Narzędzie analityczne do ilościowej oceny zmian morfologii komórkowej na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie zautomatyzowanej metody analizy i ilościowego określenia zmian morfologii komórki o nieokreślonym kształcie na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych uzyskanych za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie eksperymentu ze stymulacją chemiczną, obejmującego komórki traktowane agonistą, komórki traktowane antagonistą, a następnie agonistą, oraz komórki nietraktowane. Następnie komórki są przygotowywane do analizy immunofluorescencyjnej.

Drugim krokiem jest pozyskanie wielospektralnych trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych. Następnie, przy użyciu oprogramowania ameris neuroscience, ameris XT oraz MATLAB, przeprowadza się trójwymiarową analizę morfometryczną. W ostatnim etapie analizowane i kwantyfikowane są fenotypowe zmiany w pojedynczych komórkach, zwizualizowane za pomocą trójwymiarowej analizy morfometrycznej.

Ostatecznie ta platforma programistyczna jest wykorzystywana do ilościowego określania zmian w kształcie komórek po aktywacji receptorów, stanowiąc dodatkowe narzędzie w procesie poszukiwania nowych leków. Zazwyczaj badacze posiadają standardową wiedzę z zakresu systemów biologicznych, lecz mogą nie być zaznajomieni z aplikacjami komputerowymi. Niniejszy protokół w module I 60 niweluje lukę między wizualizacją a językiem komputerowym przed rozpoczęciem tej procedury.

Przeprowadź transfekcję ludzkich komórek embrionalnych nerek receptorem kortykoliberyną dwa (CRF R2) z markerem hemaglutyniny, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. CRF R2 jest receptorem sprzężonym z białkiem G (GPCR). Dzień po transfekcji opal płomieniem szkiełka nakrywki i umieść je w płytce 6-dołkowej.

Do fiolki zawierającej 5 mg liofilizowanej polilizyny dodać 10 ml PBS i wymieszać. Następnie 5 ml rozpuszczonej polilizyny rozcieńczyć w 500 ml PBS i nanieść 2 ml mieszaniny na każde szkiełko nakrywkowe. Pozostawić płytkę ze szkiełkami nakrywkowymi w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po 20 minutach opłukać szkiełka nakrywkowe, dodając 2 ml PBS, a następnie usuwając roztwór; powtórzyć ten proces dwukrotnie.

Po dodaniu dwóch mililitrów pożywki DMEM z 10% FBS, nanieś od dwóch do pięciu kropel zawiesiny komórkowej na szkiełka podstawowe. Komórki powinny mieć odpowiednie stężenie, aby uzyskać 60% konfluencji. Następnego dnia.

Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia sprawdzić, czy komórki osiągnęły 60% konfluencji przed traktowaniem agonistą. Stymulować wyznaczone komórki, zastępując pożywkę 2 mL pożywki uzupełnionej endogennym ligandem CRF R2, czynnikiem uwalniającym kortykotropiny (corticotropin releasing factor), w stężeniu 1 µM.

Inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu ich wstępnego opracowania antagonistą. Wymień medium na 2 mL medium uzupełnionego o selektywny antagonista CFR2 anti salvaging 30 w stężeniu 1 µM. Inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 30 minut.

Po zastosowaniu antagonisty. Pobudzić komórki agonistą CRF i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w przypadku komórek niepoddanych działaniu antagonisty. Po zakończeniu zabiegu wymienić medium na 2 mL świeżego medium.

Wymień medium w każdej dołku na 2 mL świeżego medium i dodaj przeciwciało anty-HHA rozcieńczone w stosunku 1:1000, po inkubacji przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Odsuń medium i dodaj 2 mL utrwalacza do każdego dołka. Inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie odessij utrwalacz.

Przemyć komórki trzykrotnie roztworem soli buforowanej triss-em (TBSC). Na każde szkiełko podstawowe nanieść 100 µL roztworu blokującego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie odessać istniejący roztwór blokujący z dołków i nanieść 100 µL świeżego koktajlu przeciwciał wtórnych na każde szkiełko podstawowe, inkubując przez 45 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Przemyć cztery razy roztworem TBSC, delikatnie dodając i usuwając roztwór ze ścianki bocznej dołka, pozostawiając próbki w końcowym roztworze płuczącym.

Pobierz każde szkiełko nakrywki za pomocą igły i pęsety zakrzywionej. Połóż szkiełko nakrywki komórkami do dołu na preparat z kroplą medium montażowego Vector Shield z DAPI, utrwal za pomocą lakieru do paznokci i pozostaw do wyschnięcia na 15 do 20 minut. Do wizualizacji CFR2 wykorzystuje się sprzężone przeciwciało mysie Alexa Fluor 488 nm, a do wizualizacji jąder w stadium mitotycznym stosuje się DAPI. Aby rozpocząć, zamontuj utrwalone komórki w mikroskopie fluorescencyjnym. W celu ograniczenia subiektywizmu eksperymentalnego utrzymuj warunki doświadczalne w tajemnicy aż do momentu wykonania i analizy obrazów. Wykonaj zdjęcia.

