Name: Znakowanie różnicowe białek powierzchniowych i zinternalizowanych po karmieniu przeciwciałami żywych hodowanych neuronów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Poznaj metodę różnicowego znakowania białek powierzchniowych i zinternalizowanych w żywych neuronach przy użyciu przeciwciał wtórnych. Technika ta umożliwia badanie dynamiki białek w komórkach nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Teele Palumaa za pomoc przy rysunkach. Finansowany z grantu projektu 1008046 Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych w Australii.

1. Zdysocjowana hodowla neuronów hipokampa
<ol>
	<li>Przygotuj szkiełka nakrywkowe (szkło borokrzemianowe):
	<ol>
		<li>Prać w 100% etanolu.</li>
		<li>Suszyć na powietrzu w promieniowaniu UV.</li>
		<li>Pokryć poli-D-lizyną (0,5 mg/ml w 0,15 M buforze boranowym, przez noc w temperaturze 4 °C).</li>
		<li>Następnego dnia (dzień hodowli) przemyć 3x w PBS, a następnie pokryć lamininą (2,5 μg/ml, naturalna laminina mysie) + 5% v/v inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej (FCS) rozcieńczonej w PBS przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozbioruj hipokampy szczurów z dnia 18 (E18) i zbierz je do PBS zawierającego wapń i magnez, schłodzonego na lodzie. UWAGA: wszystkie protokoły eksperymentalne z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu w Melbourne.</li>
	<li>Przygotuj roztwory papainy i DNazy I z zestawu do dysocjacji papainy zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Dodać 50 μl roztworu DNazy I do 1 ml roztworu papainy.</li>
		<li>UWAGA: Po pierwszym przygotowaniu, roztwór papainy i roztwory DNazy I mogą być oddzielnie dozowane do podwielokrotności (0,5 ml i 25 μl porcji odpowiednio dla papainy i DNazy I) i przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć jak najwięcej PBS i inkubować hipokampy (z jednego miotu zarodków) z 1 ml roztworu papainy/DNazy I w temperaturze 37 °C przez 15-20 minut. Delikatnie przesunąć probówkę, aby wymieszać zawartość dwukrotnie w okresie inkubacji.</li>
	<li>Delikatnie rozcieraj tkankę hipokampa (unikając tworzenia pęcherzyków) za pomocą polerowanej płomieniowo silikonowanej pipety Pasteura 10-15 razy, aż do uzyskania dyspersji komórek i niewielu, jeśli w ogóle, kawałków niezdysocjowanej tkanki.</li>
	<li>Ostrożnie nałożyć zawiesinę zdysocjowanych komórek na 3 ml poduszki z 4% w/v albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w zrównoważonym roztworze soli Hanksa z dodatkami (HBSS+; patrz sekcja 1.6.1).
	<ol>
		<li>Przygotować ten roztwór gradientu etapowego, rozpuszczając BSA w temperaturze pokojowej bez mieszania w HBSS zawierającym 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 4 mMNaHCO3 i 40 mM glukozy (HBSS+), a następnie sterylnie przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirówka, 100 x g, 7 min w wirówce stołowej z odchylanym wirnikiem.</li>
	<li>Usunąć supernatant, uważając, aby nie zassać osadu komórkowego.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić granulowane komórki za pomocą wypolerowanej płomieniowo (silikonowanej) pipety Pasteura (lub niebieskiej końcówki pipety o pojemności 1 ml) w 1 ml kompletnej pożywki Neurobasel (z 2% B27, 0,5 mM L-glutaminy uzupełnionej 1% FCS).</li>
	<li>Policz dwie podwielokrotności 10 μl za pomocą hemocytometru (Uwaga: licz tylko komórki o jasności fazowej jako "żywe" komórki).</li>
	<li>Płytki neuronów pierwotnych na wstępnie przygotowanych szkiełkach nakrywkowych ze szkła powlekanego (0,75-1 x 105/18 mm szkiełko nakrywkowe w płytce 12-dołkowej). Bezpośrednio przed posiewem należy odessać nadmiar roztworu lamininy/surowicy ze szkiełek nakrywkowych i zastąpić je pierwotną pożywką do hodowli neuronów (patrz poniżej). Uwaga Wymaganą liczbę szkiełek nakrywkowych należy określić z wyprzedzeniem, ponieważ przygotowanie szkiełek nakrywkowych rozpoczyna się dzień przed posiewem (patrz krok 1.1).</li>
	<li>Hodowla pierwotnych neuronów hipokampa E18 szczura przez okres do 21 dni in vitro (DIV) w pożywce neurobazalnej, 2% B27, 0,5 mM L-glutaminy uzupełnionej 1% FCS (inaktywowana termicznie). Wykonaj połowę zmiany podłoża przy 7 DIV, a następnie co tydzień. Antymitotyczną fluorodeoksyurydynę/urydynę dodaje się w 7 DIV; Rozcieńczenie 1:1,000 10 mM każdego nukleozydu), aby zapobiec przerostowi gleju.</li>
