Oparte na morfologii rozróżnienie między zdrowymi i patologicznymi komórkami z wykorzystaniem transformaty Fouriera i samoorganizujących się map

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach podstawowych i zastosowaniach klinicznych, takich jak badania nad rakiem i leczenie raka, ale także w dziedzinie immunologii. Główną zaletą tej metody jest to, że jest to metoda statyczna i łatwa do ułatwienia. Ta technika jest w stanie automatycznie zidentyfikować chore typy komórek na podstawie ich kształtu i charakterystyki ruchu.

Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę i terapię raka lub chorób zapalnych. Metoda ta może zapewnić wgląd w działania między komórkami odpornościowymi a komórkami rakowymi, ale może być również stosowana w każdej dziedzinie, w której niezbędne są trójwymiarowe dane mikroskopowe. Może się zdarzyć, że osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności z opisaniem i walidacją danych z mikroskopii trójwymiarowej z powodu problemów.

Pomyśleliśmy, że wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ narzędzia programowe, których tutaj używamy, nie są znane wielu naukowcom. Na początek uzyskaj zestaw danych z mikroskopii trójwymiarowej o wysokiej rozdzielczości, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Załaduj dane obrazu 3D do oprogramowania do rekonstrukcji i rozpocznij tworzenie powierzchni 3D dla każdego obiektu.

Aby to zrobić, wybierz opcję Widok 3D i kliknij Powierzchnie, a następnie kliknij przycisk Dalej, aby kontynuować pracę z Kreatorem tworzenia powierzchni. Teraz wybierz kanał obrazu do rekonstrukcji powierzchni. Wybierz wartość wygładzenia, która nie ukrywa szczegółów powierzchni, ale także unika porowatych powierzchni.

Zastosuj funkcję wygładzania, klikając pole wyboru Opcja wygładzania i podając promień wygładzania. Podczas tworzenia trójwymiarowych konstrukcji obrazowych danych mikroskopowych szczególnie ważne jest zwrócenie uwagi na współczynnik wygładzania i odpowiednią metodę progową, aby nie stracić żadnych cech komórkowych ani kształtów. Następnie wybierz metodę progowania, aby znaleźć powierzchnie.

Użyj bezwzględnego progu intensywności, gdy obiekty, takie jak te pokazane tutaj, są dobrze oddzielone od tła i mają w przybliżeniu jednolity poziom jasności. Jeśli obiekty różnią się intensywnością, ale nadal można je oddzielić od lokalnego tła i od innych otaczających je obiektów, zastosuj próg kontrastu lokalnego. Ustaw lokalny obszar wyszukiwania progu zgodnie z wartością oczekiwanej średnicy zrekonstruowanych obiektów.

Następnie wybierz z listy opcji, aby przefiltrować zrekonstruowane powierzchnie według interesujących ich parametrów morfologicznych. Obejmuje to objętość, sferyczność, stosunek powierzchni do objętości i inne. Zapisz i wyeksportuj wygenerowane powierzchnie w formacie takim jak VRML, który jest zgodny z oprogramowaniem do animacji 3D, które będzie używane w następnym kroku.

Uruchom Blendera i przejdź do zakładki Wyjście po prawej stronie okna. Wybierz format TIFF z menu rozwijanego i ustaw głębię kolorów na 8-bitowe RGBA. Następnie przełącz się w tryb skryptów i przejdź do dostarczonego pliku skryptu zatytułowanego:GUI_Autorotate.

py, który można pobrać z repozytorium GitHub dla tej pracy. Wróć do okna głównego, kliknij Uruchom skrypt i wybierz folder z plikami wrl, gdy zostaniesz poproszony o wprowadzenie. Następnie przejdź do menu domyślnego.

W tym miejscu ustaw obroty na wartość równą lub wyższą niż sześć. Uruchom skrypt, klikając przycisk Obróć. Obrót o sześć różnych kątów jest zwykle wystarczający do rozróżnienia różnych populacji komórkowych, jednak nie zalecamy używania mniej niż sześciu obrotów, aby nie stracić żadnych informacji o kształtach lub cechach.

Rzuty poszczególnych powierzchni należy zapisać w tym samym folderze, który został użyty do wprowadzenia danych. Domyślnie obrazy są zapisywane w 8-bitowym formacie TIFF, który jest formatem wymaganym przez wtyczkę FIJI, Shade. Otwórz Fidżi i wybierz Cień w menu Wtyczki.

