Name: Kwantyfikacja aktywności hipopigmentacyjnej in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Poznaj metody kwantyfikacji aktywności hipopigmentacyjnej in vitro z wykorzystaniem melanocytów B16-F10. Techniki te umożliwiają szybką ocenę związków przeciwmelanogennych w badaniach kosmetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Koreański Instytut Planowania i Oceny Technologii w Żywności, Rolnictwie i Leśnictwie (IPET) poprzez Program Rozwoju Technologii Agro-Bioprzemysłu, finansowany przez Ministerstwo Rolnictwa, Żywności i Spraw Wiejskich (MAFRA) (116159-02-2-WT011) oraz Szkołę Nauk Przyrodniczych i Biotechnologii dla BK21 PLUS, Korea University.

1. Przygotowanie pożywki, związków i odczynników
<ol>
	<li>Przygotować kompletne podłoże do wzrostu B16F10. Uzupełnij zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (PEST).
	<ol>
		<li>Aby uzyskać 500 ml kompletnej pożywki, wymieszaj 445 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 50 ml FBS i 5 ml PEST w wysterylizowanej szklanej butelce o pojemności 1 l. Po delikatnym wymieszaniu przefiltrować pożywkę przez filtr butelkowy 0,2 μm do nowej wysterylizowanej szklanej butelki, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Wszystkie techniki hodowli komórkowych powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego z zachowaniem techniki aseptycznej, aby zapewnić sterylność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor do lizy: 20 mM Tris (hydroksymetylo)aminometan zawierający 0,1% buforu Triton X-100 (v/v) o pH 7,5 (pH skorygowane HCl). Ten bufor może być używany przez 3 miesiące, jeśli jest przechowywany w temperaturze pokojowej (RT). Dodaj inhibitory proteazy do buforu do lizy tuż przed użyciem.</li>
	<li>Przygotować bufor do oznaczania inhibitorów tyrozynazy. Przygotować roztwory podstawowe 1 M NaH2PO4 (monozasadowe) i 1 M Na2HPO4 (dwuzasadowe). Zmieszać 46,3 ml Na2HPO4 i 53,7 ml NaH2PO4, aby przygotować końcową objętość 0,1 M buforu fosforanu sodu (pH 6,8).
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć otrzymaną mieszaninę do 1 l (objętość końcowa) za pomocąH2O. Dostosować pH roztworu końcowego do 6,8. Bufor ten może być używany przez 1 miesiąc przy przechowywaniu w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór substratu tyrozynazy: 0,1% 3,4-dihydroksy-L-fenyloalaniny (DOPA, w/v) rozpuszczony w buforze do oznaczania inhibitorów tyrozynazy (patrz krok 1.3). 
	UWAGA: Podczas użytkowania przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Opcjonalnie przygotuj 100 j./ml tyrozynazy grzybowej. Rozpuść liofilizowaną tyrozynazę grzybową w buforze do oznaczania inhibitorów tyrozynazy. Roztwór ten może być stosowany przez 2 miesiące przy przechowywaniu w temperaturze –20 °C. Aktywność tyrozynazy grzybów, jak również aktywność tyrozynazy komórkowej oblicza się w obecności materiałów komórkowych. 
	UWAGA: Roztwór podaje się na porcje przed zamrożeniem, dzięki czemu można uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. Podczas używania roztwór należy przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Przygotować 1 N roztwór NaOH. Odważyć 4 g NaOH w kolbie miarowej i rozpuścić w wodzie destylowanej do uzyskania 100 ml.</li>
	<li>Przygotować roztwór utrwalający (10% formalina). Rozcieńczyć 27 ml 37% formaldehydu w 73 ml wody destylowanej. Codziennie przygotowuj świeże.</li>
	<li>Przygotować amoniakalny roztwór podstawowy srebra. Przygotować 5 ml 10% roztworu azotanu srebra w kolbie miarowej. Dodawać kroplami roztwór wodorotlenku amonu, aż osad całkowicie się rozpuści. Dodać 200 μl roztworu azotanu srebra (10%). Roztwór stanie się lekko mętny. 
	UWAGA: Unikać kontaktu i wdychania. Użyj dygestorium.</li>
	<li>Przygotować roztwór roboczy srebra amoniakalnego. Rozcieńczyć 2,5 ml amoniakalnego roztworu podstawowego srebra w 7,5 ml wody destylowanej. Użyj raz, a następnie wyrzuć. 
	UWAGA: Unikać kontaktu i wdychania. Użyj dygestorium.</li>
	<li>Przygotować 0,1% chlorku złota. Przygotować 1 ml 10% chlorku złota i dodać 99 ml wody destylowanej do kolby miarowej. Codziennie przygotowuj świeże.</li>
	<li>Przygotować bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS). Dodać 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 i 0,24 g KH2PO4 w 800 ml wody destylowanej. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą HCl. Rozcieńczyć powstałą mieszaninę do 1 l (objętość końcowa) wodą destylowaną.</li>
	<li>Przygotować 5% (w/v) roztwór tiosiarczanu sodu rozpuszczony w wodzie destylowanej.</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa i leczenie
<ol>
	<li>Użyj dostępnych na rynku komórek B16F10. Utrzymuj komórki B16F10 w kompletnym podłożu. Kolbę do hodowli komórkowych przechowywać w nawilżonym inkubatorze z atmosferą 5%CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotować badane związki, inhibitory kontroli dodatniej i próbki kontroli ujemnej.
	<ol>
		<li>Rozpuścić badane związki w odpowiednich rozpuszczalnikach. Rozpuść związki rozpuszczalne w wodzie w wodzie podwójnie destylowanej. Związki nierozpuszczalne w wodzie rozpuścić w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, np. DMSO.</li>
		<li>W tym przypadku należy użyć arbutyny rozpuszczonej w wodzie podwójnie destylowanej (125 μg/ml) jako kontroli pozytywnej w celu oceny aktywności hipopigmentacyjnej w porównaniu ze związkami testowymi lub kontrolą ujemną. Jako kontrolę ujemną (kontrola poddana działaniu nośnika) należy użyć roztworów lub stosowanych w badanej próbce, np. wody podwójnie destylowanej, DMSO, etanolu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiew i leczenie komórek
	<ol>
		<li>Nasiona komórek B16F10 w wieku 5 × 104 komórek/basenik na 24-dołkowych płytkach hodowlanych przy użyciu kompletnej pożywki i inkubować w inkubatorze CO2 przez 24 godziny. Po inkubacji odessać całe podłoże.</li>
