Name: Wydajne i skalowalne ukierunkowane różnicowanie klinicznie kompatybilnych komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Poznaj metodę różnicowania komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych bez użycia komórek podajnikowych. Protokół umożliwia wydajną produkcję komórek klinicznej jakości do terapii rogówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie było wspierane przez Akademię Fińską (grant numer 297886), program części zamiennych dla ludzi firmy Tekes, Fińską Agencję Finansowania Technologii i Innowacji, Fińską Fundację Banku Oczu i Tkanek oraz Fińską Fundację Kultury. Autorzy dziękują technikom laboratorium biomedycznego Outi Melin, Hannie Pekkanen, Emmie Vikstedt i Outi Heikkilä za doskonałą pomoc techniczną i wkład w hodowlę komórkową. Profesor Katriina Aalto-Setälä została uznana za autorkę zastosowanej linii hiPSC oraz placówki BioMediTech Imaging Core za dostarczenie sprzętu do obrazowania fluorescencyjnego.

<ol><li>Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+epithelial+crypts%3A+a+novel+anatomical+structure+and+a+putative+limbal+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche.</a> The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).</li>
<li>Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+and+corneal+epithelial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Limbal and corneal epithelial homeostasis.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).</li>
<li>Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoforms+of+DeltaNp63+and+the+migration+of+ocular+limbal+cells+in+human+corneal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).</li>
<li>Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+stem-cell+therapy+and+long-term+corneal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).</li>
<li>Notara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+sickness+and+in+health%3A+Corneal+epithelial+stem+cell+biology%2C+pathology+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy.</a> Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).</li>
<li>Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+limbal+epithelium+of+the+eye--a+review+of+limbal+stem+cell+biology%2C+disease+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%3A+News+and+Reviews+in+Molecular%2C+Cellular+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).</li>
<li>Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+clinical+implementation+of+corneal+epithelial+stem+cell+therapy+for+treatment+of+unilateral+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).</li>
<li>Sangwan, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+outcomes+of+xeno-free+autologous+cultivated+limbal+epithelial+transplantation%3A+a+10-year+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study.</a> The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).</li>
<li>Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+limbal+epithelial+transplantation+%28SLET%29+in+failed+cultivated+limbal+epithelial+transplantation+%28CLET%29+for+unilateral+chronic+ocular+burns%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns.</a> The British Journal of Ophthalmology. , (2018).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+corneal+epithelial-like+cells+by+in+vitro+replication+of+the+corneal+epithelial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).</li>
<li>Hanson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+embryonic+stem+cells+onto+a+partially+wounded+human+cornea+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro.</a> Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+corneal+epithelial+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+human+dermal+fibroblast+and+corneal+limbal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45435(2012).</li>
<li>Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+epithelial+tissues+generated+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).</li>
<li>Shalom-Feuerstein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell+model+reveals+essential+roles+for+miR-450b-5p+and+miR-184+in+embryonic+corneal+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification.</a> Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).</li>
<li>Cieslar-Pobuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+transdifferentiation+into+corneal+epithelial-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells.</a> Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).</li>
<li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culturing+and+cloning+of+human+pluripotent+stem+cells+on+laminin-521-based+matrices+under+xeno-free+and+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).</li>
<li>Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+induction+promotes+corneal+epithelial+cell+differentiation+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).</li>
<li>Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+Culture+Time+Point+to+Induce+Corneal+Epithelial+Differentiation+in+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).</li>
<li>Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+corneal+epithelial+progenitor+cells+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions.</a> PLoS One. 12 (8), e0183303(2017).</li>
<li>Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+limbal+epithelial+cells+%28LiPSC%29+as+a+cellular+alternative+for+in+vitro+ocular+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing.</a> PLoS One. 12 (6), e0179913(2017).</li>
<li>Kamarudin, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+Activity+of+Endogenous+Bone+Morphogenetic+Protein+Signaling+Impact+on+the+Ability+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+to+Differentiate+to+Corneal+Epithelial-Like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells.</a> Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521%2FE-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5, 3195(2014).</li>
<li>Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-+and+feeder-free+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+two+distinct+ocular+epithelial+cell+types+using+simple+modifications+of+one+method%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4(2017).</li>
<li>Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+three+new+human+embryonic+stem+cell+lines+in+Finland%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland.</a> In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).</li>
<li>Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+image-based+analysis+of+single+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocyte+beating+dynamics+using+digital+image+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation.</a> Biomedical Engineering Online. 13, 39(2014).</li>
<li>Ojala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation-Specific+Phenotypes+in+hiPSC-Derived+Cardiomyocytes+Carrying+Either+Myosin-Binding+Protein+C+Or+%CE%B1-Tropomyosin+Mutation+for+Hypertrophic+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy.</a> Stem Cells International. 2016, 1684792(2016).</li>
<li>Ali, R. R., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine%3A+DIY+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine: DIY eye.</a> Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).</li>
<li>International Stem Cell Initiative,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+ethnically+diverse+human+embryonic+stem+cells+identifies+a+chromosome+20+minimal+amplicon+conferring+growth+advantage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).</li>
<li>Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cornea+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 7, 41286(2017).</li>
<li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Oczekiwanym rezultatem tego protokołu jest pomyślne i solidne generowanie LESCs z jednokomórkowej zawiesiny FF hPSC w ciągu około 3,5 tygodnia. Ponieważ nabłonek rogówki rozwija się z ektodermy powierzchniowej29, pierwszym krokiem protokołu jest skierowanie hPSC w kierunku tej linii. Krótka 24-godzinna indukcja z antagonistą transformującego czynnika wzrostu beta (TGF-β) SB-505124 i bFGF są wykorzystywane do indukcji różnicowania ektodermalnego, a następnie 48-godzinna mezodermalna wskazówka BMP-4...

