Name: Izolacja kłębuszków nerkowych i znakowanie in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszków nerkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Naucz się izolacji kłębuszków nerkowych i znakowania białek powierzchniowych in vivo u myszy za pomocą biotyny. Ta metoda umożliwia analizę wielu białek jednocześnie w badaniach nefrologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Blanki Duvnjak za wyjątkową pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 do M.W. i QU280/3-1 do I.Q. Grantodawca nie odgrywał żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu danych, analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji i przygotowaniu manuskryptu.

Myszy zostały pozyskane jako rasa wewnętrzna z lokalnego zakładu opieki nad zwierzętami lub z Janvier Labs we Francji. Badania przeprowadzono zgodnie z wytycznymi zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywaniu (publikacja U.S. National Institutes of Health nr 85-23, poprawiona w 1996 r.). Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi zezwoleniami instytucjonalnymi (rząd stanowy, numer referencyjny LANUV, AZ:84-02.04. 2016.A435).
1. Przygotowanie instrumentów, rozwiązań i sprzętu
<ol>
	<li>Przygotować 1 l roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym uzupełnionym 1 mM chlorku magnezu (MgCl2) i 0,1 mM chlorku wapnia (CaCl2) (PBSCM) i przefiltrować przez sterylny filtr.</li>
	<li>Przygotuj 5 ml sterylnego PBSCM na mysz do perfuzji i umieść na lodzie.</li>
	<li>Dla każdej myszy przygotuj 5 ml sterylnego PBSCM uzupełnionego 0,5 mg/ml biotyny.</li>
	<li>Dla każdej myszy należy przygotować 5 ml sterylnego PBSCM i dodać 0,8 x 108 kulek magnetycznych (np. 200 μl roztworu 4 x 108 kulek/ml, bez obróbki wstępnej) w celu embolizacji kłębuszków nerkowych. Przygotuj ten roztwór pod stołem do hodowli komórkowych, aby kulki magnetyczne w oryginalnej probówce były sterylne. Umieść ten roztwór na lodzie.</li>
	<li>Przygotuj roztwór hartujący, dodając 100 mM glicyny do PBSCM (5 ml na mysz) i trzymaj go na lodzie.</li>
	<li>Przygotować roztwór kolagenazy (0,378 j./ml kolagenazy A w sterylnym PBSCM). Na mysz odpipetuj 1 ml roztworu kolagenazy do probówki o pojemności 2 ml i umieść go na lodzie.</li>
	<li>Do mycia przygotować sterylny PBSCM (patrz krok 1.1) w probówce o pojemności 50 ml i umieścić go na lodzie.</li>
	<li>Do perfuzji należy użyć pompy strzykawkowej o przepływie 2,0 ml/min.</li>
	<li>Przygotować strzykawkę o pojemności 10 ml z igłą 21G. Umieść końcówkę igły w cewniku o długości 20-30 cm (średnica wewnętrzna, ID = 0,58 mm). Połącz cewnik (ID 0,58 mm) z cewnikiem o długości 10 cm (ID 0,28 mm) i odetnij końcówkę mniejszego cewnika skośnie, aby ułatwić wprowadzenie do aorty myszy.</li>
	<li>W przypadku zabiegów podwiązywania podczas operacji należy przeciąć trzy jedwabne nici o długości 5-7 cm (4-0 do 6-0) na mysz.</li>
	<li>Do operacji przygotuj 3 zaciski chirurgiczne, 2 nożyczki chirurgiczne, 2 pęsety, 2 cienkie pęsety, 1 cienkie nożyczki i waciki. Przygotuj znieczulenie (np. znieczulenie dootrzewnowe ketamina 100 mg/kg masy ciała i ksylazyna 5 mg/kg masy ciała).</li>
	<li>Do wyizolowania kłębuszków nerkowych dwóch nerek należy użyć sitka do komórek o średnicy 100 μm, dwóch probówek o pojemności 50 ml i łapacza magnesów.</li>
	<li>Przygotować bufor do lizy CHAPS: 20 mM 3-[(3-cholamidopropylo)dimetyloamonio]-1-propanosulfonianu (CHAPS); 20 mM tris(hydroksymetylo)-aminometan (Tris) pH 7,5; 50 mM sodochordydu (NaCl); 50 mM fluorek sodu (NaF); 15 mM Na4P2O7; 0,1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) pH 8,0; 2 mM orthovanadan sodu; i 2 mM adenozynotrifosforan (ATP).</li>
	<li>Schłodzić wirówki do temperatury 4 °C.</li>
</ol>
2. Operacja pod mikroskopem
<ol>
	<li>Znieczulić mysz (np. ketaminą/ksylazyną dootrzewnowo, patrz krok 1.11). Wykonaj test szczypania palców u stóp, aby potwierdzić prawidłowe znieczulenie.</li>
	<li>Zdezynfekuj brzuszną stronę myszy za pomocą 70% izopropanolu.</li>
	<li>Wykonaj środkowe cięcie przez skórę od miednicy do mostka i usuń skórę z powięzi brzusznej za pomocą pęsety. Przetnij skórę po obu stronach na środku brzucha nożyczkami chirurgicznymi.</li>
	<li>Zmień narzędzia chirurgiczne. Zastosuj środkowe cięcie od mieczykowatego do pęcherza moczowego przez warstwę mięśni brzucha i podziel je na cztery ćwiartki za pomocą pęsety i nożyczek chirurgicznych. Przymocuj dwie górne części na bok za pomocą zacisków w kierunku szyi myszy za pomocą dwóch zacisków chirurgicznych. 
	UWAGA: Brzuch jest teraz otwarty.</li>
	<li>Narządy trzewne odłożyć na bok sterylnym wacikiem i przeciąć więzadło wątrobowo-przeponowe cienkimi nożyczkami.</li>
	<li>Przygotuj podwiązanie (jedwabną nicią 4-0 do 6-0) wokół aorty proksymalnej tętnic nerkowych na wysokości nadnerczy za pomocą dwóch cienkich pęset. Zaciśnij bliższe podwiązanie aorty, aby znieść przepływ krwi za pomocą pęsety.</li>
	<li>Uwolnij dystalną aortę od powięzi, tłuszczu i innych tkanek i przygotuj podwiązanie wokół tętnicy wątrobowej/krezkowej tętnic nerkowych za pomocą cienkiej pęsety chirurgicznej.</li>
	<li>Przygotować podwiązanie (jedwabną nicią 4-0 do 6-0) wokół aorty dystalnej tętnic nerkowych i zacisnąć żyłę główną i aortę na wysokości rozwidlenia.</li>
	<li>Wytnij mały otwór w aorcie dystalnie do tętnic nerkowych, tak aby otwór miał połowę średnicy aorty. Umieść cewnik w aorcie i przymocuj go za pomocą przygotowanej ligatury. 
	UWAGA: Unikaj pęcherzyków w systemie perfuzyjnym, aby zapobiec zatorowości powietrznej.</li>
	<li>Rozpocznij perfuzję za pomocą lodowatego PBSCM przy natężeniu przepływu 2 ml/min.</li>
	<li>Wytnij otwór w żyle nerkowej na poziomie tętnic nerkowych cienkimi nożyczkami chirurgicznymi i zaciśnij podwiązanie wokół tętnic wątrobowych i krezkowych. 
	UWAGA: Nerki powinny zblednąć po rozpoczęciu perfuzji.</li>
</ol>
3. Biotynylacja in vivo
<ol>
	<li>Zmienić strzykawkę bez pęcherzyków powietrza na lodowaty PBSCM uzupełniony 0,5 mg/ml biotyny do znakowania powierzchniowego i przelać nerki na 5 ml przy natężeniu przepływu 2 ml/min. 