		<li>Inkubować komórki z pożywką DMEM (bez FBS i 1% penicyliny/streptomycyny) zawierającej badane związki, kontrolę inhibitora lub kontrolę ujemną w inkubatorze CO2 przez 72 godziny. Sprawdzaj komórki co 24 godziny pod mikroskopem. Po tym kroku przejdź do kroków 3-5, aby uzyskać dalsze eksperymenty. 
		UWAGA: Mieszaninę substancji badanej i pożywki DMEM należy przefiltrować przez filtr 0,2 μm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pomiar aktywności tyrozynazy komórkowej
<ol>
	<li>Stosując metodę opisaną w kroku 2, usunąć pożywkę i dwukrotnie przepłukać komórki 300 μl zimnego PBS.</li>
	<li>Umieść płytkę z kulturą komórkową na lodzie. Dodać 300 μl buforu do lizy i inkubować przez 5 minut. Następnie zebrać lizat komórkowy za pomocą skrobaka do komórek i przenieść lizat komórkowy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Homogenizować lizat komórkowy za pomocą homogenizatora komórkowego z prędkością 14 500 obr./min przez 2 s, 3 razy na lodzie, aby uzyskać wewnątrzkomórkową tyrozynazę. Stosować optymalne warunki specyficzne dla homogenizatora.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut w temperaturze 12 000 × g w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Przechowywać na lodzie podczas użytkowania.</li>
	<li>Przenieść 70 μl supernatantu na 96-dołkową przezroczystą mikropłytkę polistyrenową.</li>
	<li>Dodać 140 μl roztworu zawierającego substrat tyrozynazy (DOPA) do 96-dołkowej przezroczystej mikropłytki polistyrenowej z mikropłytki, delikatnie wstrząsnąć i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Opcjonalnie dodać 70 μl 100 U/ml roztworu tyrozynazy grzybowej do każdego dołka i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zmierzyć aktywność tyrozynazy przy długości fali 475 nm za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
	<li>Znormalizować aktywność tyrozynazy do stężenia białka w każdej próbce. Zmierzyć stężenie białka w każdej próbce za pomocą testu Bradforda.</li>
</ol>
4. Pomiar zawartości melaniny
<ol>
	<li>Stosując metodę opisaną w Kroku 2, usunąć pożywkę i dwukrotnie przepłukać komórki 300 μl zimnego PBS. </li>
	<li>Umieść płytkę z kulturą komórkową na lodzie. Dodać 300 μl buforu do lizy i inkubować przez 5 minut. Następnie zebrać lizat komórkowy za pomocą skrobaka do komórek i przenieść lizat komórkowy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut w temperaturze 12 000 × g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki i zmierzyć całkowite stężenie białka w celu normalizacji. Zmierzyć stężenie białka w każdej próbce za pomocą testu Bradforda.</li>
	<li>Dodać 300 μl 1 N NaOH do każdego osadu i inkubować w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Odwirować rozpuszczony roztwór przez 10 minut w temperaturze 12 000 × g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść 200 μl supernatantu na 96-dołkową mikropłytkę.</li>
	<li>Zmierz zawartość melaniny przy długości fali 400 nm.</li>
	<li>Znormalizuj zawartość melaniny do stężenia białka.</li>
</ol>
5. Barwienie Fontany-Massona
<ol>
	<li>Barwienie Fontany-Massona
	<ol>
		<li>Umyj komórki dwukrotnie 300 μl zimnego PBS.</li>
		<li>Do każdej studzienki dodać 200 μl 10% formaliny i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Spłucz wodą destylowaną.</li>
		<li>Dodać 200 μl wstępnie podgrzanego roztworu roboczego srebra amoniakalnego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C lub do momentu, gdy komórki staną się koloru żółto-brązowego. 
		UWAGA: Umieść świeżo zmieszany roztwór roboczy srebra amoniakalnego w łaźni wodnej o temperaturze 58–60°C i odczekaj odpowiedni czas, aby temperatura się wyrównała.</li>
		<li>Usuń roztwór roboczy srebra amoniakalnego i spłucz wodą destylowaną.</li>
		<li>Usuń wodę destylowaną. Dodać 200 μl 0,1% chlorku złota i inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usuń 0,1% roztwór chlorku złota i spłucz wodą destylowaną.</li>
		<li>Usuń wodę destylowaną. Dodać 200 μl roztworu tiosiarczanu sodu (5% m/v) i inkubować przez 2 min.</li>
		<li>Usunąć roztwór tiosiarczanu sodu i spłukać wodą destylowaną.</li>
		<li>Usuń wodę destylowaną. Dodać 200 μl Nuclear Fast Red i inkubować przez 5 minut.</li>
		<li>Usuń Nuclear Fast Red i spłucz wodą z kranu.</li>
		<li>Usuń wodę z kranu i obserwuj poplamione komórki pod mikroskopem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie Fontany-Massona (analiza progowa przy użyciu ImageJ) 
	Uwaga: Przykładowa procedura analizy obrazu przy użyciu oprogramowania ImageJ znajduje się w materiałach uzupełniających.
	<ol>
		<li>Otwórz program ImageJ.</li>
		<li>Wybierz punkt menu Plik | Otwórz | Obraz mikroskopowy.</li>
		<li>Wybierz punkt menu Obraz | Dostosuj | Próg koloru.</li>
		<li>Aby zmierzyć obszar zabarwiony za pomocą Fontany-Massona, ustaw pasek parametrów jasności na zero i dostosuj pasek jasności, aby znaleźć punkt, w którym uwzględnione są wszystkie zabarwione komórki (czarne lub ciemnobrązowe).</li>
		<li>Wybierz pozycję Analizuj | Analizuj cząstki. Zaznacz pole podsumowania w oknie analizy cząstek i naciśnij OK. Uzyskaj wynik podsumowania i wklej go do arkusza kalkulacyjnego. 
		Uwaga: Opis wynikowych parametrów pudełka jest następujący: 
		Plasterek: nazwa każdego obrazu 
		Liczba: Liczba barwionych komórek 
		Obszar całkowity: Całkowity obszar zliczanych komórek 
		Średnia wielkość: Całkowita powierzchnia/liczba 
		% powierzchni: obszar poplamiony/całkowita powierzchnia × 100%; Całkowita powierzchnia jest obliczana automatycznie.</li>
		<li>Oblicz względny obszar zabarwiony melaniną, używając wartości Całkowita powierzchnia. 
