Izolacja kłębuszków nerkowych i znakowanie in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszków nerkowych
January 18th, 2019
Tutaj prezentujemy protokół do mysiego znakowania in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszkowych za pomocą biotyny. Protokół ten zawiera informacje o tym, jak perfuzja nerek myszy, izolowanie kłębuszków nerkowych i przeprowadzanie endogennej immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nefrologii dotyczące roli transportu białek powierzchniowych komórek w białkomoczowej, a nie białkomoczowej chorobie nerek. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że ułatwia ona badanie transportu białek powierzchniowych komórek in vivo oraz to, że w jednym eksperymencie można analizować więcej niż jedno białko. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat transportu powierzchni komórek kłębuszkowych, może być również stosowana do innych układów narządów, które są perfundowane i są dostępne za pomocą technik izolacji.
Zacznij od potwierdzenia braku reakcji na szczypanie palca u nogi i zdezynfekuj brzuszną stronę znieczulonej myszy za pomocą 70% izopropylu. Wykonaj środkowe przecięcie skóry od miednicy do mostka i za pomocą pęsety usuń skórę z powięzi brzusznej. Przetnij skórę po obu stronach linii środkowej brzucha i wykonaj podłoże przez warstwę mięśni brzucha od pęcherza do mieczykowatej.
Użyj nożyczek i kleszczy, aby podzielić mięśnie na cztery ćwiartki I użyj dwóch zacisków chirurgicznych, aby przymocować dwie górne ćwiartki w kierunku szyi zwierząt. Umieść zwierzę pod mikroskopem preparacyjnym i użyj sterylnej zamiany, aby odsunąć na bok narządy trzewne. Za pomocą cienkich nożyczek przetnij więzadło przeponowe wątroby.
Za pomocą cienkiej pęsety chirurgicznej umieść jeden szew wokół wątrobowej tętnicy krezkowej tętnic nerkowych. I wokół aorty, proksymalnie do tętnic nerkowych, w nadnerczach. Uwolnij dystalną aortę od powięzi, tłuszczu i innych tkanek.
Następnie zaciśnij żyłę główną i aortę na wysokości rozwidlenia i umieść kolejny szew wokół aorty dystalnej tętnic nerkowych. Za pomocą pęsety zaciśnij proksymalny szew aorty, osłabiając przepływ krwi i wytnij mały otwór o połowie średnicy aorty w aorcie, dystalnie do tętnic nerkowych. Wprowadzić do aorty 10-centymetrowy cewnik przymocowany do 10-mililitrowej strzykawki zawierającej pięć mililitrów lodowatego PBS oraz wapnia i magnezu.
I zamocuj cewnik za pomocą przygotowanych ligatur. Następnie rozpocznij perfuzję nerek z szybkością przepływu dwóch mililitrów na minutę. Za pomocą cienkich nożyczek wyciąć otwór w żyle nerkowej w tętnicach nerkowych i zacisnąć szew wokół tętnic wątrobowych i krezkowych.
Po dostarczeniu całej objętości PBS zastąp perfuzat pięcioma mililitrami lodowatego PBS oraz wapnia i magnezu uzupełnionymi 0,5 miligrama na mililitr biotyny w celu etykietowania powierzchni. Kontynuuj perfuzję nerek z szybkością przepływu dwóch mililitrów na minutę. Po dostarczeniu całej objętości podłączyć do cewnika strzykawkę zawierającą pięć mililitrów lodowatego PBS oraz wapń i magnez uzupełnionych 100-milimolową glicyną.
Ugasić kłębuszki nerkowe wszystkimi pięcioma mililitrami roztworu glicyny przy natężeniu przepływu dwóch mililitrów na minutę. Następnie przeprowadź perfuzję nerek pięcioma mililitrami lodowatego PBS oraz wapnia i magnezu uzupełnionymi 200 mikrolitrami kulek magnetycznych na mililitr przy natężeniu przepływu dwóch mililitrów na minutę. Embolizacja kłębuszków nerkowych za pomocą brązowych kulek magnetycznych będzie widoczna na powierzchni nerki.