Przezroczysta rogówka na powierzchni oka pozwala światłu dostać się do siatkówki i zapewnia większość mocy refrakcyjnej oka. Najbardziej zewnętrzna warstwa, warstwowy nabłonek rogówki, jest stale regenerowany przez komórki macierzyste nabłonka rąbka (LESC). LESC znajdują się w warstwie podstawnej nisz rąbka na skrzyżowaniu korneo-twardówkowym1,2. LSC nie mają specyficznych i unikalnych markerów, więc ich identyfikacja wymaga bardziej szczegółowej analizy zestawu domniemanych markerów. Nabłonkowy czynnik transkrypcyjny p63, a zwłaszcza N-końcowo skrócony transkrypt izoformy alfa p63 (ΔNp63α), został zaproponowany jako odpowiedni dodatni marker LESC 3,4. Asymetryczny podział LESC pozwala im na samoodnawianie się, ale także na wytwarzanie potomstwa, które migruje dośrodkowo i do przodu. W miarę jak komórki zbliżają się do powierzchni rogówki, stopniowo tracą swoją łodygę i ostatecznie różnicują się w powierzchowne komórki płaskonabłonkowe, które są stale tracone z powierzchni rogówki.
Uszkodzenie którejkolwiek z warstw rogówki może prowadzić do poważnego zaburzenia widzenia, a wady rogówki są jedną z głównych przyczyn utraty wzroku na całym świecie. W niedoborze rąbków komórek macierzystych (LSCD) rąbek jest niszczony przez chorobę lub uraz, co prowadzi do spojówki i zmętnienia powierzchni rogówki, a następnie utraty wzroku5,6. Terapia zastępcza komórek z wykorzystaniem autologicznych lub allogenicznych przeszczepów rąbka ramiennego oferuje strategię leczenia dla pacjentów z LSCD4,7,8,9. Jednak pobieranie przeszczepów autologicznych niesie ze sobą ryzyko powikłań dla zdrowego oka, a tkanki dawcy jest niewystarczająca. Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC), w szczególności ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) i ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), mogą służyć jako nieograniczone źródło klinicznie istotnych typów komórek, w tym komórek nabłonka rogówki. W związku z tym LESC (HPSC-LESCs) pochodzące z hPSC stanowią atrakcyjne nowe źródło komórek w terapii wymiany komórek oka.
Tradycyjnie, zarówno metody hodowli niezróżnicowanych hPSC, jak i ich protokoły różnicowania do LESCs opierały się na użyciu niezdefiniowanych komórek żywiących, surowic zwierzęcych, kondycjonowanych pożywek lub błon owodniowych10,11,12,13,14,15. Ostatnio wysiłki na rzecz bezpieczniejszych produktów terapii komórkowej skłoniły do poszukiwania bardziej ustandaryzowanych i wolnych od ksenotypów protokołów hodowli i różnicowania. W rezultacie, kilka zdefiniowanych i wolnych od ksenotypów metod długotrwałej hodowli niezróżnicowanych hPSC jest obecnie dostępnych na rynku16,17,18. Jako kontinuum, niedawno wprowadzono protokoły ukierunkowanego różnicowania, które opierają się na sygnałach molekularnych, aby kierować hPSC do losu nabłonka rogówki19,20,21,22,23. Jednak wiele z tych protokołów wykorzystywało albo niezdefiniowane, oparte na karmie, hPSC jako materiał wyjściowy, albo złożone, ksenogeniczne koktajle czynników wzrostu w celu różnicowania.
Celem tego protokołu jest zapewnienie solidnej, zoptymalizowanej, wolnej od kseno- i karmy metody hodowli hPSC, a następnie różnicowanie jej na rogówkowe LESC. Jednowarstwowa hodowla pluripotencjalnych hPSC na matrycy lamininy-521 (LN-521) w zdefiniowanej, wolnej od albumin pożywce hPSC (w szczególności Essential 8 Flex) umożliwia szybkie wytwarzanie jednorodnego materiału wyjściowego do różnicowania. Następnie prosta, dwuetapowa strategia różnicowania kieruje hPSC w kierunku powierzchniowego losu ektodermalnego w zawiesinie, a następnie różnicowania adherentnego do LESC. Populacja komórek, w której > 65% wyraża ΔNp63α, uzyskuje się w ciągu 24 dni. Protokół bezksenologiczny i bezzasilający został przetestowany na kilku liniach hPSC (zarówno hESC, jak i hiPSC), bez konieczności optymalizacji specyficznej dla linii komórkowej. Opisane tutaj protokoły konserwacji bez weekendów, pasażu, kriokonserwacji i fenotypowania hPSC-LESC umożliwiają produkcję dużych partii wysokiej jakości LESC do celów klinicznych lub badawczych.