</ol>
2. Inkubacja przeciwciał z żywymi neuronami
<ol>
	<li>W pierwszym tygodniu hodowli neurony rozwijają altany dendrytyczne, a do 2-3 tygodnia neurony dojrzewają na tyle, aby ulegać synaptogenezie6,7.
	<ol>
		<li>W wybranych eksperymentalnych punktach czasowych nanieść przeciwciało pierwotne do trzykrotnego powiększenia studzienek zawierających pierwotne neurony embrionalne na szkiełkach nakrywkowych. Dodać podwielokrotność przeciwciała bezpośrednio do pożywki hodowlanej pierwotnych neuronów do pożądanego końcowego rozcieńczenia Uwaga: W naszym przykładzie poliklonalną surowicę królika wyhodowaną przeciwko rekombinowanej wydzielanej formie białka rozcieńczono w stosunku 1/500 przez dodanie 2 μl do 1 ml pożywki hodowlanej w studzience; przed pobraniem podwielokrotności przeciwciała można włączyć wirowanie przez 10 minut, 13 000 x g, RT, ponieważ usunie to wszelkie cząstki stałe i może pomóc w redukcji tła.</li>
		<li>W przypadku kontroli surowicy przedimmunologicznej dodać równoważną ilość surowicy przedimmunologicznej (do tego samego końcowego rozcieńczenia). Jeśli surowica przedimmunologiczna nie jest dostępna, należy dodać równoważną objętość pożywki neuropodstawowej lub PBS (brak kontroli przeciwciał pierwotnych). Alternatywnie, jeśli dostępne jest odpowiednie przeciwciało pierwszorzędowe, które rozpoznaje wewnątrzkomórkowy region/regiony białka, przeciwciało to można dodać do studzienki kontrolnej w celu zbadania swoistości barwienia powierzchni.</li>
		<li>Umieść komórki z powrotem w inkubatorze hodowlanym na 1-4 godziny (ten okres inkubacji można określić empirycznie). W naszych eksperymentach przeciwciało było obecne przez cały okres, chociaż projekt eksperymentalny mógł obejmować impuls przeciwciała, po którym następował dalszy okres inkubacji po wypłukaniu (eksperyment z pogonią za impulsem) w celu oceny przebiegu internalizacji w czasie. 
		KROK OPCJONALNY: Tę inkubację można przeprowadzić w temperaturze pokojowej lub nawet na lodzie, aby w razie potrzeby spowolnić tempo internalizacji białka podstawowego. W przypadku wykonywania w środowisku niekontrolowanym przez CO2 należy zmienić pożywkę na taką, która nie jest buforowana wodorowęglanem przed dodaniem przeciwciała/surowicy. UWAGA: Dojrzałe hodowle neuronów (>14 dni, a zwłaszcza hodowane neurony embrionalne myszy) nie tolerują dobrze pełnych zmian w pożywce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastosowaliśmy czasy inkubacji dla tego pierwotnego etapu internalizacji przeciwciał wynoszące 1 godzinę, 2 godziny i 4 godziny z dobrymi wynikami, chociaż optymalny czas będzie zależał od obfitości białka będącego przedmiotem zainteresowania, a także od dynamiki transportu białka w badanych komórkach. 
	UWAGA: Dwukolorowe obrazy pokazane w Reprezentatywnych Wynikach uzyskano przy inkubacji trwającej 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Po inkubacji przez pożądany okres odessać pożywkę zawierającą przeciwciała. Umyj studzienki delikatnie, ale szybko, raz za pomocą PBS w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Wtórne zastosowanie przeciwciał do stałych, nieprzepuszczalnych komórek
<ol>
	<li>Utrwalić neurony za pomocą 4% paraformaldehydu w buforze fosforanowym o pH 7,2, 5 min w temperaturze pokojowej Uwaga: aby uzyskać najlepsze wyniki, użyj świeżo przygotowanego utrwalacza; alternatywnie użyj fixu, który był przechowywany w temperaturze -20 °C i całkowicie rozmrożony, aby nie było widoczne wytrącony paraformaldehyd. UWAGA: Utrwalacz paraformaldehydu należy przygotować i obchodzić się z nim pod wyciągiem.</li>
	<li>Usunąć płyn ze studzienek (przenieść do pojemnika na odpady płynne w dygestorium) i spłukać 3x PBS.
	<ol>
		<li>KROK OPCJONALNY: W razie potrzeby, aby zaoszczędzić na odczynnikach przeciwciał, szkiełka nakrywkowe można ostrożnie usunąć z płytki 12-dołkowej za pomocą kleszczyków i umieścić komórką do góry na arkuszu Parafilmu ułożonym na podstawie jednorazowej płytki hodowlanej.</li>
		<li>Roztwory można następnie delikatnie pipetować na szkiełka nakrywkowe, tak aby były całkowicie pokryte, bez wylewania roztworu przez krawędź szkiełka nakrywkowego na Parafilm.</li>
