Kwantyfikacja aktywności hipopigmentacyjnej in vitro

Opisujemy trzy eksperymentalne metody oceny hipopigmentacyjnej aktywności substancji chemicznych in vitro: kwantyfikacja 1) komórkowej aktywności tyrozynazy i 2) zawartości melaniny, oraz 3) pomiar melaniny za pomocą barwienia melaniny komórkowej i analizy obrazu.

Metoda ta może być pomocna w opracowywaniu kosmetyków funkcjonalnych i środków do pielęgnacji skóry o działaniu antymelanogennym. Jest po to, aby wykonać, a wynik można uzyskać szybko. Ponadto metoda ta może być przydatna dla badaczy, którzy chcą zidentyfikować lub zbadać efekty lub związki lub zbadać działanie antymelanogenne lub promelanogenne.

Aby zmierzyć aktywność tyrozynazy, zacznij od wysiewu melanicydów B16-F10 w ilości pięć razy 10 do czwartej komórki na studzienkę o stężeniu płytki 24-dołkowej w kompletnym podłożu przez 24 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego dnia zastąpić supernatant w każdej studzience DMEM uzupełnionym świeżo przygotowanym związkiem testowym i inhibitorem kontrolnym lub kontrolą ujemną i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na kolejne 72 godziny. Pod koniec zabiegu przepłucz studzienki dwa razy 300 mikrolitrami zimnych pbs na studzienkę i umieść płytkę na lodzie.

Następnie dodaj 300 mikrolitrów buforu do lizy do każdej studzienki za pomocą skrobaka do komórek, aby zebrać lizaty komórkowe po pięciu minutach. Przenieś powstałe zawiesiny cząstek komórek do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek. I homogenizować lizaty trzy razy przez dwie sekundy przy 14 500 obr./min na lodzie, aby uwolnić międzykomórkową tyrozynazę.

Osadzaj resztki komórek przez odwirowanie i przenieś supernatanty do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych na lodzie. Przydzielić 70 mikrolitrów każdego supernatantu do indywidualnych studzienek przezroczystej 96-dołkowej mikropłytki polistyrenowej i dodać 140 mikrolitrów roztworu substratu tyrozynazy do każdej studzienki supernatantu. Delikatnie potrząsaj talerzem, aby dobrze wymieszać zawartość.

Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. I zmierz aktywność tyrozynazy na 475 nanometrach na czytniku mikropłytek. Pomiar zawartości melaniny w komórkach po zebraniu lizatu z leczonych komórek, jak pokazano.

Zebrać lizaty przez odwirowanie i przenieść supernatanty do nowych probówek. Dodaj 300 mikrolitrów jednego normalnego wodorotlenku sodu do każdej osadki na jedną godzinę inkubacji w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Następnie następuje odwirowanie rozpuszczonych zawiesin komórkowych.

Następnie przenieś 200 mikrolitrów supernatantów do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce. I zmierz zawartość melaniny na czytniku mikropłytek o długości fali 400 nanometrów. W przypadku barwienia Fontana-Masson umyj leczone komórki dwukrotnie 300 mikrolitrami zimnego pbs i utrwal komórki 200 mikrolitrami 10% formaliny przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Opłucz grube komórki wodą destylowaną i dodaj 200 mikrolitrów roztworu roboczego srebra amoniakalnego o temperaturze od 58 do 68 stopni Celsjusza do każdej studzienki. Przez godzinę inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub do momentu, gdy komórki staną się koloru żółto-brązowego. Przepłukać poplamione komórki wodą destylowaną, a następnie przeprowadzić dwuminutową inkubację w 0,1% chlorku złota w temperaturze pokojowej.

Przepłucz komórki poddane działaniu chlorku złota wodą destylowaną i dodaj do komórek 200 mikrolitrów roztworu tiosiarczanu sodu. Po dwóch minutach ponownie spłucz komórki. I oznacz komórki 200 mikrolitrami szybkiej czerwieni jądrowej na studzienkę przez pięć minut.

Następnie umyj wybarwione komórki wodą z kranu przed obrazowaniem pod mikroskopem świetlnym. Aby przeprowadzić analizę progową, otwórz obrazy na obrazie J i wybierz obraz, regulację i Próg koloru. Aby zmierzyć obszar zabarwiony farbą Fontana Masson, ustaw pasek parametrów jasności na zero i dostosuj jasność do punktu, w którym uwzględnione są wszystkie czarne lub brązowe zabarwione komórki.

Wybierz opcję Analizuj i analizuj cząstki i zaznacz pole podsumowania w oknie Analizuj cząstki, a następnie kliknij przycisk OK, aby uzyskać podsumowanie wyników oraz skopiować i wkleić dane do arkusza kalkulacyjnego. Leczenie arbutyną znacząco hamuje komórkową aktywność tyrozynazy w porównaniu z komórkami kontrolnymi leczonymi nośnikiem. Podobnie zawartość melaniny w komórkach stymulowanych arbutyną jest znacznie zmniejszona w porównaniu z kontrolą.

Chociaż komórki są morfologicznie podobne między grupami leczonymi, arbutyna zmniejsza obszar czarnego pigmentu w porównaniu z komórkami kontrolnymi traktowanymi. Ta metoda jest przydatna do badań przesiewowych działań przy użyciu naszej biblioteki złożonej. Istnieje ponad setki próbek do szybkiego przetestowania.

Co więcej, metoda ta może być również wykorzystana do zbadania mechanizmu zachodzącego w melanogenezie. Po zidentyfikowaniu bioaktywnych kandydatów na związki, w celu ich świadectwa do badania mechanizmów biologicznych lub zastosowań komercyjnych.