Kiedy wszystkie koraliki zostaną dostarczone, usuń torebkę nerki i zbierz nerki z wnęki. Umieść nerki w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej zawierającym 15 mililitrów PBS oraz wapń i magnez. Użyj nowego obosiecznego ostrza, aby pociąć nerki na najmniejsze możliwe kawałki.
Przenieś tkankę do dwumililitrowej probówki zawierającej jeden mililitr kolagenazy A przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie mieszając roztwór tkankowy przed i po trawieniu za pomocą zmodyfikowanej końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów. Pod koniec inkubacji przefiltrować strawioną tkankę przez sitko do komórek o wielkości 100 mikronów. Użyj skrobaka do komórek i lodowatego PBS oraz wapnia i magnezu, aby przetrzeć pozostałą tkankę przez sitko komórkowe.
Doprowadzić końcową objętość zawiesiny jednokomórkowej nerki do 50 mililitrów za pomocą świeżego, lodowatego PBS oraz wapnia i magnezu i zebrać komórki nerki przez odwirowanie. Usuń supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad z nieco mniej niż 1,5 mililitra lodowatego PBS oraz wapnia i magnezu podczas wirowania i przenieś zawiesinę kłębuszkową do nowej dwumililitrowej probówki. Aby umyć kłębuszki nerkowe, umieść rurkę w magnesie, aby zagregować kłębuszki.
Po jednej minucie użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby usunąć supernatant. I wyjmij rurkę z magnesu. Dodaj jeden mililitr PBS oraz wapń i magnez do tkanek.
Jednorazowo pipetować kłębuszki nerkowe w górę i w dół i wirować komórki. Umieść rurkę z powrotem na magnesie i ponownie umyj kłębuszki nerkowe, jak właśnie pokazano. Dopóki czystość próbki nie osiągnie co najmniej 90% za pomocą analizy mikroskopem świetlnym w powiększeniu od 40 do 100 razy.
Następnie zbierz oczyszczone kłębuszki magnetyczne przez odwirowanie. Aby osiągnąć czystość większą niż 95%, kłębuszki nerkowe musiały zostać dokładnie umyte, jak wykazano. Perfuzja biotyny ułatwia znakowanie pętli naczyń włosowatych w biotynie, ale nie kontrolowanych perfundowanych nerkach myszy.
Precypitacja immunologiczna frakcji biotyny ekstraktów kłębuszkowych ujawnia, że białka transbłonowe kłębuszków nerkowych nefryna i podokaliksyna są immunoprecypitowane biotyną, ale nie frakcją kontrolną. Barwienie frakcji immunoprecypitowanej streptawidyną dodatkowo potwierdza obecność nefryny obciążonej biotyną w zwierzętach perfundowanych biotyną, ale nie kontrolnych. Białko śródbłonka, kadheryna śródbłonka naczyniowego i wewnątrzkomórkowa cząsteczka adhezyjna dwie są również immunoprecypitowane we frakcji biotyny.
We wczesnej fazie nefrotoksycznego zapalenia nerek u zwierząt z nefrotoksycznym zapaleniem nerek obserwuje się zmniejszoną ekspresję nefryny na powierzchni komórek w porównaniu z grupą kontrolną. Rzeczywiście, analiza densytometyczna wykazuje znaczne zmniejszenie nefryny obciążonej biotyną u zwierząt z nefrotoksycznym zapaleniem nerek w porównaniu z osobami kontrolującymi. Analiza ilościowa całkowitego stosunku nefryny do aktyny nie wykazuje istotnych różnic między myszami z kontrolnym i nefrotoksycznym zapaleniem nerek.
Ponadto równe ilości podocytów obserwuje się u zwierząt z nefrotoksycznym zapaleniem nerek i kontrolnych. W późnym nefrotoksycznym zapaleniu nerek nefrotoksyczne zwierzęta nefrytyczne wykazują odzyskanie ekspresji nefryny bez istotnych różnic w powierzchni komórek mierzonej między myszami nefrytycznymi z grupy kontrolnej i nefrotoksycznej oraz ogólnej całkowitej redukcji nefryny u zwierząt nefrotoksycznych. Co więcej, liczba podocytów jest zmniejszona w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby strzykawki nie pozostawiały pęcherzyków powietrza podczas ich podłączania, aby uniknąć zatorowości powietrznej kłębuszków nerkowych i pracować w lodowatych warunkach po rozpoczęciu perfuzji nerek. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak izolacja RNA kłębuszków nerkowych i białka, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące ekspresji białka lub interakcji w zdrowych i chorych nerkach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół in vivo znakowania białek na powierzchni komórek kłębuszków nerkowych u myszy za pomocą biotyny. Opisuje kroki dotyczące perfuzji nerek mysich, izolowaniu kłębuszków i przeprowadzaniu immunoprecypitacji.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Nefologia
- Biologia komórki
- Transport białek
Tło
- Rozumienie transportu białek na powierzchni komórek jest kluczowe w badaniach nad chorobami nerek.
