Narzędzie analityczne, które określa ilościowo zmiany morfologii komórek na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie zautomatyzowanej metody analizy i ilościowego określenia zmian w morfologii komórki o niezdefiniowanym kształcie, pobranej z trójwymiarowych obrazów fluorescencji konfokalnej. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie najpierw eksperymentu stymulacji chemicznej, aby objąć komórki traktowane komórkami agonistycznymi, traktowane antagonistą, a następnie agonistą i komórkami bez leczenia. Komórki są następnie przygotowywane do analizy immunofluorescencyjnej.

Drugim krokiem jest pozyskanie wielospektralnych trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych. Następnie przeprowadzana jest trójwymiarowa analiza morfometryczna przy użyciu ameris neuroscience, ameris XT i oprogramowania komputerowego MATLAB. Zmiany fenotypowe pojedynczej komórki wizualizowane za pomocą trójwymiarowej analizy morfometrycznej są następnie analizowane i określane ilościowo jako ostatni krok.

Ostatecznie ta platforma oprogramowania jest wykorzystywana do ilościowego określania zmian w kształcie komórek po aktywacji receptora, zapewniając dodatkowe narzędzie do odkrywania leków. Ogólnie rzecz biorąc, badacz ma standardową wiedzę specjalistyczną w zakresie systemu biologicznego, może nie być zaznajomiony z aplikacjami komputerowymi. W tym protokole w module I 60 wypełnij lukę między wizualizacją a językiem komputerowym Przed rozpoczęciem tej procedury.

Transfekcja ludzkich embrionalnych komórek nerkowych z hemaglutyniną oznaczoną receptorem czynnika uwalniającego kortykotropinę dwa lub CRF R dwa, jak wspomniano w pisemnym protokole. CFR dwa to receptor sprzężony z białkiem G lub GPCR. Następnego dnia po transfekcji płomień pokrywa zsuwa się i umieszcza je w sześciodołkowej płytce.

Dodaj 10 mililitrów PBS do fiolki z pięcioma miligramami liofilizowanej polilizyny i wymieszaj. Następnie rozcieńczyć pięć mililitrów rozpuszczonej polilizyny w 500 mililitrach PBS i dodać dwa mililitry mieszaniny na każde z szkiełek nakrywkowych. Pozostaw płytkę z szkiełkami nakrywkowymi w temperaturze pokojowej na 20 minut Po 20 minutach umyj szkiełka nakrywkowe, dodając dwa mililitry PBS, a następnie wyjmując, powtórz ten proces dwukrotnie.

Po edycji dwóch mililitrów DMEM z 10% pożywką FBS dodaj od dwóch do pięciu kropli komórek na szkiełka okładkowe. Komórki powinny mieć niezbędne stężenie, aby osiągnąć płynność 60% CO. Następnego dnia.

Następnego dnia inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Sprawdź, czy komórki są w 60% zlewające się do leczenia agonistycznego. Stymuluj wyznaczone komórki, zastępując pożywkę dwoma mililitrami pożywki uzupełnionej o CRF R dwa endogenne ligandy uwalniające kortykotropinę w stężeniu jednego mikromola.

Inkubuj komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby komórki zostały wstępnie potraktowane antagonistą. Zastąp pożywkę dwoma mililitrami pożywki uzupełnionej selektywnym CFR dwoma antagonistami przeciw ratowaniu 30 w stężeniu jednego mikromolowca. Inkubuj komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Po leczeniu antagonistycznym. Stymuluj komórki za pomocą agonisty CRF i inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut dla komórek nieleczonych. Po zabiegu zastąp pożywkę dwoma mililitrami świeżej pożywki.

Zastąp pożywkę w każdym dołku dwoma mililitrami świeżej pożywki i dodaj anty HHA rozcieńczony jeden do tysiąca, po 60-minutowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odessać pożywkę i dodać do każdego z nich dwa mililitry utrwalacza. Dobrze inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut po zassaniu utrwalacza.

Umyj komórki trzykrotnie solą fizjologiczną trys. Kain. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu krwi na wierzch każdej pokrywy, ślizgaj się i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie odessać istniejący roztwór blotto z dołków i dodać 100 mikrolitrów świeżego koktajlu przeciwciał wtórnych na każde szkiełko nakrywkowe, po 45-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej w ciemności, przemyć czterokrotnie TBSC, delikatnie dodając i usuwając roztwór ze ściany bocznej studzienki, nadal w końcowym roztworze do mycia.

Podnieś każde szkiełko nakrywkowe za pomocą igły i zakrzywionych kleszczyków. Umieść komórki szkiełka nakrywkowego skierowane w dół na szkiełku z kroplą nośnika montażowego Vector Shield z dappy fix z lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia na 15 do 20 minut. Alexa, 4 88 nanometrowe sprzężone przeciwciało muzy służy do wizualizacji CFR dwa, a DAPI służy do wizualizacji etapu mitotycznego jąder, aby rozpocząć montaż komórek utrwalających na mikroskopie fluorescencyjnym, aby ograniczyć subiektywność eksperymentu, utrzymać nieznane warunki eksperymentalne do czasu uzyskania obrazów i analizy w celu uzyskania obrazów.