	UWAGA: Roztwory PBSCM należy delikatnie wymieszać (np. obracając probówki o pojemności 50 ml), aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków w roztworze. Po zasysaniu roztworu ze strzykawki należy usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza lub powietrze ze strzykawki. Użyj dodatkowej kaniuli (21G) na strzykawce, aby wypełnić przestrzeń w kaniuli, która jest podłączona do systemu cewnika. Na koniec wbij strzykawkę do kaniuli z cewnikiem bez pęcherzyków.</li>
	<li>Zmienić strzykawkę bez pęcherzyków na lodowatą PBSCM uzupełnioną 100 mM glicyny w celu ugaszenia kłębuszków nerkowych i perfuzji 5 ml przy przepływie 2 ml / min.</li>
	<li>Zmień strzykawkę bez pęcherzyków powietrza na lodowatą PBSCM uzupełnioną 200 μl kulkami magnetycznymi/ml i perfuzją nerkową w ilości 2 ml/min. 
	UWAGA: Na powierzchni nerki widoczna będzie embolizacja kłębuszków nerkowych z brązowymi kulkami magnetycznymi.</li>
</ol>
4. Izolacja kłębuszków nerkowych od dwóch nerek
<ol>
	<li>Usunąć nerki na wnęce i wyjąć kapsułkę. Umieść nerki na lodzie w 15 ml PBSCM w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych. Poddaj mysz eutanazji z zwichnięciem szyjki macicy w znieczuleniu po pobraniu nerek. Zabiegi chirurgiczne i perfuzyjne trwają około 20-22 min.</li>
	<li>Pokrój nerki na najmniejsze możliwe kawałki za pomocą nowego ostrza o podwójnej krawędzi. Przenieść tkankę do probówki o pojemności 2 ml z 1 ml kolagenazy A (patrz krok 1.6) i trawić w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Przed i po trawieniu delikatnie wymieszać za pomocą pokrojonej pipety o pojemności 1000 μl.</li>
	<li>Przepłukać strawioną tkankę przez sitko o wielkości 100 μm za pomocą lodowatego PBSCM. Delikatnie użyj skrobaka do komórek, aby zmielić pozostałą tkankę przez sitko do komórek, a następnie spłucz ją lodowatym PBSCM do całkowitej objętości 50 ml.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę w temperaturze 4 °C 500 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad z nieco mniejszą ilością niż 1,5 ml lodowatego PBSCM podczas wirowania osadu. Następnie umieścić zawiesinę kłębuszkową w nowej probówce o pojemności 2 ml.</li>
</ol>
5. Mycie
<ol>
	<li>Użyj łapacza magnesu, aby odciągnąć kłębuszki nerkowe na bok. Odczekaj 1 minutę, zanim kłębuszki przesuną się w kierunku magnesu.</li>
	<li>Usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 1000 μl, podczas gdy probówka o pojemności 2 ml pozostaje w chwytaczu magnesów. Podczas pierwszego i drugiego etapu płukania (patrz krok 5.3) w probówce pozostaje 250 μl supernatantu, aby uniknąć utraty kłębuszków nerkowych. Wykonaj tę procedurę szybko, aby uniknąć opadania konstrukcji rurowych na dno rury. 
	UWAGA: W przeciwnym razie procedura prania potrwa dłużej.</li>
	<li>Wyjmij probówkę o pojemności 2 ml z łapacza magnesów i dodaj 1 ml PBSCM, pipetuj w górę iw dół (bardzo ważne), a następnie wiruj.</li>
	<li>Włóż rurkę z powrotem do łapacza magnesów i zacznij od kroku 5.2.</li>
	<li>Powtarzaj etapy mycia, aż czystość kłębuszków nerkowych osiągnie 90%. W tym celu należy zbadać reprezentatywną podwielokrotność supernatantu pod mikroskopem (40-100X). 
	UWAGA: Kłębuszki pojawią się jako okrągłe struktury zawierające brązowe kulki magnetyczne. Wydłużone struktury to fragmenty rurowe, a swobodne koraliki magnetyczne pojawiają się jako brązowe okrągłe kropki. Szczątki komórkowe mogą wyglądać jak nieporęczne struktury.</li>
	<li>Jeśli zostanie osiągnięta czystość, oszacować liczbę kłębuszków nerkowych, rozpuszczając je w 1 ml PBSCM. Po wymieszaniu pobrać podwielokrotność 10 μl i policzyć kłębuszki nerkowe pod mikroskopem. Obliczyć liczbę kłębuszków nerkowych za pomocą następującego równania: końcowa liczba kłębuszków nerkowych = liczba kłębuszków w 10 μl podwielokrotności x 100.</li>
	<li>Udana izolacja kłębuszków nerkowych prowadzi do zasięgu 10 000-40 000 kłębuszków nerkowych.</li>
</ol>
6. Ekstrakcja białek i immunoprecypitacja (IP)
<ol>
	<li>Zebrać kłębuszki nerkowe przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przy 6800 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant za pomocą łapacza magnesów i ponownie zawiesić osad w lodowatym buforze do lizy (np. 30 000 kłębuszków w 300 μl; CHAPS, patrz krok 1.11). Homogenizować próbki za pomocą homogenizatora tkankowego z najwyższą prędkością przez 30 s i lizować je na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>Usunąć nierozpuszczalny materiał przez odwirowanie przy 15 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Odpipetować supernatant zawierający lizat komórkowy do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Wyrzuć granulkę.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie białka w supernatantze za pomocą metody opartej na bicinchoninie (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta. Udana liza 30 000 kłębuszków nerkowych daje ilość białka kłębuszkowego 700-1 000 μg/ml. Dostosuj do równych ilości białka za pomocą buforu do lizy.</li>
	<li>Pobrać podwielokrotność 10% całkowitej objętości lizatu kłębuszkowego i dodać 2x Laemmli + ditiotreithol (DTT) przed inkubacją przez 5 minut w temperaturze 95 °C.</li>
	<li>W przypadku IP inkubować resztę lizatu z kulkami agarozy streptawidyny przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce nad głową.</li>
	<li>Odwirować kulki agarozowe przy 1000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant i dodać 800 μl buforu do lizy w celu przepłukania kulek w celu niespecyficznego wiązania białka.</li>
	<li>Powtórz pranie 3 razy i całkowicie usuń supernatant.</li>
	<li>Dodać 30 μl 2x Laemmli + DTT i inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Załaduj sondy lizatu i IP na 10% żel SDS i uruchom żel SDS przy napięciu 70 V przez 30 minut, a następnie przy 20 mA na żel przez 1,5 godziny. Następnie osuszaj żel przez 2 godziny przy 200 mA na membranie nitrocelulozowej.</li>
	<li>Zablokować błonę nitrocelulozową na noc w temperaturze 4 °C za pomocą 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w buforze do mycia.</li>
	<li>Inkubować błonę z badanym przeciwciałem przez noc w temperaturze 4 °C. Przemywać buforem płuczącym 3 razy przez 5 minut na wytrząsarce i inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym HRP przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Powtórz krok prania.</li>
	<li>Wizualizacja sond lizatu i immunoprecypitacji na membranie za pomocą środka chemiluminescencyjnego o wysokiej rozdzielczości z kamerą CCD.</li>
</ol>