		Względny obszar zabarwiony melaniną (%) = wartość całkowitej powierzchni komórkowej badanej próbki/średnia całkowita powierzchnia kontrolna × 100, tj.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+controlling+the+migration+of+melanocytes+and+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells.</a> Pigment Cell & Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).</li>
<li>Brenner, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protective+role+of+melanin+against+UV+damage+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">The protective role of melanin against UV damage in human skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).</li>
<li>Galvan, I., Solano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanin+chemistry+and+the+ecology+of+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Biochemical+Zoology%22%5BJournal%5D)">Melanin chemistry and the ecology of stress.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).</li>
<li>Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+whitening+cosmetics%3A+Feedback+and+challenges+in+the+development+of+natural+skin+lighteners%5BTitle%5D)+AND+%22Cosmetics%22%5BJournal%5D)">Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners.</a> Cosmetics. 3 (4), 36(2016).</li>
<li>Cooksey, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+the+indirect+formation+of+the+catecholic+intermediate+substrate+responsible+for+the+autoactivation+kinetics+of+tyrosinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).</li>
<li>Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+identify+inhibitors+of+melanin+biosynthesis+via+the+quality+control+of+tyrosinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).</li>
<li>Gillbro, J. M., Olsson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+melanogenesis+and+mechanisms+of+skin-lightening+agents+-+existing+and+new+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cosmetic+Science%22%5BJournal%5D)">The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches.</a> International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).</li>
<li>Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+in+the+study+of+human+skin+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes.</a> Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Momilactione+B+inhibits+protein+kinase+A+signaling+and+reduces+tyrosinase-related+proteins+1+and+2+expression+in+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes.</a> Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).</li>
<li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+inhibitions+of+lemon+balm+%28Melissa+officinalis%29+ethanolic+extract+on+melanogenesis+in+B16-F1+murine+melanocytes%3A+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+its+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression.</a> Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).</li>
<li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p-Coumaric+acid+inhibition+of+CREB+phosphorylation+reduces+cellular+melanogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Food+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis.</a> European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).</li>
<li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+inhibition+of+%CE%B3-oryzanol+on+cellular+melanogenesis%3A+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+reduction+of+melanogenic+gene+expression+by+a+protein+kinase+a-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Natural+Products%22%5BJournal%5D)">Dual inhibition of γ-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism.</a> Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).</li>
<li>Choi, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+isoflavone+puerarin+and+its+glycosides+on+melanogenesis+in+B16+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Food+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes.</a> European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).</li>
<li>Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaine+reduces+cellular+melanin+content+via+suppression+of+microphthalmia-associated+transcription+factor+in+B16-F1+murine+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes.</a> Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).</li>
<li>Overwijk, W. W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B16+as+a+mouse+model+for+human+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B16 as a mouse model for human melanoma.</a> Current Protocols in Immunology. , CHAPTER 20, Unit 20.1 (2001).</li>
<li>Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+protocol+for+assessing+regulators+of+pigmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation.</a> Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).</li>
<li>D'Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+in+melanogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways in melanogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144(2016).</li>
<li>Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+and+transcriptional+regulation+in+the+neural+crest-derived+melanocyte+lineage%3A+interactions+between+KIT+and+MITF%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF.</a> Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).</li>
<li>Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-MSH+and+melanogenesis+in+normal+human+adult+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">α-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).</li>
<li>Hu, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+evaluation+of+melanin+content+and+production+of+pigment+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).</li>
<li>Carriel, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+histochemical+method+for+a+simultaneous+staining+of+melanin+and+collagen+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do przekazania.

