Name: Generowanie nokautujących pierwotnych i ekspandowanych ludzkich komórek NK przy użyciu rybonukleoprotein Cas9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Poznaj metodę edycji genów w ludzkich komórkach NK przy użyciu rybonukleoprotein Cas9. Technika umożliwia generowanie nokautujących linii komórkowych z wysoką wydajnością, wspierając badania nad immunoterapią nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Brianowi Tulliusowi za jego uprzejmą pomoc w edycji rękopisu.

Zdrowe płaszcze buffy od dawców zostały pozyskane jako materiał źródłowy od Amerykańskiego Czerwonego Krzyża z Regionu Środkowego Ohio. Badanie to zostało uznane za badanie zwolnione z podatku przez Institutional Review Board of Nationwide Children's Hospital.
1. Oczyszczanie i ekspansja ludzkich komórek NK
<ol>
	<li>Izoluj PBMC od Buffy Coat12.
	<ol>
		<li>Warstwę 35 ml próbki kożucha na 15 ml Ficoll-Paque.</li>
		<li>Wirować przy 400 x g przez 20 minut bez hamulca i pobrać PBMC z interfejsu.</li>
		<li>Odzyskać PBMC przemyć trzykrotnie, dodając co najmniej równą objętość PBS, odwirowując przy 400 x g przez 5 minut i odsysając płuczkę PBC. Komórka NK może być wyizolowana na tym etapie przez RosettesSep13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozszerz komórki NK poprzez stymulację napromieniowanymi komórkami podajnika 10 x 106 mbIL21 w dniach 0, 7 i 14. Zastąp pożywkę świeżym RPMI zawierającym 10% FBS, 1% glutaminy, 1% penicyliny Streptomycyny i 100 IU / ml IL-2 na całą objętość pożywki co drugi dzień.</li>
</ol>
2. Projektowanie i selekcja gRNA
<ol>
	<li>Wybierz konkretne loci genomowe, które chcesz kierować na cel, korzystając z narzędzi online, np. NCBI, Ensemble. 
	przykład. 
	Opis: Transformujący czynnik wzrostu receptora beta 2 (TGFBRR2) ektodomena 
	Zobacz rekord: PF08917 
	Zobacz InterPro: IPR015013 
	Pozycja: 49 - 157 aa 
	Sekwencja celowa: ekson 4 genu TGFBR2 (ENSG00000163513)</li>
	<li>Aby zaprojektować gRNA, użyj narzędzi internetowych do projektowania CRISPR, takich jak http://crispr.mit.edu i "Benchling".
	<ol>
		<li>Wprowadź sekwencję DNA wybraną w kroku 2.1. Wybierz ludzki (hg 19) jako genom docelowy. Przewodniki CRISPR (20 nukleotydów, po których następuje sekwencja PAM: NGG) zostaną zeskanowane z sekwencji wprowadzonej wcześniej. Pokazuje również możliwe dopasowania poza celem w całym wybranym genomie.</li>
		<li>Wybierz trzy najlepsze gRNA, które mają najwyższy wynik, w oparciu o ich wskaźniki on-target i off-target. Na przykład w tabeli 1 przedstawiono zaprojektowane RNA CRISPR do celowania w ekson 4 genu TGFBR2 sugerowane przez narzędzia internetowe do projektowania CRISPR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uporządkuj RNA CRISPR jako syntetyczne crRNA specyficzne dla sekwencji.</li>
	<li>Zamów konserwatywny, transaktywujący RNA (tracrRNA), aby oddziaływał poprzez częściową homologię z crRNA.</li>
</ol>
3. Elementarzy przesiewowych do usuwania projektów
<ol>
	<li>Zaprojektuj startery obejmujące miejsca cięcia gRNA do testu mutacji T7E1.</li>
	<li>Użyj starterów w odległości co najmniej 100 pz od przewidywanego miejsca rozszczepienia, aby zapewnić, że po teście mutacji pojawią się małe insercja-delecja (indele) w miejscu docelowym sgRNA na 1,5% żelu agarozowym. Tabela 2 przedstawia startery, które są używane do amplifikacji ektodomeny TGFBR2.</li>
</ol>
4. Transdukcja ludzkich pierwotnych i ekspandowanych komórek NK
Uwaga: Transdukcja elementów Cas9/RNPs do NK odbywa się za pomocą elektroporacji przy użyciu systemu 4D w następujący sposób.
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek 
	<ol>
		<li>W przypadku pierwotnych komórek NK inkubować świeżo wyizolowane komórki NK w pożywce RPMI w obecności 100 j.m./ml IL-2 przez 4 dni i przeprowadzić elektroporację w 5. dniu. Pożywkę należy wymieniać co drugi dzień, zgodnie z wcześniejszym opisem i dzień przed transdukcją.</li>
		<li>W przypadku ekspandowanych komórek NK należy stymulować komórki w dniu 0 napromieniowanymi ogniwami zasilającymi w stosunku 1:1 i przeprowadzić elektroporację w dniu 5 lub 6 lub 7. Pożywkę należy wymieniać co drugi dzień, zgodnie z wcześniejszym opisem i dzień przed transdukcją.</li>
		<li>W dniu elektroporacji przygotować kolbę T25 wypełnioną 8 ml świeżego RPMI zawierającego 100 j.m./ml IL-2 dla komórek poddawanych elektroporacji i kolby do wstępnej inkubacji w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 . 
		nuta: Rozmrożone komórki lub komórki, które przeszły 2. lub 3. stymulację, mogą być elektroporowane w dowolnym momencie po ich odzyskaniu, jak opisano.</li>
