Name: Ulepszone modele lipofuscyny i kwantyfikacja zdolności fagocytozy segmentu zewnętrznego w wysoce spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Poznaj nowe modele lipofuscyny i metodę kwantyfikacji fagocytozy w dojrzałych kulturach nabłonka barwnikowego siatkówki. Technika ta pozwala badać toksyczność lipofuscyny i jej wpływ na fizjologię RPE.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest częściowo wspierana przez granty z Fundacji Chirurgii Witreo-Siatkówki (VRSF), Fight for Sight (FFS) i Międzynarodowej Fundacji Badań nad Siatkówką (IRRF). J.M.L.M. jest obecnie wspierany przez grant K08 z National Eye Institute (EY033420). Na badania nad HFT nie wykorzystano żadnych funduszy federalnych. Dalsze wsparcie pochodzi od James Grosfeld Initiative for Dry AMD oraz następujących prywatnych darczyńców: Barbara Dunn oraz Dee & Dickson Brown.

Quantifying Retinal Pigment Epithelial Phagocytosis and Lipofuscin Accumulation

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż lipofuscyna RPE jest badana od dziesięcioleci, jej toksyczność jest przedmiotem dyskusji 2,9,16,42. Biorąc pod uwagę niejasności co do toksyczności lipofuscyny z modeli zwierzęcych11, modele in vitro z wykorzystaniem ludzkiego RPE są cenne. Opisano szereg modeli akumulacji lipofuscyny in vitro, ale w żadnym z nich nie wykorzystano zarówno karmie...