Przedstawiono protokoły oceny aktywności hipopigmentacyjnej badanych związków z wykorzystaniem hodowanych melanocytów. Reprezentatywne wyniki wykazały hipopigmentacyjne działanie arbutyny, inhibitora tyrozynazy, który hamował aktywność tyrozynazy i zawartość melaniny komórkowej. Metody te są szeroko stosowane w badaniach nad aktywnością antymelanogenną. Korzystając z tych testów, udało nam się również zidentyfikować kilka związków bioaktywnych, które mają działanie hamujące melanogenezę na komórki B16F10 w ciągu ostatnie...

Melanina odgrywa kluczową rolę w fizjologii, patologii i toksykologii kilku organów, w tym skóry, oczu i mózgu1. Główne funkcje melaniny to badania przesiewowe i efekty biochemiczne. Melanina pochłania światło bliskiej podczerwieni i widzialne, a także promieniowanie ultrafioletowe (UV), ze zwiększonymi szybkościami absorpcji przy krótszych falach światła; w ten sposób melanina chroni tkanki przed uszkodzeniami spowodowanymi przez światło widzialne lub promieniowanie UV2. Melanina jest przeciwutleniaczem i ma powinowactwo do metali i innych toksycznych chemikaliów; Dlatego może chronić tkanki przed stresem oksydacyjnym i chemicznym<klasa SUP="xref">3. Jednak nadmierna produkcja melaniny powoduje problemy dermatologiczne.
Ilość i jakość melaniny w skórze i tęczówce są najważniejszymi determinantami koloru tęczówki i skóry. Osoby mogą mieć różne preferencje dotyczące koloru skóry; Niektórzy faworyzują opaloną skórę, podczas gdy inni preferują jaśniejsze kolory skóry. W zależności od tych profili konsumenckich, kosmetyki hipopigmentacyjne zostały opracowane tak, aby zaspokoić potrzeby poszczególnych rynków dla preferowanych kolorów skóry4. W związku z tym badania nad hipopigmentacją i aktywnością antymelanogenną są ważne zarówno z naukowego, jak i praktycznego punktu widzenia.
Melanogeneza to złożony proces biosyntezy melaniny poprzez szereg enzymatycznych i spontanicznych reakcji chemicznych w melanocytach. Jeden melanocyt jest otoczony przez około 36 keratynocytów, a melanocyty są fabrykami syntezy melaniny, które rozprowadzają swój produkt do sąsiednich keratynocytów. W skórze melanina wytwarzana i przechowywana w melanosomalnym przedziale melanocytów jest transportowana do sąsiednich keratynocytów w naskórku za pośrednictwem dendrytów.
L-tyrozyna służy jako początkowy substrat do melanogenezy, a enzym tyrozynaza katalizuje dwie następujące po sobie reakcje, które przekształcają L-tyrozynę w 3,4-dihydroksyfenyloalaninę (DOPA), a następnie w dopachinon. Reakcje te są etapem ograniczającym szybkość melanogenezy5,6. W związku z tym aktywność hipopigmentacyjną można najpierw zmierzyć, oceniając bezpośrednio aktywność tyrozynazy komórkowej. W tym celu ekstrakty melanocytów zawierające tyrozynazę inkubuje się z DOPA, a dopachinon wytwarzany w próbkach można zmierzyć za pomocą spektrofotometrii przy długości fali 475 nm. Wartości są normalizowane przez stężenia białek w próbkach, a substancje o aktywności hipopigmentacyjnej powodują mniejsze tworzenie dopachinonu w porównaniu z kontrolami.
Po drugie, aktywność hipopigmentacji można określić ilościowo, mierząc bezpośrednio melaninę w hodowanych melanocytach. Po poddaniu komórek działaniu badanego materiału, melanina jest ekstrahowana w warunkach zasadowych, a zawartość melaniny jest oznaczana ilościowo za pomocą spektrofotometrii przy długości fali 400 nm. Środek hipopigmentacyjny spowoduje niższą zawartość melaniny niż kontrola7.
Na koniec, aktywność hipopigmentacji może być określona ilościowo przez barwienie melaniny Fontana-Masson i późniejszą analizę obrazu. W barwieniu Fontany-Massona granulki melaniny redukują azotan amoniaku i srebra do widocznego czarnego metalicznego stanu, a czarne obszary komórek na obrazach mikroskopowych reprezentują ilość melaniny.
Środek hipopigmentacyjny zwykle daje spójne i porównywalne wyniki z tymi trzema metodami, co potwierdza, że aktywność substancji jest prawidłowa. Alternatywnie, użyteczne może być zmierzenie ekspresji kluczowych genów i białek w melanogenezie w odpowiedzi na substancję badaną w celu zbadania aktywności hipopigmentacji. Oprócz tyrozynazy, białka związane z tyrozynazą (TRP-1) i tautomerazy dopachromowej (TRP-2) są kluczowymi enzymami w melanogenezie8. Czynnik transkrypcyjny związany z mikroftalmią (MITF) jest głównym regulatorem melanogenezy, a kwantyfikacja poziomów ekspresji jego genu / białka lub test aktywności promotora może być również wykorzystany do oceny aktywności hipopigmentacji.

