Analiza morfologii mitochondriów za pomocą symulacji uczenia nadzorowanego

Demonstrujemy zastosowanie narzędzia uczenia maszynowego nadzorowanego przez symulację do analizy mitochondriów w obrazach mikroskopii fluorescencyjnej utrwalonych komórek. Obecne metody segmentacji mitochondriów na obrazach mikroskopowych obejmują metody oparte na automatycznym progowaniu, takie jak Ostu lub segmentacja ręczna. Techniki oparte na progowaniu działają słabo, gdy stosunek sygnału do tła jest niski.

Zazwyczaj obrazy do analizy morfologicznej zawierają dużą liczbę mitochondriów, co sprawia, że ręczna segmentacja jest żmudna. Nadzorowane metody głębokiego uczenia wykonują segmentację z dużą dokładnością, ale wymagają dużej liczby danych wejściowych par prawda podstawowa do trenowania. Podejście to wykorzystuje symulator oparty na fizyce do generowania par obrazów mikroskopowych i ich maski kształtu 2D, eliminując w ten sposób potrzebę ręcznej adnotacji.

Model wytrenowany na symulowanych obrazach jest następnie wykorzystywany do segmentacji mitochondriów na rzeczywistych obrazach mikroskopowych. Używamy narzędzia do segmentacji opartego na głębokim uczeniu, które umożliwia automatyzację tego zadania z dużą dokładnością i nie wymaga do trenowania zestawu danych z adnotacjami. Symulacja rozpoczyna się od wygenerowania geometrii przy użyciu krzywych parametrycznych do generowania kształtów.

Emitery są równomiernie rozmieszczone i losowo rozmieszczone na powierzchni wygenerowanego kształtu tak, aby gęstość odpowiadała wartościom eksperymentalnym. Trójwymiarowy PSF mikroskopu jest obliczany przy użyciu modelu Gibsona-Lanniego. Aby uzyskać fotorealizm między symulowanymi obrazami a obrazami eksperymentalnymi, emulujemy zarówno ciemne, jak i sfotografowane odgłosy.

Podstawa fizyczna jest generowana w postaci mapy binarnej. Oceniamy wpływ leczenia CCCP na morfologię mitochondriów kardiomyoblastów stałych obrazowanych za pomocą mikroskopu konfokalnego. Hodowla komórkowa.

Przygotować do wysiewu komórek, działając w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym, umieszczając szkiełko nakrywkowe dla każdego warunku doświadczalnego w studzience na płytce 12-dołkowej. Upewnij się, że zawiesina rozcieńczonych komórek jest odpowiednio wymieszana, pipetując zawartość probówki wirówkowej kilka razy w górę iw dół przed dozowaniem odpowiedniej objętości do każdej studzienki. Procedura eksperymentalna.

Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z dołków płytki 12-dołkowej, a następnie szybko nanieść świeżą podgrzaną pożywkę do studzienek kontrolnych, a podgrzaną pożywkę z 10-mikromolowym roztworem CCCP do studzienek testowych. Inkubować w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych ze studzienek i zastosować podgrzany roztwór utrwalający.

Barwienie i mocowanie komórek na szkiełkach nakrywkowych. Dodaj 10 mikrolitrów materiału montażowego do przygotowanego szkiełka podstawowego, aby zamontować szkiełko nakrywkowe. Za pomocą pęsety podnieś szkiełko nakrywkowe z płytki 12-dołkowej i zetrzyj wilgoć z szkiełek nakrywkowych, krótko dotykając krawędzi i tyłu szkiełka nakrywkowego do przygotowanego niestrzępiącego się ręcznika papierowego.

Delikatnie opuść pokrywę w dół na oczekującą kroplę nośnika montażowego. Mikroskop i obrazowanie. Za pomocą okularów ręcznie wyreguluj poziom Z, aby próbka była ostra.

Przełącz się na zakładkę nabyte w oprogramowaniu. Użyj inteligentnej konfiguracji, aby wybrać kanał fluorescencji, który ma być używany do obrazowania. Wyśrodkowany w szyku na środku szkiełka nakrywkowego z łączną liczbą 12 pozycji do zobrazowania.

Ustawić RA wyśrodkowany na środku szkiełka nakrywkowego. Możliwe jest obrazowanie wielu lokalizacji w sposób zautomatyzowany. Generowanie symulowanych danych treningowych.

Pobierz kod i rozpakuj zawartość. Postępuj zgodnie z instrukcjami i plikiem readme, aby skonfigurować środowisko. Przejdź do folderu o nazwie src"Utwórz kopię lub użyj folderu 2.

symulacja mitochondriów przewiewna"i zmień jego nazwę. Ten folder zawiera wszystkie pliki związane z symulacją danych treningowych. Istnieją trzy zestawy parametrów, które należy ustawić dla symulacji.

