Wizualizacja migracji komórek stycznych w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozwoju, takie jak mechanizmy migracji komórek neuronalnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że w dłuższej perspektywie można wykryć indywidualną i zbiorową migrację komórek. Po wyizolowaniu 200 mililitrów kultury bakteryjnej metodą lizy alkalicznej wymieszaj dwa plazmidy tak, aby końcowe stężenie każdego z nich wynosiło cztery mikrogramy na mikrolitr.

Wysiaduj płodne jaja kurze poziomo w temperaturze 38 stopni Celsjusza przy wilgotności względnej 70%. Po dwóch i pół dniu użyj 20-mililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 18, aby usunąć pięć mililitrów albuminy ze spiczastej strony jajka. Uszczelnij otwór taśmą.

Następnie użyj zakrzywionych nożyczek, aby przeciąć górną część skorupki jajka i otworzyć otwór o średnicy dwóch centymetrów. Pod mikroskopem stereoskopowym sprawdź stadium rozwojowe zarodka. Uszczelnij ten większy otwór taśmą.

Kontynuuj inkubację w temperaturze 38 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 70 procent do E5,5. Przed elektroporacją należy przygotować 10 mikrolitrów wspomnianego plazmidowego DNA zabarwionego 0,5 mikrolitra fast green. Przygotuj również 10 mililitrów autoklawizowanego PBS zawierającego 100 jednostek na mililitr penicyliny i 100 mikrogramów na mililitr streptomycyny.

Użyj procesora do mikropipet, aby przygotować mikropipety wykonane ze szklanych probówek kapilarnych. Przyciąć dystalną końcówkę mikropipety do pory o wielkości odpowiedniej dla ilości DNA, która ma zostać wstrzyknięta. Użyj nożyczek, aby przeciąć zapieczętowaną górną skorupę, aby ponownie otworzyć otwór o średnicy dwóch i pół centymetra i ustawić jajko stabilnie pod mikroskopem stereoskopowym.

Wlej kilka kropli przygotowanego roztworu PBS do jajka. Za pomocą dwóch cienkich kleszczyków oderwij błonę omocznikową pokrywającą zarodek, uważając, aby nie spowodować krwotoku. Następnie usuń owodnię z głowy zarodka.

Obracając głowę mikroszpatułką, za pomocą mikropipety podłączonej do rurki ssącej wstrzyknąć od 0,1 do jednego mikrolitra kolorowego DNA do jamy komorowej lewej soczewki wzrokowej. Umieść parę elektrod typu kleszczykowego wokół docelowego obszaru tektum optycznego. Użyj generatora impulsów, aby naładować impuls wstępny o napięciu 30 woltów przez jedną milisekundę w odstępie pięciu milisekund, a w przypadku kolejnych impulsów o napięciu sześciu woltów przez pięć milisekund w odstępie 10 milisekund.

Po tym wszystkim uszczelnij otwór taśmą i kontynuuj inkubację w temperaturze 38 stopni Celsjusza i 70 procent wilgotności względnej. Namocz elektrody w plastikowym naczyniu wypełnionym PBS i użyj szczoteczki międzyzębowej, aby usunąć białko. Powtórz proces od początkowego cięcia skorupki do elektroporacji dla każdego jajka.

Dzień przed hodowlą flat-mount rozpoczęto przygotowanie kodowanej wkładki do hodowli komórkowej, dodając autoklaw do wody destylowanej do 10-centymetrowego naczynia do hodowli komórkowych. Umieść kilka wkładek z kulturą komórkową na wodzie. W roztworze zawierającym osiem mikrogramów na mililitr lamininy i 80 mikrogramów na mililitr Polly L, upewnij się, że zakrywasz wkładki.

Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla do hodowli komórkowych. W dniu hodowli w E7.0 usunięto roztwór lamininy i poli l-lizyny z wkładki. Następnie przenieś wkładkę do naczynia ze szklanym dnem wypełnionego 1,1 mililitra pożywki hodowlanej.