<table><tbody><tr><td>3,4-Dihydroksy-l-fenyloalanina</td><td>Sigma</td><td>D9628</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku amonu</td><td>Sigma</td><td>#320145</td><td></td></tr><tr><td>Arbutyna</td><td>Fluka</td><td>#10960</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DMEM HyClone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Yakuri Pure Chemicals</td><td>#16223</td><td>37%</td></tr><tr><td>Chlorek złota</td><td>American MasterTech</td><td>AHG0226</td><td>0,10%</td></tr> <tr><td>HCl</td><td>Samchun chemiczny</td><td>H0255</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Bio basic Canada Inc.</td><td>PB0440</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>#60218</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>J.T.Baker</td><td>#3817-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Duksan czyste chemikalia</td><td>#81</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>655104</td><td></td></tr><tr><td>Jądrowa szybka czerwień</td><td>Merck</td><td>100121</td><td>Jądrowa szybka czerwień 0,1% w 5% aluminium siarczan.</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny i streptomycyny</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Azotan srebra</td><td>Duksan Pure Chemicals</td><td>#900</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)</td><td>J.T. Baker</td><td>#3817-01</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy (Na2HPO4)</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Tiosiarczan sodu pentahydrat</td><td>Duksan Pure Chemicals</td><td>#2163</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan</td><td>Bio Basic Canada</td><td>TB0196</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Union Carbide</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tyrozynaza z grzyba</td><td>Sigma</td><td>T3824</td><td>25 KU</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja aktywności hipopigmentacyjnej in vitro