- Ta metoda może być stosowana do różnych układów narządów.
- Pozwola na analizę wielu białek w jednym eksperymencie.
- Badania in vivo zapewniają wgląd, który nie jest możliwy z metodami in vitro.
Cel badania
- Zbadać rolę transportu białek na powierzchni komórek w chorobach nerek.
- Opracować wiarygodny protokół badania białek kłębuszkowych.
- Zwiększyć zrozumienie warunków nerek białkomoczowych i niebiałkomoczowych.
Stosowane metody
- Perfuzja nerek mysich za pomocą biotyny.
- Izolowanie kłębuszków z nerek.
- Endogenous immunoprecypitacja białek docelowych.
- Potwierdzenie znieczulenia i przygotowanie chirurgiczne myszy.
Główne wyniki
- Protokół z powodzeniem oznakowuje białka na powierzchni komórek kłębuszkowych.
- Możliwa jest analiza wielu białek jednocześnie.
- Uzyskano wgląd w mechanizmy transportu białek.
- Metoda jest przystosowana do zastosowania w innych układach narządów.
Wnioski
- Ten protokół jest cennym narzędziem w badaniach nefrologicznych.
- Zapewnia ramy dla badania transportu białek in vivo.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć jego zastosowanie na inne choroby.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Studying glomerular cell surface protein trafficking in vivo provides mechanistic insights into kidney disease pathogenesis, supporting target validation in nephrology. This method enables semi-quantitative analysis of surface protein abundance under physiologic and pathophysiologic conditions, enhancing predictive confidence in preclinical models. It facilitates biomarker discovery and pathway clarification relevant to proteinuric disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking cell surface protein dynamics in intact glomeruli.
- Operational Value: Supports functional target validation through direct observation of nephrin and podocalyxin trafficking in disease models.
- Predictive Value: Provides quantitative readouts for assessing target engagement and pathway modulation in vivo.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates purified glomerular fractions suitable for downstream immunoprecipitation and protein interaction analysis.
- Reproducibility: Standardized perfusion and magnetic bead isolation yield consistent glomerular preparations across experiments.
- Multiplex Capability: Allows simultaneous analysis of multiple surface proteins per experiment, increasing screening efficiency.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Captures dynamic changes in nephrin expression during early and late phases of nephrotoxic nephritis.
- Translational Continuity: Links in vivo protein trafficking observations to podocyte loss and disease progression.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed protein changes reflect surface trafficking versus total expression shifts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation by providing functional, in vivo data on glomerular protein behavior.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on protein trafficking mechanisms in kidney disease models.
- Screening: Delivers quantitative, biotin-dependent immunoprecipitation outputs for comparing protein surface exposure.
- Analytics: Enables semi-quantitation of glomerular cell surface abundance via streptavidin-based detection.
- Translational Research: Connects surface protein dynamics to histologic and functional outcomes in nephritis models.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other perfused organ systems, supporting cross-indication target validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing surface trafficking from total protein expression changes.
- Operational Value: Standardized perfusion and isolation workflows improve reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing target accessibility and modulation in physiologic contexts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on in vivo surface protein behavior.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgery, vascular perfusion, and tissue dissection under sterile conditions.
- Dependent on perfusion equipment, magnetic separation tools, and immunoprecipitation reagents.
- Necessitates standardization of biotin perfusion timing, flow rate, and quenching steps for consistent labeling.
- Adaptation to other organ systems requires validation of accessibility and perfusion efficiency.
- Practical limitations include tissue fragility during digestion and the need for high-purity glomerular isolation (>95%) for reliable downstream analysis.