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) zapewnia krytyczne wsparcie dla leżących nad nimi fotoreceptorów, w tym codzienne pobieranie i degradację zewnętrznych końcówek lub fragmentów segmentów fotoreceptorów (w całym tym protokole skrót OS oznacza końcówki lub fragmenty OS, a nie całe zewnętrzne segmenty). Ten codzienny wychwyt postmitotycznego RPE ostatecznie przeciąża zdolność fagolizosomalną i prowadzi do gromadzenia się niestrawnego, autofluorescencyjnego materiału wewnątrzkomórkowego, zwanego lipofuscyną. Co ciekawe, kilka badań wykazało również, że lipofuscyna RPE może kumulować się bez fagocytozy OS1,2. Lipofuscyna ma wiele składników, w tym usieciowane addukty pochodzące z retinoidów cyklu wzrokowego i może zajmować prawie 20% objętości komórek RPE u osób w wieku powyżej 80 lat3.
To, czy lipofuscyna jest toksyczna, było przedmiotem gorących dyskusji. Choroba Stargardta jest autosomalnym recesywnym zwyrodnieniem fotoreceptorów i RPE, w którym mutacja w ABCA4 wyzwala nieprawidłowe przetwarzanie retinoidów cyklu wzrokowego zawartych w zewnętrznych segmentach fotoreceptorów. Niewłaściwe przetwarzanie retinoidów prowadzi do nieprawidłowego sieciowania i powstawania gatunków bis-retinoidów, w tym bis-retinoidu N-retinyliden-N-retinyloetanoloaminy (A2E). Badania wykazały wiele mechanizmów toksyczności A2E4,5. Lipofuscyna przyczynia się do sygnałów autofluorescencji dna oka podczas obrazowania klinicznego, a zarówno pacjenci Stargardta, jak i modele zwierzęce wykazują zwiększoną autofluorescencję dna oka przed zwyrodnieniem siatkówki, co sugeruje korelację między poziomem lipofuscyny a toksycznością6,7. Jednak z wiekiem lipofuscyna gromadzi się u wszystkich ludzi, nie wywołując zwyrodnienia RPE. Co więcej, w zwyrodnieniu plamki żółtej związanym z wiekiem (AMD), gdzie zwyrodnienie RPE występuje tylko u pacjentów w podeszłym wieku, osoby z wczesnymi i pośrednimi postaciami choroby mają mniej sygnałów autofluorescencji dna oka niż niechorzy ludzie w tym samym wieku8. Te wyniki kliniczne zostały zweryfikowane również na poziomie histologicznym9,10.
Modele zwierzęce akumulacji lipofuscyny RPE również pozostawiły pewne niejasności co do toksyczności lipofuscyny. Mysz z nokautem ABCA4 nie wyświetla zwyrodnienia siatkówki na pigmentowanym tle, podczas gdy na tle albinosów lub pod wpływem niebieskiego światła11,12. Co więcej, toksyczność lipofuscyny pochodzącej z nokautu ABCA4 prawdopodobnie różni się od wolniej kumulującej się lipofuscyny, która występuje wraz z naturalnym starzeniem się, jak widać w AMD13.
Modele in vitro akumulacji lipofuscyny stanowią alternatywę dla badania wpływu akumulacji lipofuscyny na zdrowie RPE. Takie modele pozwalają na manipulowanie składnikami lipofuscyny, od karmienia pojedynczymi składnikami retinoidu po karmienie OS, i umożliwiają badanie na ludziach, a nie zwierzętach. W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano wiele metod modelowania lipofuscyny RPE w hodowli. Wraz z innymi grupami, grupa dr Boultona karmiła bydlęcy OS codziennie przez okres do trzech miesięcy na przejściu od 4 do 7 ludzkich pierwotnych komórek RPE od dawców w wieku od 4 do 85 lat14. Alternatywnie, hamowanie autofagii doprowadziło również do akumulacji lipofuscyny w przejściach od 3 do 7 pierwotnych ludzkich kultur RPE15. Jednak subletalne hamowanie lizosomów w wysoce zróżnicowanych, pasażowych 1, pierwotnych ludzkich prenatalnych hodowlach RPE (hfRPE) nie indukowało lipofuscyny, nawet przy wielokrotnym dodawaniu OS codziennie16.
Jako bardziej redukcjonistyczne podejście, inni wprowadzili do hodowli pojedyncze składniki lipofuscyny, zwłaszcza bis-retinoid A2E4,17. Takie badania są cenne, ponieważ definiują potencjalne bezpośrednie mechanizmy toksyczności dla poszczególnych składników lipofuscyny, implikując na przykład homeostazę cholesterolu lizosomalnego i ceramidów18. W tym samym czasie toczy się debata na temat toksyczności A2E19, a podawanie go bezpośrednio do komórek omija typową ścieżkę akumulacji lipofuscyny, która obejmuje fagocytozę fotoreceptora OS. Próbując dostarczyć wszystkie składniki lipofuscyny do kultur RPE, Boulton i Marshall oczyścili lipofuscynę z ludzkich oczu i podali ją do przejścia od 4 do 7 ludzkich pierwotnych kultur RPE pochodzących zarówno od płodów, jak i starszych dawców ludzkich20. Chociaż metoda ta jest innowacyjna, stanowi ograniczone źródło lipofuscyny do powtarzanych eksperymentów.
Podczas gdy wielokrotne karmienie OS do kultur RPE wytwarza lipofuscynę w wielu systemach, nie udaje się to w wysoce zróżnicowanych pierwotnych kulturach RPE16. Fotoutleniający OS indukuje reakcje sieciowania, takie jak tworzenie bis-retinoidów, które naturalnie zachodzi podczas tworzenia lipofuscyny in vivo. Może to przyspieszyć tworzenie się granulek podobnych do lipofuscyny w systemach hodowli RPE, nawet tych, które są wysoce zróżnicowane i odporne na akumulację lipofuscyny16. Tutaj wprowadzono metodę indukowania akumulacji granulek podobnych do lipofuscyny w wysoce zróżnicowanych hfRPE i ludzkim iPSC-RPE, zmodyfikowaną w stosunku do opublikowanego protokołu Wihlmarka21. Zaletą tej metody jest indukowanie granulek podobnych do lipofuscyny wykorzystujących to samo źródło (fotoreceptor OS) i szlak (wychwyt fagolizosomalnego systemu operacyjnego), co ma to miejsce w przypadku lipofuscynogenezy in vivo. Co więcej, odbywa się to na ludzkich kulturach RPE, które są wysoce zróżnicowane i potwierdzone w wielu badaniach w celu replikacji ludzkiego RPE in vivo22,23,24. Te granulki podobne do lipofuscyny są określane jako niestrawny materiał autofluorescencyjny (UAM) i dostarczają danych i dyskusji w tym protokole porównując UAM z lipofuscyną in vivo. Wraz z metodami budowania i oceny kultur obciążonych UAM w wysoce zróżnicowanych ludzkich RPE, wprowadzono również zaktualizowaną metodę oceny fagocytozy RPE OS. Wprowadzono wiele doskonałych metod pościgu za pulsem do ilościowego określania fagocytozy OS, w tym Western blot, immunocytochemię i FACS25,26,27. Jednak na wczesnym etapie pogoni za impulsem systemu operacyjnego warunki, które prowadzą do słabego wychwytu systemu operacyjnego, można połączyć z warunkami, które sprzyjają szybkiej degradacji zinternalizowanego systemu operacyjnego. Przedstawiona tutaj metoda mierzy całkowitą ilość wprowadzonego systemu operacyjnego, która jest w pełni zużywana/degradowana przez RPE ("Total Consumptive Capacity"), pomagając wyeliminować tę niejednoznaczność. Przewiduje się, że wgląd w toksyczność lipofuscyny przy użyciu tych protokołów, w tym wpływ na wskaźniki fagocytozy OS przy użyciu metody "całkowitej pojemności konsumpcyjnej", zostanie wykorzystany do rzucenia światła na toksyczność lipofuscyny in vivo.