Zacznij od wartości domyślnych, a później dostosuj parametry. Kliknij OK, gdy wszystko będzie gotowe do uruchomienia programu. Następnie wybierz folder źródłowy, który zawiera pliki TIFF, które zostały utworzone w poprzedniej sekcji, i kliknij Wybierz.

Następnie podaj folder danych wyjściowych. Gdy pojawi się pierwszy obraz, narysuj prostokąt otaczający komórkę i zacznij od kliknięcia W porządku. Podczas działania wtyczki widzisz wstępne przetwarzanie obrazu na obrzeżach, znajdowanie komórek oznaczonych czerwonymi liniami.

Współrzędne znalezionych krawędzi są teraz używane do obliczania dyskretnych składowych Fouriera. Aby po raz pierwszy wytrenować samoorganizujące się mapy, zacznij od załadowania programu MATLAB. Załaduj skrypt TrainSOM MATLAP, a następnie wybierz pozycję Uruchom, aby rozpocząć trenowanie.

W razie potrzeby upewnij się, że ścieżka do pliku jest poprawna. Gdy zacznie działać, pojawi się dodatkowe okno z postępem. Poczekaj, aż szkolenie zostanie zakończone, zanim przejdziesz dalej.

Domyślnie skrypt jest ustawiony na uruchamianie 2 000 iteracji lub epików. Po zakończeniu trenowania sprawdź wykresy topologii sieci. Oto przykład wykresu odległości sąsiada, wykresu example-hits i wykresu input-planes.

Samoorganizujące się mapy są ważnym narzędziem do odnajdywania ukrytych relacji w zestawie danych. Grupują one dane w sposób obiektywny i mają tę zaletę, że nie potrzebują zestawu danych treningowych, ponieważ uczą się bez nadzoru. Sieć jest teraz przeszkolona.

Kliknij prawym przyciskiem myszy plik w swoim obszarze roboczym i zapisz go do wykorzystania w przyszłości. Załaduj samoorganizujące się mapy, gdy używasz już wytrenowanej mapy, w celu klastrowania zestawu danych. Następnie zaimportuj plik CSV, który ma być testowany ze wstępnie załadowanymi wytrenowanymi mapami.

Tutaj wybierzemy wyjście CSV wtyczki Shade. Po załadowaniu danych zmień typ danych wyjściowych na Macierz liczbowa, a następnie wybierz pozycję Importuj wybór. Po zakończeniu klasyfikacji użyj okna poleceń, aby ocenić różne wykresy.

Pokazany tutaj obraz pochodzi z dekonwolucji przyżyciowej wielofotonowej miskroskopii danych komórek mikrogleju. W warunkach fizjologicznych mikroglej miał dość złożony kształt z licznymi, silnie rozgałęzionymi procesami. Po umieszczeniu w środowisku nowotworowym, takim jak ten model guza korowego, mikroglej zmienił się na prostszy, bardziej wrzecionowaty kształt.

20 z tych komponentów opisowych w kształcie foriera zostało wykorzystanych jako dane wejściowe do trenowania samoorganizującej się mapy. Wytrenowana mapa została następnie przetestowana w celu oceny jej zdolności do odróżniania komórek zdrowych od nowotworowych. Zdrowa populacja komórek została rzutowana na pojedynczy obszar pokazany tutaj, podczas gdy zestaw danych dotyczących mikrogleju nowotworowego został przedstawiony jako obszar aktywny w kształcie hantli.

Mapy mogą być również trenowane przez ekspertów medycznych w celu identyfikacji różnych grup komórek. W tym przypadku zidentyfikowano, zrekonstruowano i wykorzystano komórki spoczynkowe, komórki fagocytozy, komórki oddziałujące i komórki ruchome do trenowania mapy 12x12. Ta połączona mapa pokazuje grupy sztucznych neuronów o wysokiej wartości trafienia, szczególnie w lewym dolnym i środkowym obszarze mapy.

Solidność podejścia do mapowania została przetestowana przy użyciu wytrenowanej samoorganizującej się mapy z 3 losowymi podzbiorami tego samego typu komórek spoczynkowych, które nie były częścią zestawu danych treningowych. Odpowiedź S.O.M na to dane wejściowe wykazuje bardzo podobną odpowiedź, która wskazuje prawidłowy typ komórki. Po opracowaniu tej techniki mamy teraz zestaw narzędzi, za pomocą którego możemy w prosty sposób kategoryzować zmiany kształtu komórki.

Zmiany te zachodzą, na przykład podczas raka lub innych reakcji układu odpornościowego, i możemy je zmierzyć za pomocą mikroskopii, używając całych zwierząt, wyciętych tkanek, a nawet narządów na chipie.