Name: Narzędzie analityczne, które określa ilościowo zmiany morfologii komórek na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj automatyczną analizę morfologii komórek o nieregularnym kształcie przy użyciu trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych. Ta metoda wykorzystuje Imaris i MATLAB do ilościowej oceny zmian fenotypowych w badaniach nad odkrywaniem leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Biological Imaging Development Center (BIDC) na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco za możliwość korzystania z oprogramowania Imaris, Imaris XT oraz Matlab. Dziękujemy V. Kharazia za pomoc techniczną oraz A.T. Henry, L.K. Floren i L. Daitch za wkład w redakcję tekstu. Praca ta była finansowana ze środków stanowych Kalifornii na badania medyczne nad nadużywaniem alkoholu i substancji psychoaktywnych (State of California Medical Research on Alcohol &amp; Substance Abuse) przekazanych za pośrednictwem UCSF dla SEB, z National Institutes of Health: 1R21DA029966-01 oraz grantu NIH Fast Track na przesiewową analizę kolekcji MLSMR dla SEB, a także przez UCSF School of Pharmacy (Dean's Office and Clinical Pharmacy) oraz School of Medicine (Clinical Pharmacology &amp; Experimental Therapeutics) dla CLHK.

1. Trójwymiarowa analiza morfometryczna zmian fenotypowych pojedynczych komórek
<ol>
	<li>Komórki ludzkiej embrionalnej nerki (HEK293) przetransfekowano receptorem 2 czynnika uwalniającego kortykotropinę (CRF-R2) z znacznikiem hemaglutyniny (HA), będącym receptorem sprzężonym z białkiem G (GPCR), zgodnie z wcześniejszym opisem4, 5.</li>
	<li>Komórki pozostawiono nieleczone (brak opracowania, NT), stymulowano endogennym ligandem CRF-R2, czynnikiem uwalniającym kortykotropinę, CRF (1 μM, 30 min) lub poddano wstępnemu leczeniu selektywnym antagonistą CRF-R2, anti-sauvagine 30 (AS-30, 1 μM, 30 min) przed podaniem agonisty.</li>
	<li>Następnie komórki utrwalono, permeabilizowano i inkubowano z przeciwciałem anty-HA. CRF-R2 wizualizowano przy użyciu przeciwciała anty-mysiego (IgG1) sprzężonego z barwnikiem Alexa 594 nm. DAPI wykorzystano do wizualizacji fazy mitotycznej jąder.</li>
	<li>Aby ograniczyć subiektywizm eksperymentatora, warunki doświadczalne nie były znane aż do momentu pozyskania i przeanalizowania obrazów.</li>
	<li>Obrazy utrwalonych komórek HEK293 pozyskano przy użyciu obiektywu Plan-apochromat 63x/1.4 oil DIC i konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM 510 META połączonego z zintegrowanym dwufotonowym systemem laserowym Coherent, składającym się z lasera Verdi-V5 oraz systemu laserowego Mira 900-F.</li>
	<li>Podczas procesu akwizycji danych komórki podzielono na przedziały zarówno poprzez sekcjonowanie wielospektralne (488 nm i 790 nm (~350 nm 2ph Ex.)), jak i partycjonowanie w osi z (przyrosty 0.5 μm), aby uwzględnić dane od błony jądrowej po zewnętrzne krańce receptorów zewnątrzkomórkowych.</li>
	<li>Dane fluorescencyjne przetworzono najpierw w programie Imaris, który umożliwia wizualizację i segmentację trójwymiarowych zbiorów danych z mikroskopii, a następnie utworzono model 3D złożony z sześciennych wokseli do analizy morfometrycznej. 
	Następnie wykorzystano moduł Imaris XT do połączenia programu Imaris z językiem programowania MATLAB w celu wyznaczenia współrzędnych punktów (spots) wypustek GPCR. 
	Aby uwzględnić zmienność komórkową, pozyskano i przeanalizowano obrazy fluorescencyjne z 22 komórek: bez leczenia (NT) (n = 7), po leczeniu agonistą (CRF) (n = 8) oraz po wstępnym leczeniu antagonistą (AS-30) przed podaniem agonisty (n = 7) (Rysunek 2).
	<ol>
		<li>Obszar zainteresowania (ROI) powinien obejmować jedną komórkę, która nie znajduje się w aktywnej fazie mitotycznej i nie leży blisko innych komórek. W ten sposób analiza obejmie komórki z tylko jednym jądrem, a wypustki receptorowe nie będą zaburzone przez bliskość innych komórek.</li>
		<li>Trójwymiarową strukturę komórkową zrekonstruowano najpierw z wielospektralnych danych fluorescencyjnych przy użyciu programu Imaris (v.7.1.1).</li>
