Badanie ekspresji genów regulowanej cyklem komórkowym za pomocą dwóch uzupełniających się protokołów synchronizacji komórek

Ogólnym celem tego protokołu jest zapewnienie kontekstu dla analizy ekspresji genów w sposób specyficzny dla cyklu komórkowego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nowotworów związane ze zdarzeniami transkrypcyjnymi zależnymi od cyklu komórkowego, które leżą u podstaw transformacji nowotworowej, a także leczenia przeciwnowotworowego. Główną zaletą tego protokołu jest to, że ustala on z dokładnością wzorce ekspresji genów specyficzne dla fazy cyklu komórkowego zarówno w warunkach numer dwa, jak i po ekspozycji na chemioterapię.

Do tego eksperymentu wykorzystywane są komórki U2OS, które należy wysiać w 100-milimetrowych szalkach wieczorem około godziny 19:00, aby kolejne kroki można było przeprowadzić w godzinach pracy. Pozwól komórkom przyczepić się, inkubując naczynia w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 przez 24 godziny.

Następnego dnia zbadaj komórki, aby potwierdzić, że są w 50% zbieżności. W przypadku bloku tymidyny dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego 200-milimolowego bulionu tymidyny do każdej 100-milimetrowej płytki hodowlanej. Inkubuj komórki z tymidyną w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 przez 20 godzin.

Następnego dnia, około godziny trzeciej, uwolnij komórki z bloku tymidyny, usuwając pożywkę wzrostową zawierającą tymidynę. Umyj komórki dwukrotnie wstępnie podgrzanym 1X PBS.

A następnie dodaj 10 mililitrów kompletnego podłoża do każdego 100-milimetrowego naczynia. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć godzin. W celu zatrzymania komórek mitotycznych dodać nokodazol do końcowego stężenia 50 nanogramów na mililitr.

Inkubować komórki z nokodazolem nie dłużej niż 10 do 11 godzin. Następnego ranka, między szóstą a siódmą rano, sprawdź komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić, że są rzeczywiście zablokowane w G2-M, na co wskazuje ich zaokrąglony wygląd.

Odłączyć komórki mitotyczne, potrząsając każdą płytką i delikatnie pipetując pożywkę zawierającą nokodazol z odłączonymi komórkami z każdej płytki o średnicy 100 milimetrów. Połącz komórki mitotyczne ze wszystkich naczyń w sterylnej probówce o pojemności 50 mililetów. Wirować 300 razy g przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza.

Umyj komórki dwukrotnie, dodając zimny 1X PBS, a następnie odwiruj. Po usunięciu PBS z drugiego płukania, ponownie zawiesić komórki mitotyczne w kompletnej pożywce hodowlanej. Zaoszczędź dwa mililitry na ekstrakcję RNA i dwa mililitry na analizę FACS dla punktu czasowego godziny zero.

Ponownie płytkuj pozostałe komórki mitotyczne dla kolejnych punktów czasowych na sześciu płytkach dołkowych. Aby rozpocząć tę procedurę, wysiewaj 0,25 razy 10 do szóstej komórki U2OS na studzienkę w sześciu płytkach dołkowych. Na pokrywie każdej płytki z sześcioma dołkami napisz warunki doświadczalne dla każdej studzienki.

Na przykład nieleczone lub leczone różnymi stężeniami leku i punktami czasowymi. Pozwól komórkom przyczepić się, inkubując sześć płytek dołkowych przez noc. Następnego ranka zbadaj komórki, aby upewnić się, że są w 50% zbieżności.

Usuń całe podłoże z dołków i dodaj dwa mililitry wstępnie podgrzanej, wolnej od FBS pożywki DMEM-Glutaminy na dołek. Inkubuj komórki przez dodatkowe 24 godziny. Aby zatrzymać komórki za pomocą hydroksymocznika, usuń pożywkę ze studzienek i zastąp świeżo przygotowanymi czterema mikromolowymi hydroksymocznikami zawierającymi kompletną pożywkę.

Inkubować komórki w pożywce zawierającej hydroksymocznik przez 24 godziny. Przed uwolnieniem komórek z zatrzymania za pośrednictwem hydroksymocznika należy sprawdzić komórki, aby potwierdzić, że są zatrzymane. Usuń pożywkę zawierającą hydroksymocznik ze studzienek i dwukrotnie przepłucz studzienki wstępnie podgrzanym 1X PBS.

Po wyjęciu PBS z drugiego prania dodaj dwa mililitry kompletnego podłoża na studzienkę. Przechowywać płytki w inkubatorze do czasu pobrania próbki. Próbki z obu protokołów synchronizacji są pobierane w ten sam sposób do analizy FACS i do ekstrakcji RNA.

Do analizy FACS przepłucz każdą studzienkę dwoma mililitrami wstępnie podgrzanego 1X PBS, a następnie dodaj 0,3 mililitra wstępnie podgrzanego roztworu trypsyny-EDTA, aby odłączyć komórki. Po pięciu minutach dezaktywuj Trypsinę-EDTA, dodając jeden mililitr kompletnej pożywki. Zbierz każdą próbkę do osobnej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Odwirować komórki w temperaturze 300 razy G w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Wyrzuć supernatant, przemyj 1X PBS i ponownie odwiruj. Usuń PBS i zachowaj osad komórkowy.

Aby naprawić komórki, ponownie zawieś każdą osadkę komórkową w jednym mililitrze schłodzonego 70% etanolu, delikatnie wirując. Umieść komórki na lodzie na około 15 minut przed barwieniem jodkiem propidyny i analizą FACS. W celu ekstrakcji RNA usuń pożywkę i przepłucz każdą studzienkę dwoma mililitrami wstępnie podgrzanego 1X PBS.

Przenieść płytkę do szafki bezpieczeństwa i dodać jeden mililitr odpowiedniego odczynnika do izolacji RNA na studzienkę. Pipetować w górę iw dół, aby pipetować i lizować komórki, a następnie przenieść każdy lizat komórkowy do 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Procedurę ekstrakcji RNA należy rozpocząć od wyjęcia z zamrażarki probówek do mikrowirówek z próbkami w odczynniku do izolacji RNA i rozmrożenia ich w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa na chemikalia. Dodać 400 mikrolitrów chloroformu do każdej próbki i energicznie wstrząsać bez wirowania, aż do całkowitego wymieszania. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Odwiruj probówki przez 15 minut w mikrowirówce stołowej. Przenieść fazę wodną każdej próbki do nowej probówki do mikrowirówki o średnicy 1,5 mililitra. Dodawaj powoli jedną objętość 100% etanolu, kropla po kropli, do fazy wodnej podczas mieszania.

Nie odwirowywać. Przenieś do 700 mikrolitrów każdej próbki, w tym osad, który mógł uformować się w kolumnę wirową, w dwumililitrowej probówce zbiorczej dostarczonej przez komercyjny zestaw do mini-przygotowania RNA, i zamknij pokrywkę. Wirować przez 15 sekund.

Odrzuć przepływ. Jeśli zaczynasz od więcej niż 700 mikrolitrów na próbkę, przenieś pozostałą próbkę do kolumny wirowej i ponownie odwiruj. Po umyciu RNA zgodnie z instrukcjami producenta, wymyj każdą próbkę, pipetując od 30 do 40 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do kolumny wirowej i odwirowując w temperaturze pokojowej przez jedną minutę.

Oznaczyć stężenie RNA i czystość próbek za pomocą pomiarów absorbancji. Przechowuj próbki RNA w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu wykorzystania do analizy ekspresji genów. Leczenie protokołem tymidyna-nokodazol zatrzymuje komórki U2OS we wejściu w fazę m i zapewnia populację komórek, która postępuje synchronicznie przez G1 i do fazy S, jak wykazano w analizie cytometrii przepływowej.

Leczenie protokołem hydroksymocznika zatrzymuje komórki na granicy G1/S. Po uwolnieniu komórki przechodzą synchronicznie przez fazy S i G2. Protokół tymidyna-nokodazol jest najbardziej odpowiedni do analizy profili mRNA genów z pikową ekspresją w fazie G1.

Jak pokazano dla wyrażenia E2F1. Natomiast protokół hydroksymocznika działa lepiej w analizie genów o preferencyjnej ekspresji w S lub G2, jak pokazano w przypadku ekspresji E2F7. Cykl komórkowy jest zwykle zaburzony przez leki przeciwnowotworowe, wykazano trwałe zatrzymanie fazy G2 narzucone mitomycyną C w komórkach zsynchronizowanych z hydroksymocznikiem.

Sychronizacja komórek pomaga odróżnić geny, które reagują na środek przeciwnowotworowy, od tych, na które wpływają wyłącznie zaburzenia cyklu komórkowego narzucone przez środek, na przykład obniżenie poziomu mRNA E2F1 po leczeniu mitomycyną C jest prawdopodobnie pośrednim wpływem leku na dynamikę cyklu komórkowego. Natomiast szczyt ekspresji mRNA p21-Cip1 po leczeniu mitomycyną C jest bezpośrednio wynikiem programu transkrypcyjnego wyzwalanego przez ten lek. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić analizę transkryptomiczną całego genomu, a także analizę proteomiczną, w celu wyjaśnienia globalnych zmian ekspresji genów wpływających na określone fazy cyklu komórkowego.

Albo w stanach numer dwa, albo na leczeniu przeciwnowotworowym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć procedury, które są wymagane do przeprowadzenia analizy ekspresji genów w zsynchronizowanych hodowlach komórkowych. Nie zapominaj, że praca z odczynnikami do izolacji jodku propidyny lub RNA może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak rękawice i szafa bezpieczeństwa na chemikalia.