Ulepszone modele lipofuscyny i kwantyfikacja zdolności fagocytozy segmentu zewnętrznego w wysoce spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki

Podczas gdy lipofuscyna powszechnie gromadzi się w RPE wraz z wiekiem, rozpoznanie jej toksyczności było trudne. Tutaj opracowujemy protokoły, które pozwalają nam rozwinąć akumulację podobną do lipofuscyny w wysoce spolaryzowanych i dojrzałych kulturach RPE, aby pomóc dostrzec wpływ lipofuscyny na fizjologię RPE. Badanie toksyczności lipofuscyny u ludzi jest mylone przez fakt, że lipofuscyna zmniejsza się wraz ze śmiercią RPE.

Modele zwierzęce toksyczności lipofuscyny przyniosły bardzo rozbieżne wyniki. Starannie stworzyliśmy modele in vitro akumulacji materiału podobnego do lipofuscyny, aby ułatwić badanie toksyczności lipofuscyny. Kluczem do sukcesu naszych modeli jest utrzymanie wysoce zróżnicowanych kultur, przy jednoczesnym indukowaniu genezy lipofuscyny poprzez ten sam proces, który wyzwala lipofuscynę in vivo, a mianowicie fagocytozę zewnętrznych segmentów fotoreceptorów.

Nasz protokół in vitro jest wyjątkowy, ponieważ materiał podobny do lipofuscyny gromadzi się w kulturach RPE, które są wysoce zróżnicowane, aby wiernie naśladować RP in vivo. W tych okolicznościach stwierdzamy, że hodowle RPE są wysoce odporne na akumulację lipofuscyny i toksyczne działanie lipofuscyny. Dodatkowo, w procesie oznaczania fenotypów indukowanych przez akumulację podobną do lipofuscyny w naszych kulturach RP, stworzyliśmy nowy rodzaj testu fagocytozy zwany całkowitą pojemnością konsumpcyjną.

Ten test pozwala nam określić całkowitą zdolność RPE do fagocytozy zewnętrznych segmentów, unikając jednocześnie niektórych mylących interpretacji, które towarzyszą klasycznym testom fagocytozy w pogoni za impulsem. Cieszymy się, że możemy wykorzystać ten model akumulacji materiału podobnego do lipofuscyny, aby lepiej zrozumieć, jakie stresory RPE mogą sprawić, że normalnie obojętna lipofuscyna zacznie odgrywać bardziej patologiczną rolę w śmierci komórek RPE. Rozpocznij od sterylizacji szkiełek pokrytych politetrafluoroetylenem lub PTFE, zanurzając je w 70% etanolu na 10 minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu w sterylnym naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 100 milimetrów. Umieść każde szkiełko w jednym nowym 100-milimetrowym naczyniu do hodowli komórkowych i dodaj 200 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych zawierającej surowicę do każdego prostokąta. Następnie umieść ręczne światło UV o długości fali 254 nm na 100-milimetrowej naczyniu do hodowli komórkowych z żarówką skierowaną bezpośrednio w stronę szkiełka na 20 minut.

Rozmrozić zamrożone podwielokrotności zewnętrznych segmentów lub OS w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie obracaj OS z prędkością 2,400 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Natychmiast odessać supernatant w komorze bezpieczeństwa biologicznego za pomocą pipety i ponownie zawiesić OS w PBS.

Teraz odessać pożywkę ze szkiełek i umieścić do 500 mikrolitrów roztworu dwa razy 10 do ósmego OS na mililitr PBS dwa razy 10 do ósmego OS na mililitr PBS roztworu na każdym prostokącie szkiełka. Umieść ręczne światło UV o długości fali 254 nm nad naczyniem do hodowli komórkowej z żarówką skierowaną bezpośrednio w stronę systemu operacyjnego na 40 minut. Zbierz roztwór PBS OS w probówce o pojemności 1,5 mililitra.

Umyj prostokąt powlekanego szkiełka 200 do 500 mikrolitrami PBS i zbierz każde popłuczynie w probówce do mikrowirówki. Następnie odwirować roztwór PBS OS o objętości 2 400 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odessać PBS w komorze bezpieczeństwa biologicznego za pomocą pipetera i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach standardowego podłoża do użycia do hodowli nabłonka barwnikowego siatkówki lub RPE.

Umieścić 10 mikrolitrów zawiesiny w nowej probówce do mikrowirówki. Rozcieńczyć od 50 do 100 razy większą ilością pożywki do hodowli komórkowych i policzyć OS za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć fotoutlenioną zawiesinę OS lub OXOS.

Dodaj 5,6 razy 10 do siódmego stężenia OS na mililitr do standardowego podłoża RPE. Dodaj ligandy mostkujące fagocytozę, które ułatwiają wychwyt OS i akumulację lipofuscyny. Następnie poddzielić OXOS na jednorazowe łodygi i zamrozić w ciekłym azocie.

Rozmrozić podwielokrotności OXOS, rozcieńczając zamrożoną podwielokrotność w 45 mikrolitrach pożywki do hodowli komórkowych przed dodaniem jej do transwelli RPE w celu wywołania akumulacji lipofuscyny. Następnie scharakteryzuj utleniony OS poprzez pomiar widma emisyjnego OXOS za pomocą skanowania lambda na mikroskopie konfokalnym. Obrazowanie konfokalne wykazało, że leczony OS miał zwiększoną autofluorescencję w porównaniu z nieleczonymi OS.To rozpocząć, weź utrwalony transwell z hodowlami RPE załadowanymi lipofuscyną.

Po pięciokrotnym umyciu kultur PBS należy pozostawić niewielką ilość PBS w komorze wierzchołkowej. Umieść transwell do góry nogami pod mikroskopem preparacyjnym. Za pomocą żyletki odetnij półporowatą membranę od transwell, przykładając siłę cięcia na styku membrany i transwell.

Po przecięciu membrany transwell umieść ją na szkiełku mikroskopowym za pomocą kleszczy. Usuń nadmiar PBS za pomocą czyszczenia zadań, unikając dotykania komórek. Dodać podłoże montażowe, a następnie szkiełko nakrywkowe.

Upewnij się, że śledzisz, która strona transwell jest prawą stroną do góry. Następnie wykryj interesujący nas antygen za pomocą fluoroforu z wzbudzeniem piku około 488 nanometrów i detekcją emisji przy 500 do 530 nanometrach. Skonfiguruj oddzielny kanał do wykrywania autofluorescencji o wzbudzeniu 405 nanometrów i emisji od 585 do 635 nanometrów.

Granulki autofluorescencyjne indukowane przez OXOS wykazały większą akumulację po 20 karmieniach w porównaniu z pięcioma karmieniami. Obrazowanie metryczne oparte na proporcjach pomogło rozszyfrować auto florescencję UAM z LC3 oznaczonego Alexą 488. Kanał czerwony zawiera tylko niestrawny materiał autofluorescencyjny i pomaga oddzielić sygnał LC3 od kanału zielonego.

Aby rozpocząć, oblicz liczbę studzienek potrzebnych do eksperymentu, a następnie rozmroź odpowiednią ilość zwykłej próbki OS. Dodaj wystarczającą ilość pożywki RPE, aby osiągnąć końcowe stężenie OS cztery razy od 10 do szóstego na mililitr. Usunąć pożywkę wierzchołkową i dodać 50 mikrolitrów cztery razy 10 do szóstego OS na mililitr z odpowiednimi stężeniami ligandów mostkujących.

Po dodaniu OS należy inkubować próbki dla różnych punktów czasowych. Pod koniec inkubacji dodać 16,67 mikrolitra czterokrotnego buforu próbki Laemmli z inhibitorami proteazy, aby lizować zarówno komórki, jak i leżący nad nimi supernatant zawierający OS. Za pomocą pipety P200 zdrap powierzchnię transwella i zbierz razem połączony supernatant komórkowy i lizat komórkowy.

Wiruj i pozostaw w temperaturze pokojowej na 30 minut w celu dokładnej denaturacji. Western blot rodopsyny wykazał, że nienaruszone pasmo rodopsyny było nie do odróżnienia w kontrolnych i obciążonych UAM komórkach RPE. Jednak produkty rozkładu rodopsyny były wyższe w grupie UAM, co sugeruje pewną łagodną dysfunkcję degradacyjną w układzie fagolisosomalnym.

Równe poziomy GAPDH wskazują, że liczba komórek między studzienkami jest równa. Różne przeciwciała rodopsyny rozpoznają różne fragmenty degradacji. 4D2 rozpoznaje końcowy koniec rodopsyny, który jest nienaruszony aż do ostatnich etapów degradacji lizosomalnej.

W przeciwieństwie do tego, 1D4 rozpoznaje koniec C rodopsyny, który ulega degradacji wcześniej w procesie fagolizosomalnym.