Generowanie nokautujących pierwotnych i ekspandowanych ludzkich komórek NK przy użyciu rybonukleoprotein Cas9
14 czerwca 2018
Tutaj prezentujemy protokół genetycznej modyfikacji pierwotnych lub rozszerzonych komórek NK (ang. human natural killer) za pomocą rybonukleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Korzystając z tego protokołu, wygenerowaliśmy ludzkie komórki NK z niedoborem receptora 2 czynnika wzrostu b (TGFBR2) i fosforybozylotransferazy hipoksantynowej 1 (HPRT1).
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórek NK dotyczące roli i funkcji określonych genów i szlaków, które regulują funkcję komórek efektorowych. Główną zaletą tej techniki jest jej wysoki wskaźnik sukcesu w porównaniu z podejściami zależnymi od DNA, co ułatwia wysoce skuteczny nokaut jednego z najbardziej istotnych klinicznie genów w terapii komórkami NK. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku immunoterapii guzów litych i guzów mózgu, które wyrażają TGF-beta jako sposób ucieczki immunologicznej.
W przypadku pierwotnej transdukcji komórek NK inkubować trzy razy po 10 do pięciu świeżo wyizolowanych komórek NK na mililitr pożywki RPMI uzupełnionej 100 IU na mililitr IL2 na kolbę T75 przez cztery dni, zastępując pożywkę co drugi dzień i dzień przed transdukcją. W celu rozszerzonej transdukcji komórek NK, stymuluj pierwotne komórki NK w dniu zero za pomocą wypromieniowanych, związanych z błoną komórek zasilających K562 eksprymujących IL21 w stosunku jeden do jednego, zastępując pożywkę co drugi dzień i dzień przed transdukcją. W dniu elektroporacji napełnić jedną kolbę T25 ośmioma mililitrami świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej 100 IU na mililitr IL2 na stan komórki doświadczalnej i umieścić kolby w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.
Podczas gdy pożywka się równoważy, dodaj trzy do czterech razy po 10 do szóstych komórek na warunek na 26 mikrolitrów mieszanki transdukcyjnej do stożkowej probówki i osadzaj komórki przez odwirowanie. Następnie umyj komórki trzy razy w 12 mililitrach sterylnego PBS na pranie, aby usunąć cały FBS z zawiesin komórek. Podczas mycia komórek należy ponownie zawiesić każdy CRISPR RNA i tracrRNA do końcowych stężeń 200 mikromolowych.
Wymieszaj 2,2 mikrolitra każdego RNA CRISPR z jedną objętością tracrRNA o objętości 200 mikromolów na próbkę i podgrzewaj próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie pozwól próbkom ostygnąć do temperatury pokojowej i przechowuj kompleksy CRISPR RNA/tracrRNA w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza do czasu ich użycia. Aby utworzyć kompleksy rybonukleoproteinowe, dodaj endonukleazę Cas9 do odpowiedniego odpowiedniego kompleksu CRISPR RNA/tracrRNA, wirując przez 30 do 60 sekund i inkubuj powstałe kompleksy rybonukleoproteinowe Cas9 w temperaturze pokojowej przez 15 do 20 minut.
Po ostatnim płukaniu dodaj całą objętość suplementu do elektroporacji z zestawu Nucleofector roztwór P3 i ponownie zawieś każdą komórkę w 20 mikrolitrach pierwotnego roztworu P3 4D-Nucleofector uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Natychmiast dodaj pięć mikrolitrów każdego kompleksu rybonukleoproteinowego do odpowiedniej zawiesiny komórkowej i dodaj jeden mikrolitr 100-mikromolowego wzmacniacza elektroporacji Cas9 do mieszanki komórek kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9. Przenieś 26 mikrolitrów roztworu komórek rybonukleoproteiny Cas9 do indywidualnych dołków paska Nucleocuvette i delikatnie postukaj w pasek, aby upewnić się, że próbki pokrywają dno każdej studzienki.