		<li>Zgodnie z algorytmem opracowanym przez Imaris, najpierw wykorzystano renderowanie powierzchni (Surface rendering) do reprezentacji błony jądrowej. Program Imaris określi, czy w obszarze ROI znajduje się więcej niż jedno jądro.</li>
		<li>Następnie wykorzystano algorytm tworzenia punktów (spots-creation) do zlokalizowania wypustek CRF-R2. Detekcję punktów zastosowano, ponieważ kompensuje ona szum tła i nieregularną intensywność złożonej sieci amorficznych komórek.</li>
		<li>Aby zmaksymalizować uwzględnienie każdej jednostki detekcji fluorescencji CRF-R2, średnicę punktów ustawiono na 0.2 μm, co stanowi najmniejszą jednostkę w obrazie pozwalającą na ekstrapolację odrębnych informacji w postaci zmierzonej intensywności przy użyciu filtra Gaussa. Filtrowanie punktów włączono do procesu zautomatyzowanego tworzenia punktów. Oprogramowanie daje jednak użytkownikowi możliwość elastycznego stosowania filtrów do definiowania parametrów.</li>
		<li>Aby uniknąć ucinania danych, zbiór danych przekonwertowano z 8-bitowego (bez znaku) punktu stałego na 32-bitowy format dziesiętny.</li>
		<li>Dane o intensywności wokseli zamieniono na dane o współrzędnych punktów za pomocą modułu Imaris XT zintegrowanego z programem MATLAB, a dokładną lokalizację przestrzenną każdego punktu wyznaczono poprzez transformację odległości, przyjmując błonę jądrową jako punkt odniesienia (Rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otrzymane dane można skwantyfikować i przedstawić w formie graficznej do analizy statystycznej. Porównania między grupami przeprowadzono za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (Two-way ANOVA) i testu post-hoc Bonferroniego. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Różnice uznano za istotne przy *p &lt; 0.05. Obliczenia wykonano w programie GraphPad Prism 5.02 (Rysunek 4).</li>
</ol>
2. Reprezentatywne wyniki
Aby zaprezentować skuteczność naszego podejścia, ilościowo określono zmiany komórkowe wynikające z oddziaływania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCRs) oraz receptora kortykoliberyny 2 (CRF-R2) z jego endogennym ligandem CRF w transfektowanych komórkach HEK293.
Wykazujemy, że receptory CRF-R2 znajdują się w błonie plazmatycznej i wystają z ograniczonych obszarów błony komórkowej (Rycina 2A oraz Film 1). Przy użyciu konwencjonalnej analizy 2D wykrycie tej podgrupy zewnątrzkomórkowych receptorów CRF-R2 jest możliwe tylko wtedy, gdy analizujemy punkty adhezji receptorów na szkiełkach podstawowych. W konsekwencji tracimy wszelkie inne informacje wynikające z wielospektralnych danych z serii obrazów w osi z (Rycina 5).
Po potraktowaniu komórek CRF liczba receptorów zewnątrzkomórkowych znacznie spada, co objawia się zmniejszeniem odległości plamek od błony komórkowej. Następuje również ich redystrybucja z lokalizacji głównie ograniczonych do wielu rozproszonych punktów (Rysunek 2B oraz Film 2).
Efekt CRF na dystrybucję receptorów w błonie jest zapobieganym poprzez wstępne podanie specyficznego antagonisty CRF-R2, antisavagine 30 (AS-30), i stwierdzamy, że rozszerzenia CRF-R2 nie ulegają zmianie (Rycina 2C oraz Film 3).
Dystalny rozkład plamek, naniesiony na interwały widmowo-kolorowe co 5 μm, służy do wizualizacji odległości wokseli od błony jądrowej. Brak traktowania oraz pretreatment antagonistą (AS-30, 1 μM, 30 min) przed traktowaniem agonistą (CRF, 1 μM, 30 min) nie wykazują istotnej (n.s.) różnicy w kontrakcji GPCR. Traktowanie komórek agonistą (CRF, 1 μM, 30 min) progresywnie redukuje liczbę wokseli zawierających CRF-R2 w porównaniu do braku traktowania: 0-5 μm (n.s.), 6-15 μm (**p&lt;0.01) i &gt;15 μm (***p&lt; 0.005), lub w porównaniu do traktowania AS-30: 0-10 μm (n.s.), 11-15 μm (**p&lt;0.01) i &gt;15 μm (***p&lt; 0.005) (Rycina 4).
<img alt="Schemat metod obrazowania fluorescencyjnego 3D; automatyzacja; ograniczenia; struktury neuronów." src="/files/ftp_upload/4233/4233fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1 . Schemat obecnie dostępnych technik i ich ograniczeń w analizie obrazów fluorescencyjnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
