Znakowanie różnicowe białek powierzchniowych i zinternalizowanych po karmieniu przeciwciałami żywych hodowanych neuronów

Ogólnym celem tej procedury jest znakowanie białek na powierzchni żywych neuronów, a następnie odróżnienie białka powierzchniowego od białek zinternalizowanych za pomocą różnicowego znakowania przeciwciał wtórnych. Aby to zrobić, neurony pierwotne hodowane na szkle nakrywkowym są inkubowane z przeciwciałem skierowanym przeciwko epitopowi powierzchniowemu i inkubowane, aby umożliwić internalizację. Po inkubacji nakłada się znakowane fluorescencyjnie przeciwciało drugorzędowe w celu identyfikacji białek narażonych na działanie powierzchni.

Następnie nakłada się nadmiar nieznakowanego przeciwciała drugorzędowego w celu zablokowania pozostałych kompleksów przeciwciał pierwszorzędowych białek powierzchniowych. Wyhodowane neurony są następnie poddawane permecji i nakłada się przeciwciało wtórne o innym kolorze w celu wykrycia zinternalizowanego białka. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują względne poziomy białka zinternalizowanego w porównaniu z białkiem powierzchniowym za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.