		<li>Technika ta jest odpowiednia do krótkotrwałych inkubacji (1-2 godziny), jednak dłuższe inkubacje (np. przez noc) należy przeprowadzać w wilgotnej komorze. Alternatywnie, szkiełka nakrywkowe można umieścić z powrotem w dołkach płytki 12-dołkowej w celu inkubacji przez noc i dodać wystarczającą objętość, aby zapewnić, że szkiełka nakrywkowe nie wyschną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej z 5% BSA w PBS (Uwaga: Na tym etapie nie dodawaj detergentu do roztworu blokującego, ponieważ ważne jest, aby komórki nie były przepuszczalne).</li>
	<li>W celu znakowania białka powierzchniowego przed przystąpieniem do wykrywania białka zinternalizowanego, należy zastosować pierwsze wybrane przeciwciało 2° znakowane fluorescencyjnie. 
	Uwaga: W opisanym tutaj przykładzie pierwszorzędowa surowica została wyhodowana w króliku (przeciwciało wewnętrzne) do rekombinowanej wydzielanej izoformy4. Tak więc, aby uzyskać pierwsze przeciwciało wtórne, które wykryło zewnątrzkomórkowy region izoformy transbłonowej na powierzchni nieprzepuszczalnych neuronów, użyliśmy anty-królika Dylight 649 (1/200 rozcieńczonego w PBS zawierającym 5% BSA). Zaleca się odwirowanie rozcieńczonych roztworów przeciwciał drugorzędowych (10 min, 13 000 x g, RT) przed użyciem.</li>
	<li>Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe myć (w studzienkach), 2x 5 min za pomocą PBS.</li>
</ol>
4. Blokowanie za pomocą nadmiaru nieoznakowanego przeciwciała 2°
<ol>
	<li>Zablokuj nieprzepuszczalne neurony wysokim stężeniem (>0,1 mg/ml) nieznakowanego przeciwciała 2°.
	<ol>
		<li>Nieznakowane przeciwciało 2° powinno być hodowane przeciwko gatunkowi, u którego wyhodowano przeciwciało pierwszorzędowe (w tym przypadku królik) przez inkubację przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>W tym protokole zastosowano AffiniPure Fab fragment kozioł anty-króliczy IgG (H+L) w stężeniu 0,13 mg/ml. 
		UWAGA: Stwierdzono, że inkubacja przez noc jest kluczowa, ponieważ krótszy okres inkubacji (2 godziny) był niewystarczający do całkowitego zablokowania przeciwciała pierwszorzędowego, które nie było w pełni związane przez znakowane przeciwciało drugorzędowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe myć (w studzienkach), 2x 5 min za pomocą PBS.</li>
	<li>Po tym etapie blokowania należy utrwalić komórki 4% paraformaldehydem w buforze fosforanowym o pH 7,2, 5 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać PBS (2x) po usunięciu utrwalacza (przenieść utrwalacz do pojemnika na odpady płynne w dygestorium).</li>
</ol>
5. Permeabilizacja i zastosowanie drugiego fluorescencyjnie sprzężonego przeciwciała 2°
<ol>
	<li>Przepuszczać i blokować komórki za pomocą 5% BSA w PBS zawierającym 0,1% Triton-X-100 w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li>
	<li>Usuń roztwór blokujący (uważając, aby szkiełka nakrywkowe nie wyschły). Dodać drugie fluorescencyjnie sprzężone przeciwciało 2° oznaczone innym fluoroforem.
	<ol>
		<li>UWAGA: Musi istnieć możliwość odróżnienia tego znacznika fluoroforowego od poprzednio używanego, w zależności od dostępnych filtrów wzbudzenia/emisji w mikroskopie konfokalnym (patrz poniżej).</li>
		<li>W przykładzie przedstawionym w tym protokole użyto sprzężonego z Alexa Fluor 488 przeciwciała anty-króliczego 2° osła (1/200 w PBS, 5% BSA i 0,1% Triton-X-100). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć roztwór przeciwciał o temperaturze 2°.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe myć 3x 5 min PBS, a na koniec krótko umyć wodą dejonizowaną.</li>
</ol>
6. Montaż i obrazowanie
<ol>
	<li>Szkiełka nakrywkowe zamontować na szkiełkach podstawowych z wodnym medium mocującym zapobiegającym blaknięciu (np. VECTASHIELD) i pozostawić do wyschnięcia. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C w celu optymalnego zachowania intensywności sygnału fluorescencyjnego.</li>
	<li>Obraz komórek barwionych immunologicznie pod mikroskopem konfokalnym.
	<ol>
		<li>Muszą być dostępne odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji do wykrywania dwóch sygnałów fluoroforowych.</li>