<img alt="Mikrografie z mikroskopii fluorescencyjnej porównujące struktury komórkowe przy różnych traktowaniach: NT, CRF, AS-30." src="/files/ftp_upload/4233/4233fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Trójwymiarowe wielospektralne obrazy fluorescencyjne komórek HEK293 przetransfekowanych HA-CRF-R2 przed i po traktowaniu agonistą oraz antagonistą. Obrazy złożone pokazują HA-CRF-R2 wykryty za pomocą przeciwciał anty-HA i wizualizowany przy użyciu przeciwciała wtórnego anty-mysiego (IgG1) koniugowanego z Alexa 488; do wizualizacji jąder komórkowych użyto DAPI. Obrazy uzyskano za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego (CLS). Pasek skali 5 μm.
<img alt="Analiza morfologii komórek; obraz z mikroskopii konfokalnej; dane o strukturach komórkowych z kodowaniem kolorystycznym." src="/files/ftp_upload/4233/4233fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Model 3D transfektowanych komórek HEK293 z HA-CRF-R2 zrekonstruowany z obrazów CLS przy użyciu oprogramowania Imaris. Rendering powierzchni jądra komórkowego oraz tworzenie punktów opisujących rozszerzenia GPCR przekształcone w małe pęcherzyki. Dane fluorescencyjne zostały najpierw przetworzone w programie Imaris, który umożliwia wizualizację i segmentację zestawu danych z mikroskopii 3D. Następnie wykorzystano Imaris XT do połączenia Imaris z MATLAB. Intensywności wokseli zostały zamienione na współrzędne punktów. Kolor kodujący widmo punktów (niebieski 0-5 μm, zielony 6-10 μm, żółty 11-15 μm i czerwony &gt;15 μm) reprezentuje odległość od błony jądrowej. Skala 5 μm.
<img alt="Wykres słupkowy; liczba pęcherzyków względem odległości od jądra, istotność statystyczna; analiza biologii komórki." src="/files/ftp_upload/4233/4233fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Graficzna reprezentacja dystalnego rozkładu punktów naniesionych na widmo z kodowaniem kolorami w interwałach 5 μm służy do wizualizacji odległości wokseli od błony jądrowej. Brak terapii oraz pretreatment antagonistą (AS-30, 1 μM, 30 min) przed podaniem agonisty (CRF, 1 μM, 30 min) nie wykazują istotnych (n.s.) różnic w kontrakcji GPCR. Traktowanie komórek agonistą (CRF, 1 μM, 30 min) progresywnie zmniejsza odległość liczby wokseli zawierających CRF-R2 w porównaniu do braku terapii: 0-5 μm (n.s.), 6-15 μm (**p&lt;0.01) i &gt;15 μm (***p&lt; 0.005); lub w porównaniu do traktowania AS-30: 0-10 μm (n.s.), 11-15 μm (**p&lt;0.01) i &gt;15 μm (***p&lt; 0.005).
<img alt="Analiza adhezji komórek, mikroskopia fluorescencyjna; NT vs CRF, wariacje ostrości w płaszczyźnie z, schemat." src="/files/ftp_upload/4233/4233fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Ograniczenia 2D analizy morfometrycznej komórek HEK 293 przetransfekowanych HA-CRF-R2. Przekrój przez płaszczyznę środkową komórek (3-4μm powyżej szkiełka podstawowego) pokazujący centrum jąder wizualizowanych za pomocą DAPI oraz HA-CRF-R2 wykrywane przy użyciu przeciwciała anty-HA i wizualizowane za pomocą koniugowanego z Alexa 488nm wtórnego przeciwciała anty-mysiego (IgG1), obrazowane przy użyciu CLS, nie wykazuje różnic między (A) brakiem traktowania (NT) a (B) agonistą (CRF, 1 μM, 30 min), podczas gdy punkty adhezji receptorów różnią się drastycznie.
Film 1. Swobodnie obracający się model 3D w trybie „Surpass” komórek HEK 293 przetransfekowanych HA-CRF-R2, bez obróbki, w celu oceny różnic w fenotypie komórkowym pomiędzy białkami receptorowymi. Pasek skali od 5 do 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić film.</a>
Film 2. Swobodnie obracający się model 3D w trybie „Surpass” komórek HEK 293 przetransfekowanych HA-CRF-R2, po zastosowaniu agonisty, CRF (CRF, 1 μM, 30 min), w celu oceny różnic w fenotypie komórkowym między białkami receptorowymi. Pasek skali od 5 do 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233movie2.avi" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić film.</a>
Film 3. Swobodna rotacja 3D w trybie „Surpass” komórek HEK 293 przetransfekowanych HA-CRF-R2, z wstępną inkubacją z antagonistą (AS-30, 1 μM, 30 min) przed podaniem agonisty (CRF, 1 μM, 30 min) w celu oceny różnic w fenotypie komórkowym białek receptorowych. Pasek skali od 5 do 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233movie3.avi" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.</a>