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

To badanie przedstawia metody laboratoryjne do ilościowego oznaczania aktywności hipopigmentacji in vitro. Melanina, główny barwnik w melanocytach, jest syntetyzowany w odpowiedzi na wiele czynników komórkowych i środowiskowych. Melanina chroni komórki skóry przed uszkodzeniem przez promieniowanie ultrafioletowe, ale pełni również funkcje biofizyczne i biochemiczne. Nadmierna produkcja lub nagromadzenie melaniny w melanocytach może powodować problemy dermatologiczne, takie jak piegi, ciemne plamy, melasma i pieprzyki. Dlatego kontrola melanogenezy za pomocą środków hipopigmentacyjnych jest ważna u osób z potrzebami klinicznymi lub kosmetycznymi. Melanina jest syntetyzowana przede wszystkim w melanosomach melanocytów w złożonym procesie biochemicznym zwanym melanogenezą, na który wpływają czynniki zewnętrzne i wewnętrzne, takie jak hormony, stan zapalny, wiek i ekspozycja na światło ultrafioletowe. Opisujemy trzy metody określania aktywności hipopigmentacyjnej substancji chemicznych lub naturalnych w melanocytach: pomiar 1) aktywności tyrozynazy komórkowej i 2) zawartości melaniny oraz 3) barwienie i ilościowe określanie melaniny komórkowej za pomocą analizy obrazu.
W melanogenezie, tyrozynaza katalizuje etap ograniczający szybkość, który przekształca L-tyrozynę w 3,4-dihydroksyfenyloalaninę (L-DOPA), a następnie w dopachinon. Dlatego hamowanie tyrozynazy jest pierwotnym mechanizmem hipopigmentacji. W hodowanych melanocytach aktywność tyrozynazy można określić ilościowo, dodając L-DOPA jako substrat i mierząc produkcję dopachinonu za pomocą spektrofotometrii. Melanogenezę można również zmierzyć, określając ilościowo zawartość melaniny. Frakcja komórkowa zawierająca melaninę jest ekstrahowana za pomocą NaOH, a melanina jest oznaczana ilościowo spektrofotometrycznie. Wreszcie, zawartość melaniny można określić ilościowo za pomocą analizy obrazu po barwieniu melaniny metodą Fontany-Massona. Chociaż wyniki tych testów in vitro nie zawsze mogą być odtworzone w ludzkiej skórze, metody te są szeroko stosowane w badaniach nad melanogenezą, zwłaszcza jako pierwszy krok do zidentyfikowania potencjalnej aktywności hipopigmentacyjnej. Metody te można również wykorzystać do oceny aktywności, wzrostu i różnicowania melanocytów. Spójne wyniki przy użyciu trzech różnych metod zapewniają ważność efektów.

Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki aktywności hipopigmentacyjnej arbutyny, związku anty-melanogennego, w melanocytach B16F10. Rysunek 1A pokazuje, że arbutyna znacząco zahamowała komórkową aktywność tyrozynazy w porównaniu z kontrolą traktowaną nośnikiem. Podobnie, zawartość melaniny w komórkach stymulowanych arbutyną była znacząco zmniejszona w porównaniu z grupami kontrolnymi (Rysunek 1B). Obrazy mikroskopowe komórek ...

Opisujemy trzy eksperymentalne metody oceny hipopigmentacyjnej aktywności substancji chemicznych in vitro: kwantyfikacja 1) komórkowej aktywności tyrozynazy i 2) zawartości melaniny, oraz 3) pomiar melaniny za pomocą barwienia melaniny komórkowej i analizy obrazu.