<table><tbody><tr><td>Materiał/Odczynnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS zawierający Ca2+ i Mg2+</td><td>Gibco</td><td>#14040-091</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS bez Ca2+ i Mg2+</td><td>Lonza</td><td>#17-512F/12</td><td></td></tr><tr><td>100 mm naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3296</td><td>Format naczynia hodowlanego dla adherentnego hPSC-LESC różnicowanie</td></tr><tr><td>Płytka 12-dołkowa</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3336</td><td>Format naczynia hodowlanego dla próbek IF</td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3337</td><td>Forma naczynia hodowlanego dla próbek IF</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>#31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa, nasadka Ultra-Low</td><td>Corning Costar</td><td>#3471</td><td>Format naczynia hodowlanego do indukcji w zawiesinie kultura</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anty-mysie Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-21202</td><td>Przeciwciało drugorzędowe dla IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anty-królik Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-21206</td><td>Przeciwciało drugorzędowe dla IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anty-kozie Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-11057</td><td>Przeciwciało drugorzędowe dla IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anty-mysie Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-10037</td><td>Przeciwciało drugorzędowe dla IF</td></tr><tr><td>Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF, człowiek)</td><td>PeproTech Inc.</td><td>#AF-100-18B</td><td>Niezwierzęcy rekombinowany ludzki FGF-basic (154 a.a.)</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Roztwór do utrwalania/przepuszczalności</td><td>BD Biosciences</td><td>#554722</td><td>Roztwór do utrwalania i przepuszczalności do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>BD Perm/Wash Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>#554723</td><td>Bufor płuczący do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#B0560</td><td></td></tr><tr><td>Białko morfogenetyczne kości 4 (BMP-4)</td><td>PeproTech Inc.</td><td>#120-05A Albumina</td><td></td></tr><tr><td>surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A8022-100G</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało cytokeratyny 12</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#SC-17099</td><td>Pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko</td></tr><tr><td>cytokeratynie 14</td><td>IF R& D Systems</td><td>#MAB3164</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko przeciwciału IF</td></tr><tr><td>Cytokeratin 15</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#MS-1068-P</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe dla IF</td></tr><tr><td>CnT-30</td><td>CELLnTEC Advanced Cell Systems AG</td><td>#Cnt-30</td><td>Pożywka hodowlana do adherentnego różnicowania hPSC-LESC</td></tr><tr><td>Kolagen typu IV (ludzki)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C5533</td><td>Ludzki kolagen łożyskowy typu IV</td></tr><tr><td>CoolCell LX Pojemnik do zamrażania</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>Probówki CryoPure</td><td>Sarsted</td><td>#72.380</td><td>1,6 ml krioprobówka do kriokonserwacji hPSC-LESC</td></tr><tr><td>Zdefiniowany inhibitor trypsyny</td><td>Gibco</td><td>#R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Flex Medium Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A2858501</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>#35050061</td><td></td></tr><tr><td>Laminin 521</td><td>Biolamina</td><td>#Ln521</td><td>Ludzka rekombinowana laminina 521</td></tr><tr><td>&Delta; Np63&alfa; przeciwciało</td><td>BioCare