<ol><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design-based+stereological+methods+for+counting+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Prog%2C+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Design-based stereological methods for counting neurons.</a> Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).</li>
<li>Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knowing+what+counts%3A+unbiased+stereology+in+the+non-human+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain.</a> J. Vis. Exp. (27), e1262(2009).</li>
<li>Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+morphometry+and+cell-cell+communication+of+the+osteocyte+network+in+chick+and+mouse+embryonic+calvaria%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif.+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria.</a> Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).</li>
<li>Vickery, R. G., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+dynamin-dependent+and+-independent+mechanisms+target+structurally+homologous+dopamine+receptors+to+different+endocytic+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes.</a> J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).</li>
<li>Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+responsiveness+is+regulated+by+targeted+sorting+of+D2+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pro.c+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors.</a> Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).</li>
<li>Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+quantification+of+molecules+and+rates+using+open-source+microscope-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry.</a> Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).</li>
<li>Schock, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).</li>
<li>Pincus, Z., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+quantitative+methods+for+cell-shape+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis.</a> J. Microsc. 227, 140-156 (2007).</li>
<li>Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+single-cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Measurement of single-cell dynamics.</a> Nature. 465, 736-745 (2010).</li>
<li>Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+multivariate+profiling+of+drug+responses+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells.</a> Nat Methods. 4, 445-453 (2007).</li>
<li>Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+cell+migration+inhibitors+via+automated+microscopy+reveals+a+Rho-kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor.</a> Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Wykazaliśmy, że traktowanie CRF indukuje istotną zmianę morfologii i lokalizacji CRF-R2. Zmiana CRF-R2 została zahamowana przez traktowanie selektywnym antagonistą. Wykazaliśmy, że modyfikacje receptorów nie zostały wykryte i nie mogą być mierzone przy użyciu standardowych technik multispektralnych 2D. Zdolność do badania złożonych obrazów 3D jest kluczowa dla uwzględnienia złożoności parametrów biologicznych w analizie morfometrycznej. Byliśmy w stanie przeprowadzić pomiary 3D komórek o niezdefiniowanym kształcie z nies...