<ol><li>Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+biology+for+the+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Kidney+Disease%22%5BJournal%5D)">Podocyte biology for the bedside.</a> American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).</li>
<li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513(2016).</li>
<li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Arrestin2+mediates+nephrin+endocytosis+and+impairs+slit+diaphragm+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).</li>
<li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC+alpha+mediates+beta-arrestin2-dependent+nephrin+endocytosis+in+hyperglycemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemitry%22%5BJournal%5D)">PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia.</a> Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).</li>
<li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+Trafficking+at+the+Mature+Podocyte+Slit+Diaphragm%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 32(2017).</li>
<li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+trafficking+in+podocyte+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Membrane trafficking in podocyte health and disease.</a> Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).</li>
<li>Soda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+dynamin%2C+synaptojanin%2C+and+endophilin+in+podocyte+foot+processes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).</li>
<li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein--nephrin--is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li>
<li>Martin, C. E., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephrin+Signaling+in+the+Podocyte%3A+An+Updated+View+of+Signal+Regulation+at+the+Slit+Diaphragm+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302(2018).</li>
<li>Nielsen, J. S., McNagny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+podocalyxin+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The role of podocalyxin in health and disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).</li>
<li>Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab27+effector+Slp2-a+transports+the+apical+signaling+molecule+podocalyxin+to+the+apical+surface+of+MDCK+II+cells+and+regulates+claudin-2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).</li>
<li>Tossidou, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytic+PKC-alpha+is+regulated+in+murine+and+human+diabetes+and+mediates+nephrin+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis.</a> Public Library of Science One. 5 (4), 10185(2010).</li>
<li>Qin, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+nephrin+triggers+its+internalization+by+raft-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).</li>
<li>Waters, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+promotes+dynamin-dependent+endocytosis+of+nephrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+tyrosine+kinases+endocytosis+in+endothelium%3A+biology+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).</li>
<li>Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+trafficking+mechanisms+in+endothelial+cells+as+modulators+of+the+tumor+vasculature+and+targets+of+antiangiogenic+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Biochemical+Societies+Journal%22%5BJournal%5D)">Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).</li>
<li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li>
<li>Takemoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+large+scale+isolation+of+kidney+glomeruli+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice.</a> American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+glomeruli+from+mice%3A+A+practical+approach+for+beginners%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Therapeutic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).</li>
<li>Haase, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vivo+method+to+quantify+slit+diaphragm+protein+abundance+in+murine+proteinuric+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease.</a> Public Library of Science One. 12 (6), 0179217(2017).</li>
<li>Satoh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((aPKClambda+maintains+the+integrity+of+the+glomerular+slit+diaphragm+through+trafficking+of+nephrin+to+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface.</a> Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).</li>
<li>Tomas, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin+type-1+domain-containing+7A+in+idiopathic+membranous+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy.</a> New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).</li>
<li>Daniels, G. M., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+labeling+of+neurotransmitter+transporters+at+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface.</a> Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).</li>
<li>Ougaard, M. K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Nephrotoxic+Nephritis+as+a+Model+of+Chronic+Kidney+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease.</a> International Journal of Nephrology. 2018, 8424502(2018).</li>
<li>Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+membranous+glomerulonephritis+in+rats.+Quantitative+studies+of+glomerular+immune+deposit+formation+in+isolated+glomeruli+and+whole+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals.</a> Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiona metoda umożliwia skuteczną izolację kłębuszków nerkowych w celu zbadania kłębuszkowego RNA lub białka. Ponadto z izolowanych kłębuszków nerkowych można przeprowadzić pierwotne hodowle komórek kłębuszków nerkowych. Jeśli biotyna zostanie zastosowana przed izolacją kłębuszków nerkowych, można przeprowadzić znakowanie białek powierzchniowych komórek kłębuszkowych. Dzięki tej metodzie można badać in vivo transport białek powierzchniowych komórek kłębuszków nerkowych i możliwe jest częściowe określenie ...