<table><tbody><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 100 mm</td><td>Corning</td><td>#353003</td><td>Inne działają również</td></tr><tr><td>24-dołkowe Transwells</td><td>Corning</td><td>#3470</td><td></td></tr><tr><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td> <td>przeciwciała anty-LC3</td><td>#4801S</td><td>rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało antyrodopsynowe 1D4</td><td>Abcam</td><td>#5417</td><td>1:1000 rozcieńczenie. Epitop jest C-końcowy.</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-rodopsynowe 4D2</td><td>EnCor Biotech</td><td>MCA-B630</td><td>1:5000 rozcieńczenie do western blot, rozcieńczenie 1:1000 do barwienia immunologicznego. Epitop jest N-końcowy.</td></tr><tr><td>Wygaszacz autofluorescencji</td><td>Biotium</td><td>#23007</td><td>TrueBlack Lipofuscin Ugaszanie autofluorescencji</td></tr><tr><td>Wygaszanie autofluorescencji</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-8400</td><td>Vector TrueVIEW Zestaw do gaszenia autofluorescencji</td></tr><tr><td>Bodipy 493/503</td><td>Life Technologies</td><td>D3922</td><td></td></tr><tr><td>Esteraza cholesterolu&nbsp;</td>Zestaw <td></td><td>Life Technologies</td><td>From A12216</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>Leica Stellaris SP8 z modułem</td><td></td>FALCON</tr><tr><td>Siatkówki bydlęce przystosowane do ciemności</td><td>Firma W. L. Lawson Ciemne</td><td>siatkówki bydła (wstępnie wypreparowane)</td><td>Informacje kontaktowe: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com</td></tr><tr><td>Filipiński</td><td>cytometr przepływowy Sigma-Aldrich</td><td>F4767</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>Attune NxT</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy cytometru przepływowego&nbsp;</td><td>BD</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Ręczna lampa UV&nbsp;</td><td>Analytik Jena US</td><td>UVGL-55</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki MFG-E8</td><td>Sino Biological</td><td>10853-H08B</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie oczyszczone białko S</td><td>Enzyme Research Laboratories</td> Bufor próbki <td>HPS</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli</td><td>Test próbek Thermo Fisher</td><td>J60015-AD</td><td></td></tr><tr>Test<td>LDH</td><td>Promega</td><td>J2380</td><td>LDH-Glo Test cytotoksyczności</td></tr><tr><td>Media montażowe</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Odczynnik przeciwblaknięcie Prolong Gold</td></tr><tr><td>Czerwień nilowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#72485</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka powlekane politetrafluoroetylenem</td><td>Tekdon</td><td>Dostosowane</td><td>Dostosowane specyfikacje: Maska PTFE z następującymi "wycięciami" -&nbsp; 3 szklane prostokąty, każdy o wymiarach 17 mm x 9 mm, zorientowane tak, aby bok 17 mm znajdował się 4 mm od góry szkiełka i 4 mm od dołu szkiełka, przy założeniu standardowego szkiełka mikroskopowego o wymiarach 25 mm x 75 mm. Każdy prostokąt jest oddalony o co najmniej 6 mm od innych prostokątów i krawędzi zjeżdżalni. Wydrukuj maskę PTFE na szkiełku z matowym szkłem z jednej strony, aby umożliwić oznaczenie szkiełka.</td></tr><tr><td>Inhibitory proteazy&nbsp;</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>#5872</td><td></td></tr><tr><td>Test białka</td><td>Bio-Rad</td><td>#5000122 Test</td><td></td>białka RC DC</tr><tr><td>Elektroda TEER</td><td>World Precision Instruments</td><td>STX3</td><td></td></tr><tr><td>Miernik transnabłonkowej rezystancji elektrycznej (TEER)</td><td>World Precision Instruments</td><td>EVOM3</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do sieciowania ultrafioletowego</td><td>Analytik Jena US</td><td>UVP CL-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

ulepszone modele lipofuscyny i kwantyfikacja zdolności fagocytozy segmentu zewnętrznego w wysoce spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

