Wydajne i skalowalne ukierunkowane różnicowanie klinicznie kompatybilnych komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Protokół ten wprowadził zdefiniowaną, bezkomórkową metodę różnicowania komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Komórki macierzyste nabłonka rąbka rogówki są odpowiedzialne za odnowienie nabłonka rogówki w zdrowym oku. Uszkodzenie tych komórek prowadzi do stanu znanego jako niedobór rąbkowych komórek macierzystych i do utraty przejrzystości rogówki.

Przedstawione tutaj metody hodowli komórkowych umożliwiają wydajną produkcję komórek macierzystych nabłonka rąbka na potrzeby przyszłych terapii wymiany komórek rogówki. Aby rozpocząć, należy przejść i utrzymać hodowlę ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych wolną od karmnika, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Upewnij się, że używasz tylko wysokiej jakości ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych jako materiału wyjściowego do różnicowania.

Kiedy będziesz gotowy do wywołania tworzenia się ciała zarodkowego, ogrzej wszystkie potrzebne materiały i odczynniki do temperatury pokojowej w okapie z przepływem laminarnym. Odłącz ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste wolne od karmnika od zawiesiny, dodając 500 mikrolitrów EDTA wolnej od ksenocytów trypsyny do każdej studzienki. Inkubacja w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z 5% CO2.

Po trzech minutach wyjmij komórki z inkubatora i sprawdź morfologię komórek, aby określić optymalną fazę usuwania trypsyny. Uważnie obserwuj komórki, aby określić optymalny czas na usunięcie wolnego od ksenotypu tryspinu EDTA, kiedy komórki zaokrągliły się w górę, ale nie odłączyły się całkowicie. W optymalnym czasie usuń z komórek wolną od ksenotypów trypsynę EDTA.

Dodaj zdefiniowany inhibitor trypsyny i delikatnie pipetuj do odłączenia komórek. Zbierz zawiesinę jednokomórkową do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Wirować przy 300 g przez pięć minut.

Następnie usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze pożywki hodowlanej. Po policzeniu komórek rozprowadź od dwóch do trzech milionów komórek w trzech mililitrach podstawowej pożywki indukcyjnej uzupełnionej pięcioma mikromolowymi bróbstatynami do każdej studzienki sześciodołkowej płytki o niskim przyłączeniu. Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2.

Następnego dnia sprawdź jakość ciał zarodków pod mikroskopem. Usuń pożywkę i zastąp ją trzema mililitrami podstawowej pożywki indukcyjnej uzupełnionej 10 mikromolami SB-505124 i 50 nanogramami na mililitr ludzkiego podstawowego czynnika wzrostu włókna szklanego. Kontynuuj inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2.

W ciągu następnych dwóch dni usuń pożywkę i zastąp ją trzema mililitrami podstawowej pożywki indukcyjnej, uzupełnionej 25 nanogramami na mililitr białka morfogenetycznego kości cztery. Następnie kontynuuj inkubację przy użyciu poprzednich warunków. Czwartego dnia przygotuj mieszaninę 0,5 mikrograma na centymetr kwadratowy Lamininy-521 i pięciu mikrogramów na centymetr kwadratowy ludzkiego kolagenu łożyskowego typu cztery, rozcieńczonego w DPBS zawierającym jony wapń dwa i magnez dwa.

Używając tej mieszaniny, pokryj 100-milimetrowe szalki do kultur tkankowych w celu przylegającego różnicowania w całkowitej objętości powłoki wynoszącej pięć mililitrów na naczynie. Zamknij płytki i przechowuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Piątego dnia podgrzej wszystkie potrzebne materiały i odczynniki do temperatury pokojowej w okapie z przepływem laminarnym.

Następnie usuń roztwór powlekający i dodaj 10 mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej do każdego naczynia. Za pomocą pipety przenieś ciała zarodków z jednej płytki na dwie do trzech szalek do hodowli tkankowych. Następnie delikatnie potrząśnij każdą szalką hodowlaną, aby równomiernie rozprowadzić ciała zarodków.

Utrzymuj komórki w przylegającej kulturze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 przez następne dwa i pół do trzech tygodni, pamiętając o zastąpieniu pożywki 10 mililitrami świeżej pożywki różnicującej trzy razy w tygodniu. Za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym regularnie sprawdzaj komórki pod kątem pojawienia się prawidłowej morfologii nabłonka. Na początek należy wstępnie podgrzać wszystkie potrzebne materiały i odczynniki do temperatury pokojowej w okapie z przepływem laminarnym, z wyjątkiem podłoża do krioprezerwacji, które należy wstępnie schłodzić.

Następnie odłącz ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące z nabłonka rąbka do zawiesiny pojedynczej komórki, dodając EDTA trypsynę wolną od ksenotypu i inkubując w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2. Po pięciu minutach wyjmij komórki z inkubatora i sprawdź morfologię komórek, aby określić optymalną fazę usuwania trypsyny. Uważnie obserwuj komórki, aby określić optymalny czas na usunięcie EDTA trypsyny wolnej od kseno, kiedy komórki zaokrągliły się w górę, ale nie odłączyły się całkowicie.