Białkomocz jest cechą charakterystyczną uszkodzenia kłębuszków nerkowych i zwykle towarzyszy przerwaniu działania filtra kłębuszkowego1. Filtr kłębuszkowy składa się z fenestrowanego śródbłonka, błony podstawnej kłębuszków nerkowych i podocytów. Delikatna struktura molekularna filtra kłębuszkowego jest bardzo dynamiczna i podlega transportowi białek powierzchniowych komórek zarówno w zdrowych, jak i chorych nerkach2,3,4,5,6. Wykazano, że endocytoza białek powierzchniowych komórek jest niezbędna do przetrwania podocytów7. Nefryna i podokaliksyna są białkami transbłonowymi ulegającymi ekspresji na podocytach. Nefryna jest szkieletem membrany szczeliny kłębuszkowej kłębuszkowej, podczas gdy podokaliksyna jest sialoglykoproteiną pokrywającą wtórne procesy stopy podocytów8,9,10. Handel endocytarny został wcześniej pokazany dla nefryny i podokalixin3,11,12,13,14.
Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, endocytoza białek powierzchniowych komórek nie została jeszcze opisana w literaturze w komórkach śródbłonka kłębuszków nerkowych. Jednak komórki śródbłonka na ogół wyrażają wszystkie niezbędne białka dla różnych typów endocytozy (tj. endocytozy zależnej od klatryny, zależnej od tratwy)15,16. W związku z tym transport powierzchniowy komórek śródbłonka może być badany za pomocą tej metody, na przykład kadheryny śródbłonka naczyniowego (VE) i wewnątrzkomórkowej cząsteczki adhezyjnej (ICAM-2) jako białka markerowego powierzchni komórki dla komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych17.
Niestety, nie ma dokładnego modelu in vitro dla delikatnego trójwarstwowego filtra kłębuszkowego, w którym można by badać transport białek na powierzchni komórki. Celem tej metody jest zatem zbadanie transportu białek kłębuszkowych in vivo. Ponadto protokół ten zawiera informacje o tym, jak izolować kłębuszki nerkowe, umożliwiając dalszą analizę kłębuszkowego RNA, białek lub komórek. Podobne techniki izolacji kłębuszków nerkowych zostały opisane przez różne grupy18,19.
Poprzednio, my i inni używaliśmy znakowania ex vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszków nerkowych za pomocą biotynylacji2,3,4,20,21. Jednak w tej metodzie ex vivo izolowane kłębuszki nerkowe były narażone na naprężenia mechaniczne, które mogą wpływać na transport endocytarny. Alternatywnie, znakowanie immunofluorescencyjne białek powierzchniowych komórek kłębuszków nerkowych jest szeroko stosowane w literaturze2,20,22. Jednak dzięki tej metodzie tylko niewielka liczba białek może być analizowana na jednym szkiełku, a kwantyfikacja obrazów immunofluorescencyjnych jest często trudna.
Ta nowatorska metoda in vivo oferuje niezawodne narzędzie do dokładnego badania obfitości białek na powierzchni komórek kłębuszkowych i transportu w zdrowych i chorych nerkach, i może być stosowana jako dodatek do testów immunofluorescencyjnych.