Medical</td><td>#4892</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe dla</td></tr><tr><td>przeciwciała IF OCT3/4</td><td>R& D Systems</td><td>#AF1759</td><td>Pierwszorzędowe przeciwciało dla IF</td></tr><tr><td>p63 i alfa</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>#ACI3066A</td><td>Pierwszorzędowe przeciwciało dla IF</td></tr><tr><td>p63-&alpha; (D2K8X) XP Rabbit mAb (koniugat PE)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td>#<td>56687</td><td>p63-&alpha; Przeciwciało sprzężone z PE do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Przeciwciało PAX6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#HPA030775</td><td>Pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko</td></tr><tr><td>penicylinie IF / streptomycynie</td><td>Lonza</td> <td># 17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td> <td># 158127</td><td>Utrwalacz komórek do IF</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant z DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#P36931</td><td>Mocowanie DAPI do twardych mocowanie do</td></tr><tr><td>zestawu do kriokonserwacji IF PSC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A2644601</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme</td><td>Gibco</td><td>#12563-011</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium</td><td>Gibco</td><td>#10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut SR XenoFree CTS</td><td>Gibco</td><td>#10828028</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminokwasy endogenne</td><td>Gibco</td><td>#11140050</td><td></td></tr><tr><td>SB-505124</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#S4696</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T8787</td><td>Środek permeabilizacyjny do IF</td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Laboratories</td><td>#H-1200</td><td>Uchwyt DAPI do montażu płynnego do IF</td></tr><<tr><td>strong>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II</td><td>Tharmac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy, np. BD Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny, np. Olympus IX 51</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wydajne i skalowalne ukierunkowane różnicowanie klinicznie kompatybilnych komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Komórki macierzyste nabłonka rąbka rogówki (LESC) są odpowiedzialne za ciągłe odnawianie nabłonka rogówki, a tym samym za utrzymanie homeostazy rogówki i przejrzystości wizualnej. LESC pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) stanowią obiecujące źródło komórek w terapii wymiany komórek rogówki. Nieokreślone, ksenogeniczne warunki hodowli i różnicowania powodują różnice w wynikach badań i utrudniają kliniczne zastosowanie środków terapeutycznych pochodzących z hPSC. Protokół ten zapewnia powtarzalną i wydajną metodę różnicowania hPSC-LESC w warunkach wolnych od komórek kseno- i zasilających. Po pierwsze, jednowarstwowa hodowla niezróżnicowanego hPSC na rekombinowanej lamininie-521 (LN-521) i zdefiniowanej pożywce hPSC służy jako podstawa do solidnej produkcji wysokiej jakości materiału wyjściowego do różnicowania. Po drugie, szybka i prosta metoda różnicowania hPSC-LESC pozwala na uzyskanie populacji LESC w ciągu zaledwie 24 dni. Metoda ta obejmuje czterodniową indukcję ektodermalną powierzchni w zawiesinie z małymi cząsteczkami, a następnie fazę hodowli adherentnej na matrycy kombinacji LN-521 / kolagen IV w określonym podłożu różnicującym nabłonek rogówki. Krioprzechowywanie i rozszerzone różnicowanie dodatkowo oczyszcza populację komórek i umożliwia przechowywanie komórek w dużych ilościach w celu wykorzystania ich do produktów terapii komórkowej. Uzyskane w ten sposób wysokiej jakości hPSC-LESCs stanowią potencjalną nową strategię leczenia rekonstrukcji powierzchni rogówki w leczeniu niedoboru rąbkowych komórek macierzystych (LSCD).