		<li>Jeżeli mają być porównane różne warunki eksperymentalne (na przykład szybkość internalizacji w zdepolaryzowanych8,9 lub warunki kontrolne), należy upewnić się, że wszystkie powtórzone szkiełka nakrywkowe z różnych warunków są obrazowane z tymi samymi parametrami akwizycji obrazu. Zintegrowana gęstość standardowych obszarów zainteresowania lub atrybuty puncta (np. liczba, rozmiar) z wynikowych obrazów mogą być następnie mierzone za pomocą standardowego oprogramowania do analizy obrazów (np. Fiji/ImageJ, Metamorph).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lewis, T. L. Jr, Mao, T., Arnold, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+myosin+VI+in+the+localization+of+axonal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for myosin VI in the localization of axonal proteins.</a> PLoS Biol. 9, (2010).</li>
<li>von Zastrow, M., Williams, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+neuromodulation+by+receptor+membrane+traffic+in+the+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway.</a> Neuron. 76, 22-32 (2012).</li>
<li>Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+gene+expression+patterns+in+developing+mouse+neocortex+using+serial+analysis+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression.</a> Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).</li>
<li>Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sez-6+proteins+affect+dendritic+arborization+patterns+and+excitability+of+cortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons.</a> Neuron. 56, 621-639 (2007).</li>
<li>Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin-4+Defines+a+Domain+for+Activity-Dependent+Exocytosis+in+Dendritic+Spines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines.</a> Cell. 141, 524-535 (2010).</li>
<li>Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-to-neuron+ratio+is+inversely+related+to+neuronal+density+in+mature+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures.</a> Brain Res. 1359, 44-55 (2010).</li>
<li>Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+in+primary+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture.</a> Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).</li>
<li>Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+underlying+reversible%2C+activity-dependent+dendrite+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation.</a> Neuron. 34, 985-998 (2002).</li>
<li>Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recycling+endosomes+supply+AMPA+receptors+for+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP.</a> Science. 305, 1972-1975 (2004).</li>
<li>Kennedy, M. J. &, Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelles+and+trafficking+machinery+for+postsynaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).</li>
<li>Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+early+endosomes+require+EHD1+for+L1%2FNgCAM+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking.</a> J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).</li>
<li>Arancibia-Cárcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T. Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArancibia-C%C3%A1rcamo%2C+IL+%22The+Dynamic+Synapse%3A+Molecular+Methods+in+Ionotropic+Receptor+Biology%22">The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology</a>. Kittler, J. T., Moss, S. J. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2006).</li>
<li>Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+trafficking+and+recycling+maintain+a+pool+of+mobile+surface+AMPA+receptors+required+for+synaptic+potentiation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation).</a> Neuron. 63, 92-105 (2009).</li>
<li>Reider, A., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+adaptors+%E2%80%93+social+networking+at+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Endocytic adaptors – social networking at the plasma membrane.</a> J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisana tutaj technika jest komplementarna do biotynylacji na powierzchni komórki (recenzowana przez Arancibia-Càrcamo i wsp.)12 i jest to metoda z wyboru do zachowania informacji o subkomórkowej lokalizacji zinternalizowanego białka, pod warunkiem, że dostępne jest odpowiednie pierwotne przeciwciało przeciwko epitopowi zewnątrzkomórkowemu. Ponadto można przeprowadzić ilościowe określenie transportu/internalizacji białek w czasie (poprzez utrwalanie szkiełek nakrywkowych w różnych momentach inkubacji ...