<table><tbody><tr><td>Motic SMZ168 BL</td><td>Mikroskop Motic</td><td>SMZ168BL</td><td>do chirurgii myszy</td></tr><tr><td>KL1500LCD</td><td>Mikroskopia pulchowa i Lorenza</td><td>150500</td><td>światło do chirurgii myszy</td></tr><tr><td>Rompun (Xylazin) 2%</td><td>Bayer</td><td>PZN:01320422</td><td>znieczulenie</td></tr><tr><td>Microfederschere</td><td>Braun, Aesculap</td><td>FD100R</td><td>cienkie nożyczki do cięcia aorty</td></tr><tr><td>Durotip Feine Scheren</td><td>Braun, Aesculap</td><td>BC210R</td><td>do cięcia brzucha</td></tr><tr><td>Anatomische Pinzette</td><td>Braun, Aesculap</td><td>BD215R</td><td>do operacji do momentu otwarcia jamy brzusznej</td></tr><tr><td>Pr&auml; parierklemme</td><td>Aesculap</td><td>BJ008R</td><td>do zabiegów chirurgicznych&nbsp;</td></tr><tr><td>Seraflex</td><td>Serag Wiessner</td><td>IC108000</td><td>nić jedwabna</td></tr><tr><td>Ketamina 10%</td> <td>znieczulenie</td> <td>Medistar</td><td></td></tr><tr><td>Rompun (Xylazin) 2%</td> <td>znieczulenie</td> <td>Bayera</td><td></td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa o drobnym otworze ID 0,28 mm OD 0,61 mm</td><td>Portex</td><td>800/100/100</td><td>Cewnik</td></tr> z <tr><td>polietylenu o drobnym otworze ID 0,58 mm OD 0,96 mm</td><td>Cewnik</td> <td>Portex</td><td>800/100/200</td></tr><tr><td>Aparat Harvard 11 Plus</td><td>Aparat Harvard</td><td>70-2209</td><td>pompa strzykawkowa</td></tr><tr><td>EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotyna</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td>biotyna</td></tr><tr><td>Dynabeads Nietknięte mysie limfocyty T</td><td>Invitrogen</td><td>11413D</td><td>do embolizacji kłębuszków nerkowych</td></tr><tr><td>Kolagenaza A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>do trawienia tkanki nerkowej</td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>123.21D</td><td>Łapacz magnesów</td></tr><tr><td>100&micro; m Barwnik komórek</td><td>Greiner-bio</td><td>542000</td><td>do izolacji kłębuszków nerkowych</td></tr><tr><td>Axiovert 40 CFL</td><td>Zeiss</td><td>niedostępny</td><td>w celu potwierdzenia czystości kłębuszków nerkowych</td></tr><tr><td>TissueRuptor</td><td>Quiagen</td><td>9002755</td><td>Homogenizator tkankowy</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023</td><td>do buforu do lizy</td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td>do buforu do lizy</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR chemicals</td><td>27810295</td><td>do buforu do lizy</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201154</td><td>do buforu do lizy</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>do buforu do lizy</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34369-07-8</td><td>do buforu do lizy</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta</td></tr><tr><td>Przeciwciało nefryny</td><td>Progen</td><td>GP-N2</td><td>dla</td></tr><tr><td>poliklonalnego kozła anty-podokaliksyna przeciwko westernblot</td><td>R& D Systems</td><td>AF15556-SP</td><td>dla żywicy agarozowej westernblot</td></tr><tr><td>Streptawidyna</td><td>Thermo Scientific</td><td>20347</td><td>do immunoprecypitacji</td></tr><tr><td>Sefaroza białka A CL-4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17096303</td><td>do immunoprecypitacji</td></tr><tr><td>poliklonalne królicze przeciwciało anty-p57</td><td>SCBT</td><td>sc-8298</td><td>do immunohistochemii</td></tr><tr><td>mysie monoklonalne przeciwciało anty-beta aktyny, klon AC-74</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2228</td><td>Western blot kontrola ładowania</td></tr><tr><td>królika anty-p44/42</td> sygnalizacja <td>komórkowa</td><td>4695</td><td>dla westernblot</td></tr><tr><td>Pierce Streptavidin-HRP o wysokiej czułości</td><td>Thermo Scientific</td><td>21130</td> dla <td></td></tr><tr><td>poliklonalnego przeciwciała ICAM-2 myszy</td> westernblot <td>R& D Systems</td><td>AF774</td><td>dla</td></tr><tr><td>myszy poliklonalnej westernblot anty-VE-kadheryny</td><td>R& D Systems</td><td>AF1002</td><td>dla westernblot</td></tr></tbody></table>

izolacja kłębuszków nerkowych i znakowanie in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszków nerkowych