		<li>Weź 3 - 4 × 106 komórek na warunek na 26 μl mieszanki transdukcyjnej. 
		nuta: Bardzo wysokie stężenie ogniw NK w roztworze do elektroporacji zwiększa szybkość transdukcji.</li>
		<li>Umyj komórki 3 razy PBS, aby usunąć cały FBS, który zwykle zawiera aktywność RNazy. Wiruj je za każdym razem w 300 x g przez 8 minut. 
		nuta: Rozważ 7 warunków elektroporacji dla Cas / RNP jako pojedyncze gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) i kombinację dwóch gRNA (gRNA1 + gRNA2, gRNA1 + gRNA3, gRNA2 + gRNA3) i jedną kontrolę bez Cas9 / RNP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzą crRNA:tracerRNA/kompleks
	<ol>
		<li>Zawiesić crRNA (gRNA1, gRNA2 i gRNA3) i tracerRNA w 1x roztworze TE do końcowych stężeń 200 μM. Wymieszać 2,2 μl każdego 200 μM gRNA z 200 μM tracerRNA, jak pokazano w tabeli 3.</li>
		<li>Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut i pozostawić do ostygnięcia na blacie stołu do temperatury pokojowej (15–25 °C). Przechowywać zawieszone RNA i crRNA: tracerRNA/kompleks w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzą kompleks RNP 
	Uwaga: Aby zaoszczędzić czas, należy utworzyć kompleks RNP na etapie prania 4.1.5.
	<ol>
		<li>W przypadku pojedynczej reakcji dupleksowej crRNA:tracrRNA rozcieńczyć endonukleazę Cas9 do 36 μM, jak pokazano w przykładzie w tabeli 4.</li>
		<li>W przypadku transdukcji skojarzonej dupleksów crRNA:tracrRNA należy rozcieńczyć endonukleazę Cas9 do 36 μM, jak pokazano w przykładzie w tabeli 5. </li>
		<li>Dodaj endonukleazę Cas9 do crRNA: tracrRNA dupleksuje powoli, obracając końcówkę pipety, przez 30 s do 1 minuty.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15 - 20 minut. Jeśli mieszanina nie jest gotowa do użycia po inkubacji, należy przechowywać mieszaninę na lodzie do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektroporacja 
	<ol>
		<li>Dodaj cały suplement do roztworu do elektroporacji P3 i przechowuj go w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zawiesić osad ogniw (3 - 4 × 106 ogniw z kroku 4.1.5) w 20 μl pierwotnego roztworu do elektroporacji P3 4D. Unikaj pęcherzyków powietrza podczas pipetowania. 
		Uwaga: Komórek nie należy pozostawiać przez dłuższy czas w roztworze P3.</li>
		<li>Natychmiast dodać 5 μl kompleksu RNP (krok 4.3) do zawiesiny komórek.</li>
		<li>Dodaj 1 μl 100 μM wzmacniacza elektroporacji Cas9 do mieszanki Cas9/RNPs/cell.</li>
		<li>Przenieś mieszaninę Cas9/RNPs/ogniw do pasków elektroporacyjnych o pojemności 20 μl.</li>
		<li>Delikatnie postukaj w paski, aby upewnić się, że próbka zakrywa spód pasków.</li>
		<li>Uruchom system elektroporacji 4D i wybierz program EN-138.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Po transdukcji
<ol>
	<li>Pozwól komórkom odpocząć przez 3 minuty w paskach.</li>
	<li>Dodać 80 μl wstępnie zbilansowanej pożywki hodowlanej do kuwety i delikatnie przenieść próbkę do kolb.</li>
	<li>48 godzin po transdukcji wyekstrahuj genomowe DNA z 5 × 105 komórek w celu przeprowadzenia badań przesiewowych w kierunku delecji genów.</li>
	<li>Amplifikuj interesujący nas gen za pomocą starterów zaprojektowanych w kroku 3.2 z zestawami polimerazy DNA Taq.</li>
	<li>Utworzyć heterodupleksy amplikonu PCR do roztwarzania T7EI i inkubować produkt przez 30 - 60 minut z enzymem T7EI w temperaturze 37 °C. 
	nuta: Test T7EI jest preferowany do badań przesiewowych, ponieważ jest szybki, prosty i zapewnia czyste wyniki elektroforezy w porównaniu z testem geodezyjnym. Jednak ta metoda nie może wykryć insercji i delecji zasad <2, które są generowane przez aktywność niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) w eksperymentach Cas9 RNPs14.</li>
	<li>Uruchom strawione DNA na 1,5% żelu agarozowym pod napięciem 110 V przez 30 - 45 minut, co 15 minut wizualizuj żel.</li>
	<li>Stymuluj resztę komórek za pomocą komórek zasilających wykazujących ekspresję mbIL21 w stosunku 1:1.</li>
	<li>Pięć dni po stymulacji wyekstrahuj RNA do poziomu ekspresji genów za pomocą qPCR.</li>
	<li>Przeprowadź testy kalceiny zgodnie z wcześniejszymi raportami12. Krótko mówiąc, załaduj komórki docelowe kalceiną AM (w pokazanym przykładzie użyto 3 μg / ml / 1 000 000 ogniw DAOY). Przygotować komórki NK do testów cytotoksyczności, odpoczywając przez noc w IL2 (100 IU / ml) plus lub minus 10 ng / ml rozpuszczalnego TGFβ. Przeprowadzaj testy kalceiny w tych samych cytokinach, w których komórki NK odpoczywały przez noc.</li>
</ol>