W ustalaniu funkcji nowo zidentyfikowanych białek, badanie subkomórkowej lokalizacji i transportu białka, o którym mowa, może dostarczyć ważnych wskazówek na temat prawdopodobnej roli/ról białka1,2. Analiza bioinformatyczna transkryptomu rozwijającej się kory nowej3 dostarczyła nam listy genów wykazujących zmienioną ekspresję podczas kortykogenezy mózgu myszy. Następnie przyjęliśmy podejście oparte na nokaucie genów, aby upewnić się, że białko kodowane przez jeden z tych genów, sez6, odgrywa kluczową rolę w rozwoju neuronów. Zaobserwowaliśmy, że białko genu 6 lub Sez6 związanego z napadami padaczkowymi znajduje się w rozwijających się dendrytach i jest również obecne w kolcach dendrytycznych, wyspecjalizowanych strukturach na dendrytach, które odbierają i integrują sygnały pobudzające. Co więcej, gdy brakuje tego białka, dendryty i synapsy pobudzające nie tworzą sięprawidłowo4. Prawdopodobna dominująca izoforma białka ma cechy receptora transbłonowego, chociaż gdy subkomórkowa dystrybucja białka znakowanego immunologicznie została zbadana za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii immunoelektronowej, większość, jeśli nie całość, sygnału wydawała się związana z małymi pęcherzykami w kompartmencie somatodendrytycznym z niewielką ilością lub bez białka znakowanego na błonie plazmatycznej na powierzchni komórki.
Aby ostatecznie wykazać, że ten domniemany receptor z przewidywaną dużą domeną zewnątrzkomórkową jest transportowany do błony komórkowej, przyjęliśmy podejście oparte na żywych komórkach, używając wygenerowanej przez nas surowicy do zewnątrzkomórkowej części białka, aby oznaczyć białko na powierzchni komórki. Łącząc to podejście "karmienia przeciwciałami" z dwoma zastosowaniami różnie znakowanego przeciwciała drugorzędowego oddzielonego rozległym etapem blokowania i etapem przepuszczalności, byliśmy w stanie zidentyfikować dwie różne pule białek wyróżniające się przez wiązanie z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi o różnych znacznikach fluorescencyjnych. W ten sposób byliśmy w stanie odróżnić białko, które zostało zinternalizowane przez endocytozę podczas etapu inkubacji przeciwciał, od białka, które albo pozostało na powierzchni komórki, albo zostało przetransportowane na powierzchnię w tym okresie. Korzystając z tej metody, ustaliliśmy, że białko będące przedmiotem zainteresowania jest transportowane do i z powierzchni komórki w neuronach. Dlatego ta stosunkowo szybka i prosta technika okazała się bardziej pouczająca niż tradycyjne metody immunocytochemiczne lub wstępna mikroskopia elektronowa immunogold, pomimo faktu, że użyliśmy tej samej poliklonalnej surowicy królika do wszystkich tych technik. Technika ta ma ogólne zastosowanie do każdego białka transbłonowego, pod warunkiem, że dostępne jest dobre przeciwciało rozpoznające epitopy domen zewnątrzkomórkowych. Technika ta była wcześniej stosowana do badania transportu receptora glutaminianu podjednostki5 receptora glutaminianu GluR1.