Przenieś naczynie do inkubatora dwutlenku węgla do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ustaw wilgotną komorę na odwróconym mikroskopie konfokalnym o przepływie gazu 40% tlenu i 5% dwutlenku węgla oraz temperaturze 38 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć przygotowywanie próbki tkanki na wkładce, użyj kleszczy, aby uszczypnąć główkę zarodka do sześciocentymetrowego naczynia do hodowli komórek zawierającego lodowaty HBSS.

Użyj dwóch cienkich kleszczyków, aby odizolować elektroporowaną osłonę optyczną. A następnie użyj plastikowego zakraplacza, aby przenieść go do wklęsłego szklanego naczynia na bazie czarnego silikonu i wypełnionego lodowatym HBSS. Sprawdź położenie etykiety pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym.

Za pomocą noża mikrochirurgicznego wytnij tkankę tektalną otaczającą etykietę, zwracając uwagę na kierunek tkanki w tectum. Następnie użyj plastikowego zakraplacza, aby przenieść oznakowaną tkankę do wkładki, tak aby strona szpilki była przymocowana do wkładki. Ułóż tkankę tektalną w pożądanym kierunku i usuń nadmiar HBSS.

Powtórz proces przygotowania tkanek dla wszystkich innych próbek tkanek przeznaczonych do tej samej wkładki. Następnie umieść naczynie w uformowanej komorze odwróconego mikroskopu konfokalnego. Za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego sprawdź oznakowanie fluorescencyjne i skoncentruj pole mikroskopowe.

Uruchom laserową jednostkę konfokalną. Pobrać próbkę skanu konfokalnego w celu dostosowania kierunku i położenia tkanki wzdłuż osi x i y w terenie. Następnie wybierz rozmiar skanowania.

Określ interwał i całkowity zakres skanowania konfokalnego wzdłuż osi z. Weź odstęp pięciu lub 10 mikrometrów dla zakresu 100 mikrometrów. Wybierz przedział czasowy obrazowania konfokalnego i całkowity czas trwania obrazowania.

Po ustawieniu parametrów uruchomionego programu konfokalnego rozpocznij obrazowanie. Po zakończeniu obrazowania połącz obrazy konfokalne w innej osi C, aby uzyskać obrazy z-stack z ostateczną regulacją ogniskowej w każdym punkcie czasowym. Następnie dołącz obrazy stosu Z w różnych punktach czasowych, aby skonstruować film poklatkowy.

W tym badaniu migracja komórek jest wykrywana w warstwach powierzchownych poprzez elektroporację w Ovo, hodowlę komórkową flat mount i poklatkowe obrazowanie konfokalne. Stycznie migrujące komórki i jądra w powierzchownych warstwach tektum optycznego są tutaj widoczne zero godzin, dziewięć godzin, 18 godzin i 27 godzin po rozpoczęciu rejestracji. Film poklatkowy z 10-minutowymi interwałami w okresie 28 godzin i 50 minut pokazuje masowy ruch migrujących komórek i ich jąder.

Scalony film wyraźnie pokazuje masowy ruch migrujących komórek. Kierunkowość migracji komórek można zbadać, skupiając się na komórkach rozpraszających się od oznaczonego środka we wszystkich kierunkach. Wyraźne obrazy ruchu jądrowego pozwalają na automatyczne śledzenie migracji jądrowej za pomocą wtyczki do śledzenia cząstek.

Czasowe zmiany trajektorii migracji stycznej mogą być zobrazowane i udowodnić, że migracja rozpraszająca jest dookólna. Zdjęcia w większym powiększeniu można wykonywać w odstępach pięciominutowych. Badanie zachowania poszczególnych komórek z sekwencyjną zmianą morfologiczną procesu wiodącego, końcowego procesu i jąder.

Po tej procedurze można wykonać etykietowanie działań oświetleniowych. Aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak mechanizmy prowadzenia Aksum.