<ol><li>Guven, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells+by+retroviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction.</a> Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).</li>
<li>Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).</li>
<li>Carlsten, M., Childs, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Manipulation+of+NK+Cells+for+Cancer+Immunotherapy%3A+Techniques+and+Clinical+Implications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications.</a> Frontiers in Immunology. 6, 266(2015).</li>
<li>Mehta, R. S., Rezvani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+Expressing+Natural+Killer+Cells+for+the+Immunotherapy+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer.</a> Frontiers in Immunology. 283, 9(2018).</li>
<li>Zuris, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-mediated+delivery+of+proteins+enables+efficient+protein-based+genome+editing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+delivery+of+genome-editing+proteins+using+bioreducible+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles.</a> PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).</li>
<li>Liang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+DNA-free+genome+editing+of+bread+wheat+using+CRISPR%2FCas9+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Nature Communications. 8, 14261(2017).</li>
<li>DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+via+delivery+of+Cas9+ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein.</a> Methods. , 9-15 (2017).</li>
<li>Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Natural+Killer+Cells+for+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy.</a> Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).</li>
<li>Sutlu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+intracellular+antiviral+defense+mechanisms+augments+lentiviral+transduction+of+human+natural+killer+cells%3A+implications+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).</li>
<li>Viel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+inhibits+the+activation+and+functions+of+NK+cells+by+repressing+the+mTOR+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway.</a> Science Signaling. 9 (415), (2016).</li>
<li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion%2C+purification%2C+and+functional+assessment+of+human+peripheral+blood+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells.</a> JoVE. (48), (2011).</li>
<li>Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition%2C+preparation%2C+and+functional+assessment+of+human+NK+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy.</a> Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).</li>
<li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5 (3), Bethesda. 407-415 (2015).</li>
<li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR%2FCas9+enhances+tumour+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+efficient+mammalian+cell+engineering+via+Cas9+protein+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection.</a> Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Chmielecki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Profiling+of+a+Large+Set+of+Diverse+Pediatric+Cancers+Identifies+Known+and+Novel+Mutations+across+Tumor+Spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra.</a> Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).</li>
<li>Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+immunotherapy+for+pediatric+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors.</a> Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).</li>
</ol>