Codzienna fagocytoza zewnętrznych segmentów fotoreceptorów przez nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) przyczynia się do gromadzenia wewnątrzkomórkowego barwnika starzejącego się, zwanego lipofuscyną. Toksyczność lipofuscyny jest dobrze znana w chorobie Stargardta, najczęstszym dziedzicznym zwyrodnieniu siatkówki, ale jest bardziej kontrowersyjna w zwyrodnieniu plamki żółtej związanym z wiekiem (AMD), głównej przyczynie nieodwracalnej ślepoty w krajach rozwiniętych. Określenie toksyczności lipofuscyny u ludzi było trudne, a zwierzęce modele Stargardta miały ograniczoną toksyczność. W związku z tym modele in vitro, które naśladują ludzkie RPE in vivo, są potrzebne do lepszego zrozumienia wytwarzania, klirensu i toksyczności lipofuscyny. Większość dotychczasowych modeli lipofuscyny w hodowlach komórkowych znajdowała się w liniach komórkowych lub polegała na podawaniu RPE pojedynczego składnika złożonej mieszaniny lipofuscyny, a nie fragmentów/końcówek całego zewnętrznego segmentu fotoreceptora, co generuje bardziej kompletny i fizjologiczny model lipofuscyny. Opisano tutaj metodę indukowania akumulacji materiału podobnego do lipofuscyny (określanego jako niestrawny materiał autofluorescencyjny lub UAM) w wysoce zróżnicowanym pierwotnym ludzkim prenatalnym RPE (hfRPE) i indukowanym pluripotencjalnym RPE pochodzącym z pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). UAM akumulował się w kulturach poprzez wielokrotne karmienie fragmentami OS poddanymi działaniu światła ultrafioletowego, pobranymi przez RPE poprzez fagocytozę. Omówiono również kluczowe sposoby, w jakie UAM zbliża się i różni od lipofuscyny in vivo. Do tego modelu akumulacji podobnej do lipofuscyny wprowadzono metody obrazowania mające na celu odróżnienie szerokiego spektrum autofluorescencji granulek UAM od jednoczesnego barwienia przeciwciałami. Wreszcie, aby ocenić wpływ UAM na zdolność fagocytozy RPE, wprowadzono nową metodę ilościowego określania wychwytu i rozpadu fragmentów segmentów zewnętrznych/końcówek. Metoda ta, określana jako "całkowita pojemność konsumpcyjna", przezwycięża potencjalne błędne interpretacje zdolności fagocytozy RPE nieodłącznie związanej z klasycznymi testami "pogoni za impulsami" w segmencie zewnętrznym. Przedstawione tutaj modele i techniki mogą być wykorzystane do badania szlaków wytwarzania i klirensu lipofuscyny oraz przypuszczalnej toksyczności.

Układ do fotoutleniania OS przedstawiono na Rysunku 1Ai. Slajdy powlekone politetrafluoroetylenem umożliwiają naniesienie dużej objętości OS w roztworze na jeden otwarty prostokąt, zapobiegając rozlewaniu się cieczy na pozostałą część slajdu. Slajd z OS umieszcza się w sterylnej szalce Petriego bez pokrywy, a nad slajdem ustawia się lampę UV, jak pokazano na Rysunku 1Aii. Alternatywnie slajd można umieścić w urządzeniu UV Crosslinker, jak pokazano na <strong cla...

Ten protokół opisuje model akumulacji lipofuscyny w wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych kulturach ludzkiego nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) oraz ulepszony test fagocytozy zewnętrznego segmentu (OS) w celu wykrycia całkowitej zdolności ZORE/degradacji OS. Metody te przezwyciężają ograniczenia poprzednich modeli lipofuscyny i klasycznych testów fagocytozy zewnętrznego segmentu z pościgiem impulsowym.

