Znakowanie różnicowe białek powierzchniowych i zinternalizowanych po karmieniu przeciwciałami żywych hodowanych neuronów

Ogólnym celem tej procedury jest znakowanie białek na powierzchni żywych neuronów, a następnie odróżnienie białka powierzchniowego od białek zinternalizowanych za pomocą różnicowego znakowania przeciwciał wtórnych. Aby to zrobić, neurony pierwotne hodowane na szkle nakrywkowym są inkubowane z przeciwciałem skierowanym przeciwko epitopowi powierzchniowemu i inkubowane, aby umożliwić internalizację. Po inkubacji nakłada się znakowane fluorescencyjnie przeciwciało drugorzędowe w celu identyfikacji białek narażonych na działanie powierzchni.

Następnie nakłada się nadmiar nieznakowanego przeciwciała drugorzędowego w celu zablokowania pozostałych kompleksów przeciwciał pierwszorzędowych białek powierzchniowych. Wyhodowane neurony są następnie poddawane permecji i nakłada się przeciwciało wtórne o innym kolorze w celu wykrycia zinternalizowanego białka. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują względne poziomy białka zinternalizowanego w porównaniu z białkiem powierzchniowym za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Po tej procedurze można uzyskać przebieg w czasie internalizacji białka powierzchniowego źródła, dostarczając informacji o wskaźnikach transportu białka w warunkach bazylii i stymulowanych. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania szkiełek nakrywkowych do mycia hodowli komórkowych pokrytych polilizyną 18-milimetrowych szkiełek nakrywkowych ze szkła bolicznego przygotowanych dzień wcześniej, zanurzając je w trzech oddzielnych naczyniach do płukania zawierających PBS Dodaj 500 mikrolitrów roztworu laminatu do dołków 12-dołkowej płytki, a następnie za pomocą kleszczy umieść szkiełka nakrywkowe w każdym z nich. Dobrze dociśnij każde szkiełko nakrywkowe, aby upewnić się, że siedzi płasko w podstawie studni inkubowanej przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, protokół ten można wykonać przy użyciu kory myszy E 15 lub hipopotama szczura E 18 Campi.

W tej demonstracji używane są kory myszy. Umieścić korowe z połowy miotu lub jednego miotu zarodków na lodzie w jednomililitrowym einorze zawierającym PBS z wapniem i magnezem i umieścić na lodzie. Następnie, za pomocą mikropipety o pojemności jednego mililitra, usuń PBS z tkanki korowej.

Następnie dodaj 500 mikrolitrów jednego roztworu DNA Pappa do tkanki korowej z połowy miotu zarodków. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 do 20 minut. Dwa razy w okresie inkubacji delikatnie przesuń probówkę, aby wymieszać zawartość po inkubacji, użyj polerowanej płomieniowo silikonowanej pipety do pasty, aby delikatnie przewartościować tkankę od 10 do 15 razy, aż do uzyskania dyspersji komórek.

Niewiele, jeśli w ogóle, kawałków niezdysocjowanej tkanki powinno pozostać, unikaj generowania pęcherzyków. Ostrożnie ułóż zdysocjowaną zawiesinę komórkową na trzymililitrowej poduszce 4% BS, A w BSS Hanka z dodatkami. Następnie w wirówce stołowej z odchylanym wirnikiem wirowym wirować pod ciśnieniem 100 razy G przez siedem minut.

Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant, uważając, aby nie zassać osadu komórkowego. Następnie dodaj jeden mililitr kompletnego podłoża neuro basemal, delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby ponownie zawiesić granulowane komórki. Następnie użyj cytometru hemologicznego, aby określić stężenie żywych komórek.

Tylko komórki jasne fazowo powinny być uważane za żywe bezpośrednio przed posiewem. Odessać nadmiar roztworu surowicy laminacji z szkiełek przykrywkowych w studzienkach i zastąpić go pierwotną pożywką do hodowli neuronów. Następnie dodaj 75 000 do 100 000 neuronów pierwotnych do każdej studzienki.

Hoduj neurony przez okres do 21 dni w pożywce neuro w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla w siódmym dniu, a następnie co tydzień dodawaj antymitotyczny fluor, deoksyurydynę urydynę, aby zapobiec przerostowi gleju i wykonaj połowę zmiany pożywki. W pierwszym tygodniu hodowli neurony rozwinęły dendrytyczne altany, jak pokazano na tym obrazie dwudniowej kultury. W drugim do trzeciego tygodnia dojrzewają i będą przechodzić synaptogenezę.

Na tym rysunku przedstawiono rozległą sieć projekcji wykonanych po 14 dniach in vitro w celu znakowania interesujących białek eksponowanych na powierzchnię, dodania pierwszorzędowego przeciwciała bezpośrednio do kondycjonowanej pożywki w odpowiednim stężeniu. Każdy stan powinien być badany w trzech próbach kontrolnych, surowica przedimmunologiczna lub przeciwciała, które rozpoznają wewnątrzkomórkowe regiony białka, które nie są narażone podczas egzocytozy, mogą być stosowane w tym samym rozcieńczeniu, co badane przeciwciało pierwszorzędowe. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze hodowli na jedną, dwie lub cztery godziny po inkubacji, odessać pożywkę zawierającą przeciwciało, raz delikatnie, ale szybko przemyć studzienki PBS.