DAL służy/służył jako konsultant dla Courier Therapeutics, Obsidian Therapeutics, Intellia Therapeutics, Merck Research Laboratories i Miltenyi Biotec, a także posiada udziały w CytoSen Therapeutics.

Zależna od DNA modyfikacja komórek NK stanowi wyzwanie 4,9. W związku z tym wprowadziliśmy bezpośrednio syntetycznie preformowany kompleks rybonukleoproteinowy (RNPs) i białko Cas9 jako oczyszczone białko do pierwotnych i ekspandowanych komórek NK8. Ta metoda pozwoliła nam wyeliminować capping, tailing i inne procesy transkrypcyjne i translacyjne zapoczątkowane przez polimerazę RNA II, które mogą powodować apoptozę komórek NK związaną z me...

Immunoterapia nowotworów została rozwinięta w ostatnich latach. Genetycznie zmodyfikowane limfocyty T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) są doskonałym przykładem zmodyfikowanych komórek odpornościowych, które z powodzeniem znajdują zastosowanie w immunoterapii nowotworów. Komórki te zostały niedawno zatwierdzone przez FDA do leczenia nowotworów złośliwych komórek B CD19 +, ale sukces do tej pory ograniczał się do chorób zawierających kilka docelowych antygenów, a celowanie w tak ograniczony repertuar antygenowy jest podatne na niepowodzenie w wyniku ucieczki immunologicznej. Ponadto limfocyty CAR T skoncentrowano na wykorzystaniu autologicznych limfocytów T ze względu na ryzyko choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi wywołanej przez allogeniczne limfocyty T. W przeciwieństwie do tego, komórki NK są w stanie zabijać cele nowotworowe w sposób niezależny od antygenu i nie powodują GvHD, co czyni je dobrym kandydatem do immunoterapii raka6,7,8,9.
Technologia CRISPR/Cas9 została ostatnio wykorzystana w inżynierii komórek odpornościowych, ale genetyczne przeprogramowanie komórek NK za pomocą plazmidów zawsze było wyzwaniem. Było to spowodowane trudnościami w dostarczaniu transgenów w sposób zależny od DNA, takimi jak transdukcja lentiwirusowa i retrowirusowa, powodująca znaczną apoptozę komórek NK związaną z procedurą i ograniczoną produkcję genetycznie modyfikowanych komórek NK4,9.
Wiele wrodzonych komórek odpornościowych wykazuje wysoki poziom receptorów dla wzorców molekularnych związanych z patogenami, takich jak gen I (RIG-I) indukowany kwasem retinowym, który umożliwia zwiększone rozpoznawanie obcego DNA. Tłumienie tych szlaków umożliwiło wyższą wydajność transdukcji w komórkach NK przy użyciu metod modyfikacji genetycznej opartych na DNA10.
Opisujemy tutaj metodę edycji genomu pierwotnych i rozszerzonych ludzkich komórek NK bez użycia DNA, wykorzystujących kompleksy rybonukleoproteinowe Cas9 (Cas9/RNP). Cas9 / RNPs składa się z trzech składników, rekombinowanego białka Cas9 skompleksowanego z syntetycznym jednoprowadnicowym RNA składającym się ze skompleksowanego crRNA i tracerRNA. Te Cas9 / RNP są zdolne do rozszczepiania celów genomowych z większą wydajnością w porównaniu z obcymi podejściami zależnymi od DNA ze względu na ich dostarczanie w postaci funkcjonalnych kompleksów. Dodatkowo, szybki usuwany Cas9 / RNP z komórek może zmniejszyć efekty niezamierzone, takie jak indukcja apoptozy. W związku z tym mogą być używane do generowania knock-outów lub knock-inów w połączeniu z DNA w celu rekombinacji homologicznej6,7. Wykazaliśmy, że elektroporacja Cas9/RNP jest łatwą i stosunkowo skuteczną metodą, która pokonuje dotychczasowe ograniczenia modyfikacji genetycznej w komórkach NK.
TGFβ jest główną cytokiną immunosupresyjną, która hamuje aktywację i funkcje komórek NK. Sugeruje się, że celowanie w szlak TGFβ może zwiększyć funkcje komórek odpornościowych. Skupiliśmy się na regionie kodującym ektodomenę TGBR2, która wiąże TGFβ11. Reprezentatywne wyniki wskazują na znaczny spadek poziomu ekspresji mRNA tego genu i dodatkowo pokazują, że zmodyfikowane komórki NK stają się odporne na TGFβ. Ponadto zmodyfikowane komórki zachowują żywotność i potencjał proliferacyjny, ponieważ są w stanie rozrastać się po elektroporacji za pomocą napromieniowanych ogniw zasilających. Dlatego poniższa metoda jest obiecującym podejściem do genetycznej manipulacji komórkami NK do dalszych celów klinicznych lub badawczych.