W optymalnym czasie usuń wolną od ksenotypów trypsynę EDTA z komórek i odłącz komórki, jak opisano wcześniej. Po policzeniu komórek odwiruj je z prędkością 300 g przez pięć minut. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki we wstępnie schłodzonym pożywce do kriokonserwacji wolnej od kseno.

Za pomocą pipety przenieś zawiesinę pojedynczej komórki do krioprobówek, tak aby każda krioprobówka zawierała od 500 000 do miliona komórek w jednym mililitrze pożywki do kriokonserwacji. Umieść probówki w pojemniku do zamrażania. W ciągu pięciu minut przenieś je do zamrażarki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu przechowywania przez noc.

Następnego dnia przenieś probówki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania. Przed rozmrożeniem komórek pokryj wszystkie potrzebne naczynia i dołki płytkowe mieszaniną pięciu mikrogramów na centymetr kwadratowy ludzkiego kolagenu łożyskowego typu czwartego i 0,5 mikrograma na centymetr kwadratowy LM-521 i wstępnie podgrzej wszystkie potrzebne materiały i odczynniki do temperatury pokojowej w okapie z przepływem laminarnym. Następnie usunąć roztwór powlekający z naczyń i dołków talerzowych i dodać odpowiednią ilość wstępnie podgrzanego podłoża różnicującego.

Dodaj wstępnie podgrzaną pożywkę różnicującą do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Szybko rozmrozić komórki do temperatury pokojowej. Po rozmrożeniu natychmiast przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki wirówkowej.

Wirować przy 300 g przez pięć minut. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce różnicującej, aby usunąć wszelkie pożywki do krioprezerwacji. Ułóż komórki na wstępnie powlekanych szalkach w pożywce różnicującej o gęstości od 40 000 do 50 000 komórek na centymetr kwadratowy.

Utrzymuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 5% CO2, wymieniając pożywkę różnicującą trzy razy w tygodniu. Na Laminin-521 niezróżnicowane, wysokiej jakości ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste wolne od karmnika najpierw tworzą odrębne kolonie o ostrych krawędziach, które łączą się w jednorodne monowarstwy po zbiegu. Hodowla w podstawowej pożywce indukcyjnej, uzupełnionej pięcioma mikromolowymi pęcherzystatynami przez 24 godziny, zazwyczaj wytwarza zawiesinę ciasnych, regularnych ciał zarodkowych o różnych rozmiarach, podczas gdy morfologia ciała zarodka nie powinna się dramatycznie zmieniać podczas powierzchniowej indukcji ektodermalnej w zawiesinie, obserwuje się, że wzrost kolonialny pojawia się wkrótce po posianiu ciał zarodków na matrycę kombinacyjną kolagenu typu czwartego i Lamininy-521 w pożywce różnicowej.

W ciągu 21 do 25 dni od różnicowania komórki tworzą zlewające się jednorodne warstwy o morfologii wielokątnej, która jest typowa dla komórek nabłonkowych. Komórki mogą być następnie przechowywane w kriogenicznym przechowywaniu do późniejszego wykorzystania, ponieważ żywotność i morfologia są dobrze zachowane po rozmrożeniu. W 24 dniu różnicowania zdecydowana większość komórek wykazywała ekspresję sparowanego białka pudełkowego, PAX6, kluczowego regulatora rozwoju oka, a także p63 alfa, powszechnie uznanego markera LESC.

Delta Np63 ulega koekspresji w większości komórek alfa-dodatnich p63, potwierdzając fenotyp komórek alfa-dodatnich delta Np63 specyficzny dla rogówki. Inne markery ulegają częściowej ekspresji, podczas gdy inne są w tym momencie niewykrywalne, co wskazuje, że różnicowanie postępowało w kierunku unipotencjalnych progenitorów nabłonka rąbka, ale końcowe różnicowanie się w dojrzałe komórki nabłonka rogówki jeszcze nie nastąpiło. Średnio każda niezróżnicowana ludzka pluripotencjalna komórka macierzysta wolna od karmnika generuje 0,7 komórki do 25 dnia.

Do 24 dnia można spodziewać się co najmniej 65% populacji komórek alfa-dodatnich delta Np63. Kriokonserwacja dodatkowo oczyszcza populację komórek. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawione tutaj metody są stosunkowo proste, ale istnieje kilka krytycznych punktów sukcesu.

Niezbędna jest wysoka jakość materiału wyjściowego, a także delikatne, płynne techniki hodowli komórkowych. Protokół ten zapewnia solidne środki do produkcji komórek macierzystych nabłonka rąbka do zastosowań klinicznych, a także do różnych celów badawczych. Co więcej, metoda może być łatwo modyfikowana w celu różnicowania komórek nabłonka barwnikowego siatkówki.