<table><tbody><tr><td>Ludzkie embrionalne komórki nerki (HEK293) </td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-488 (IgG2b) </td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>monoklonalne przeciwciało anty-HA.11 (IgG&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;)</td><td>Covance</td><td>16B12</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>CRF</td><td>Sigma</td><td>C2917</td><td></td></tr><tr><td>Antisauvagine-30 (AS-30)</td><td>Sigma</td><td>A4727</td><td></td></tr></tbody></table>

narzędzie analityczne do ilościowej oceny zmian morfologii komórkowej na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Najpowszechniejsze dostępne narzędzia do analizy programowej służące do pomiaru obrazów fluorescencyjnych dotyczą danych dwuwymiarowych (2D), które opierają się na ręcznych ustawieniach w celu włączenia lub wykluczenia punktów danych oraz na wspomaganym komputerowo rozpoznawaniu wzorców, aby wesprzeć interpretację i wyniki analizy. Coraz ważniejsza staje się zdolność do pomiaru obrazów fluorescencyjnych zbudowanych z zestawów danych trójwymiarowych (3D), aby móc uchwycić złożoność dynamiki komórkowej i zrozumieć podstawy plastyczności komórek w systemach biologicznych. Zaawansowane instrumenty mikroskopowe umożliwiły wizualizację trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych poprzez akwizycję wielospektralnych obrazów fluorescencyjnych oraz zastosowanie potężnego oprogramowania analitycznego, które rekonstruuje obrazy ze stosów konfokalnych, zapewniając tym samym reprezentację 3D zebranych obrazów 2D. Nowoczesne metody stereologii oparte na projekcie ewoluowały z przybliżeń i założeń pierwotnej stereologii opartej na modelach1, nawet w przypadku złożonych przekrojów tkankowych2. Pomimo tych postępów naukowych w mikroskopii, nadal istnieje potrzeba opracowania zautomatyzowanej metody analitycznej, która w pełni wykorzystuje natywne dane 3D, aby umożliwić analizę i kwantyfikację złożonych zmian w morfologii komórek, lokalizacji białek oraz transporcie receptorów.
Obecne techniki dostępne do kwantyfikacji obrazów fluorescencyjnych obejmują Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) oraz Image J (NIH), które umożliwiają analizę manualną. Oprogramowanie Imaris (Andor Technology, Belfast, Irlandia Północna) oferuje funkcję MeasurementPro, która pozwala na ręczne tworzenie punktów pomiarowych, które można umieścić w obrazie wolumetrycznym lub narysować na serii przekrojów 2D w celu utworzenia obiektu 3D. Metoda ta jest użyteczna przy pomiarach punktowych jednym kliknięciem w celu zmierzenia odległości liniowej między dwoma obiektami lub utworzenia wielokąta obejmującego obszar zainteresowania, jednak trudno ją zastosować do złożonych struktur sieci komórkowych. Moduł Filament Tracer (Andor) umożliwia automatyczną detekcję trójwymiarowych struktur przypominających włókna neuronalne, jednak moduł ten został opracowany do pomiaru zdefiniowanych struktur, takich jak neurony, składających się z dendrytów, aksonów i kolców (struktura drzewiasta). Moduł ten był pomysłowo wykorzystywany do pomiarów morfologicznych komórek nieneuronalnych3, jednak dane wyjściowe dostarczają informacji o rozległej sieci komórkowej przy użyciu oprogramowania opartego na zdefiniowanym kształcie komórki, a nie na modelu komórkowym o kształcie amorficznym. Aby rozwiązać problem analizy komórek o kształcie amorficznym i uczynić oprogramowanie bardziej odpowiednim do zastosowań biologicznych, firma Imaris opracowała Imaris Cell. Był to projekt naukowy z Eidgenössische Technische Hochschule, stworzony w celu obliczenia relacji między komórkami a organellami. Choć oprogramowanie to umożliwia detekcję ograniczeń biologicznych poprzez wymuszanie obecności jednego jądra na komórkę i wykorzystanie błon komórkowych do segmentacji komórek, nie może być ono użyte do analizy danych fluorescencyjnych, które nie są ciągłe, ponieważ w idealnych warunkach buduje ono powierzchnię komórki bez pustych przestrzeni. Z naszej wiedzy, obecnie nie opracowano żadnego modyfikowalnego przez użytkownika automatycznego podejścia do uzyskiwania informacji morfometrycznych z obrazów fluorescencyjnych 3D, które pozwalałoby na uzyskanie informacji przestrzennych o komórkach o niezdefiniowanym kształcie (Rycina 1). 
Opracowaliśmy platformę analityczną wykorzystującą podstawowy moduł oprogramowania Imaris oraz Imaris XT zintegrowany z programem MATLAB (Mat Works, Inc.). Narzędzia te umożliwiają trójwymiarowy pomiar komórek o niezdefiniowanym kształcie i niespójnych komponentach sieci fluorescencyjnych. Ponadto metoda ta pozwoli badaczom posiadającym szeroką wiedzę w zakresie systemów biologicznych, lecz niebędącym ekspertami w obsłudze aplikacji komputerowych, na przeprowadzenie ilościowej oceny zmian morfologicznych w dynamice komórek.

Opracowaliśmy platformę programową wykorzystującą Imaris Neuroscience, ImarisXT oraz MATLAB do pomiaru zmian morfologii nieokreślonego kształtu uzyskanego z trójwymiarowej konfokalnej fluorescencji pojedynczych komórek. To nowatorskie podejście może być wykorzystane do ilościowego określania zmian w kształcie komórek po aktywacji receptorów, stanowiąc tym samym potencjalne dodatkowe narzędzie w procesie odkrywania leków.

Narzędzie analityczne do ilościowej oceny zmian morfologii komórkowej na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych

Najczęściej stosowane narzędzia do analizy programowej dostępne do pomiarów obrazów fluorescencyjnych służą do analizy danych dwuwymiarowych (2D) i opierają się na ręcznych ustawieniach dla...