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Białkomocz wynika z przerwania filtra kłębuszkowego, który składa się z fenestrowanego śródbłonka, błony podstawnej kłębuszków nerkowych i podocytów z ich szczelinowymi membranami. Delikatna struktura filtra kłębuszkowego, zwłaszcza membrany szczelinowej, opiera się na wzajemnym oddziaływaniu różnych białek powierzchniowych komórek. Badanie tych białek powierzchniowych komórek ograniczało się do tej pory do badań in vitro lub analizy histologicznej. W niniejszej pracy przedstawiono mysią metodę znakowania biotynylacji in vivo, która umożliwia badanie białek powierzchniowych komórek kłębuszkowych w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Protokół ten zawiera informacje o tym, jak perfuzji nerek myszy, izolowania kłębuszków nerkowych i przeprowadzania endogennej immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Częściowa ocena ilościowa liczebności komórek kłębuszków nerkowych jest łatwo dostępna dzięki tej nowatorskiej metodzie, a wszystkie białka dostępne do perfuzji biotyny i immunoprecypitacji mogą być badane. Ponadto izolacja kłębuszków nerkowych z biotynylacją lub bez biotynylacji umożliwia dalszą analizę kłębuszkowego RNA i białka, a także pierwotną hodowlę komórek kłębuszków nerkowych (tj. pierwotną hodowlę komórek podocytów).

Aby dokładnie wyizolować kłębuszki, konieczne jest najpierw przepłukanie nerek mysich roztworem PBSCM. Przepłukanie roztworem PBSCM powoduje pobladnięcie nerek (Rycina 1A). Zablokowanie kłębuszków nerkowych kulkami magnetycznymi będzie widoczne jako brązowe punkty na powierzchni nerek (Rycina 1B). Izolacja kłębuszków z użyciem magnetycznego uchwytu może wykazywać zanieczyszczenie kanalikami nerko...

Tutaj prezentujemy protokół do mysiego znakowania in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszkowych za pomocą biotyny. Protokół ten zawiera informacje o tym, jak perfuzja nerek myszy, izolowanie kłębuszków nerkowych i przeprowadzanie endogennej immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Izolacja kłębuszków nerkowych i znakowanie in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszków nerkowych