Zastosowano olej plan acro mat, obiektyw DIC o powiększeniu 63x i aperturze numerycznej 1,4 w połączeniu z mikroskopem konfokalnym zeis LSM five 10 meta połączonym ze spójnym zintegrowanym dwufotonowym systemem laserowym Podczas procesu pozyskiwania danych należy podzielić komórki zarówno za pomocą podziału wielokanałowego, jak i c, aby uwzględnić dane z błony jądrowej do zewnętrznych kończyn receptora zewnątrzkomórkowego. Przetwarzaj dane fluorescencyjne za pomocą amris, który umożliwia wizualizację i segmentację zestawu danych mikroskopii 3D. Postępując zgodnie z algorytmem zaprojektowanym przez Amaris, najpierw wykorzystaj renderowanie powierzchni do przedstawienia błony jądrowej NU.

Amaris określi, czy w obszarze zainteresowania znajduje się więcej niż jedno jądro lub ROI. Następnie wykorzystaj algorytm tworzenia miejsc, aby zlokalizować dwa miejsca rozszerzenia CFR. Kompensuje szum tła i nieregularną intensywność złożonej sieci komórek o amorficznym kształcie, aby zmaksymalizować włączenie każdej jednostki detekcji fluorescencji CFR dwa, ustaw średnicę plamki na 0,2 mikrometra, co jest najmniejszą jednostką na obrazie.

Pozwala to na ekstrapolację odrębnych informacji w postaci zmierzonej intensywności. Korzystając z filtra Gaussa, włącz filtrowanie punktowe do automatycznego procesu tworzenia spotu. Aby uniknąć kationu danych, przekonwertuj zestaw danych z ośmiobitowego stałego punktu na 32-bitowy zmiennoprzecinkowy.

Wybierz utworzoną powierzchnię i określ dokładne położenie przestrzenne każdego punktu poza powierzchnią jądra, wykonując transformację odległości przy użyciu błony jądrowej jako punktu odniesienia. Wymieniaj dane o intensywności wokseli w celu wykrycia danych współrzędnych za pomocą modułu ameris XT połączonego z MATLAB. Zaznacz spoty i wybierz zakodowane statystycznie w typie statystycznym.

Wybierz centrum intensywności raportowane w nowo utworzonym kanale. Załaduj żądany kolor do wyświetlenia i ustaw zakres mapy kolorów do analizy. Dane liczbowe można wizualizować w zakładce statystycznej i eksportować do Excela za pomocą pryzmatu GraphPad.

Określ ilościowo uzyskane dane i przedstaw je w formacie graficznym do analizy statystycznej. Wykonaj porównania między grupami za pomocą dwukierunkowych danych po teście Inova i Bonferroni jako średnia plus minus odchylenie standardowe. Aby zademonstrować moc tego podejścia, zmiany komórkowe, które wynikają z interakcji receptorów sprzężonych z białkiem G i receptora czynnika uwalniającego kortykotropinę dwa z jego endogennym ligandem CRF.

W transfekowanym HT K 2 93 komórki zostały określone ilościowo, połączone obrazy są wizualizowane za pomocą Alexa 4 88 sprzężone, przeciwciała anty myszy, przeciwciała wtórnego i DPI w celu wizualizacji jąder. Wyniki pokazują, że dwa receptory CRF R znajdują się w błonie komórkowej i wystają ze skończonych obszarów błony komórkowej. Korzystając z konwencjonalnej analizy 2D, możliwe jest wykrycie tego podzbioru zewnątrzkomórkowych receptorów CRF R tylko wtedy, gdy analizowane są punkty adhezji receptorów na szklanych pokrywach.

W związku z tym wszelkie inne informacje pochodzące z danych MULTISPECTRAL ZS są tracone. Wynik nie wybrał różnicy między brakiem leczenia a agonistą. Podczas gdy punkty adhezji receptorów są dramatycznie różne, gdy komórki są traktowane CRF, receptory zewnątrzkomórkowe są znacznie zmniejszone, o czym świadczy zmniejszenie odległości plamek od błony plazmatycznej.

Są one również redystrybuowane z głównie skończonych lokalizacji do wielu dyskretnych lokalizacji. Wpływowi CRF na dystrybucję błony receptorowej zapobiega się poprzez wstępne leczenie dwoma specyficznymi antagonistami CR. Rozdział 30 30.

W tych warunkach dwa rozszerzenia CRFR nie zmieniają się wraz z leczeniem CRF. Dystalny rozkład plam wykreślony w pięciomikrometrowych przedziałach kolorystycznych widma jest wykorzystywany do wizualizacji odległości wokseli od błony jądrowej. Brak leczenia i wstępne leczenie antagonistami przed leczeniem agonistą nie wykazało istotnej różnicy w skurczu GPCR.

Leczenie komórek agonistą CRF stopniowo zmniejsza liczbę wokseli zawierających CFR dwa w porównaniu z brakiem leczenia lub w porównaniu z komórkami. Wstępnie potraktowany antagonistą Jak po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie techniki obrazowania ilościowego do zbadania i scharakteryzowania licznych zmian fenotypowych pojedynczych komórek, dzięki czemu ten test oparty na komórkach stał się dodatkowym narzędziem do profilowania pojedynczych komórek w procesie odkrywania leków.