Ilościowe określanie ostrych zmian w aktywności nerek współczulnych w odpowiedzi na manipulacje ośrodkowego układu nerwowego u znieczulonych szczurów
11 września 2018
Metody pomiaru reakcji układu współczulnego i sercowo-naczyniowego na manipulacje ośrodkowego układu nerwowego (OUN) są ważne dla rozwoju neuronauki. Protokół ten został opracowany, aby pomóc naukowcom w pomiarze i ilościowym określeniu ostrych zmian w aktywności nerkowego nerwu współczulnego (RSNA) u znieczulonych szczurów (brak przeżycia).
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące autonomicznego układu nerwowego, w szczególności mechanizmów ośrodkowego układu nerwowego, które regulują odpływ współczulny do nerki. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona pomiar wpływu, jaki manipulacje ośrodkowego układu nerwowego mają na odpływ współczulny nerek do nerki. Przed kaniulacją tętniczą sprawdź cewnik wykrywający ciśnienie w dużym powiększeniu, aby potwierdzić, że cewnik jest wolny od pęcherzyków i zanieczyszczeń oraz ma nienaruszoną menisk między składnikami wypełnionymi płynem i żelem.
Przed każdą implantacją należy uzupełnić żel na dystalnej końcówce cewnika i za pomocą magnesu włączyć nadajnik. Umieść luźny półwęzeł od góry w proksymalnym szwie, aby na krótko zamknąć tętnicę udową. Trzymając wprowadzacz cewnika w ręce niedominującej, użyj kleszczy do kaniulacji naczyń, aby chwycić końcówkę kaniuli jednostki telemetrycznej, aby uniknąć przemieszczenia żelu z końcówki.
Użyj wygiętej końcówki igły o rozmiarze 22, aby przebić otwór w tętnicy i wprowadzić kaniulę do tętnicy tak daleko, jak to możliwe. Następnie zabezpiecz cewnik ciśnieniowy za pomocą proksymalnych i dystalnych opasek szwowych. I wsuń korpus implantu telemetrycznego w bok przylegający do nacięcia.
Aby uzyskać dostęp do mózgu, delikatnie przesuń szczura do pozycji leżącej w stereotaktycznej ramie chirurgicznej z głową między nausznikami i wyreguluj siekacze, aby wyrównać wysokość lambdy i bregmy. Następnie wykonaj dwucentymetrowe nacięcie ogona rostralnego przez linię środkową skóry głowy i użyj aplikatorów z bawełnianą końcówką, aby mocno usunąć tkankę łączną z powierzchni czaszki. Nałóż nadtlenek wodoru na odsłoniętą czaszkę, aby pomóc w wizualizacji szwów bregma, lambda i linii środkowej.
Korzystając z atlasu mózgu szczura do kierowania celowaniem, wywierć otwór w kształcie zadziorów o rozmiarze umożliwiającym dostęp elektrody przez czaszkę. Aby wyizolować nerwy współczulne, podłącz drutową nerkową elektrodę współczulną lub elektrodę RSNA do 10-krotnego wzmacniacza wstępnego i wzmacniacza mikroelektrody i wykonaj nacięcie skalpela rozciągające się od czterech do pięciu centymetrów poniżej żeber w kierunku ogonowym nieco bocznie do kręgosłupa. rozwarstwienie, aby uwidocznić mięśnie przykręgosłupowe i wykonać bardzo powierzchowne nacięcie ogona rostralnego o długości od jednego do dwóch centymetrów, w miejscu, w którym tłuszcz styka się z mięśniem.
Za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką rozprowadź tłuszcz z dala od mięśnia, aby uwidocznić nerkę bez wchodzenia do przestrzeni otrzewnej. I użyj retraktorów, aby delikatnie oddzielić nerkę od mięśni przykręgosłupowych, aby uwidocznić tętnicę nerkową i aortę brzuszną. I użyj dużego powiększenia, aby zidentyfikować nerwy nerkowe w kieszonce nacięcia.
Pęczki nerwowe są najłatwiej widoczne w kącie prostym utworzonym przez aortę i tętnicę nerkową ściśle podążającą za tętnicą nerkową od aorty do nerek. Następnie za pomocą pęsety do mikropreparowania delikatnie wypreparuj z otaczającej tkanki fragment pęczka nerwowego, który ma zostać umieszczony na elektrodzie rejestrującej. Zamocuj drucianą elektrodę RSNA w uchwycie i opuść elektrodę do poziomu segmentu nerwowego.
Użyj haczyka nerwowego, aby delikatnie podnieść odcinek nerwu nerkowego na elektrodę bez rozciągania nerwu. I wypełnij nacięcie olejem mineralnym, aby utrzymać odsłonięty nerkowy nerek współczulnych nawilżony. Przymocuj zacisk uziemiający do zwierzęcia, a drugi koniec do klatki Faradaya i użyj filtrowania górno- i dolnoprzepustowego, aby skierować sygnał do amplifiers.