Następnie uruchom program EN138 systemu 4D-Nucleofector . Pod koniec transdukcji pozwól komórkom odpocząć przez trzy minuty. Następnie dodać 80 mikrolitrów wstępnie zbilansowanej pożywki hodowlanej do każdej kuwety i delikatnie przenieść próbki do jednej kolby na warunki w inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po 48 godzinach hodowli wyekstrahuj genomowe DNA z pięciu razy 10 do pięciu transdukowanych komórek w celu przeprowadzenia badań przesiewowych delecji genów zgodnie ze standardowymi protokołami. Następnie stymuluj resztę transdukowanych komórek świeżymi, związanymi z błoną komórkami odżywiającymi IL21 w stosunku jeden do jednego i ekstrahuj RNA po pięciu dniach wspólnej hodowli zgodnie ze standardowymi protokołami analizy ekspresji genów za pomocą ilościowego PCR. Analiza cytometrii przepływowej ujawnia, że program EN138 skutkuje najwyższym procentem żywotności komórek i wydajności transdukcji spośród dostępnych programów systemu Nucleofector.
Na przykład, korzystając z komercyjnie dostarczanych przewodników RNA, ludzki HPRT1 jest z powodzeniem eliminowany w ekspandowanych ludzkich komórkach NK. Ponadto rybonukleoproteiny Cas9 zawierające przewodnik RNA2, przewodnik RNA1 plus przewodnik RNA2 i przewodnik RNA3 wykazują udany nokaut dwóch genów ektodomenowych receptora TGF-beta, podczas gdy sam przewodnik RNA1 nie indukuje żadnych wykrywalnych delecji insercji T7E1. Rzeczywiście, użycie programu EN138 do elektroporacji rybonukleoproteiny Cas9 powoduje 60% zmniejszenie ekspresji mRNA receptora TGF-beta dwa w komórkach transdukowanych za pomocą tego programu.
Co więcej, kohodowla transdukowanych komórek z TGF-beta i ludzką pierwotną linią komórkową rdzeniaka zarodkowego nie wpływa znacząco na cytotoksyczność komórek NK w porównaniu z komórkami transdukowanymi bez TGF-beta, konfrontując się z odpowiednim brakiem funkcji receptora TGF-beta w komórkach zmodyfikowanych rybonukleoproteiną Cas9 na poziomie białka. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując tej procedury, należy pamiętać o zaprojektowaniu kilku różnych przewodnikowych RNA, aby uzyskać najlepszy wynik edycji genów.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak sekwencjonowanie DNA lub test mutacji T7E1, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące skuteczności edycji genów lub sposobu określenia potencjalnych mutacji genetycznych poza celem. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się immunoterapią nowotworów do zbadania możliwości wykorzystania komórek NK z edytowanymi genami w leczeniu raka. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić edycję genów w pierwotnych ludzkich komórkach NK.
Aby uzyskać więcej informacji na temat ekspansji komórek NK po tym procesie, zobacz nasz wcześniejszy artykuł Jove. Nie zapominaj, że praca z ludzką krwią może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować uniwersalne środki ostrożności i higienę pracy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół genetycznej modyfikacji ludzkich naturalnych komórek zwanych komórkami zwanych NK (Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs)). Metoda ta pozwala na wygenerowanie komórek NK ubogich w TGFBR2 i HPRT1, ułatwiając badania nad biologią komórek NK i immunoterapią.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Immunologia
- Edycja genów
Tło
- Naturalne komórki zabójcze (NK) odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej.
- Rozumienie funkcji genów w komórkach NK może poprawić podejścia immunoterapii.
- Obecne metody edycji genów w komórkach NK mają ograniczenia.
- Ten protokół ma na celu poprawę efektywności knockoutu genów w komórkach NK.
Cel badania
- Ustanowienie niezawodnej metody modyfikacji komórek NK.
- Zbadanie ról określonych genów w funkcji komórek NK.
