Znakowanie różnicowe białek powierzchniowych i zinternalizowanych po karmieniu przeciwciałami żywych hodowanych neuronów

Ogólnym celem niniejszej procedury jest znakowanie białek znajdujących się na powierzchni żywych neuronów, a następnie odróżnienie białek powierzchniowych od białek zinternalizowanych przy użyciu różnicowego znakowania przeciwciałami wtórnymi. W tym celu pierwotne neurony hodowane na szkiełkach podstawowych inkubuje się z przeciwciałem skierowanym przeciwko epitopowi powierzchniowemu, a następnie inkubuje dalej, aby umożliwić ich internalizację. Po inkubacji stosuje się znakowane fluorescencyjnie przeciwciało wtórne w celu zidentyfikowania białek wyeksponowanych na powierzchni.

Następnie stosuje się nadmiar nieznakowanego przeciwciała wtórnego, aby zablokować pozostałe kompleksy przeciwciał pierwotnych z białkami powierzchniowymi. Następnie hodowane neurony poddaje się permeabilizacji i stosuje przeciwciało wtórne o innym kolorze w celu wykrycia zinternalizowanego białka. W rezultacie, za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, można uzyskać wyniki obrazujące względne poziomy białka zinternalizowanego w stosunku do białka powierzchniowego.

Zastosowanie tej procedury pozwala na uzyskanie przebiegu czasowego internalizacji białek powierzchniowych, co dostarcza informacji o szybkości transportu białek w warunkach bazowych i stymulowanych. Procedurę należy rozpocząć od przygotowania szkiełek podstawkowych do hodowli komórkowej: szkiełka z borokrzemowego szkła o średnicy 18 mm, pokryte polilizyną i przygotowane dzień wcześniej, należy zanurzyć w trzech oddzielnych naczyniach płuczących zawierających PBS. Do dołków płytki 12-dołkowej należy dodać 500 µL roztworu lamininy, a następnie za pomocą pincety umieścić w każdym z nich szkiełko podstawkowe. Należy docisnąć każde szkiełko, aby upewnić się, że przylega ono płasko do dna dołka. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 °C; protokół ten można przeprowadzić z wykorzystaniem kory mózgu myszy w stadium E 15 lub hipokampów szczura w stadium E 18.

W niniejszej demonstracji wykorzystano korę mózgową myszy. Korę z połowy jednego miotu lub z całego jednego miotu embrionów należy umieścić na lodzie w probówce typu eppendorf o pojemności 1 ml zawierającej PBS z dodatkiem wapnia i magnezu. Następnie, używając mikropipety o pojemności 1 ml, należy usunąć PBS z tkanki kory.

Następnie dodaj 500 µL roztworu Pappa DNA do tkanki korowej pochodzącej z połowy miotu embrionów. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 15 do 20 minut. Dwukrotnie w czasie inkubacji delikatnie potrząśnij probówką, aby wymieszać zawartość. Po inkubacji, używając wypalanej w płomieniu silikonizowanej pipety Pasteura, delikatnie pipetuj tkankę 10 do 15 razy, aż do uzyskania dyspersji komórek.

Nie powinno pozostać żadnych, a co najwyżej niewielu fragmentów niedysocjowanej tkanki; należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Ostrożnie nanieś dysocjowaną zawiesinę komórek na trzy mililitry poduszki z 4% BS, A w Hank's BSS z dodatkami. Następnie wiruj w wirówce laboratoryjnej z rotorem kątowym przy 100 ×g przez siedem minut.

Po wirowaniu ostrożnie usuń nadsącz, uważając, aby nie odessać osadu komórkowego. Następnie dodaj 1 ml kompletnego pożywki Neurobasal i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby resuspendować osad komórek. W kolejnym kroku użyj komory countingowej (hemocytometru), aby określić stężenie żywych komórek.

Tylko komórki jasne w fazie kontrastowej należy uznać za żywe bezpośrednio przed wysianiem. Odessaj nadmiar roztworu surowicy laminującej z szkiełek nakrywkowych w dołkach i zastąp go pożywką do pierwotnych kultur neuronów. Następnie dodaj od 75 000 do 100 000 pierwotnych neuronów do każdego dołka.

Hoduj neurony do 21 dni w pożywce neurobasal w temperaturze 37°C, przy 5% carbon dioxide. W siódmym dniu oraz w każdym kolejnym tygodniu dodaj antymitotyczną fluoro-deoksyurydynę, aby zapobiec nadmiernemu rozrostowi gleju, i wymień połowę pożywki. W pierwszym tygodniu hodowli neurony rozwijają drzewa dendrytyczne, co pokazano na tym obrazie dwudniowej kultury. W drugim i trzecim tygodniu neurony dojrzewają i przechodzą proces synaptogenezy.

Na tej rycinie przedstawiono rozległą sieć projekcji; aby oznakować białka zainteresowania eksponowane na powierzchni, w 14. dniu hodowli in vitro należy dodać przeciwciało pierwszorzędowe bezpośrednio do medium warunkującego w odpowiednim stężeniu. Każdy wariant należy przebadać w trzech powtórzeniach. Jako cztery kontrole można zastosować surowicę przedimmunizacyjną lub przeciwciała rozpoznające regiony wewnątrzkomórkowe białka, które nie są eksponowane podczas egzocytozy, przy zastosowaniu takiego samego rozcieńczenia jak w przypadku badanego przeciwciała pierwszorzędowego. Komórki należy zwrócić do inkubatora hodowlanego na jedną, dwie lub cztery godziny; po inkubacji należy odessać medium zawierające przeciwciała i raz delikatnie, lecz szybko, wypłukać studzienki za pomocą PBS.