Ulepszone modele lipofuscyny i kwantyfikacja zdolności fagocytozy segmentu zewnętrznego w wysoce spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging ...

Podczas gdy lipofuscyna powszechnie gromadzi się w RPE wraz z wiekiem, rozpoznanie jej toksyczności było trudne. Tutaj opracowujemy protokoły, które pozwalają nam rozwinąć akumulację podobną do lipofuscyny w wysoce spolaryzowanych i dojrzałych kulturach RPE, aby pomóc dostrzec wpływ lipofuscyny na fizjologię RPE. Badanie toksyczności lipofuscyny u ludzi jest mylone przez fakt, że lipofuscyna zmniejsza się wraz ze śmiercią RPE.Modele zwierzęce toksyczności lipofuscyny przyniosły bardzo rozbieżne wyniki. Starannie stworzyliśmy modele in vitro akumulacji materiału podobnego do lipofuscyny, aby ułatwić badanie toksyczności lipofuscyny. Kluczem do sukcesu naszych modeli jest utrzymanie wysoce zróżnicowanych kultur, przy jednoczesnym indukowaniu genezy lipofuscyny poprzez ten sam proces, który wyzwala lipofuscynę in vivo, a mianowicie fagocytozę zewnętrznych segmentów fotoreceptorów.Nasz protokół in vitro jest wyjątkowy, ponieważ materiał podobny do lipofuscyny gromadzi się w kulturach RPE, które są wysoce zróżnicowane, aby wiernie naśladować RP in vivo. W tych okolicznościach stwierdzamy, że hodowle RPE są wysoce odporne na akumulację lipofuscyny i toksyczne działanie lipofuscyny. Dodatkowo, w procesie oznaczania fenotypów indukowanych przez akumulację podobną do lipofuscyny w naszych kulturach RP, stworzyliśmy nowy rodzaj testu fagocytozy zwany całkowitą pojemnością konsumpcyjną.Ten test pozwala nam określić całkowitą zdolność RPE do fagocytozy zewnętrznych segmentów, unikając jednocześnie niektórych mylących interpretacji, które towarzyszą klasycznym testom fagocytozy w pogoni za impulsem. Cieszymy się, że możemy wykorzystać ten model akumulacji materiału podobnego do lipofuscyny, aby lepiej zrozumieć, jakie stresory RPE mogą sprawić, że normalnie obojętna lipofuscyna zacznie odgrywać bardziej patologiczną rolę w śmierci komórek RPE. Rozpocznij od sterylizacji szkiełek pokrytych politetrafluoroetylenem lub PTFE, zanurzając je w 70% etanolu na 10 minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego.Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu w sterylnym naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 100 milimetrów. Umieść każde szkiełko w jednym nowym 100-milimetrowym naczyniu do hodowli komórkowych i dodaj 200 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych zawierającej surowicę do każdego prostokąta. Następnie umieść ręczne światło UV o długości fali 254 nm na 100-milimetrowej naczyniu do hodowli komórkowych z żarówką skierowaną bezpośrednio w stronę szkiełka na 20 minut.Rozmrozić zamrożone podwielokrotności zewnętrznych segmentów lub OS w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie obracaj OS z prędkością 2,400 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Natychmiast odessać supernatant w komorze bezpieczeństwa biologicznego za pomocą pipety i ponownie zawiesić OS w PBS.Teraz odessać pożywkę ze szkiełek i umieścić do 500 mikrolitrów roztworu dwa razy 10 do ósmego OS na mililitr PBS dwa razy 10 do ósmego OS na mililitr PBS roztworu na każdym prostokącie szkiełka. Umieść ręczne światło UV o długości fali 254 nm nad naczyniem do hodowli komórkowej z żarówką skierowaną bezpośrednio w stronę systemu operacyjnego na 40 minut. Zbierz roztwór PBS OS w probówce o pojemności 1,5 mililitra.Umyj prostokąt powlekanego szkiełka 200 do 500 mikrolitrami PBS i zbierz każde popłuczynie w probówce do mikrowirówki. Następnie odwirować roztwór PBS OS o objętości 2 400 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odessać PBS w komorze bezpieczeństwa biologicznego za pomocą pipetera i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach standardowego podłoża do użycia do hodowli nabłonka barwnikowego siatkówki lub RPE.Umieścić 10 mikrolitrów zawiesiny w nowej probówce do mikrowirówki. Rozcieńczyć od 50 do 100 razy większą ilością pożywki do hodowli komórkowych i policzyć OS za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć fotoutlenioną zawiesinę OS lub OXOS.Dodaj 5,6 razy 10 do siódmego stężenia OS na mililitr do standardowego podłoża RPE. Dodaj ligandy mostkujące fagocytozę, które ułatwiają wychwyt OS i akumulację lipofuscyny. Następnie poddzielić OXOS na jednorazowe łodygi i zamrozić w ciekłym azocie.Rozmrozić podwielokrotności OXOS, rozcieńczając zamrożoną podwielokrotność w 45 mikrolitrach pożywki do hodowli komórkowych przed dodaniem jej do transwelli RPE w celu wywołania akumulacji lipofuscyny. Następnie scharakteryzuj utleniony OS poprzez pomiar widma emisyjnego OXOS za pomocą skanowania lambda na mikroskopie konfokalnym. Obrazowanie konfokalne wykazało, że leczony OS miał zwiększoną autofluorescencję w porównaniu z nieleczonymi OS.To rozpocząć, weź utrwalony transwell z hodowlami RPE załadowanymi lipofuscyną.Po pięciokrotnym umyciu kultur PBS należy pozostawić niewielką ilość PBS w komorze wierzchołkowej. Umieść transwell do góry nogami pod mikroskopem preparacyjnym. Za pomocą żyletki odetnij półporowatą membranę od transwell, przykładając siłę cięcia na styku membrany i transwell.Po przecięciu membrany transwell umieść ją na szkiełku mikroskopowym za pomocą kleszczy. Usuń nadmiar PBS za pomocą czyszczenia zadań, unikając dotykania komórek. Dodać podłoże montażowe, a następnie szkiełko nakrywkowe.Upewnij się, że śledzisz, która strona transwell jest prawą stroną do góry. Następnie wykryj interesujący nas antygen za pomocą fluoroforu z wzbudzeniem piku około 488 nanometrów i detekcją emisji przy 500 do 530 nanometrach. Skonfiguruj oddzielny kanał do wykrywania autofluorescencji o wzbudzeniu 405 nanometrów i emisji od 585 do 635 nanometrów.Granulki autofluorescencyjne indukowane przez OXOS wykazały większą akumulację po 20 karmieniach w porównaniu z pięcioma karmieniami. Obrazowanie metryczne oparte na proporcjach pomogło rozszyfrować auto florescencję UAM z LC3 oznaczonego Alexą 488. Kanał czerwony zawiera tylko niestrawny materiał autofluorescencyjny i pomaga oddzielić sygnał LC3 od kanału zielonego.Aby rozpocząć, oblicz liczbę studzienek potrzebnych do eksperymentu, a następnie rozmroź odpowiednią ilość zwykłej próbki OS. Dodaj wystarczającą ilość pożywki RPE, aby osiągnąć końcowe stężenie OS cztery razy od 10 do szóstego na mililitr. Usunąć pożywkę wierzchołkową i dodać 50 mikrolitrów cztery razy 10 do szóstego OS na mililitr z odpowiednimi stężeniami ligandów mostkujących.Po dodaniu OS należy inkubować próbki dla różnych punktów czasowych. Pod koniec inkubacji dodać 16,67 mikrolitra czterokrotnego buforu próbki Laemmli z inhibitorami proteazy, aby lizować zarówno komórki, jak i leżący nad nimi supernatant zawierający OS. Za pomocą pipety P200 zdrap powierzchnię transwella i zbierz razem połączony supernatant komórkowy i lizat komórkowy.Wiruj i pozostaw w temperaturze pokojowej na 30 minut w celu dokładnej denaturacji. Western blot rodopsyny wykazał, że nienaruszone pasmo rodopsyny było nie do odróżnienia w kontrolnych i obciążonych UAM komórkach RPE. Jednak produkty rozkładu rodopsyny były wyższe w grupie UAM, co sugeruje pewną łagodną dysfunkcję degradacyjną w układzie fagolisosomalnym.Równe poziomy GAPDH wskazują, że liczba komórek między studzienkami jest równa. Różne przeciwciała rodopsyny rozpoznają różne fragmenty degradacji. 4D2 rozpoznaje końcowy koniec rodopsyny, który jest nienaruszony aż do ostatnich etapów degradacji lizosomalnej.W przeciwieństwie do tego, 1D4 rozpoznaje koniec C rodopsyny, który ulega degradacji wcześniej w procesie fagolizosomalnym.