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie zautomatyzowanej metody analizy i ilościowego określenia zmian morfologii komórki o nieokreślonym kształcie na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych uzyskanych za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie eksperymentu ze stymulacją chemiczną, obejmującego komórki traktowane agonistą, komórki traktowane antagonistą, a następnie agonistą, oraz komórki nietraktowane. Następnie komórki są przygotowywane do analizy immunofluorescencyjnej.Drugim krokiem jest pozyskanie wielospektralnych trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych. Następnie, przy użyciu oprogramowania ameris neuroscience, ameris XT oraz MATLAB, przeprowadza się trójwymiarową analizę morfometryczną. W ostatnim etapie analizowane i kwantyfikowane są fenotypowe zmiany w pojedynczych komórkach, zwizualizowane za pomocą trójwymiarowej analizy morfometrycznej.Ostatecznie ta platforma programistyczna jest wykorzystywana do ilościowego określania zmian w kształcie komórek po aktywacji receptorów, stanowiąc dodatkowe narzędzie w procesie poszukiwania nowych leków. Zazwyczaj badacze posiadają standardową wiedzę z zakresu systemów biologicznych, lecz mogą nie być zaznajomieni z aplikacjami komputerowymi. Niniejszy protokół w module I 60 niweluje lukę między wizualizacją a językiem komputerowym przed rozpoczęciem tej procedury.Przeprowadź transfekcję ludzkich komórek embrionalnych nerek receptorem kortykoliberyną dwa (CRF R2) z markerem hemaglutyniny, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. CRF R2 jest receptorem sprzężonym z białkiem G (GPCR). Dzień po transfekcji opal płomieniem szkiełka nakrywki i umieść je w płytce 6-dołkowej.Do fiolki zawierającej 5 mg liofilizowanej polilizyny dodać 10 ml PBS i wymieszać. Następnie 5 ml rozpuszczonej polilizyny rozcieńczyć w 500 ml PBS i nanieść 2 ml mieszaniny na każde szkiełko nakrywkowe. Pozostawić płytkę ze szkiełkami nakrywkowymi w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po 20 minutach opłukać szkiełka nakrywkowe, dodając 2 ml PBS, a następnie usuwając roztwór; powtórzyć ten proces dwukrotnie.Po dodaniu dwóch mililitrów pożywki DMEM z 10% FBS, nanieś od dwóch do pięciu kropel zawiesiny komórkowej na szkiełka podstawowe. Komórki powinny mieć odpowiednie stężenie, aby uzyskać 60% konfluencji. Następnego dnia.Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia sprawdzić, czy komórki osiągnęły 60% konfluencji przed traktowaniem agonistą. Stymulować wyznaczone komórki, zastępując pożywkę 2 mL pożywki uzupełnionej endogennym ligandem CRF R2, czynnikiem uwalniającym kortykotropiny (corticotropin releasing factor), w stężeniu 1 µM.Inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu ich wstępnego opracowania antagonistą. Wymień medium na 2 mL medium uzupełnionego o selektywny antagonista CFR2 anti salvaging 30 w stężeniu 1 µM. Inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 30 minut.Po zastosowaniu antagonisty. Pobudzić komórki agonistą CRF i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w przypadku komórek niepoddanych działaniu antagonisty. Po zakończeniu zabiegu wymienić medium na 2 mL świeżego medium.Wymień medium w każdej dołku na 2 mL świeżego medium i dodaj przeciwciało anty-HHA rozcieńczone w stosunku 1:1000, po inkubacji przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Odsuń medium i dodaj 2 mL utrwalacza do każdego dołka. Inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie odessij utrwalacz.Przemyć komórki trzykrotnie roztworem soli buforowanej triss-em (TBSC). Na każde szkiełko podstawowe nanieść 100 µL roztworu blokującego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie odessać istniejący roztwór blokujący z dołków i nanieść 100 µL świeżego koktajlu przeciwciał wtórnych na każde szkiełko podstawowe, inkubując przez 45 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Przemyć cztery razy roztworem TBSC, delikatnie dodając i usuwając roztwór ze ścianki bocznej dołka, pozostawiając próbki w końcowym roztworze płuczącym.Pobierz każde szkiełko nakrywki za pomocą igły i pęsety zakrzywionej. Połóż szkiełko nakrywki komórkami do dołu na preparat z kroplą medium montażowego Vector Shield z DAPI, utrwal za pomocą lakieru do paznokci i pozostaw do wyschnięcia na 15 do 20 minut. Do wizualizacji CFR2 wykorzystuje się sprzężone przeciwciało mysie Alexa Fluor 488 nm, a do wizualizacji jąder w stadium mitotycznym stosuje się DAPI. Aby rozpocząć, zamontuj utrwalone komórki w mikroskopie fluorescencyjnym. W celu ograniczenia subiektywizmu eksperymentalnego utrzymuj warunki doświadczalne w tajemnicy aż do momentu wykonania i analizy obrazów. Wykonaj zdjęcia.Do obrazowania wykorzystano