- Zbadanie implikacji dla immunoterapii ukierunkowanej na guzy stałe.
Stosowane metody
- Izolacja i hodowlą pierwotnych komórek NK w medium RPMI.
- Transdukcja komórek NK za pomocą IL2 i komórek hodujących.
- Elektroporacja do wprowadzenia Cas9/RNPs do komórek NK.
- Ocena efektywności knockoutu genów i funkcjonalności.
Główne wyniki
- Skuteczne wygenerowanie komórek NK ubogich w TGFBR2 i HPRT1.
- Wysoka skuteczność knockoutu genów w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
- Potencjalne zastosowania w zwiększeniu terapii komórek NK przeciwko guzom.
- Wgląd w mechanizmy ucieczki immunologicznej w guzach.
Wnioski
- Protokół zapewnia solidne podejście do modyfikacji komórek NK.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia biologii i terapii komórek NK.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę technikę do zastosowań klinicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient genome editing of primary human NK cells addresses a critical bottleneck in immunotherapy development, enabling mechanistic interrogation of immune evasion pathways such as TGF-beta signaling. This DNA-free Cas9/RNP approach improves target validation confidence by reducing procedure-associated apoptosis and increasing knockout efficiency, supporting de-risking of NK cell-based therapeutics. The method enhances translational continuity from discovery to preclinical evaluation by generating functionally modified NK cells that retain expansion capacity and cytotoxic potential.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in primary human NK cells to clarify roles of TGFBR2 and HPRT1 in effector cell regulation.
- Operational Value: Provides a high-success-rate alternative to viral transduction, minimizing apoptosis and improving yield of genetically modified NK cells.
- Predictive Value: Supports assessment of gene knockout impact on TGF-beta sensitivity, informing mechanistic de-risking of immunotherapy candidates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates knockout NK cells suitable for functional assays, including cytotoxicity and gene expression analysis via RT-PCR and flow cytometry.
- Operational Value: Enables standardized preparation of edited NK cells using defined electroporation parameters (EN138 program) for reproducible transduction efficiency.
- Scalability: Supports post-electroporation expansion using irradiated mbIL21-expressing feeder cells, facilitating scale-up for downstream screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Produces TGFBR2-deficient NK cells with reduced sensitivity to TGF-beta, modeling immune escape mechanisms in solid and brain tumors.
- Preclinical Continuity: Allows co-culture with tumor cell lines (e.g., medulloblastoma) to evaluate functional resistance to immunosuppressive cytokines.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of gene-edited NK cell persistence and function after modification, supporting go/no-go decisions in immunotherapy development.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting target validation through gene knockout, enabling screening-ready cell products, and informing preclinical assessment of immunomodulatory resistance.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of gene roles in NK cell effector function, particularly in TGF-beta-mediated immune suppression pathways.
- Screening: Generates assay-ready NK cells with quantifiable outputs (viability, transduction efficiency, gene expression) for compound or condition comparison.
- Analytics: Delivers measurable endpoints including mRNA reduction (60% for TGFBR2), viability rates, and cytotoxicity shifts for data-driven decision making.
- Translational Research: Connects genetic modification to functional outcomes in tumor co-culture models, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for NK cell editing that can be applied across multiple genetic targets and therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by enabling efficient, DNA-free knockout in primary human NK cells.
- Operational Value: Improves reproducibility and standardization through defined electroporation conditions and feeder cell-based expansion.
- Strategic Value: Reduces biological risk in NK cell therapy development by clarifying gene function and immune escape mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunotherapy targets through mechanistic de-risking of TGF-beta resistance pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary NK cell isolation, culture, and electroporation techniques.
- Dependent on access to Nucleofector 4D system, Cas9 protein, and synthetic guide RNAs.
- Necessitates standardization of guide RNA design and validation across targets to ensure editing efficiency.
- Involves optimization of cell-to-complex ratios and incubation timing for RNP formation and delivery.
- Limited by primary NK cell donor variability and expansion potential post-electroporation.