Wyrównaj temperaturę do temperatury pokojowej poprzez dodanie roztworu do studzienek, a następnie jego odessanie. Następnie dodaj świeżo przygotowaną 4% paraformaldehyd i inkubuj przez pięć minut. Po utrwaleniu dodaj roztwór o temperaturze pokojowej, aby utrwalić komórki.

Usunąć roztwór paraformaldehydu z dołków i wylać go do pojemnika na odpady ciekłe w dygestorium. Następnie szybko przepłukać komórki trzy razy PBS, tak jak wcześniej. Pozostawić trzecią porcję płukania, aby umożliwić łatwe usunięcie szkiełka nakrywkowego.

Następnie za pomocą pęsety ostrożnie usuń szkiełka nakrywki z płytki i ułóż je stroną z komórkami do góry na arkuszu parafilmu umieszczonym na dnie lub pokrywce jednorazowej płytki hodowlanej. Pozostała część protokołu barwienia będzie przeprowadzana na tej powierzchni; delikatnie nanieś pipetą roztwór blokujący (PBS 5% BSA) na komórki, tworząc na szkiełku nakrywce kroplę w kształcie zaokrąglonej bańki, aby zapobiec wysychaniu. Inkubuj przez 30 minut.

Ważne jest, aby nie dodawać detergentu do roztworu blokującego. Na tym etapie komórki nie powinny być permeabilizowane, jeżeli celem jest znakowanie wyłącznie białek powierzchniowych. Po blokowaniu odessać roztwór blokujący, a następnie, aby oznakować białka eksponowane na powierzchni, nanieść znakowane fluorescencyjnie przeciwciało wtórne i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji odessać przeciwciało wtórne i dwukrotnie przemyć szkiełka podstawowe buforem PBS przez pięć minut przy każdym myciu, aby zablokować wszelkie białka na powierzchni komórki, które nie związały się z oznakowanym przeciwciałem wtórnym.

Inkubować nieprzepuszczalne neurony z wysokim stężeniem nieznakowanego przeciwciała wtórnego przez noc, w temperaturze pokojowej. Inkubacja przez noc jest kluczowa.

Krótsze okresy inkubacji nie zablokują całkowicie przeciwciał pierwszorzędowych, które nie zostały w pełni związane przez znakowane przeciwciała drugorzędowe. Następnego dnia przemyć szkiełka podstawowe dwukrotnie przez pięć minut każde, używając PBS, jak poprzednio. Następnie przeprowadzić postfiksację komórek w 4% paraformaldehydzie w buforze fosforanowym przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a po usunięciu utrwalacza przemyć próbki.

Szybko przepłucz komórki dwukrotnie buforem PBS. Następnie, w celu przeprowadzenia znakowania wewnątrzkomórkowego, poddaj komórki permeabilizacji i blokowaniu w buforze PBS zawierającym 5% BSA i 0,1% Triton X 100 w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po permeabilizacji usuń roztwór blokujący.

Należy dopilnować, aby szkiełka podstawowe nie wyschły. Należy dodać przeciwciało wtórne z innym znacznikiem i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po usunięciu drugiego przeciwciała wtórnego szkiełka podstawowe należy przemyć trzykrotnie przez pięć minut w PBS.

Następnie krótko przemyć je wodą zdejonizowaną. Przykryć preparaty na szkiełkach przedmiotowych za pomocą wodnego medium montażowego zawierającego czynnik zapobiegający blaknięciu i pozwolić im wyschnąć. Przechowywać szkiełka w ciemności w temperaturze 4 °C dla optymalnej konserwacji sygnału fluorescencyjnego. Wykonać obrazowanie komórek poddanych immunobarwieniu za pomocą mikroskopu konfokalnego, stosując odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji.

Dla wszystkich powtórzeń i warunków po obrazowaniu należy zastosować te same parametry akwizycji obrazu. Do wyznaczenia zintegrowanej gęstości standardowych obszarów zainteresowania (ROI) lub atrybutów punktów, takich jak liczba i rozmiar, należy użyć standardowego oprogramowania do analizy obrazu, np. Fiji Image J lub MetaMorph, aby ustalić, czy białko seizure-related gene 6 lub SEZ6 znajdowało się na powierzchni neuronu i czy uległo internalizacji. Podwójne znakowanie barwnikiem hodowlanych neuronów hipokampa szczura przeprowadzono zgodnie z opisem w tym filmie.

Na tym obrazie białko powierzchniowe komórki jest pokazane w kolorze cyjanowym, a białko zinternalizowane w kolorze zielonym. Podwójne barwienie wskazane grotem strzałki zaobserwowano jedynie w komórce, która wydawała się niezdrowa. Aby określić, czy białko zinternalizowane podczas inkubacji w procesie karmienia przeciwciałem lokalizuje się w endosomach, neurony wykazujące ekspresję markera wczesnych endosomów recyklingujących transferrin mCherry zostały poddane immunobarwieniu po permeabilizacji. Jak pokazano w tym obszarze drzewa dendrytycznego, wystąpiło rozległe nakładanie się barwienia punktowego z transferrin, co potwierdza, że zinternalizowane białko lokalizuje się w endosomach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość wykorzystania pojedynczego przeciwciała do rozróżnienia pul białek powierzchniowych i zinternalizowanych.