obiektyw DIC plan acro mat oil o powiększeniu 63 x i aperturze numerycznej 1,4 w połączeniu z mikroskopem konfokalnym Zeiss LSM 500 Meta podłączonym do zintegrowanego dwufotonowego systemu laserowego Coherent. Podczas procesu akwizycji danych komórki podzielono na przedziały, stosując zarówno wielokanałowość, jak i partycjonowanie, aby objąć dane od błony jądrowej po zewnętrzne krańce receptorów zewnątrzkomórkowych. Dane fluorescencyjne przetworzono przy użyciu oprogramowania Amaris, które umożliwia wizualizację i segmentację trójwymiarowych zbiorów danych mikroskopowych. Zgodnie z algorytmem opracowanym w programie Amaris, w pierwszej kolejności zastosowano renderowanie powierzchni w celu przedstawienia błony jądrowej (NU).Program Amaris określi, czy w badanym obszarze (ROI) znajduje się więcej niż jedno jądro. Następnie należy wykorzystać algorytm tworzenia punktów (spots), aby zlokalizować dwa punkty rozszerzenia CFR. Aby skompensować szum tła i nierównomierną intensywność złożonej sieci komórek o amorficznym kształcie i zmaksymalizować detekcję każdej jednostki fluorescencji CFR, ustaw średnicę punktów na 0,2 µm, co stanowi najmniejszą jednostkę w obrazie.Pozwala to na ekstrapolację odrębnych informacji w postaci zmierzonej intensywności. Przy użyciu filtru Gaussa należy wprowadzić filtrowanie plamek do procesu ich automatycznego tworzenia. Aby uniknąć utraty danych, przekonwertuj zestaw danych z ośmiobitowego formatu stałoprzecinkowego na 32-bitowy format zmiennoprzecinkowy.Wybierz utworzoną powierzchnię i określ dokładną lokalizację przestrzenną każdego punktu poza powierzchnią jądra, wykonując transformację dystansu z błoną jądrową jako punktem odniesienia. Przekształć dane o intensywności wokseli w dane o współrzędnych punktów, korzystając z modułu ameris XT zintegrowanego z programem MATLAB. Wybierz punkty oraz określ kodowanie statystyczne w typie statystycznym.Wybierz centrum intensywności zgłoszone w nowo utworzonym kanale. Załaduj żądany kolor wyświetlania i ustaw zakres mapy kolorów do analizy. Dane numeryczne można zwizualizować w zakładce statystycznej i wyeksportować do programu Excel za pomocą GraphPad prism.Ilościowo określ uzyskane dane i przedstaw je w formie graficznej do analizy statystycznej. Przeprowadź porównania między grupami, wykorzystując dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) oraz test post-hoc Bonferroniego; dane przedstaw jako średnią plus lub minus odchylenie standardowe. Aby zademonstrować skuteczność tego podejścia, przeanalizowano zmiany komórkowe wynikające z oddziaływania receptorów sprzężonych z białkiem G oraz receptora czynnika uwalniającego kortykotropinę typu dwa z jego endogennym ligandem CRF.W transfektowanych komórkach HT K 2 93 ilościowo określono obrazach połączonych, wizualizowanych przy użyciu przeciwciała wtórnego anty-mysiego sprzężonego z Alexa 4 88 oraz DPI do wizualizacji jąder komórkowych. Wyniki wykazują, że receptory CRF R dwa znajdują się w błonie komórkowej i wystają z ograniczonych obszarów błony komórek. Przy użyciu konwencjonalnej analizy 2D możliwe jest wykrycie tej podgrupy pozakomórkowych receptorów CRF R dwa tylko wtedy, gdy analizowane są punkty adhezji receptorów na szkiełkach podstawowych.W konsekwencji wszystkie inne informacje pochodzące ze stosu danych MULTISPEKTRALNYCH z ZS zostają utracone. Wynik nie wykazał różnicy pomiędzy brakiem traktowania a agonistą. Choć punkty adhezji receptorów różnią się drastycznie, gdy komórki są traktowane CRF, liczba receptorów zewnątrzkomórkowych jest znacznie zredukowana, co wykazuje zmniejszenie odległości plamek od błony plazmatycznej.Są one również redystrybuowane z lokalizacji głównie ograniczonych do wielu rozproszonych lokalizacji. Efekt CRF na rozkład receptorów w błonie jest zapobiegany poprzez wstępne podanie specyficznych antagonistów CR2. 30 30.W tych warunkach dwa przedłużenia CRFR nie zmieniają się podczas leczenia CRF. Rozkład dystalny punktów wykreślonych w pięciomikrometrowych przedziałach zakodowanych kolorami widma jest wykorzystywany do wizualizacji odległości wokseli od błony jądrowej. Brak leczenia oraz wstępne leczenie antagonistą przed podaniem agonisty nie wykazały istotnych różnic w skurczu GPCR.Traktowanie komórek agonistą CRF stopniowo zmniejsza liczbę wokseli zawierających CFR dwa w porównaniu do braku traktowania lub w porównaniu do komórek poddanych wstępnemu traktowaniu antagonistą As po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny technik obrazowania ilościowego do badania i charakteryzowania licznych zmian fenotypowych pojedynczych komórek, czyniąc ten test komórkowy dodatkowym narzędziem profilowania pojedynczych komórek w procesie poszukiwania nowych leków.