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nefrologii dotyczące roli transportu białek powierzchniowych komórek w białkomoczowej, a nie białkomoczowej chorobie nerek. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że ułatwia ona badanie transportu białek powierzchniowych komórek in vivo oraz to, że w jednym eksperymencie można analizować więcej niż jedno białko. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat transportu powierzchni komórek kłębuszkowych, może być również stosowana do innych układów narządów, które są perfundowane i są dostępne za pomocą technik izolacji.Zacznij od potwierdzenia braku reakcji na szczypanie palca u nogi i zdezynfekuj brzuszną stronę znieczulonej myszy za pomocą 70% izopropylu. Wykonaj środkowe przecięcie skóry od miednicy do mostka i za pomocą pęsety usuń skórę z powięzi brzusznej. Przetnij skórę po obu stronach linii środkowej brzucha i wykonaj podłoże przez warstwę mięśni brzucha od pęcherza do mieczykowatej.Użyj nożyczek i kleszczy, aby podzielić mięśnie na cztery ćwiartki I użyj dwóch zacisków chirurgicznych, aby przymocować dwie górne ćwiartki w kierunku szyi zwierząt. Umieść zwierzę pod mikroskopem preparacyjnym i użyj sterylnej zamiany, aby odsunąć na bok narządy trzewne. Za pomocą cienkich nożyczek przetnij więzadło przeponowe wątroby.Za pomocą cienkiej pęsety chirurgicznej umieść jeden szew wokół wątrobowej tętnicy krezkowej tętnic nerkowych. I wokół aorty, proksymalnie do tętnic nerkowych, w nadnerczach. Uwolnij dystalną aortę od powięzi, tłuszczu i innych tkanek.Następnie zaciśnij żyłę główną i aortę na wysokości rozwidlenia i umieść kolejny szew wokół aorty dystalnej tętnic nerkowych. Za pomocą pęsety zaciśnij proksymalny szew aorty, osłabiając przepływ krwi i wytnij mały otwór o połowie średnicy aorty w aorcie, dystalnie do tętnic nerkowych. Wprowadzić do aorty 10-centymetrowy cewnik przymocowany do 10-mililitrowej strzykawki zawierającej pięć mililitrów lodowatego PBS oraz wapnia i magnezu.I zamocuj cewnik za pomocą przygotowanych ligatur. Następnie rozpocznij perfuzję nerek z szybkością przepływu dwóch mililitrów na minutę. Za pomocą cienkich nożyczek wyciąć otwór w żyle nerkowej w tętnicach nerkowych i zacisnąć szew wokół tętnic wątrobowych i krezkowych.Po dostarczeniu całej objętości PBS zastąp perfuzat pięcioma mililitrami lodowatego PBS oraz wapnia i magnezu uzupełnionymi 0,5 miligrama na mililitr biotyny w celu etykietowania powierzchni. Kontynuuj perfuzję nerek z szybkością przepływu dwóch mililitrów na minutę. Po dostarczeniu całej objętości podłączyć do cewnika strzykawkę zawierającą pięć mililitrów lodowatego PBS oraz wapń i magnez uzupełnionych 100-milimolową glicyną.Ugasić kłębuszki nerkowe wszystkimi pięcioma mililitrami roztworu glicyny przy natężeniu przepływu dwóch mililitrów na minutę. Następnie przeprowadź perfuzję nerek pięcioma mililitrami lodowatego PBS oraz wapnia i magnezu uzupełnionymi 200 mikrolitrami kulek magnetycznych na mililitr przy natężeniu przepływu dwóch mililitrów na minutę. Embolizacja kłębuszków nerkowych za pomocą brązowych kulek magnetycznych będzie widoczna na powierzchni nerki.Kiedy wszystkie koraliki zostaną dostarczone, usuń torebkę nerki i zbierz nerki z wnęki. Umieść nerki w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej zawierającym 15 mililitrów PBS oraz wapń i magnez. Użyj nowego obosiecznego ostrza, aby pociąć nerki na najmniejsze możliwe kawałki.Przenieś tkankę do dwumililitrowej probówki zawierającej jeden mililitr kolagenazy A przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie mieszając roztwór tkankowy przed i po trawieniu za pomocą zmodyfikowanej końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów. Pod koniec inkubacji przefiltrować strawioną tkankę przez sitko do komórek o wielkości 100 mikronów. Użyj skrobaka do komórek i lodowatego PBS oraz wapnia i magnezu, aby przetrzeć pozostałą tkankę przez sitko komórkowe.Doprowadzić końcową objętość zawiesiny jednokomórkowej nerki do 50 mililitrów za pomocą świeżego, lodowatego PBS oraz wapnia i magnezu i zebrać komórki nerki przez odwirowanie. Usuń supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad z nieco mniej niż 1,5 mililitra lodowatego PBS oraz wapnia i magnezu podczas wirowania i przenieś zawiesinę kłębuszkową do nowej dwumililitrowej probówki. Aby umyć kłębuszki nerkowe, umieść rurkę w magnesie, aby zagregować kłębuszki.Po jednej minucie użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby usunąć supernatant. I wyjmij rurkę z magnesu. Dodaj jeden mililitr PBS oraz wapń i magnez do tkanek.Jednorazowo pipetować kłębuszki nerkowe w górę i w dół i wirować komórki. Umieść rurkę z powrotem na magnesie i ponownie umyj kłębuszki nerkowe, jak właśnie pokazano. Dopóki czystość próbki nie osiągnie co najmniej 90% za pomocą analizy mikroskopem świetlnym w powiększeniu od 40 do 100 razy.Następnie zbierz oczyszczone kłębuszki magnetyczne przez odwirowanie. Aby osiągnąć czystość większą niż 95%, kłębuszki nerkowe musiały zostać dokładnie umyte, jak wykazano. Perfuzja biotyny ułatwia znakowanie pętli naczyń włosowatych w biotynie, ale nie kontrolowanych perfundowanych nerkach myszy.Precypitacja immunologiczna frakcji biotyny ekstraktów kłębuszkowych ujawnia, że białka transbłonowe kłębuszków nerkowych nefryna i podokaliksyna są immunoprecypitowane biotyną, ale nie frakcją kontrolną. Barwienie frakcji immunoprecypitowanej streptawidyną dodatkowo potwierdza obecność nefryny obciążonej biotyną w zwierzętach perfundowanych biotyną, ale nie kontrolnych. Białko śródbłonka, kadheryna śródbłonka naczyniowego i wewnątrzkomórkowa cząsteczka adhezyjna dwie są również immunoprecypitowane we frakcji biotyny.We wczesnej fazie nefrotoksycznego zapalenia nerek u zwierząt z nefrotoksycznym zapaleniem nerek obserwuje się zmniejszoną ekspresję nefryny na powierzchni komórek w porównaniu z grupą kontrolną. Rzeczywiście, analiza densytometyczna wykazuje znaczne zmniejszenie nefryny obciążonej biotyną u zwierząt z nefrotoksycznym zapaleniem nerek w porównaniu z osobami kontrolującymi. Analiza ilościowa całkowitego stosunku nefryny do aktyny nie wykazuje istotnych różnic między myszami z kontrolnym i nefrotoksycznym zapaleniem nerek.Ponadto równe ilości podocytów obserwuje się u zwierząt z nefrotoksycznym zapaleniem nerek i kontrolnych. W późnym nefrotoksycznym zapaleniu nerek nefrotoksyczne zwierzęta nefrytyczne wykazują odzyskanie ekspresji nefryny bez istotnych różnic w powierzchni komórek mierzonej między myszami nefrytycznymi z grupy kontrolnej i nefrotoksycznej oraz ogólnej całkowitej redukcji nefryny u zwierząt nefrotoksycznych. Co więcej, liczba podocytów jest zmniejszona w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby strzykawki nie pozostawiały pęcherzyków powietrza podczas ich podłączania, aby uniknąć zatorowości powietrznej kłębuszków nerkowych i pracować w lodowatych warunkach po rozpoczęciu perfuzji nerek. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak izolacja RNA kłębuszków nerkowych i białka, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące ekspresji białka lub interakcji w zdrowych i chorych nerkach.

isolation-glomeruli-vivo-labeling-glomerular-cell-surface

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje metodę izolowania nienaruszonych kłębuszków nerkowych od nerek myszy. Otrzymane w ten sposób kapsułkowane i zdecapsulowane kłębuszki nerkowe mogą być dalej wykorzystywane do hodowli komórek nabłonka ciemieniowego z mysiej nerki.