<table><tbody><tr><td>PBS z Ca i Mg</td><td>Invitrogen</td><td>14040182</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże neurobazalne</td><td>Suplement Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>System dysocjacji papainy</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>PDS</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039; s zbilansowany roztwór soli bez wapnia, magnezu, czerwieni fenolowej</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lizyna</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Naturalna laminina mysia</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>Rozmrozić na lodzie przed zrobieniem podwielokrotności</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca HyClone</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorodeoksyurydyna</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>18 mm Szkiełka nakrywkowe okrągłe</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td>CB00180RA1</td><td></td></tr><tr><td>wodne medium montażowe VECTASHIELD</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1400</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-królik Dylight 649&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-495-152</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab fragment Kozia anty-królik 1gG (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-007-003</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>P6148</td><td>TOXIC - uchwyt w dygestoriach</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-sprzężony osioł anty-królik 2&deg; przeciwciało</td><td>Invitrogen - Sondy molekularne</td><td>A21206</td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie różnicowe białek powierzchniowych i zinternalizowanych po karmieniu przeciwciałami żywych hodowanych neuronów

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Aby zademonstrować lokalizację domniemanego receptora transbłonowego na powierzchni komórki w hodowanych neuronach, oznaczyliśmy białko na powierzchni żywych neuronów specyficznym pierwotnym przeciwciałem podniesionym przeciwko zewnątrzkomórkowej części białka. Biorąc pod uwagę, że receptory są transportowane do i z powierzchni, jeśli komórki są przepuszczalne po utrwaleniu, zarówno białko powierzchniowe, jak i wewnętrzne zostaną wykryte przez to samo znakowane przeciwciało drugorzędowe. W tym przypadku dostosowaliśmy metodę stosowaną do badania transportu białek ("karmienia przeciwciałami") w celu różnicowego znakowania białka, które zostało zinternalizowane przez endocytozę na etapie inkubacji przeciwciał i białka, które albo pozostało na powierzchni komórki, albo zostało przetransportowane na powierzchnię w tym okresie. Zdolność do rozróżnienia tych dwóch pul białek była możliwa dzięki włączeniu nocnego etapu blokowania z wysoce skoncentrowanym nieznakowanym przeciwciałem drugorzędowym po początkowej inkubacji nieprzepuszczalnych neuronów z fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym. Po etapie blokowania, przepuszczalność neuronów pozwoliła na wykrycie zinternalizowanej puli za pomocą fluorescencyjnego przeciwciała drugorzędowego znakowanego innym fluoroforem. Korzystając z tej techniki, byliśmy w stanie uzyskać ważne informacje na temat subkomórkowej lokalizacji tego domniemanego receptora, ujawniając, że rzeczywiście był on transportowany na powierzchnię komórki w neuronach. Technika ta ma szerokie zastosowanie do wielu typów komórek i białek powierzchniowych komórek, zapewniając odpowiednie przeciwciało przeciwko epitopowi zewnątrzkomórkowemu.