an-analytical-tool-that-quantifies-cellular-morphology-changes-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Narzędzie analityczne, które ilościowo określa zmiany morfologii komórkowej na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych

Presented to elastyczny przepływ pracy w informatyce, umożliwiający multipleksowaną analizę obrazów fluorescencyjnie znakowanych komórek. Przepływ pracy określa ilościowo markery jądrowe i cytoplazmatyczne oraz oblicza translokację markerów między tymi przedziałami. Przedstawiono procedury perturbacji komórek z wykorzystaniem siRNA oraz wiarygodną metodologię wykrywania markerów za pomocą immunofluorescencji pośredniej w formatach 96-dołkowych.

Przepływ pracy dla wysokiej zawartości, indywidualnej kwantyfikacji komórek markerów fluorescencyjnych na podstawie danych z mikroskopu uniwersalnego, wspierany przez oprogramowanie Open Source

Obrazowanie metodą rezonansowego transferu energii (FRET) Förstera jest potężnym narzędziem do badań biologii komórki w czasie rzeczywistym. W artykule przedstawiono metodę obrazowania komórek FRET w fizjologicznych trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach hydrożelowych z wykorzystaniem konwencjonalnej mikroskopii epifluorescencyjnej. Opisano analizę dla ratiometrycznych sond FRET, która daje współczynniki liniowe w zakresie aktywacji.

Obrazowanie FRET w trójwymiarowych hydrożelach

Ten manuskrypt opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania zlokalizowanych zdarzeń translacji w subkomórkowych przedziałach. Podejście zaproponowane w tym manuskrypcie wymaga podstawowego systemu obrazowania konfokalnego i odczynników oraz jest szybkie i opłacalne.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Mikroglej to komórki odpornościowe mózgu, które badają i reagują na zmienione fizjologie mózgu poprzez zmiany morfologiczne, które mogą być oceniane ilościowo. Protokół ten przedstawia protokół analizy oparty na ImageJ, aby przedstawić morfologię mikrogleju jako ciągłe dane zgodnie z takimi wskaźnikami, jak rozgałęzienie komórki, złożoność i kształt.

Kwantyfikacja morfologii mikrogleju na podstawie mikrofotografii immunohistochemicznej tkanki przygotowanej za pomocą ImageJ

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

Ten protokół wyjaśnia, jak przygotować i zamontować próbki bakterii do trójwymiarowego obrazowania na żywo oraz jak zrekonstruować trójwymiarowy kształt E. coli na podstawie tych obrazów.

Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych w celu dokładnego odwzorowania komórek i precyzyjnej lokalizacji białek

Prezentowany tutaj jest protokół produkcji urządzenia do obrazowania sferoidowego. Urządzenie to umożliwia dynamiczne lub podłużne obrazowanie fluorescencyjne sferoid komórek nowotworowych. Protokół oferuje również prostą procedurę przetwarzania obrazu do analizy inwazji komórek rakowych.

Czasowo-rozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne i analiza inwazji komórek nowotworowych w modelu sferoidalnym 3D

W tym miejscu opisujemy lokalizator zdarzeń mitochondrialnych (MEL), wtyczkę ImageJ przydatną w ilościowym określaniu trójwymiarowych zmian w rozszczepieniu mitochondriów i aktywności fuzyjnej w czasie. Opisujemy również potok przetwarzania obrazu przydatny do czyszczenia mikrofotografii przed analizą w ImageJ.

Zrozumienie zmian w morfologii mitochondriów za pomocą dynamicznych i trójwymiarowych mikrofotografii fluorescencyjnych

Dokładna analiza danych z mikroskopii wielowymiarowej wymaga złożonych procesów pracy. Ten artykuł pokazuje, jak korzystać z oprogramowania Cell-ACDC. Wykorzystuje nowoczesne modele oparte na AI do segmentacji, śledzenia, analizy genetyki komórek oraz ilościowej analizy danych mikroskopowych. Co istotne, uzupełnia te modele innowacyjnym ramowym systemem półautomatycznej korekty wyników modeli.

Analiza danych z mikroskopii wielowymiarowej z wykorzystaniem Cell-ACDC

Poznaj automatyczną analizę morfologii komórek o nieregularnym kształcie przy użyciu trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych. Ta metoda wykorzystuje Imaris i MATLAB do ilościowej oceny zmian fenotypowych w badaniach nad odkrywaniem leków.

Narzędzie analityczne do ilościowej oceny zmian morfologii komórkowej na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych

Przeglądaj więcej filmów