Wizualizacja migracji komórek stycznych w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt
24 października 2018
Opisujemy metody fluorescencyjnego znakowania stycznie migrujących komórek za pomocą elektroporacji, oraz obrazowania poklatkowego ruchu oznaczonej komórki w hodowli płaskiej w celu wizualizacji zachowania migrujących komórek w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozwoju, takie jak mechanizmy migracji komórek neuronalnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że w dłuższej perspektywie można wykryć indywidualną i zbiorową migrację komórek. Po wyizolowaniu 200 mililitrów kultury bakteryjnej metodą lizy alkalicznej wymieszaj dwa plazmidy tak, aby końcowe stężenie każdego z nich wynosiło cztery mikrogramy na mikrolitr.
Wysiaduj płodne jaja kurze poziomo w temperaturze 38 stopni Celsjusza przy wilgotności względnej 70%. Po dwóch i pół dniu użyj 20-mililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 18, aby usunąć pięć mililitrów albuminy ze spiczastej strony jajka. Uszczelnij otwór taśmą.
Następnie użyj zakrzywionych nożyczek, aby przeciąć górną część skorupki jajka i otworzyć otwór o średnicy dwóch centymetrów. Pod mikroskopem stereoskopowym sprawdź stadium rozwojowe zarodka. Uszczelnij ten większy otwór taśmą.
Kontynuuj inkubację w temperaturze 38 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 70 procent do E5,5. Przed elektroporacją należy przygotować 10 mikrolitrów wspomnianego plazmidowego DNA zabarwionego 0,5 mikrolitra fast green. Przygotuj również 10 mililitrów autoklawizowanego PBS zawierającego 100 jednostek na mililitr penicyliny i 100 mikrogramów na mililitr streptomycyny.
Użyj procesora do mikropipet, aby przygotować mikropipety wykonane ze szklanych probówek kapilarnych. Przyciąć dystalną końcówkę mikropipety do pory o wielkości odpowiedniej dla ilości DNA, która ma zostać wstrzyknięta. Użyj nożyczek, aby przeciąć zapieczętowaną górną skorupę, aby ponownie otworzyć otwór o średnicy dwóch i pół centymetra i ustawić jajko stabilnie pod mikroskopem stereoskopowym.
Wlej kilka kropli przygotowanego roztworu PBS do jajka. Za pomocą dwóch cienkich kleszczyków oderwij błonę omocznikową pokrywającą zarodek, uważając, aby nie spowodować krwotoku. Następnie usuń owodnię z głowy zarodka.
Obracając głowę mikroszpatułką, za pomocą mikropipety podłączonej do rurki ssącej wstrzyknąć od 0,1 do jednego mikrolitra kolorowego DNA do jamy komorowej lewej soczewki wzrokowej. Umieść parę elektrod typu kleszczykowego wokół docelowego obszaru tektum optycznego. Użyj generatora impulsów, aby naładować impuls wstępny o napięciu 30 woltów przez jedną milisekundę w odstępie pięciu milisekund, a w przypadku kolejnych impulsów o napięciu sześciu woltów przez pięć milisekund w odstępie 10 milisekund.
Po tym wszystkim uszczelnij otwór taśmą i kontynuuj inkubację w temperaturze 38 stopni Celsjusza i 70 procent wilgotności względnej. Namocz elektrody w plastikowym naczyniu wypełnionym PBS i użyj szczoteczki międzyzębowej, aby usunąć białko. Powtórz proces od początkowego cięcia skorupki do elektroporacji dla każdego jajka.
Dzień przed hodowlą flat-mount rozpoczęto przygotowanie kodowanej wkładki do hodowli komórkowej, dodając autoklaw do wody destylowanej do 10-centymetrowego naczynia do hodowli komórkowych. Umieść kilka wkładek z kulturą komórkową na wodzie. W roztworze zawierającym osiem mikrogramów na mililitr lamininy i 80 mikrogramów na mililitr Polly L, upewnij się, że zakrywasz wkładki.
Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla do hodowli komórkowych. W dniu hodowli w E7.0 usunięto roztwór lamininy i poli l-lizyny z wkładki. Następnie przenieś wkładkę do naczynia ze szklanym dnem wypełnionego 1,1 mililitra pożywki hodowlanej.
Przenieś naczynie do inkubatora dwutlenku węgla do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ustaw wilgotną komorę na odwróconym mikroskopie konfokalnym o przepływie gazu 40% tlenu i 5% dwutlenku węgla oraz temperaturze 38 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć przygotowywanie próbki tkanki na wkładce, użyj kleszczy, aby uszczypnąć główkę zarodka do sześciocentymetrowego naczynia do hodowli komórek zawierającego lodowaty HBSS.
Użyj dwóch cienkich kleszczyków, aby odizolować elektroporowaną osłonę optyczną. A następnie użyj plastikowego zakraplacza, aby przenieść go do wklęsłego szklanego naczynia na bazie czarnego silikonu i wypełnionego lodowatym HBSS. Sprawdź położenie etykiety pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym.
Za pomocą noża mikrochirurgicznego wytnij tkankę tektalną otaczającą etykietę, zwracając uwagę na kierunek tkanki w tectum. Następnie użyj plastikowego zakraplacza, aby przenieść oznakowaną tkankę do wkładki, tak aby strona szpilki była przymocowana do wkładki. Ułóż tkankę tektalną w pożądanym kierunku i usuń nadmiar HBSS.
Powtórz proces przygotowania tkanek dla wszystkich innych próbek tkanek przeznaczonych do tej samej wkładki. Następnie umieść naczynie w uformowanej komorze odwróconego mikroskopu konfokalnego. Za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego sprawdź oznakowanie fluorescencyjne i skoncentruj pole mikroskopowe.
Uruchom laserową jednostkę konfokalną. Pobrać próbkę skanu konfokalnego w celu dostosowania kierunku i położenia tkanki wzdłuż osi x i y w terenie. Następnie wybierz rozmiar skanowania.
Określ interwał i całkowity zakres skanowania konfokalnego wzdłuż osi z. Weź odstęp pięciu lub 10 mikrometrów dla zakresu 100 mikrometrów. Wybierz przedział czasowy obrazowania konfokalnego i całkowity czas trwania obrazowania.
Po ustawieniu parametrów uruchomionego programu konfokalnego rozpocznij obrazowanie. Po zakończeniu obrazowania połącz obrazy konfokalne w innej osi C, aby uzyskać obrazy z-stack z ostateczną regulacją ogniskowej w każdym punkcie czasowym. Następnie dołącz obrazy stosu Z w różnych punktach czasowych, aby skonstruować film poklatkowy.
W tym badaniu migracja komórek jest wykrywana w warstwach powierzchownych poprzez elektroporację w Ovo, hodowlę komórkową flat mount i poklatkowe obrazowanie konfokalne. Stycznie migrujące komórki i jądra w powierzchownych warstwach tektum optycznego są tutaj widoczne zero godzin, dziewięć godzin, 18 godzin i 27 godzin po rozpoczęciu rejestracji. Film poklatkowy z 10-minutowymi interwałami w okresie 28 godzin i 50 minut pokazuje masowy ruch migrujących komórek i ich jąder.
Scalony film wyraźnie pokazuje masowy ruch migrujących komórek. Kierunkowość migracji komórek można zbadać, skupiając się na komórkach rozpraszających się od oznaczonego środka we wszystkich kierunkach. Wyraźne obrazy ruchu jądrowego pozwalają na automatyczne śledzenie migracji jądrowej za pomocą wtyczki do śledzenia cząstek.
Czasowe zmiany trajektorii migracji stycznej mogą być zobrazowane i udowodnić, że migracja rozpraszająca jest dookólna. Zdjęcia w większym powiększeniu można wykonywać w odstępach pięciominutowych. Badanie zachowania poszczególnych komórek z sekwencyjną zmianą morfologiczną procesu wiodącego, końcowego procesu i jąder.