improved-lipofuscin-models-quantification-outer-segment-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten artykuł opisuje protokół oczyszczania fragmentów zewnętrznych segmentów fotoreceptorów (POS) poprzez ultrawirowanie z siatkówki świni/bydła przy użyciu homogenizacji i wirowania w gradionym smaku sacharozy. Protokół ten pozwala na przygotowanie dużych zapasów porcji POS, oznakowanych lub nieoznakowanych, które mogą być następnie przechowywane w temperaturze -80 °C.

Oczyszczanie na dużą skalę zewnętrznych segmentów fotoreceptorów świń lub bydła do oznaczania fagocytozy na komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) wspiera siatkówkę czuciową poprzez recykling produktów ubocznych cyklu wzrokowego, które gromadzą się jako lipofuscyna. Produkty te są autofluorescencyjne i mogą być jakościowo obrazowane in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę ilościowego obrazowania lipofuscyny RPE za pomocą konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej.

Ilościowa autofluorescencja dna oka w ocenie chorób siatkówki

Ten protokół, który pierwotnie został zgłoszony przez Fernandez-Godino et al. w 2016 roku1, opisuje metodę efektywnego izolowania i hodowli mysich komórek RPE, które tworzą funkcjonalną i spolaryzowaną monowarstwę RPE w ciągu jednego tygodnia na płytkach Transwell. Zabieg trwa około 3 godzin.

Skuteczna dyssekcja i hodowla pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Choroby zwyrodnieniowe oczu, które wpływają na warstwę nabłonka barwnikowego siatkówki, mają pochodzenie monogenowe i poligenowe. Opracowano kilka modeli chorób i aplikację LipidUNet w celu badania mechanizmów choroby, a także potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Oparta na uczeniu maszynowym metoda charakterystyki i kwantyfikacji złogów lipidowych LipidUNet przy użyciu nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPSC

Ilościowe oznaczanie pęknięć obu nici DNA z wykorzystaniem formowania γH2AX jako markera molekularnego stało się nieocenionym narzędziem w radiobiologii. W niniejszej pracy demonstrujemy zastosowanie testu immunofluorescencyjnego do ilościowego oznaczania ognisk γH2AX po narażeniu komórek na promieniowanie.

Ilościowe oznaczanie ognisk &gamma;H2AX w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedury związane z nadekspresją i analizą małych GTPaz w spolaryzowanych komórkach nabłonkowych z wykorzystaniem techniki mikroiniekcji.

Analiza funkcji małych GTPaz poprzez mikroiniekcję plazmidów do spolaryzowanych komórek nabłonkowych

ChIRP to nowatorska i szybka technika mapowania genomowych miejsc wiązania długich niekodujących RNA (lncRNAs). Metoda ta wykorzystuje specyficzność komplementarnych, kafelkowych oligonukleotydów, co pozwala na wyliczenie genomowych miejsc związanych z lncRNA.

Izolacja chromatyny poprzez oczyszczanie RNA (ChIRP)

Analiza specyficzna dla tkanki w modelu regeneracji mieszka włosowego z wykorzystaniem lentiwirusów do mediacji funkcji wzmocnionej (gain-of-function) lub utraconej (loss-of-function).

Szybka analiza genetyczna sygnalizacji nabłonkowo-mezenchymalnej podczas regeneracji włosa

Porównano profile mikroRNA (miRNA) ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzącego z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS-RPE) oraz płodowego RPE.

Profile ekspresji mikroRNA ludzkich komórek iPS, nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPS oraz nabłonka barwnikowego siatkówki płodu

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Poznaj nowe modele lipofuscyny i metodę kwantyfikacji fagocytozy w dojrzałych kulturach nabłonka barwnikowego siatkówki. Technika ta pozwala badać toksyczność lipofuscyny i jej wpływ na fizjologię RPE.

Ulepszone modele lipofuscyny i kwantyfikacja zdolności fagocytozy segmentu zewnętrznego w wysoce spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki (Wideo) | JoVE Journal

Ulepszone modele lipofuscyny i kwantyfikacja zdolności fagocytozy segmentu zewnętrznego w wysoce spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki

Przeglądaj więcej filmów