Kwantyfikacja aktywności hipopigmentacyjnej in vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Metoda ta może być pomocna w opracowywaniu kosmetyków funkcjonalnych i środków do pielęgnacji skóry o działaniu antymelanogennym. Jest po to, aby wykonać, a wynik można uzyskać szybko. Ponadto metoda ta może być przydatna dla badaczy, którzy chcą zidentyfikować lub zbadać efekty lub związki lub zbadać działanie antymelanogenne lub promelanogenne.Aby zmierzyć aktywność tyrozynazy, zacznij od wysiewu melanicydów B16-F10 w ilości pięć razy 10 do czwartej komórki na studzienkę o stężeniu płytki 24-dołkowej w kompletnym podłożu przez 24 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego dnia zastąpić supernatant w każdej studzience DMEM uzupełnionym świeżo przygotowanym związkiem testowym i inhibitorem kontrolnym lub kontrolą ujemną i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na kolejne 72 godziny. Pod koniec zabiegu przepłucz studzienki dwa razy 300 mikrolitrami zimnych pbs na studzienkę i umieść płytkę na lodzie.Następnie dodaj 300 mikrolitrów buforu do lizy do każdej studzienki za pomocą skrobaka do komórek, aby zebrać lizaty komórkowe po pięciu minutach. Przenieś powstałe zawiesiny cząstek komórek do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek. I homogenizować lizaty trzy razy przez dwie sekundy przy 14 500 obr./min na lodzie, aby uwolnić międzykomórkową tyrozynazę.Osadzaj resztki komórek przez odwirowanie i przenieś supernatanty do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych na lodzie. Przydzielić 70 mikrolitrów każdego supernatantu do indywidualnych studzienek przezroczystej 96-dołkowej mikropłytki polistyrenowej i dodać 140 mikrolitrów roztworu substratu tyrozynazy do każdej studzienki supernatantu. Delikatnie potrząsaj talerzem, aby dobrze wymieszać zawartość.Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. I zmierz aktywność tyrozynazy na 475 nanometrach na czytniku mikropłytek. Pomiar zawartości melaniny w komórkach po zebraniu lizatu z leczonych komórek, jak pokazano.Zebrać lizaty przez odwirowanie i przenieść supernatanty do nowych probówek. Dodaj 300 mikrolitrów jednego normalnego wodorotlenku sodu do każdej osadki na jedną godzinę inkubacji w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Następnie następuje odwirowanie rozpuszczonych zawiesin komórkowych.Następnie przenieś 200 mikrolitrów supernatantów do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce. I zmierz zawartość melaniny na czytniku mikropłytek o długości fali 400 nanometrów. W przypadku barwienia Fontana-Masson umyj leczone komórki dwukrotnie 300 mikrolitrami zimnego pbs i utrwal komórki 200 mikrolitrami 10% formaliny przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Opłucz grube komórki wodą destylowaną i dodaj 200 mikrolitrów roztworu roboczego srebra amoniakalnego o temperaturze od 58 do 68 stopni Celsjusza do każdej studzienki. Przez godzinę inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub do momentu, gdy komórki staną się koloru żółto-brązowego. Przepłukać poplamione komórki wodą destylowaną, a następnie przeprowadzić dwuminutową inkubację w 0,1% chlorku złota w temperaturze pokojowej.Przepłucz komórki poddane działaniu chlorku złota wodą destylowaną i dodaj do komórek 200 mikrolitrów roztworu tiosiarczanu sodu. Po dwóch minutach ponownie spłucz komórki. I oznacz komórki 200 mikrolitrami szybkiej czerwieni jądrowej na studzienkę przez pięć minut.Następnie umyj wybarwione komórki wodą z kranu przed obrazowaniem pod mikroskopem świetlnym. Aby przeprowadzić analizę progową, otwórz obrazy na obrazie J i wybierz obraz, regulację i Próg koloru. Aby zmierzyć obszar zabarwiony farbą Fontana Masson, ustaw pasek parametrów jasności na zero i dostosuj jasność do punktu, w którym uwzględnione są wszystkie czarne lub brązowe zabarwione komórki.Wybierz opcję Analizuj i analizuj cząstki i zaznacz pole podsumowania w oknie Analizuj cząstki, a następnie kliknij przycisk OK, aby uzyskać podsumowanie wyników oraz skopiować i wkleić dane do arkusza kalkulacyjnego. Leczenie arbutyną znacząco hamuje komórkową aktywność tyrozynazy w porównaniu z komórkami kontrolnymi leczonymi nośnikiem. Podobnie zawartość melaniny w komórkach stymulowanych arbutyną jest znacznie zmniejszona w porównaniu z kontrolą.Chociaż komórki są morfologicznie podobne między grupami leczonymi, arbutyna zmniejsza obszar czarnego pigmentu w porównaniu z komórkami kontrolnymi traktowanymi. Ta metoda jest przydatna do badań przesiewowych działań przy użyciu naszej biblioteki złożonej. Istnieje ponad setki próbek do szybkiego przetestowania.Co więcej, metoda ta może być również wykorzystana do zbadania mechanizmu zachodzącego w melanogenezie. Po zidentyfikowaniu bioaktywnych kandydatów na związki, w celu ich świadectwa do badania mechanizmów biologicznych lub zastosowań komercyjnych.

quantification-of-hypopigmentation-activity-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano metodę pomiaru markerów biochemicznych hipoksji i niedokrwienia u noworodków. Podejście to wykorzystuje wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) oraz chromatografię gazową sprzężoną ze spektrometrią mas (GC/MS).