Izolacja kłębuszków nerkowych: technika uzyskiwania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z mysiej nerki

Ten film demonstruje metodę izolowania komórek glejowych jelit od błony podśluzowej i blaszki właściwej jelita myszy. Przedstawiono w nim etapy ekstrakcji tkanki podśluzówkowej i blaszki właściwej, izolowania z nich komórek glejowych jelitowych i hodowli komórek na powlekanej płytce studzienkowej w celu ustanowienia hodowli komórek glejowych jelitowych.

Izolowanie komórek glejowych jelitowych z błony podśluzowej i blaszki właściwej myszy

Opisujemy metodę znakowania białka na powierzchni żywych neuronów za pomocą specyficznego poliklonalnego przeciwciała przeciwko epitopom zewnątrzkomórkowym. Białko związane przez przeciwciało na powierzchni komórki, a następnie internalizowane przez endocytozę, można odróżnić od białka pozostającego na powierzchni lub transportowanego na powierzchnię podczas inkubacji.

Znakowanie różnicowe białek powierzchniowych i zinternalizowanych po karmieniu przeciwciałami żywych hodowanych neuronów

Metoda postembed immunogold jest jednym z najskuteczniejszych sposobów dostarczania wysokorozdzielczych analiz subkomórkowej lokalizacji określonych molekuł. Tutaj opisujemy protokół ilościowej analizy receptorów glutaminianu w synapsach wstęgowych siatkówki.

Ilościowa analiza immunozłota o wysokiej rozdzielczości receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki

Tutaj opisujemy izolację komórek glejowych jelitowych z błony podśluzowej jelita za pomocą sekwencyjnych inkubacji EDTA do chelatowania kationów dwuwartościowych, a następnie inkubacji w nieenzymatycznym roztworze do odzyskiwania komórek. Posiewanie powstałej zawiesiny komórkowej na poli-D-lizynie i lamininie daje w wyniku wysoce wzbogaconą hodowlę komórek glejowych podśluzówkowych do analizy funkcjonalnej.

Izolacja komórek glejowych jelitowych z błony podśluzowej i blaszki właściwej dorosłej myszy

Ten protokół opisuje pełne badanie nerek, które powinno być przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

Głównym celem tego protokołu jest efektywne izolowanie żywotnych pierwotnych kultur kłębuszków nerkowych z minimalnymi zanieczyszczeniami do wykorzystania w różnych dalszych zastosowaniach. Wyizolowane kłębuszki nerkowe zachowują relacje strukturalne między typami komórek składowych i mogą być hodowane ex vivo przez krótki czas.

Skuteczna metoda przesiewania w celu odizolowania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z nerki dorosłego szczura

Ten protokół opisuje metodę cryoAPEX, w której białko błonowe oznaczone znacznikiem APEX2 może być zlokalizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w optymalnie zachowanej ultrastrukturze komórki.

Metoda CryoAPEX do analizy mikroskopii elektronowej lokalizacji białek błonowych w komórkach zachowanych ultrastrukturalnie

Artykuł opisuje metodę izolowania warunkowo unieśmiertelnionych komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych z nerek transgenicznych myszy wykazujących ekspresję termolabilnego wirusa małp 40 i fotoaktywowalnych mitochondriów,PhAM wyciętych. Opisujemy procedurę izolacji kłębuszków nerkowych z całych nerek za pomocą kulek, etapów trawienia, wysiewu i hodowli GECs-CD31 dodatnich.

Izolacja warunkowo unieśmiertelnionych komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych myszy z fluorescencyjnymi mitochondriami

To badanie przedstawia łatwy w użyciu, kompletny i prosty zestaw metod do oznaczania i analizowania kłębuszków nerkowych z mysich nerek oczyszczonych metodą CUBIC. Dane, takie jak liczba i objętość kłębuszków nerkowych, można łatwo i niezawodnie uzyskać za pomocą dekstranu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-Dextran, mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych (LSFM) lub popularnej mikroskopii konfokalnej i oprogramowania, takiego jak Imaris.

Wydajna i szybka metoda etykietowania i analizy kłębuszków mysich

Ten protokół opisuje szczegółowe etapy wstępnego wdrażania mikroskopii immunoelektronowej, skupiając się na badaniu obwodów synaptycznych i lokalizacji białek w siatkówce.

Badanie obwodów siatkówki i lokalizacji molekularnej poprzez wstępne osadzenie mikroskopii immunoelektronowej

Naucz się izolacji kłębuszków nerkowych i znakowania białek powierzchniowych in vivo u myszy za pomocą biotyny. Ta metoda umożliwia analizę wielu białek jednocześnie w badaniach nefrologicznych.

Izolacja kłębuszków nerkowych i znakowanie in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszków nerkowych

Przeglądaj więcej filmów