powietrza podczas ich podłączania, aby uniknąć zatorowości powietrznej kłębuszków nerkowych i pracować w lodowatych warunkach po rozpoczęciu perfuzji nerek. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak izolacja RNA kłębuszków nerkowych i białka, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące ekspresji białka lub interakcji w zdrowych i chorych nerkach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół znakowania in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszkowych u myszy z wykorzystaniem biotyny. Szczegółowo opisano etapy perfuzji nerek mysich, izolacji kłębuszków oraz przeprowadzania immunoprecypitacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nefrologia
- Biologia komórki
- Transport białek
Wstęp
- Zrozumienie transportu białek powierzchniowych komórek jest kluczowe w badaniach nad chorobami nerek.
- Metoda ta może być zastosowana w różnych układach narządowych.
- Umożliwia ona analizę wielu białek w ramach jednego eksperymentu.
- Badania in vivo dostarczają informacji, których nie można uzyskać za pomocą metod in vitro.
Cel badania
- Zbadanie roli transportu białek powierzchniowych komórek w chorobach nerek.
- Opracowanie wiarygodnego protokołu badania białek kłębuszkowych.
- Pogłębienie zrozumienia białkomoczniczych i niebiałkomoczniczych schorzeń nerek.
Zastosowane metody
- Perfuzja nerek myszy biotyną.
- Izolacja kłębków nerkowych z nerek.
- Endogenna immunoprecypitacja białek docelowych.
- Potwierdzenie znieczulenia i przygotowanie chirurgiczne myszy.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na skuteczne znakowanie białek powierzchniowych komórek kłębuszkowych.
- Możliwa jest jednoczasowa analiza wielu białek.
- Uzyskano wgląd w mechanizmy transportu białek.
- Metoda może zostać dostosowana do zastosowania w innych układach narządowych.
Wnioski
- Niniejszy protokół stanowi wartościowe narzędzie w badaniach nad nefrologią.
- Zapewnia on ramy do badania transportu białek in vivo.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć jego zastosowanie na inne jednostki chorobowe.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Badanie transportu białek powierzchniowych komórek kłębuszkowych in vivo dostarcza mechanistycznych wglądów w patogenezę chorób nerek, wspierając walidację celów terapeutycznych w nefrologii. Metoda ta umożliwia półilościową analizę zawartości białek powierzchniowych w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych, zwiększając wiarygodność predykcyjną w modelach przedklinicznych. Ułatwia ona odkrywanie biomarkerów oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych istotnych dla zaburzeń białkomocznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez śledzenie dynamiki białek powierzchniowych komórek w nienaruszonych kłębuszkach.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez bezpośrednią obserwację transportu nefryny i podokalicyny w modelach chorób.
- Wartość prognostyczna: Dostarcza ilościowych odczytów służących do oceny zaangażowania celu i modulacji szlaków in vivo.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Pozwala na uzyskanie oczyszczonych frakcji kłębków, odpowiednich do późniejszej immunoprecypitacji i analizy oddziaływań białkowych.
- Powtarzalność: Standaryzowana perfuzja i izolacja za pomocą kulek magnetycznych zapewniają spójne preparaty kłębków w różnych eksperymentach.
- Możliwość multipleksowania: Umożliwia jednoczesną analizę wielu białek powierzchniowych w ramach jednego eksperymentu, co zwiększa wydajność przesiewową.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Rejestruje dynamiczne zmiany w ekspresji nefryny podczas wczesnej i późnej fazy nefrotoksycznego zapalenia nerek.
- Ciągłość translacyjna: Łączy obserwacje transportu białek in vivo z utratą podocytów i progresją choroby.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia, czy obserwowane zmiany białkowe odzwierciedlają transport powierzchniowy, czy przesunięcia w całkowitej ekspresji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od walidacji celu po ocenę przedkliniczną, dostarczając funkcjonalnych danych in vivo na temat zachowania białek w kłębuszkach nerkowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących mechanizmów transportu białek w modelach chorób nerek.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych wyników immunoprecypitacji zależnej od biotyny w celu porównania ekspozycji powierzchniowej białek.
- Analityka: Umożliwia półilościowe oznaczenie zawartości białek na powierzchni komórek kłębuszków za pomocą detekcji opartej na streptawidynie.
- Badania translacyjne: Łączy dynamikę białek powierzchniowych z wynikami histologicznymi i funkcjonalnymi w modelach nefritis.
- Zastosowania przedsiębiorcze: Możliwość adaptacji do innych perfundowanych systemów narządowych, wspierając walidację celów w różnych jednostkach chorobowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez rozróżnienie transportu powierzchniowego od zmian w całkowitej ekspresji białek.
- Wartość operacyjna: Ustandaryzowane przepływy pracy w zakresie perfuzji i izolacji poprawiają powtarzalność wyników w różnych laboratoriach.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez ujawnienie dostępności i modulacji celu w kontekstach fizjologicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zachowanie białek powierzchniowych in vivo.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza ekspercka w zakresie chirurgii mysiej, perfuzji naczyniowej oraz sekcji tkanek w warunkach sterylnych.
- Procedura zależy od dostępności sprzętu do perfuzji, narzędzi do separacji magnetycznej oraz odczynników do immunoprecypitacji.
- Niezbędna jest standaryzacja czasu perfuzji biotyny, szybkości przepływu oraz etapów gaszenia reakcji w celu uzyskania spójnego znakowania.
- Adaptacja do innych układów narządowych wymaga walidacji dostępności oraz wydajności perfuzji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują kruchość tkanek podczas trawienia oraz konieczność uzyskania wysokiej czystości izolacji kłębuszków (>95%) dla wiarygodnych analiz końcowych.