Biochemiczny pomiar hipoksji noworodkowej

Terapia fotodynamiczna (PDT) jest nieinwazyjną i niechirurgiczną metodą leczenia raka płuc. Fotouczulacze selektywnie kumulują się w tkance nowotworowej i prowadzą do śmierci komórek nowotworowych w obecności tlenu i odpowiedniej długości fali światła. W tym filmie z protokołem metoda oparta na PDT jest stosowana do oceny potencjału fototoksycznego potencjalnego fotosensybilizatora w komórkach raka płuc.

Test fototoksyczności in vitro: metoda oparta na PDT do oceny potencjału fototoksycznego fotosensybilizatora w komórkach raka płuc

Ten film opisuje metodę pomiaru wrażliwości na promieniowanie UV w humanizowanym modelu myszy - modelu myszy, który naśladuje ludzką skórę. Określamy minimalną dawkę rumieniową (MED) promieniowania UV, które może powodować rumień lub obrzęk skóry. Metoda może pomóc w ustaleniu skuteczności leków stosowanych w celu zmniejszenia wrażliwości na promieniowanie UV.

Test minimalnej dawki rumieniowej: metoda pomiaru wrażliwości na promieniowanie UV w modelach mysich

Melanina naskórkowa jest indukowana przez miejscowe stosowanie forskoliny w mysim modelu człowieka o jasnej karnacji, wrażliwego na promieniowanie UV.    Farmakologiczna manipulacja poziomami cAMP w skórze i ciemnienie naskórka silnie chronią przed stanem zapalnym o podłożu UV (oparzenia słoneczne), mierzonym za pomocą testu minimalnej dawki rumieniowej (MED).

Farmakologiczna indukcja melaniny naskórka i ochrona przed oparzeniami słonecznymi w humanizowanym modelu myszy

Ten artykuł informuje, że dodanie Y-27632 do podłoża TIVA może znacznie zwiększyć wydajność melanocytów z tkanek skóry dorosłych.

Y-27632 Wzbogaca wydajność ludzkich melanocytów z tkanek skóry dorosłych

Ten protokół przedstawia zestaw eksperymentów przyjętych do oceny fotoprzełączalnych peptydów przeciwnowotworowych, które mogą być użyte w przedklinicznych badaniach przesiewowych takich związków. Obejmuje to ocenę cytotoksyczności w hodowlach komórkowych 2D i 3D, ocenę skuteczności fotoizomeryzacji ex vivo (tkanki modelowej) oraz skuteczności in vivo.

Ocena in vitro i in vivo fotokontrolowanych związków biologicznie czynnych - potencjalni kandydaci na leki w fotofarmakologii nowotworów

Ten protokół opisuje model akumulacji lipofuscyny w wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych kulturach ludzkiego nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) oraz ulepszony test fagocytozy zewnętrznego segmentu (OS) w celu wykrycia całkowitej zdolności ZORE/degradacji OS. Metody te przezwyciężają ograniczenia poprzednich modeli lipofuscyny i klasycznych testów fagocytozy zewnętrznego segmentu z pościgiem impulsowym.

Ulepszone modele lipofuscyny i kwantyfikacja zdolności fagocytozy segmentu zewnętrznego w wysoce spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki

Choroby zwyrodnieniowe oczu, które wpływają na warstwę nabłonka barwnikowego siatkówki, mają pochodzenie monogenowe i poligenowe. Opracowano kilka modeli chorób i aplikację LipidUNet w celu badania mechanizmów choroby, a także potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Oparta na uczeniu maszynowym metoda charakterystyki i kwantyfikacji złogów lipidowych LipidUNet przy użyciu nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPSC

To badanie opisuje techniki biofizyczne, biochemiczne i molekularne do scharakteryzowania aktywności opiekuńczej Escherichia coli HdeB w warunkach kwaśnego pH. Metody te zostały z powodzeniem zastosowane do innych opiekuńczych chroniących przed kwasami, takich jak HdeA, i mogą być modyfikowane tak, aby działały w przypadku innych białek opiekuńczych i warunków stresu.

Wykrywanie zależnej od pH aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro i In Vivo

Tutaj prezentujemy metodę bezpośredniego pomiaru poziomów ładowania transferowego RNA z oczyszczonego RNA Escherichia coli, a także sposób porównywania względnych poziomów transferowego RNA, lub dowolnego innego krótkiego RNA, w różnych próbkach na podstawie dodania komórek impulsowych wyrażających gen odniesienia.

Kwantyfikacja liczebności i poziomów naładowania transferowych RNA w Escherichia coli

Poznaj metody kwantyfikacji aktywności hipopigmentacyjnej in vitro z wykorzystaniem melanocytów B16-F10. Techniki te umożliwiają szybką ocenę związków przeciwmelanogennych w badaniach kosmetycznych.

Kwantyfikacja aktywności hipopigmentacyjnej in vitro

Przeglądaj więcej filmów