Najpierw ustaw parametry liczby mitochondriów, zakresu średnicy, zakresu osi Z i gęstości fluoroforów dla symulatora w pliku konfiguracyjnym partii. Następnie ustaw parametry optyczne apertury numerycznej, powiększenia i minimalnej długości fali zestawu danych w mikroskopie plikowym PSFmode. py"Ustaw żądaną wartość rozmiaru piksela i długości fali emisji w generate_batch_parallel pożaru.

py"Ustaw trzeci zestaw parametrów dotyczących wyjściowego zestawu danych, takich jak rozmiar obrazów wyjściowych, liczba kafelków na każdym obrazie i liczba wszystkich obrazów w pliku generate_batch_parallel. py"Uruchom plik generate_batch_parallel. py"aby rozpocząć symulację.

Aby uzyskać obraz o ostatecznym rozmiarze, utwórz kopię folderu o nazwie 5. Przygotowanie danych i szkolenie/przygotowanie danych" i przejdź do niego. Ustaw parametry numeru partii i liczby obrazów w partii, zakres szumu, który ma być dodany do pliku Data_generator.

py"Uruchom plik Data_generator. py"utwórz obrazy montażowe. Skopiuj foldery o nazwie image"i segment"do folderu datatrain/train".

Segmentacja oparta na głębokim uczeniu. Aby wytrenować model segmentacji dla nowego ustawienia obrazu mikroskopu, przejdź do folderu o nazwie "pociąg" i ustaw parametry rozmiaru Bacha, modelu szkieletu dla segmentacji, liczby epok i szybkości uczenia się do trenowania w pliku o nazwie train_unet. py"Uruchom plik train_unet.

py"aby rozpocząć szkolenie. W procesie trenowania jest wyświetlana metryka służąca do oceny modelu segmentacji w symulowanym zestawie walidacji. Po zakończeniu trenowania model jest zapisywany jako best_model.

h5"w folderze o nazwie pociąg"Aby przetestować model na obrazach mikroskopowych, obrazy muszą zostać podzielone do rozmiaru pożądanego przez model pociągu. W tym celu przejdź do folderu o nazwie 6. Przygotuj dane testowe"i skopiuj pliki danych w formacie PNG do folderu PNG"i uruchom plik split_1024_256.

py"Spowoduje to utworzenie kadrów obrazów w folderze danych o wymiarach 256 na 256. Aby podzielić przycięte obrazy na segmenty, przejdź do folderu o nazwie 7. Przetestuj segmentację"i uruchom plik o nazwie segment.

py"po ustawieniu nazwy zapisanego modelu, który ma być używany. Podzielone na segmenty obrazy są zapisywane w folderze wyjściowym. Analiza morfologiczna.

Umieść plik o nazwie make_montage. py" w folderze o nazwie 7. Przetestuj segmentację"i uruchom plik, aby zszyć podzielony na segmenty wynik z powrotem do oryginalnego rozmiaru obrazu.

Utwórz nowy folder o nazwie 9. Analiza morfologiczna"w folderze źródłowym i przejdź do niego. Zainstaluj biblioteki skan i seaborn za pomocą polecenia install seaborn skan"Maski segmentacji są szkieletowane przy użyciu biblioteki o nazwie skan"aby umożliwić analizę topologii poszczególnych mitochondrium.

Umieść plik w folderze 9. Analiza morfologiczna"Ułóż obrazy różnych grup eksperymentu w różnych folderach w folderze 7. Segmentacja testowa"Uruchom plik, aby utworzyć wykresy do analizy. Wyniki.

Analiza ilościowa, którą należy przeprowadzić, zależy od pytań badawczych lub hipotezy. W naszym eksperymencie interesowały nas trzy różne morfologie mitochondriów, a mianowicie kropki"małe bity mitochondriów, pręciki"mitochondria przypominające włókna lub sznurki oraz sieci wielogałęziowe"Aby zidentyfikować morfologię, najpierw szkieletyzujemy wynik segmentacji i analizujemy ogniwa rozgałęzione różnych klas. Przedstawiamy wyniki analizy dla dwóch grup komórek przystosowanych do galaktozy, grupy kontrolnej i grupy leczonej CCCP.

Obserwujemy znaczny wzrost średniej długości gałęzi kropek, co jest oczekiwane, biorąc pod uwagę pęcznienie mitochondriów pod wpływem CCCP. Procent mitochondriów w poszczególnych długościach zarówno pręcików, jak i klas sieci jest znacznie zmniejszony w stosunku do kontroli, gdy komórki zostały potraktowane CCCP, co potwierdza naszą hipotezę. Trudnym scenariuszem dla naszej metody jest sytuacja, w której obraz ma gęsto upakowane mitochondria.

Kolor różowy oznacza najdłuższe pojedyncze mitochondrium wykryte na obrazie, co jest spowodowane zwiększonym błędem w wynikach segmentacji. Te przypadki niepowodzeń można wykryć poprzez kontrolę długości mitochondriów i użycie operatorów morfologicznych. Chociaż nasza aplikacja jest przykładem tego, jak przeprowadziliśmy analizę morfologii mitochondriów, uważamy, że taka analiza i pytania badawcze wokół niej mogą być sformułowane dla różnych aspektów mitofagii i powiązanych eksperymentów biologicznych.