Od hPSC do hPSC-LESC
Cały proces, od indukowania różnicowania FF hPSC do kriokonserwacji hPSC-LESC, trwa około 3,5 tygodnia. Schematyczny przegląd metody różnicowania z zaznaczeniem kluczowych etapów przedstawiono na Rysunku 1A. Rysunek 1B przedstawia typową morfologię populacji komórek w różnych fazach protokołu. Przedstawione dane uzyskano z linii hESC Regea08/017 oraz l...

Ten protokół wprowadza prostą dwuetapową metodę różnicowania komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli wolnej od kseno- i komórek karmiących. Przedstawione tu metody hodowli komórkowych umożliwiają opłacalną produkcję na dużą skalę komórek o jakości klinicznej, mających zastosowanie w terapii komórkami rogówki.

Wydajne i skalowalne ukierunkowane różnicowanie klinicznie kompatybilnych komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Protokół ten wprowadził zdefiniowaną, bezkomórkową metodę różnicowania komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Komórki macierzyste nabłonka rąbka rogówki są odpowiedzialne za odnowienie nabłonka rogówki w zdrowym oku. Uszkodzenie tych komórek prowadzi do stanu znanego jako niedobór rąbkowych komórek macierzystych i do utraty przejrzystości rogówki.Przedstawione tutaj metody hodowli komórkowych umożliwiają wydajną produkcję komórek macierzystych nabłonka rąbka na potrzeby przyszłych terapii wymiany komórek rogówki. Aby rozpocząć, należy przejść i utrzymać hodowlę ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych wolną od karmnika, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Upewnij się, że używasz tylko wysokiej jakości ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych jako materiału wyjściowego do różnicowania.Kiedy będziesz gotowy do wywołania tworzenia się ciała zarodkowego, ogrzej wszystkie potrzebne materiały i odczynniki do temperatury pokojowej w okapie z przepływem laminarnym. Odłącz ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste wolne od karmnika od zawiesiny, dodając 500 mikrolitrów EDTA wolnej od ksenocytów trypsyny do każdej studzienki. Inkubacja w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z 5% CO2.Po trzech minutach wyjmij komórki z inkubatora i sprawdź morfologię komórek, aby określić optymalną fazę usuwania trypsyny. Uważnie obserwuj komórki, aby określić optymalny czas na usunięcie wolnego od ksenotypu tryspinu EDTA, kiedy komórki zaokrągliły się w górę, ale nie odłączyły się całkowicie. W optymalnym czasie usuń z komórek wolną od ksenotypów trypsynę EDTA.Dodaj zdefiniowany inhibitor trypsyny i delikatnie pipetuj do odłączenia komórek. Zbierz zawiesinę jednokomórkową do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Wirować przy 300 g przez pięć minut.Następnie usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze pożywki hodowlanej. Po policzeniu komórek rozprowadź od dwóch do trzech milionów komórek w trzech mililitrach podstawowej pożywki indukcyjnej uzupełnionej pięcioma mikromolowymi bróbstatynami do każdej studzienki sześciodołkowej płytki o niskim przyłączeniu. Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2.Następnego dnia sprawdź jakość ciał zarodków pod mikroskopem. Usuń pożywkę i zastąp ją trzema mililitrami podstawowej pożywki indukcyjnej uzupełnionej 10 mikromolami SB-505124 i 50 nanogramami na mililitr ludzkiego podstawowego czynnika wzrostu włókna szklanego. Kontynuuj inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2.W ciągu następnych dwóch dni usuń pożywkę i zastąp ją trzema mililitrami podstawowej pożywki indukcyjnej, uzupełnionej 25 nanogramami na mililitr białka morfogenetycznego kości cztery. Następnie kontynuuj inkubację przy użyciu poprzednich warunków. Czwartego dnia przygotuj mieszaninę 0,5 mikrograma na centymetr kwadratowy Lamininy-521 i pięciu mikrogramów na centymetr kwadratowy ludzkiego kolagenu łożyskowego typu cztery, rozcieńczonego w DPBS zawierającym jony wapń dwa i magnez dwa.Używając tej mieszaniny, pokryj 100-milimetrowe szalki do kultur tkankowych w celu przylegającego różnicowania w całkowitej objętości powłoki wynoszącej pięć mililitrów na naczynie. Zamknij płytki i przechowuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Piątego dnia podgrzej wszystkie potrzebne materiały i odczynniki do temperatury pokojowej w okapie z przepływem laminarnym.Następnie usuń roztwór powlekający i dodaj 10 mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej do każdego naczynia. Za pomocą pipety przenieś ciała zarodków z jednej płytki na dwie do trzech szalek do hodowli tkankowych. Następnie delikatnie potrząśnij każdą szalką hodowlaną, aby równomiernie rozprowadzić ciała zarodków.Utrzymuj komórki w przylegającej kulturze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 przez następne dwa i pół do trzech tygodni, pamiętając o zastąpieniu pożywki 10 mililitrami świeżej pożywki różnicującej trzy razy w tygodniu. Za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym regularnie sprawdzaj komórki pod kątem pojawienia się prawidłowej morfologii nabłonka. Na początek należy wstępnie podgrzać wszystkie potrzebne materiały i odczynniki do temperatury pokojowej w okapie z przepływem laminarnym, z wyjątkiem podłoża do krioprezerwacji, które należy wstępnie schłodzić.Następnie odłącz ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące z nabłonka rąbka do zawiesiny pojedynczej komórki, dodając EDTA trypsynę wolną od ksenotypu i inkubując w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2. Po pięciu minutach wyjmij komórki z inkubatora i sprawdź morfologię komórek, aby określić optymalną fazę usuwania trypsyny. Uważnie obserwuj komórki, aby określić optymalny czas na usunięcie EDTA trypsyny wolnej od kseno, kiedy komórki zaokrągliły się w górę, ale nie odłączyły się całkowicie.W optymalnym czasie usuń wolną od ksenotypów trypsynę EDTA z komórek i odłącz komórki, jak opisano wcześniej. Po policzeniu komórek odwiruj je z prędkością 300 g przez pięć minut. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki we wstępnie schłodzonym pożywce do kriokonserwacji wolnej od kseno.Za pomocą pipety przenieś zawiesinę pojedynczej komórki do krioprobówek, tak aby każda krioprobówka zawierała od 500 000 do miliona komórek w jednym mililitrze pożywki do kriokonserwacji. Umieść probówki w pojemniku do zamrażania. W ciągu pięciu minut przenieś je do zamrażarki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu przechowywania przez noc.Następnego dnia przenieś probówki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania. Przed rozmrożeniem komórek pokryj wszystkie potrzebne naczynia i dołki płytkowe mieszaniną pięciu mikrogramów na centymetr kwadratowy ludzkiego kolagenu łożyskowego typu czwartego i 0,5 mikrograma na centymetr kwadratowy LM-521 i wstępnie podgrzej