Następnie dostosuj wzmocnienie do 10 kiloherców, w tym monitor audio, aby ocenić wzór pękania RSNA. Aby ocenić jakość zapisu RSNA, wywołaj baroodruch za pomocą 100 mikrolitrów bolusa dożylnego wstrzyknięcia 10 mikrogramów na mililitr fenylefryny w celu zwiększenia ciśnienia krwi i zahamowania aktywności nerkowego nerwu współczulnego, dostosowując położenie elektrod w celu poprawy sygnału w razie potrzeby. Po uzyskaniu wyraźnego sygnału należy odessać olej mineralny i zabezpieczyć elektrodę na miejscu żelem krzemionkowym.
W tym reprezentatywnym eksperymencie dożylne wstrzyknięcie fenylefryny zastosowano w celu wywołania wzrostu średniego ciśnienia tętniczego i wywołania barorerefleksu i przejściowego zahamowania układu współczulnego. Aby określić ilościowo RSNA, surowy RSNA został skorygowany i uśredniony dla nienakładających się na siebie 10-sekundowych segmentów, a oszacowanie hałasu odjęto od każdego segmentu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby upewnić się, że szczur jest odpowiednio znieczulony, że jest prawidłowo umieszczony w ramie stereotaktycznej i że system jest odpowiednio uziemiony w celu zmniejszenia szumów elektrycznych.
Po tej procedurze i pobraniu tkanki mózgowej można zastosować metody histologiczne w celu scharakteryzowania typów jąder systemu centralnego, które kontrolują odpowiedź współczulno-pobudzającą. Technika ta pozwala neuronaukowcom badać autonomiczne mechanizmy regulacji u znieczulonych szczurów, co stanowi podstawę przyszłych badań na zwierzętach w celu zrozumienia kontroli ciśnienia krwi i funkcji nerek. Nie zapominaj, że bardzo ważna jest ocena płaszczyzny znieczulenia co najmniej co 15 minut.
I w razie potrzeby zapewnić dodatkowe znieczulenie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół pomiaru aktywności współczulnych nerwów nerkowych (RSNA) oraz średniego ciśnienia tętniczego u znieczulonych szczurów. Metoda ta umożliwia badaczom analizę mechanizmów ośrodkowego układu nerwowego (CNS) regulujących odpływ współczulny do nerki i jest kompatybilna z manipulacjami w obrębie CNS, takimi jak stymulacja farmakologiczna, optogenetyczna lub elektryczna. Protokół został opracowany dla krótkotrwałych eksperymentów nieprzeżywalnych i obejmuje etapy dostępu do mózgu, rejestracji RSNA oraz późniejszej analizy histologicznej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Fizjologia układu sercowo-naczyniowego
- Badania nad autonomicznym układem nerwowym
Wprowadzenie
- RSNA oraz średnie ciśnienie tętnicze są kluczowymi parametrami w badaniach układu sercowo-naczyniowego i autonomicznego.
- Istnieje potrzeba opracowania szczegółowych protokołów pomiaru i analizy tych zmiennych w modelach zwierzęcych.
- Zrozumienie kontroli ośrodkowego układu nerwowego nad współczulnym odpływem nerkowym dostarcza istotnych informacji dla badań nad regulacją ciśnienia krwi i funkcji nerek.
- Obecnie dostępne metody przewlekłego rejestrowania RSNA u szczurów są ograniczone; niniejszy protokół koncentruje się na ostrych eksperymentach bez przeżywalności.
Cel badania
- Przedstawienie szczegółowego protokołu pomiaru RSNA oraz średniego ciśnienia tętniczego u znieczulonych szczurów.
- Umożliwienie manipulacji w obrębie OUN podczas rejestracji RSNA na potrzeby badań mechanistycznych.
- Ułatwienie korelacji anatomicznej z jądrami OUN poprzez późniejszą analizę histologiczną.
Zastosowane Metody
- Przygotowanie i kontrola cewników pomiarowych ciśnienia do kaniulacji tętnicy.
- Kaniulacja tętnicy udowej i implantacja jednostek telemetrycznych do rejestracji średniego ciśnienia tętniczego.
- Pozycjonowanie stereotaktyczne i przygotowanie czaszki do dostępu do mózgu i manipulacji w ośrodkowym układzie nerwowym.
- Izolacja i umieszczenie elektrod RSNA na nerwach nerkowych wraz z wzmocnieniem i filtrowaniem sygnału.
- Wywołanie barorefleksu za pomocą dożylnej fenylefryny w celu oceny jakości sygnału RSNA.
- Kwantyfikacja RSNA poprzez prostowanie, uśrednianie i odejmowanie szumów.
- Pobieranie tkanki mózgowej po zakończeniu eksperymentu do analizy histologicznej.
Główne wyniki
- Protokół ten umożliwia wiarygodny pomiar RSNA oraz średniego ciśnienia tętniczego u znieczulonych szczurów.
- Podczas rejestracji RSNA można przeprowadzać manipulacje w obrębie OUN, aby ocenić ich wpływ na odpływ sympatyczny.
- Aktywacja barorefleksu za pomocą fenyloefryny wywołuje spodziewane wzrosty średniego ciśnienia tętniczego oraz przejściową sympatykoinhibicję.
- Sygnały RSNA mogą być kwantyfikowane i analizowane przy użyciu parametrycznych testów statystycznych.
Wnioski
- Technika ta umożliwia szczegółowe badanie mechanizmów regulacji autonomicznej u znieczulonych szczurów.
- Stanowi ona podstawę dla przyszłych badań nad kontrolą ciśnienia krwi i funkcji nerek przez OUN.
- Prawidłowe znieczulenie, ułożenie zwierzęcia oraz uziemienie są kluczowe dla pomyślnego przeprowadzenia pomiarów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowy pomiar aktywności współczulnych nerwów nerkowych (RSNA) w odpowiedzi na manipulacje w obrębie ośrodkowego układu nerwowego (CNS) dostarcza kluczowych informacji mechanistycznych niezbędnych we wczesnych etapach poszukiwania leków przeciwsercowo-naczyniowych i autonomicznych. Niniejszy protokół umożliwia precyzyjną, krótkoterminową ocenę wyjść autonomicznych sterowanych przez CNS, co zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych i badaniu szlaków sygnałowych. Podejście to wspiera podejmowanie decyzji uwzględniających ryzyko w kluczowych punktach zwrotnych procesu rozwoju portfela badań przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę mechanizmów OUN regulujących współczulny przepływ nerkowy.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez ilościowe określanie ostrych reakcji autonomicznych na interwencje w OUN.
- Ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniach nad szlakami kandydackimi w obszarze badań sercowo-naczyniowych i autonomicznych.
- Dostarcza danych ilościowych dla zwiększenia pewności predykcyjnej przy wyborze celów na wczesnym etapie badań.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowany, powtarzalny pomiar RSNA oraz średniego ciśnienia tętniczego dla dalszych analiz.
- Zapewnia zestandaryzowane, ilościowe wyniki odpowiednie do analizy porównawczej w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Umożliwia wiarygodną ocenę farmakologicznych, optogenetycznych lub elektrycznych manipulacji w OUN.
- Wspiera przygotowanie analiz do przesiewowego badania modulatorów OUN wpływających na funkcje autonomiczne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie ostrych odczytów autonomicznych z punktami końcowymi istotnymi dla choroby w modelach sercowo-naczyniowych.
- Zapewnia ciągłość przejścia od mechanistycznych badań OUN do przedklinicznej walidacji celów autonomicznych.
- Wspiera strategie biomarkerów translacyjnych poprzez powiązanie jąder OUN z funkcjonalnymi odpowiedziami autonomicznymi.
- Ułatwia dostosowane do ryzyka wdrażanie terapeutyków celujących w OUN.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania – od wczesnych badań mechanistycznych po przedkliniczną walidację celu, umożliwiając rzetelne testowanie hipotez oraz ograniczanie ryzyka związanego z analizowanymi szlakami sygnałowymi.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie zmian w RSNA indukowanych przez OUN w celu wyjaśnienia dróg regulacji autonomicznej.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych danych dotyczących RSNA oraz średniego ciśnienia tętniczego do oceny związków.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie ostrych reakcji autonomicznych przy użyciu testów parametrycznych.
- Badania translacyjne: Łączy badania nad manipulacjami w OUN z funkcjonalnymi punktami końcowymi układu sercowo-naczyniowego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zestandaryzowaną platformę do powtarzalnych badań nad interakcjami OUN-układ autonomiczny w ramach różnych programów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad układem autonomicznym i OUN.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane, powtarzalne i skalowalne przepływy pracy dla pomiarów ostrego RSNA.
- Wartość strategiczna: Poprawia procesy podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego ograniczania ryzyka biologicznego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój celów w obszarze OUN i układu autonomicznego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie chirurgii stereotaksycznej, neurofizjologii oraz pracy z zwierzętami w stanach ostrych.
- Wymaga specjalistycznej aparatury do rejestracji RSNA, telemetrii oraz wzmacniania sygnału.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać optymalizacji i walidacji protokołu.
- Ograniczone do ostrych eksperymentów bez przeżycia; nieodpowiednie do przewlekłych badań RSNA.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:36
Femoral Artery Cannulation for Map Arterial Pressure (MAP) Monitoring
1:41
Brain Access, Renal Sympathetic Nerve Isolation, and Recording Quality Assessment
5:02
Results: Representative RSNA and Blood Pressure Responses to IV Phenylephrine Injection
5:30
Conclusion