Przedstawiona tutaj technika dwukolorowego fluorescencyjnego barwienia immunocytochemicznego jest użyteczna do znakowania domen pozakomórkowych białek transbłonowych w żywych komórkach (schematycznie przedstawiono na Rysunku 1). W okresie inkubacji immunoglobuliny wiążą dostępne epitopy, a część populacji cząsteczek białek, wraz z przywiązanym przeciwciałem, ulega endocytozie. Ponadto nowo syntetyzowane białka mogą przedostawać się na powierzchnię komórki poprzez transport anterogradowy, a recyklowane cz...

Opisujemy metodę znakowania białka na powierzchni żywych neuronów za pomocą specyficznego poliklonalnego przeciwciała przeciwko epitopom zewnątrzkomórkowym. Białko związane przez przeciwciało na powierzchni komórki, a następnie internalizowane przez endocytozę, można odróżnić od białka pozostającego na powierzchni lub transportowanego na powierzchnię podczas inkubacji.

Znakowanie różnicowe białek powierzchniowych i zinternalizowanych po karmieniu przeciwciałami żywych hodowanych neuronów

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest znakowanie białek znajdujących się na powierzchni żywych neuronów, a następnie odróżnienie białek powierzchniowych od białek zinternalizowanych przy użyciu różnicowego znakowania przeciwciałami wtórnymi. W tym celu pierwotne neurony hodowane na szkiełkach podstawowych inkubuje się z przeciwciałem skierowanym przeciwko epitopowi powierzchniowemu, a następnie inkubuje dalej, aby umożliwić ich internalizację. Po inkubacji stosuje się znakowane fluorescencyjnie przeciwciało wtórne w celu zidentyfikowania białek wyeksponowanych na powierzchni.Następnie stosuje się nadmiar nieznakowanego przeciwciała wtórnego, aby zablokować pozostałe kompleksy przeciwciał pierwotnych z białkami powierzchniowymi. Następnie hodowane neurony poddaje się permeabilizacji i stosuje przeciwciało wtórne o innym kolorze w celu wykrycia zinternalizowanego białka. W rezultacie, za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, można uzyskać wyniki obrazujące względne poziomy białka zinternalizowanego w stosunku do białka powierzchniowego.Zastosowanie tej procedury pozwala na uzyskanie przebiegu czasowego internalizacji białek powierzchniowych, co dostarcza informacji o szybkości

differential-labeling-cell-surface-internalized-proteins-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Różnicowe znakowanie białek na powierzchni komórki i zinternalizowanych po podawaniu przeciwciał żywym neuronom hodowanym w kulturze

Prezentujemy zastosowanie pistoletu genowego do wprowadzania barwników fluorescencyjnych, takich jak DiI, do neuronów wyrytych z plastrów mózgu gryzoni oraz naczelnych innych niż człowiek w różnym wieku. W tym konkretnym przypadku wykorzystujemy dorosłe myszy (w wieku 3–6 miesięcy) oraz dorosłe makaki krabikowate (w wieku 9–15 lat). Technika ta, pierwotnie opisana przez laboratorium dr. Lichtmana (Gan et al., 2000), jest odpowiednia do badania rozgałęzień dendrytycznych oraz morfologii kolców...

DIOLISTYCzne znakowanie neuronów w skrawkach mózgu gryzoni i naczelnych niebędących ludźmi

Opisano szybką metodę badania interakcji oraz wpływu na mechanizmy molekularne związane z obecnością przeciwciał w środowisku wewnątrzkomórkowym. Metoda ta polega na transfekcji przeciwciał do żywych komórek przy użyciu tworzenia kompleksów niekowalencyjnych w oparciu o formulację lipidową. Technika ta jest możliwa do zastosowania w unieśmiertelnionych liniach komórkowych oraz komórkach pierwotnych.

Transfekcja przeciwciał do neuronów jako narzędzie do badania patogenezy chorób

Prezentujemy technikę oznaczania pojedynczych neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) zarodków Drosophila, która pozwala na analizę morfologii neuronów za pomocą światła przechodzącego lub mikroskopii konfokalnej.