<table><tbody><tr><td>RozetaSep&handel; Ludzki koktajl wzbogacający komórki NK</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>15065</td><td>RozetaSep&trade; Ludzki koktajl wzbogacający komórki NK jest przeznaczony do izolowania komórek NK z krwi pełnej poprzez selekcję negatywną.</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque&reg; PLUS</td><td>GE Healthcare - Nauki Biologiczne</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>1072532</td><td>TracrRNA, który zawiera zastrzeżone modyfikacje chemiczne nadające zwiększoną odporność na nukleazy. Hybrydyzuje z crRNA w celu aktywacji enzymu Cas9</td></tr><tr><td>Alt-R&reg; CRISPR-Cas9 crRNA</td><td>Zintegrowane technologie</td><td></td> DNA <td>Syntetycznie wytwarzane jako Alt-R&reg; CrRNA CRISPR-Cas9, oparty na sekwencji zaprojektowanego gRNA ukierunkowanego na gen zainteresowania</td></tr><tr><td>Alt-R&reg; Zestaw do wykrywania edycji genomu</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>1075931</td><td>Każdy zestaw zawiera endonukleazę T7EI, bufor reakcyjny T7EI i kontrolę testu T7EI.</td></tr><tr><td>Platyna&reg; Taq DNA Polimeraza High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>11304-011</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector&handel; System</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie rekombinowane białko IL-2</td><td>Novartis</td><td>65483-0116-07</td><td></td></tr><tr><td>P3 Komórka pierwotna 4D-Nucleofector&handel; X Kit</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td>Zawiera pmaxGFP&trade; Wektor, Nucleofector&handel; Roztwór, suplement, 16-dołkowy nukleokulet i handel; Paski</td></tr><tr><td>bez celowania: Niestandardowe siRNA, standardowe 0,05 2mol ON-TARGETplus</td><td>Dharmacon</td><td>CTM-360019</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; S.p. Cas9 Nukleaza 3NLS</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>1074181</td><td>Cas9 Nukleaza</td></tr><tr><td>DNeasy&reg; Krew & Podręcznik tkanek</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>ThermoFisher</td><td>C3099</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta;</td><td>Biolegend</td><td>580706</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; Zestaw kontrolny CRISPR-Cas9, Human</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1072554</td><td>Zawiera tracrRNA, crRNA kontroli pozytywnej HPRT, crRNA kontroli negatywnej # 1, mieszankę starterów HPRT i bufor dupleksowy bez nukleaz.</td></tr><tr><td>IDTE pH 7,5 (1X roztwór TE)</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>11-01-02-02</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; Cas9 Electroporation Enhancer</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>1075915</td><td>Cas9 Electroporation Enhancer</td></tr></tbody></table>

generowanie nokautujących pierwotnych i ekspandowanych ludzkich komórek nk przy użyciu rybonukleoprotein cas9

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

Technologia CRISPR/Cas9 przyspiesza inżynierię genomu w wielu typach komórek, ale jak dotąd, dostarczanie genów i stabilna modyfikacja genów były wyzwaniem w pierwotnych komórkach NK. Na przykład dostarczanie transgenu za pomocą transdukcji lentiwirusowej lub retrowirusowej skutkowało ograniczoną wydajnością genetycznie modyfikowanych komórek NK z powodu znacznej apoptozy komórek NK związanej z zabiegiem. Opisujemy tutaj bezDNA metodę edycji genomu ludzkich pierwotnych i ekspandowanych komórek NK przy użyciu kompleksów rybonukleoproteinowych Cas9 (Cas9 / RNP). Metoda ta pozwoliła na skuteczny nokaut genów TGFBR2 i HPRT1 w komórkach NK. Dane RT-PCR wykazały znaczny spadek poziomu ekspresji genów, a test cytotoksyczności reprezentatywnego produktu komórkowego sugerował, że zmodyfikowane RNP komórki NK stały się mniej wrażliwe na TGFβ. Genetycznie zmodyfikowane komórki mogą być namnażane po elektroporacji poprzez stymulację napromieniowanymi komórkami zasilającymi z ekspresją mbIL21.

Wydajność elektroporacji
Aby zoptymalizować elektroporację kompleksów Cas9/RNP, przetestowano 16 różnych programów podczas transdukcji niecelującego siRNA GFP oraz plazmidu DNA do komórek NK. Analiza cytometryczna wykazała, że program EN-138 zapewnił najwyższy odsetek żywotności komórek i wydajność transdukcji (35% żywych komórek GFP-dodatnich) dla obu cząstek (Rysunek 1 &amp;#38; <str...

Tutaj prezentujemy protokół genetycznej modyfikacji pierwotnych lub rozszerzonych komórek NK (ang. human natural killer) za pomocą rybonukleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Korzystając z tego protokołu, wygenerowaliśmy ludzkie komórki NK z niedoborem receptora 2 czynnika wzrostu b (TGFBR2) i fosforybozylotransferazy hipoksantynowej 1 (HPRT1).

Generowanie nokautujących pierwotnych i ekspandowanych ludzkich komórek NK przy użyciu rybonukleoprotein Cas9

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórek NK dotyczące roli i funkcji określonych genów i szlaków, które regulują funkcję komórek efektorowych. Główną zaletą tej techniki jest jej wysoki wskaźnik sukcesu w porównaniu z podejściami zależnymi od DNA, co ułatwia wysoce skuteczny nokaut jednego z najbardziej istotnych klinicznie genów w terapii komórkami NK. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku immunoterapii guzów litych i guzów mózgu, które wyrażają TGF-beta jako sposób ucieczki immunologicznej.W przypadku pierwotnej transdukcji komórek NK inkubować trzy razy po 10 do pięciu świeżo wyizolowanych komórek NK na mililitr pożywki RPMI uzupełnionej 100 IU na mililitr IL2 na kolbę T75 przez cztery dni, zastępując pożywkę co drugi dzień i dzień przed transdukcją. W celu rozszerzonej transdukcji komórek NK, stymuluj pierwotne komórki NK w dniu zero za pomocą wypromieniowanych, związanych z błoną komórek zasilających K562 eksprymujących IL21 w stosunku jeden do jednego, zastępując pożywkę co drugi dzień i dzień przed transdukcją. W dniu elektroporacji napełnić jedną kolbę T25 ośmioma mililitrami świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej 100