Do obrazowania wykorzystano obiektyw DIC plan acro mat oil o powiększeniu 63 x i aperturze numerycznej 1,4 w połączeniu z mikroskopem konfokalnym Zeiss LSM 500 Meta podłączonym do zintegrowanego dwufotonowego systemu laserowego Coherent. Podczas procesu akwizycji danych komórki podzielono na przedziały, stosując zarówno wielokanałowość, jak i partycjonowanie, aby objąć dane od błony jądrowej po zewnętrzne krańce receptorów zewnątrzkomórkowych. Dane fluorescencyjne przetworzono przy użyciu oprogramowania Amaris, które umożliwia wizualizację i segmentację trójwymiarowych zbiorów danych mikroskopowych. Zgodnie z algorytmem opracowanym w programie Amaris, w pierwszej kolejności zastosowano renderowanie powierzchni w celu przedstawienia błony jądrowej (NU).

Program Amaris określi, czy w badanym obszarze (ROI) znajduje się więcej niż jedno jądro. Następnie należy wykorzystać algorytm tworzenia punktów (spots), aby zlokalizować dwa punkty rozszerzenia CFR. Aby skompensować szum tła i nierównomierną intensywność złożonej sieci komórek o amorficznym kształcie i zmaksymalizować detekcję każdej jednostki fluorescencji CFR, ustaw średnicę punktów na 0,2 µm, co stanowi najmniejszą jednostkę w obrazie.

Pozwala to na ekstrapolację odrębnych informacji w postaci zmierzonej intensywności. Przy użyciu filtru Gaussa należy wprowadzić filtrowanie plamek do procesu ich automatycznego tworzenia. Aby uniknąć utraty danych, przekonwertuj zestaw danych z ośmiobitowego formatu stałoprzecinkowego na 32-bitowy format zmiennoprzecinkowy.

Wybierz utworzoną powierzchnię i określ dokładną lokalizację przestrzenną każdego punktu poza powierzchnią jądra, wykonując transformację dystansu z błoną jądrową jako punktem odniesienia. Przekształć dane o intensywności wokseli w dane o współrzędnych punktów, korzystając z modułu ameris XT zintegrowanego z programem MATLAB. Wybierz punkty oraz określ kodowanie statystyczne w typie statystycznym.

Wybierz centrum intensywności zgłoszone w nowo utworzonym kanale. Załaduj żądany kolor wyświetlania i ustaw zakres mapy kolorów do analizy. Dane numeryczne można zwizualizować w zakładce statystycznej i wyeksportować do programu Excel za pomocą GraphPad prism.

Ilościowo określ uzyskane dane i przedstaw je w formie graficznej do analizy statystycznej. Przeprowadź porównania między grupami, wykorzystując dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) oraz test post-hoc Bonferroniego; dane przedstaw jako średnią plus lub minus odchylenie standardowe. Aby zademonstrować skuteczność tego podejścia, przeanalizowano zmiany komórkowe wynikające z oddziaływania receptorów sprzężonych z białkiem G oraz receptora czynnika uwalniającego kortykotropinę typu dwa z jego endogennym ligandem CRF.

W transfektowanych komórkach HT K 2 93 ilościowo określono obrazach połączonych, wizualizowanych przy użyciu przeciwciała wtórnego anty-mysiego sprzężonego z Alexa 4 88 oraz DPI do wizualizacji jąder komórkowych. Wyniki wykazują, że receptory CRF R dwa znajdują się w błonie komórkowej i wystają z ograniczonych obszarów błony komórek. Przy użyciu konwencjonalnej analizy 2D możliwe jest wykrycie tej podgrupy pozakomórkowych receptorów CRF R dwa tylko wtedy, gdy analizowane są punkty adhezji receptorów na szkiełkach podstawowych.

W konsekwencji wszystkie inne informacje pochodzące ze stosu danych MULTISPEKTRALNYCH z ZS zostają utracone. Wynik nie wykazał różnicy pomiędzy brakiem traktowania a agonistą. Choć punkty adhezji receptorów różnią się drastycznie, gdy komórki są traktowane CRF, liczba receptorów zewnątrzkomórkowych jest znacznie zredukowana, co wykazuje zmniejszenie odległości plamek od błony plazmatycznej.

Są one również redystrybuowane z lokalizacji głównie ograniczonych do wielu rozproszonych lokalizacji. Efekt CRF na rozkład receptorów w błonie jest zapobiegany poprzez wstępne podanie specyficznych antagonistów CR2. 30 30.

W tych warunkach dwa przedłużenia CRFR nie zmieniają się podczas leczenia CRF. Rozkład dystalny punktów wykreślonych w pięciomikrometrowych przedziałach zakodowanych kolorami widma jest wykorzystywany do wizualizacji odległości wokseli od błony jądrowej. Brak leczenia oraz wstępne leczenie antagonistą przed podaniem agonisty nie wykazały istotnych różnic w skurczu GPCR.

Traktowanie komórek agonistą CRF stopniowo zmniejsza liczbę wokseli zawierających CFR dwa w porównaniu do braku traktowania lub w porównaniu do komórek poddanych wstępnemu traktowaniu antagonistą As po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny technik obrazowania ilościowego do badania i charakteryzowania licznych zmian fenotypowych pojedynczych komórek, czyniąc ten test komórkowy dodatkowym narzędziem profilowania pojedynczych komórek w procesie poszukiwania nowych leków.