Znakowanie pojedynczych komórek w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila melanogaster

Mikroglej to komórki odpornościowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN) o dużej zdolności do fagocytozy lub pochłaniania materiału w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu opisano szeroko stosowany, wiarygodny i wysoce ilościowy test do wizualizacji i pomiaru pochłaniania składników synaptycznych za pośrednictwem mikrogleju.

Test pochłaniania: protokół oceny interakcji między fagocytami OUN a neuronami

Dostarczamy szczegółowy opis protokołu analizy cytometrycznej powierzchni i/lub antygenów wewnątrzkomórkowych w typach komórek nerwowych. Wyjaśniono kluczowe aspekty planowania eksperymentalnego, procedury metodologiczne krok po kroku i podstawowe zasady cytometrii przepływowej, aby umożliwić neurobiologom wykorzystanie tej potężnej technologii.

Protokoły cytometrii przepływowej do powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych analiz antygenowych typów komórek nerwowych

Ruch receptorów moduluje sygnalizację i reakcję komórki na ligandy i sam reaguje na warunki komórkowe, w tym sygnalizację indukowaną przez ligand. W tym miejscu opisujemy potężną i elastyczną technikę ilościowej oceny transportu receptorów indukowanego przez lek za pomocą znakowania immunologicznego i analizy kolokalizacyjnej.

Śledzenie zmian wywołanych przez leki w transporcie receptorów po internalizacji za pomocą analizy kolokalizacyjnej

Badanie transportu błonowego jest kluczowe dla zrozumienia funkcji neuronalnych. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków w neuronach. Jest to wygodna metoda, którą można dostosować do ilościowego oznaczania transportu błonowego w układzie nerwowym.

Kwantyfikacja ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych

Prezentowany tutaj jest protokół, który łączy system kohodowli neuronalno-śródbłonkowej in vitro i metaboliczną inkorporację sialoglikanu z bioortogonalnymi grupami funkcyjnymi w celu rozszerzenia pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych oraz oznaczenia ich powierzchniowych sialoglykoprotein do obrazowania lub analizy spektrometrii mas markerów powierzchni komórki.

Identyfikacja markerów powierzchniowych pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez znakowanie metaboliczne sialoglikanu

Pobudliwość neuronów może być modulowana poprzez dynamiczny proces endo- i egzocytozy pobudzających jonotropowych receptorów glutaminianu. Opisany tutaj jest dostępny test o wysokiej zawartości do ilościowego określania puli populacji receptorów powierzchniowych i wewnętrznych.

Test o wysokiej zawartości do monitorowania transportu receptora AMPA

Ten artykuł przedstawia metodę badania transportu receptora glutaminianu (GluR) w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa. Wykorzystując podejście oparte na podawaniu przeciwciał do znakowania endogennych lub nadmiernie eksprymowanych receptorów w połączeniu z podejściami farmakologicznymi, metoda ta pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych regulujących ekspresję powierzchniową GluR poprzez modulację procesów internalizacji lub recyklingu.

Podejście do karmienia przeciwciałami w celu zbadania transportu receptora glutaminianu w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa

Proteasom błony neuronalnej (NMP) został niedawno zidentyfikowany w podzbiorze neuronów somatosensorycznych jako kluczowy regulator percepcji dotyku, bólu i swędzenia. W tym artykule przedstawiono solidny przepływ pracy do analizy ekspresji i funkcji NMP specyficznej dla typu komórki przy użyciu sortowania komórek, profilowania transkryptomu i analiz immunofluorescencyjnych opartych na hodowlach.

Specyficzna dla podtypu komórki analiza proteasomu błony neuronalnej w neuronach somatosensorycznych

Poznaj metodę różnicowego znakowania białek powierzchniowych i zinternalizowanych w żywych neuronach przy użyciu przeciwciał wtórnych. Technika ta umożliwia badanie dynamiki białek w komórkach nerwowych.

Znakowanie różnicowe białek powierzchniowych i zinternalizowanych po karmieniu przeciwciałami żywych hodowanych neuronów

Przeglądaj więcej filmów