generation-knock-out-primary-expanded-human-nk-cells-using-cas9

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje technikę genetycznej modyfikacji komórek NK za pośrednictwem rybonukleoproteiny Cas9. Rybonukleoproteina Cas9, składająca się z endonukleazy Cas9 związanej z przewodnikiem RNA (gRNA) utworzonego przez parowanie zasad CRISPR RNA (crRNA) i transaktywującego crRNA (tracrRNA), jest wprowadzana do pierwotnych komórek NK za pomocą elektroporacji. Rybonukleoproteina atakuje i rozszczepia DNA gospodarza w miejscu docelowym, prowadząc do nokautu genu poprzez modyfikację genu...

Technika edycji genów w komórkach NK przy użyciu CRISPR Cas9

Narzędzia do edycji genomu, takie jak system CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (związany z CRISPR), znacznie poprawiły skuteczność celowania w geny w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hiPSC). Niniejszy manuskrypt opisuje protokół generowania specyficznego dla linii reportera hiPSC przy użyciu rekombinacji homologicznej wspomaganej systemem CRISPR/Cas.

Wydajne generowanie reporterów knockin specyficznych dla linii neuronowej hiPSC przy użyciu systemu podwójnej nickazy CRISPR/Cas9 i Cas9

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Opracowaliśmy prosty i tani protokół ładowania kompleksów rybonukleoproteinowych Cas9/jednoprowadnicowego RNA (sgRNA) w cząsteczkach wirusopodobnych. Cząstki te, zwane "nanoostrzami", umożliwiają skuteczne dostarczanie kompleksu Cas9/sgRNA w komórkach unieśmiertelnionych i pierwotnych, a także in vivo.

Dostarczanie kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9/sgRNA do komórek unieśmiertelnionych i pierwotnych za pośrednictwem cząstek wirusopodobnych ("nanoostrzy")

Ten protokół wykorzystuje fluorescencyjne reportery i sortowanie komórek, aby uprościć eksperymenty z wykorzystaniem fagów i linii komórek T. Do tych uproszczonych eksperymentów knock-in stosuje się dwa plazmidy, a mianowicie plazmid z ekspresją CRISPR/Cas9 i DsRed2 oraz plazmid dawcy z ekspresją rekombinacji homologicznej EBFP2, który jest trwale zintegrowany w locus Rosa26 w komórkach odpornościowych.

Knock-in genu przez CRISPR/Cas9 i sortowanie komórek w liniach makrofagów i limfocytów T

Protokół opisuje, jak generować nokautujące mioblasty za pomocą CRISPR/Cas9, zaczynając od projektowania przewodników RNA, aż po klonowanie komórkowe i charakterystykę klonów nokautujących.

Rozwój nokautujących linii komórkowych mięśni przy użyciu edycji genów CRISPR/Cas9 za pośrednictwem lentiwirusa

W miarę jak protokoły związane z CRISPR stają się coraz bardziej użyteczne i dostępne, w określonych warunkach eksperymentalnych nadal mogą pojawić się komplikacje i przeszkody. Protokół ten przedstawia w zarysie tworzenie wchodzącej w interakcję z receptorem ludzkiej linii komórkowej kinazy serynowo-treoninowej 1 (RIPK1/RIP1) przy użyciu CRISPR/Cas9 i podkreśla potencjalne wyzwania napotkane podczas tego procesu.

Generowanie linii komórkowej U937 z nokautem RIP1 przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

W niniejszej pracy opisujemy metodę wydajnej ekspansji i oczyszczania dużych ilości ludzkich komórek NK oraz oceny ich funkcji.

Ekspansja, oczyszczanie i ocena funkcjonalna ludzkich komórek NK z krwi obwodowej

Poznaj metodę edycji genów w ludzkich komórkach NK przy użyciu rybonukleoprotein Cas9. Technika umożliwia generowanie nokautujących linii komórkowych z wysoką wydajnością, wspierając badania nad immunoterapią nowotworów.

Generowanie nokautujących pierwotnych i ekspandowanych ludzkich komórek NK przy użyciu rybonukleoprotein Cas9

Przeglądaj więcej filmów