Po tej procedurze można wykonać etykietowanie działań oświetleniowych. Aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak mechanizmy prowadzenia Aksum.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metody fluorescencyjnego znaczenia komórek migrujących tangencjalnie oraz obrazowania time-lapse w celu wizualizowania ruchu komórek w rozwijającym się tectum opticum kurczaka. Techniki te pozwalają na obserwację indywidualnej i zbiorowej migracji komórek w czasie.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Biologia rozwojowa
- Neuronauka
- Migracja komórek
Tło
- Zrozumienie migracji komórek neuronalnych jest kluczowe w biologii rozwojowej.
- Fluorescencyjne znaczenie umożliwia śledzenie ruchu komórek.
- Obrazowanie time-lapse poprawia obserwację dynamicznych procesów.
- To badanie koncentruje się na tectum opticum kurczaka jako systemie modelowym.
Cel badania
- Wizualizacja zachowania migrujących komórek w rozwijającym się organizmie.
- Zbadanie mechanizmów leżących u podstaw migracji komórek neuronalnych.
- Dostarczenie metodologii do długoterminowej obserwacji dynamiki komórek.
Stosowane metody
- Elektroporacja do fluorescencyjnego znaczenia komórek.
- Obrazowanie time-lapse w kulturach płaskich.
- Izolacja kultury bakteryjnej za pomocą lizy alkalicznej.
- Inkubacja jaj kurzego w kontrolowanych warunkach.
Główne wyniki
- Pomyślne znaczenie komórek migrujących tangencjalnie.
- Obserwacja zarówno indywidualnej, jak i zbiorowej migracji komórek.
- Demonstracja skuteczności techniki obrazowania.
- Wgląd w zachowanie komórek w tectum opticum.
Wnioski
- Opisane metody są skuteczne w badaniu migracji komórek.
- Fluorescencyjne znaczenie w połączeniu z obrazowaniem time-lapse zapewnia cenne wglądy.
- To podejście może być zastosowane w innych badaniach z zakresu biologii rozwojowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables long-term visualization of tangential cell migration in developing neural tissue, supporting mechanistic studies of neuronal development. By capturing both individual and collective cell behaviors, it provides predictive insights into cell motility mechanisms relevant to neurodevelopmental disorder modeling. The approach enhances target validation in early discovery by clarifying migratory pathways and functional dynamics in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing tangential migration patterns in developing optic tectum.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of cell dispersal and nuclear tracking.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by revealing omnidirectional migration and temporal trajectory changes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening via fluorescently labeled migrating cells.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled flat-mount culture and time-lapse imaging.
- Scalability Value: Facilitates platform reuse for longitudinal studies of cell displacement and axonal elongation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains continuity from discovery to preclinical validation by modeling developmental cell migration processes.
- Mechanistic Value: Focuses on predictive de-risking through visualization of leading/trailing process dynamics and nuclear migration.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying migratory behavior changes over 28-hour intervals.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of neuronal migration mechanisms prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking through direct visualization of tangential cell migration in chick optic tectum.
- Screening: Delivers assay readiness via standardized flat-mount culture on cell culture inserts with laminin/poly-L-lysine coating.
- Analytics: Provides quantitative outputs including nuclear trajectory tracking and temporal change analysis using particle tracking plugins.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling developmental processes relevant to neurodevelopmental target validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for long-term imaging of cell migration across multiple tissue samples and time points.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in cell migration pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of time-lapse imaging in flat-mount neural tissue cultures.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in neurodevelopmental programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative migratory behavior metrics.
Implementation Considerations
- Required expertise in avian embryology, electroporation techniques, and confocal microscopy.
- Instrumentation needs include stereo microscope, micropipette processor, pulse generator, and inverted confocal microscope with laser unit.
- Cross-team standardization requires consistent egg incubation conditions (38°C, 70% humidity) and tissue preparation protocols.
- Adaptation considerations across model systems involve optimizing electroporation parameters and culture insert coating for non-avian species.
- Practical limitations include tissue viability constraints beyond 28 hours and dependency on precise ventricular cavity injection accuracy.