wszystkie potrzebne materiały i odczynniki do temperatury pokojowej w okapie z przepływem laminarnym. Następnie usunąć roztwór powlekający z naczyń i dołków talerzowych i dodać odpowiednią ilość wstępnie podgrzanego podłoża różnicującego.Dodaj wstępnie podgrzaną pożywkę różnicującą do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Szybko rozmrozić komórki do temperatury pokojowej. Po rozmrożeniu natychmiast przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki wirówkowej.Wirować przy 300 g przez pięć minut. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce różnicującej, aby usunąć wszelkie pożywki do krioprezerwacji. Ułóż komórki na wstępnie powlekanych szalkach w pożywce różnicującej o gęstości od 40 000 do 50 000 komórek na centymetr kwadratowy.Utrzymuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 5% CO2, wymieniając pożywkę różnicującą trzy razy w tygodniu. Na Laminin-521 niezróżnicowane, wysokiej jakości ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste wolne od karmnika najpierw tworzą odrębne kolonie o ostrych krawędziach, które łączą się w jednorodne monowarstwy po zbiegu. Hodowla w podstawowej pożywce indukcyjnej, uzupełnionej pięcioma mikromolowymi pęcherzystatynami przez 24 godziny, zazwyczaj wytwarza zawiesinę ciasnych, regularnych ciał zarodkowych o różnych rozmiarach, podczas gdy morfologia ciała zarodka nie powinna się dramatycznie zmieniać podczas powierzchniowej indukcji ektodermalnej w zawiesinie, obserwuje się, że wzrost kolonialny pojawia się wkrótce po posianiu ciał zarodków na matrycę kombinacyjną kolagenu typu czwartego i Lamininy-521 w pożywce różnicowej.W ciągu 21 do 25 dni od różnicowania komórki tworzą zlewające się jednorodne warstwy o morfologii wielokątnej, która jest typowa dla komórek nabłonkowych. Komórki mogą być następnie przechowywane w kriogenicznym przechowywaniu do późniejszego wykorzystania, ponieważ żywotność i morfologia są dobrze zachowane po rozmrożeniu. W 24 dniu różnicowania zdecydowana większość komórek wykazywała ekspresję sparowanego białka pudełkowego, PAX6, kluczowego regulatora rozwoju oka, a także p63 alfa, powszechnie uznanego markera LESC.Delta Np63 ulega koekspresji w większości komórek alfa-dodatnich p63, potwierdzając fenotyp komórek alfa-dodatnich delta Np63 specyficzny dla rogówki. Inne markery ulegają częściowej ekspresji, podczas gdy inne są w tym momencie niewykrywalne, co wskazuje, że różnicowanie postępowało w kierunku unipotencjalnych progenitorów nabłonka rąbka, ale końcowe różnicowanie się w dojrzałe komórki nabłonka rogówki jeszcze nie nastąpiło. Średnio każda niezróżnicowana ludzka pluripotencjalna komórka macierzysta wolna od karmnika generuje 0,7 komórki do 25 dnia.Do 24 dnia można spodziewać się co najmniej 65% populacji komórek alfa-dodatnich delta Np63. Kriokonserwacja dodatkowo oczyszcza populację komórek. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawione tutaj metody są stosunkowo proste, ale istnieje kilka krytycznych punktów sukcesu.Niezbędna jest wysoka jakość materiału wyjściowego, a także delikatne, płynne techniki hodowli komórkowych. Protokół ten zapewnia solidne środki do produkcji komórek macierzystych nabłonka rąbka do zastosowań klinicznych, a także do różnych celów badawczych. Co więcej, metoda może być łatwo modyfikowana w celu różnicowania komórek nabłonka barwnikowego siatkówki.