Dodaj temperaturę pokojową, dodając roztwór do studzienek, a następnie zasysając. Następnie dodaj świeżo przygotowany 4%para formaldehyd i inkubuj przez pięć minut. Dodaj temperaturę pokojową, aby utrwalić komórki po utrwaleniu.

Usunąć roztwór para-formaldehydu ze studzienek i wyrzucić go do pojemnika na odpady płynne w dygestorium. Następnie szybko przepłucz komórki trzykrotnie PBS, tak jak poprzednio. Pozostaw trzecie pranie na miejscu, aby można było łatwo usunąć szkiełko nakrywkowe.

Następnie za pomocą kleszczyków ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe z płytki i umieść je komórką do góry na arkuszu param na podstawie lub pokrywie jednorazowej płytki hodowlanej. Pozostała część protokołu barwienia zostanie wykonana na tej powierzchni, delikatnie pipetą blokujący roztwór PBS 5% BSA na komórki, aby uzyskać zaokrągloną kroplę w kształcie pęcherzyka na szkiełku nakrywkowym, aby nie wyschła. Inkubować przez 30 minut.

Ważne jest, aby pamiętać, aby nie dodawać detergentu do roztworu blokującego. Na tym etapie komórki nie powinny być przenikane, gdy znakowane mają być tylko białka powierzchniowe komórek. Po zablokowaniu odessać roztwór blokujący, a następnie znakować białka naświetlone powierzchniowo, nałożyć znakowane fluorescencyjnie przeciwciało drugorzędowe, następnie inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej po inkubacji, odessać przeciwciało drugorzędowe i przemyć szkiełka nakrywkowe dwukrotnie PBS przez pięć minut za każdym razem, aby zablokować jakiekolwiek białko na powierzchni komórki, które nie jest związane przez znakowane przeciwciało drugorzędowe.

Inkubuj nieprzepuszczalne neurony z wysokim stężeniem nieznakowanego przeciwciała wtórnego przez noc. W temperaturze pokojowej. Inkubacja przez noc ma kluczowe znaczenie.

Krótsze okresy inkubacji nie zablokują całkowicie żadnego przeciwciała pierwszorzędowego, które nie jest w pełni związane przez znakowane przeciwciało drugorzędowe. Następnego dnia umyj szkiełka nakrywkowe dwa razy przez pięć minut, każdy z PBS, tak jak poprzednio. Następnie utrwalić komórki 4% paraformaldehydem w buforze fosforanowym przez pięć minut w temperaturze pokojowej po usunięciu utrwalacza.

Szybko przepłucz komórki dwukrotnie za pomocą PBS. Następnie do znakowania wewnątrzkomórkowego należy przepuszczać i blokować komórki PBS zawierającym 5% BSA i 0,1% Triton X 100 w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po przesiąknięciu usuń roztwór blokujący.

Uważaj, aby szkiełka nakrywkowe nie wyschły. Dodaj inaczej oznakowane przeciwciało drugorzędowe i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po usunięciu drugiego przeciwciała drugorzędowego przemyć szkiełka nakrywkowe trzy razy przez pięć minut PBS.

Następnie umyj je krótko za pomocą uchwytu na wodę dejonizowaną. Okładkę nasuwa się na szkiełka z wodnym medium montażowym zawierającym środek zapobiegający blaknięciu i pozwala na suche przechowywanie szkiełek w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu optymalnego zachowania sygnału fluorescencyjnego. Zobrazuj komórki barwnika immunologicznego pod mikroskopem konfokalnym przy użyciu odpowiednich filtrów wzbudzenia i emisji.

Należy stosować te same parametry akwizycji obrazowania dla wszystkich powtórzeń i warunków następujących po obrazowaniu. Użyj standardowego oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak Fiji Image J lub metamorph, aby określić zintegrowaną gęstość standardowych regionów zainteresowania lub atrybutów Punta, takich jak liczba i rozmiar, aby określić, czy gen związany z napadem sześć lub mówi sześć był obecny i zinternalizowany z powierzchni neuronu. Dwukolorowe znakowanie hodowanych neuronów hipokampa szczura przeprowadzono zgodnie z opisem w tym filmie.

Na tym obrazie białko oznaczone na powierzchni komórki jest pokazane w kolorze cyjanu, a białko zinternalizowane jest pokazane na zielono. Podwójne barwienie wskazane przez grot strzałki zaobserwowano tylko w komórce, która wydawała się być niezdrowa, aby określić, czy białko zinternalizowane podczas inkubacji karmienia przeciwciałami zlokalizowane w neuronach endosomów wyrażających wczesny recykling markera endosomu transferyny mCherry było wybarwione immunologicznie po przenikaniu, jak pokazano w tym regionie altany dendrytycznej, występowało rozległe nakładanie się barwienia punktowego z transferyną, potwierdzając, że zinternalizowane białko zlokalizowało się w endosomach. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że pojedyncze przeciwciało może być użyte do rozróżnienia między powierzchnią komórki a zinternalizowanymi pulami białkowymi.