efficient-scalable-directed-differentiation-clinically-compatible

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzące z komórek macierzystych mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, w tym do terapii komórkowych w celu zwyrodnienia siatkówki, modelowania chorób i badań nad lekami. Poniżej przedstawiamy prosty protokół umożliwiający powtarzalne pozyskiwanie RPE z komórek macierzystych.

Efektywne pozyskiwanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych

Przykład terapii genowej adenowirusa w ludzkich rogówkach z hodowlą narządów cukrzycowych jest przedstawiony w kierunku normalizacji opóźnionego gojenia się ran i znacznie zmniejszonej ekspresji markerów nabłonkowych komórek macierzystych w tych rogówkach. Opisano również optymalizację tego procesu w kulturach nabłonka rąbka włokanego wzbogaconych komórkami macierzystymi.

Adenowirusowa terapia genowa w keratopatii cukrzycowej: wpływ na gojenie się ran i ekspresję markerów komórek macierzystych w rogówkach i komórkach nabłonka rąbka ludzkiego hodowanych w narządach

Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metoda wykorzystuje kombinację czynników wzrostu i małych cząsteczek do skierowania różnicowania komórek macierzystych w niedojrzałe RPE w ciągu czternastu dni i dojrzałe, funkcjonalne RPE po trzech miesiącach.

Szybkie, ukierunkowane różnicowanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z ludzkich embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje monowarstwową, pozbawioną surowicy metodę efektywnego generowania komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w ciągu 18 dni. Obejmuje to sześć etapów, w których hPSC sekwencyjnie różnicują się w pośrednie typy komórek, takie jak prymitywna smuga, ostateczna endoderma, tylne jelito przednie i progenitorzy zawiązków wątroby, zanim utworzą komórki podobne do hepatocytów.

Skuteczne różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki wątroby

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Korzystając z metody samoorganizacji, opracowujemy protokół z dodatkiem COCO, który może znacznie zwiększyć generowanie fotoreceptorów.

Ukierunkowana indukcja organoidów siatkówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Prezentowany tutaj jest prosty protokół do bezpośredniego różnicowania hemogennych komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia.

Ukierunkowane różnicowanie hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system indukcji organoidów siatkówki, który jest odpowiedni dla różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do generowania tkanek siatkówki o wysokiej powtarzalności i wydajności.

System indukcji organoidów siatkówki do wyprowadzania tkanek siatkówki 3D z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół do izolacji i identyfikacji ludzkich komórek niszy rąbkowej.

Izolacja i identyfikacja komórek niszy rąbka ramiennego

Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający uzyskanie wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek z całych rogówek myszy poprzez sekwencyjne trawienie kolagenazą A i trypsyną. Metoda ta daje żywotne pojedyncze komórki o wysokiej integralności RNA, co sprawia, że są kompatybilne z dalszymi zastosowaniami, takimi jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek czy cytometrprzepływowy y.

Protokół do pobierania zawiesiny jednokomórkowej z rogówek myszy

Poznaj metodę różnicowania komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych bez użycia komórek podajnikowych. Protokół umożliwia wydajną produkcję komórek klinicznej jakości do terapii rogówki.

Wydajne i skalowalne ukierunkowane różnicowanie klinicznie kompatybilnych komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Wydajne i skalowalne ukierunkowane różnicowanie klinicznie kompatybilnych komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów