Name: Analiza morfologii mitochondriów za pomocą symulacji uczenia nadzorowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T12:05:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Poznaj metodę symulacyjnego uczenia nadzorowanego do analizy morfologii mitochondriów w obrazach mikroskopii fluorescencyjnej. To podejście automatyzuje segmentację bez konieczności ręcznej adnotacji danych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy potwierdzają dyskusję z Arifem Ahmedem Sekhem. Zambarlal Bhujabal jest uznawany za pomoc w budowie stabilnych komórek H9c2. Przyjmujemy do wiadomości następujące dofinansowanie: grant ERC na start nr 804233 (dla K.A.), grant dla projektu badawczego na rzecz odnowy naukowej nr 325741 (dla D.K.P.), GRANT Regionalnego Urzędu ds. Zdrowia Północnej Norwegii nr HNF1449-19 (Å. B.B.) oraz tematyczny projekt finansowania UiT VirtualStain z Cristin Project ID 2061348 (D.K.P., Å. B.B., K.A. i A.H.).

UWAGA: Sekcje 1-4 można pominąć, jeśli pracujesz z istniejącymi obrazami mikroskopowymi mitochondriów ze znanymi warunkami eksperymentalnymi.
1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Hoduj komórki H9c2 w DMEM bez glukozy uzupełnionej 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 10 mM galaktozy, 10% FBS, 1% streptomycyny / penicyliny i 1 μg / ml puromycyny. Pozwól komórkom przystosować się do galaktozy przez co najmniej 7 dni w hodowli przed eksperymentami. 
	UWAGA: Zastosowane tutaj komórki H9c2 zostały genetycznie zmodyfikowane w celu ekspresji fluorescencyjnych mitochondriów, a także nabyły gen oporności na puromycynę. Dodatek tego antybiotyku zapewnia wzrost komórek z genem oporności, a co za tym idzie fluorescencyjnych mitochondriów.</li>
	<li>Zasiaj komórki H9c2 do eksperymentu, gdy zbieg komórek osiągnie około 80% (kolba hodowlana T75, oceniana za pomocą mikroskopii jasnego pola). Podgrzej pożywkę i trypsynę do temperatury 37°C przez co najmniej 15 minut przed kontynuacją. 
	UWAGA: Możliwe jest przeprowadzenie eksperymentu równolegle z dwoma lub więcej różnymi warunkami hodowli komórkowej. Zbieganie komórek H9c2 nie powinno przekraczać 80%, aby zapobiec utracie komórek mioblastycznych. Przy 100% zbiegu komórki tworzą miorurki i zaczynają się różnicować.</li>
	<li>Przygotuj się do wysiewu komórek, działając w sterylnym okapie z przepływem laminarnym, umieszczając szklane szkiełko nakrywkowe #1,5 dla każdego warunku eksperymentalnego w studzience na 12-dołkowej płytce. Oznacz każdy warunek i szczegóły eksperymentu na płytce 12-dołkowej.</li>
	<li>Przenieść kolbę do hodowli komórkowych z inkubatora na powierzchnię roboczą w okapie. Zassać pożywkę za pomocą systemu aspiracji lub pipety elektronicznej, a następnie przemyć dwukrotnie 5 ml PBS (temperatura pokojowa).</li>
	<li>Przenieś wstępnie podgrzaną trypsynę na powierzchnię roboczą i odessaj końcowe płukanie PBS; następnie dodaj wstępnie podgrzaną trypsynę, aby odłączyć komórki (1 ml dla kolby hodowlanej T75). Umieścić kolbę hodowlaną z powrotem w inkubatorze na 2-3 minuty w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Przenieś wstępnie podgrzane podłoże na powierzchnię roboczą pod koniec inkubacji. Sprawdź, czy komórki odłączyły się za pomocą mikroskopu jasnego pola.
	<ol>
		<li>Jeżeli wszystkie komórki nie zostały odłączone, należy kilkakrotnie ostrożnie, ale mocno stuknąć w bok kolby, aby odłączyć pozostałe komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść kolbę hodowlaną z powrotem na powierzchni roboczej. Dodać 4 ml pożywki do hodowli komórkowej do kolby hodowlanej za pomocą pipety elektronicznej, aby zatrzymać działanie trypsyny. Podczas dodawania pożywki hodowlanej do kolby, należy użyć pipety, aby kilkakrotnie rozproszyć pożywkę na powierzchni, aby odłączyć i zebrać komórki w zawiesinę komórek.</li>
	<li>Odpipetować zawiesinę komórek (5 ml) z kolby do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut. Otworzyć probówkę w kapturze, usunąć supernatant przez aspirację i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Oceń liczbę komórek, analizując niewielką objętość zawiesiny komórek w automatycznym liczniku komórek. Zwróć uwagę na liczbę żywych komórek na mililitr pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Przenieść żądaną objętość (np. 150 μl na studzienkę) zawiesiny komórek, obliczoną dla gęstości wysiewu około 2 x 104 komórek/cm2, do wstępnie oznakowanej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodać wstępnie podgrzaną pożywkę do hodowli komórkowej do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml w objętości obliczonej wcześniej na podstawie liczby studzienek. W przypadku płytek 12-dołkowych należy użyć całkowitej objętości 1 ml na każdą studzienkę.</li>
	<li>Upewnij się, że zawiesina rozcieńczonych komórek jest prawidłowo wymieszana, pipetując zawartość probówki wirówkowej kilka razy w górę i w dół przed dozowaniem odpowiedniej objętości do każdej studzienki. Po dozowaniu zawiesiny komórek do studzienki należy potrząsnąć płytką w dokładnie kontrolowany sposób w każdym kierunku, aby lepiej rozprowadzić komórki w studzienkach. Umieścić 12-dołkową płytkę w inkubatorze w temperaturze 37°C do następnego dnia.</li>
	<li>Sprawdź komórki za pomocą mikroskopu jasnego pola, aby ocenić wzrost. Jeśli komórki osiągnęły wystarczający wzrost do około 80% zbieżności, przejdź do kolejnych kroków; W przeciwnym razie powtarzaj ocenę codziennie, aż do osiągnięcia wystarczającego wzrostu.</li>
</ol>
2. Procedura eksperymentalna
<ol>
	<li>Obliczyć ilości potrzebne do materiałów do doświadczenia zgodnie ze stężeniami roztworu podstawowego. Rozmrozić zamrożone materiały (30 mM roztwór podstawowy CCCP) w temperaturze 37 °C i wstępnie podgrzać pożywkę do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po rozmrożeniu utworzyć roztwór roboczy 10 μM CCCP, rozcieńczając roztwór podstawowy (1:3 000) w pożywce do hodowli komórkowych. 
	UWAGA: Nie pipetować objętości mniejszych niż 1 μl.</li>
	<li>Zabiegi eksperymentalne należy rozpocząć po przygotowaniu i wstępnym podgrzaniu wszystkich niezbędnych materiałów. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z dołków płytki 12-dołkowej, a następnie szybko nanieść świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę do studzienek kontrolnych, a wstępnie podgrzaną pożywkę z 10 μM roztworem CCCP do studzienek do warunków badania.</li>
	<li>Inkubować 12-dołkową płytkę w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37°C przez 2 godziny. W okresie inkubacji przygotuj roztwór utrwalający.</li>
	<li>Do przygotowania roztworu utrwalającego należy użyć gotowego 4% paraformaldehydu (PFA) do rozcieńczenia 25% roztworu podstawowego aldehydu glutarowego (GA) do 0,2% (1:125). Ustaw roztwór na wstępne podgrzanie w temperaturze 37°C. W przypadku płytki 12-dołkowej wystarczy 500 μl na studzienkę. 
	UWAGA: PFA i GA są toksycznymi chemikaliami. Pracuj w kapturze chemicznym ze sprzętem ochronnym. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zapoznaj się z ich odpowiednimi kartami charakterystyki.</li>
	<li>Po zakończeniu okresu inkubacji wyjmij 12-dołkową płytkę z inkubatora i umieść ją na powierzchni roboczej. 
	UWAGA: Praca nie wymaga już sterylnego środowiska.</li>
	<li>Odessać pożywkę do hodowli komórkowych ze studzienek i nałożyć wstępnie podgrzany roztwór utrwalający. Włożyć 12-dołkową płytkę z powrotem do inkubatora w temperaturze 37°C na 20 minut.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji odessać roztwór utrwalający i dwukrotnie przemyć każdą studzienkę PBS o temperaturze pokojowej. Możliwe jest wstrzymanie eksperymentu na tym etapie protokołu i kontynuowanie go później.
	<ol>
		<li>Jeśli eksperyment zostanie przerwany, dodać 1 ml PBS na studzienkę, zamknąć 12-dołkową płytkę folią z tworzywa sztucznego (parafilmem) i przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Barwienie i montaż komórek na szkiełkach nakrywkowych
<ol>
	<li>Rozmrozić bulion DAPI (plama jądrowa) i odwirować w mini wirówce przed otwarciem. Przygotuj roztwór barwiący DAPI, rozcieńczając materiał DAPI w PBS (1:1,000).</li>
	<li>Odessać PBS z 12-dołkowej płytki i nanieść 1 ml roztworu barwiącego DAPI na każdą studzienkę. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Zassać roztwór barwiący DAPI. Przemyć dwukrotnie 2 ml PBS na studzienkę.</li>
	<li>Przygotuj szkiełka mikroskopowe z matowego szkła (szkiełka podstawowe), myjąc je w 70% etanolu, a następnie trzykrotnie myjąc w PBS. Ostrożnie osusz szkiełka za pomocą niestrzępiących się ręczników papierowych i skieruj je w stronę światła, aby sprawdzić, czy nie ma śladów kurzu lub tłuszczu. 
	UWAGA: Na tym etapie wymagane są rękawice.</li>
	<li>Oznacz szklane szkiełka szczegółami eksperymentalnymi. Przenieś medium mocujące do probówki mikrowirówki i odwiruj w mini wirówce.</li>
	<li>Przygotuj się do montażu szkiełek nakrywkowych, aranżując przestrzeń roboczą. Miej pod ręką 12-dołkową płytkę z szkiełkami nakrywkowymi, oznakowanymi szkiełkami podstawowymi, podłożem montażowym, pipetą, końcówkami do pipet 10 μl, niestrzępiącymi się ręcznikami papierowymi i pęsetą.</li>
	<li>Nanieść 10 μl podłoża mocującego (ProLong Glass) na przygotowane szkiełko podstawowe w celu zamontowania szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Za pomocą pęsety podnieś szkiełko nakrywkowe z płytki 12-dołkowej i zetrzyj wilgoć z szkiełka nakrywkowego, krótko dotykając krawędzi i tyłu szkiełka nakrywkowego do przygotowanego niestrzępiącego się ręcznika papierowego. Delikatnie opuść szkiełko nakrywkowe na kroplę podłoża montażowego.</li>
	<li>Powtórz powyższe dwa kroki dla każdego szkiełka nakrywkowego. Umieść kropelki podłoża montażowego tak, aby na jedno szkiełko nakrywkowe przypadło od jednego do czterech szkiełek.</li>
	<li>Upewnij się, że szkiełka podstawowe znajdują się na płaskiej powierzchni, aby uniknąć przesuwania się zamontowanych szkiełek nakrywkowych. Umieść szkiełka w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej na noc, aby umożliwić zastygnięcie nośnika montażowego. Próbki są teraz gotowe do obrazowania. Eksperyment może zostać wstrzymany na tym etapie protokołu i kontynuowany później.</li>
	<li>Jeśli eksperyment zostanie wstrzymany na tym etapie, to po pozostawieniu próbek na noc do zastygnięcia w temperaturze pokojowej, przykryj je folią aluminiową w celu ochrony przed światłem i przechowuj w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
4. Mikroskopia i obrazowanie
<ol>
	<li>Przykryj próbki folią aluminiową na czas transportu (jeśli jeszcze tego nie zrobiono).</li>
	<li>Po przybyciu do zakładu mikroskopowego należy użyć podwójnie destylowanegoH2Oz bibułą filtracyjną mikroskopu, aby usunąć pozostałości PBS z szkiełek nakrywkowych na szkiełkach szklanych. Sprawdź, czy na szkiełkach nakrywkowych nie ma plam, trzymając szkiełka w kierunku jasnego światła.</li>
	<li>Przejdź przez procedurę uruchamiania mikroskopu. Wybierz odpowiedni obiektyw (Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil M27) i dodaj medium immersyjne.</li>
	<li>Umieścić próbkę w uchwycie na próbkę. W oprogramowaniu mikroskopu użyj zakładki "Zlokalizuj", aby aktywować oświetlenie fluorescencyjne EGFP, a następnie za pomocą okularów ręcznie wyreguluj poziom z, aby uzyskać ostrość próbki. Wyłącz podświetlenie fluorescencyjne po znalezieniu ostrości.</li>
	<li>Przełącz się na zakładkę "Acquire" (Pobieranie) w oprogramowaniu mikroskopu. Użyj "Smart Setup", aby wybrać kanały fluorescencji, które mają być używane do obrazowania. Do tego eksperymentu wybrano presety kanałów EGFP i DAPI.</li>
	<li>Dostosuj intensywność każdego kanału od ustawień początkowych, używając histogramu intensywności jako przewodnika w celu zoptymalizowania siły sygnału. Można teraz rozpocząć obrazowanie.</li>
	<li>W przypadku obrazowania należy skorzystać z opcji oprogramowania, aby umieścić pozycje obrazowania w tablicy i wyśrodkować matrycę na środku szkiełka nakrywkowego, uzyskując łącznie 12 pozycji do zobrazowania. Sprawdź, czy każda pozycja w tablicy zawiera komórki. Jeśli nie ma żadnych komórek, dostosuj położenie do obszaru z komórkami.</li>
	<li>Dostosuj ostrość każdej pozycji w matrycy za pomocą autofokusa oprogramowania mikroskopu, a następnie dokonaj ręcznej precyzyjnej regulacji, aby upewnić się, że jak najwięcej mitochondriów jest ostrych. 
	UWAGA: Kanał EGFP jest używany do tych ręcznych regulacji.</li>
	<li>Za pomocą tej metody należy uzyskać obrazy dla każdego szkiełka nakrywkowego. Zapisz pliki obrazów i przejdź do etapów analizy morfologicznej.</li>
</ol>
5. Generowanie symulowanych danych treningowych
<ol>
	<li>Pobierz code10 i rozpakuj zawartość. Postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi w README.md, aby skonfigurować wymagane środowisko.</li>
	<li>Przejdź do folderu o nazwie "src", który jest folderem domowym dla tego projektu. Ponumerowane foldery w środku zawierają kody specyficzne dla różnych etapów korzystania z narzędzia. 
	UWAGA: Użyj polecenia "cd <<path>>", aby przejść do dowolnych podfolderów kodu. Aby uruchomić dowolny plik Pythona, użyj polecenia "python <<nazwa pliku>>.py". Prezentacja o nazwie "Tutorial.pptx" zawiera komplet instrukcji korzystania z modelu segmentacji.</li>
	<li>Zrób kopię lub skorzystaj z folderu "2. Mitochondria Simulation Airy" i zmień jego nazwę (Airy jest tutaj używany, ponieważ jest to funkcja PSF najbliższa mikroskopowi konfokalnemu, który był używany jako obecny mikroskop). Przejdź do folderu o nazwie "simulator". 
	UWAGA: Ten folder zawiera wszystkie pliki związane z symulacją danych treningowych. Istnieją trzy zestawy parametrów, które należy ustawić dla symulacji.</li>
	<li>Po pierwsze, dla symulatora w pliku konfiguracyjnym partii "simulator/batch/bxx.csv", ustaw parametry dotyczące próbki, w tym liczbę mitochondriów, zakres średnic i długości struktur, zakres osi z, którą wykazuje struktura, oraz gęstość fluoroforów.</li>
	<li>Następnie ustaw parametry związane z układem optycznym.
	<ol>
		<li>Zestaw ten zawiera typ mikroskopu (który określa, który model PSF jest wybrany), aperturę numeryczną (NDA), powiększenie (M), rozmiar piksela (w μm), długość fali emisji fluoroforów, parametr szumu tła itp.</li>
		<li>Ustaw parametry optyczne N.A., powiększenie i minimalną długość fali zestawu danych w pliku "simulator/microscPSFmod.py".</li>
		<li>Ustaw żądaną wartość rozmiaru piksela i ustaw długość fali emisji zestawu danych jako parametr funkcji "process_matrix_all_z" w pliku "simulator/generate_batch_parallel.py".</li>
		<li>Ustaw trzy ostatnie parametry funkcji "save_physics_gt" w pliku "simulator/generate_batch_parallel.py". Parametry to rozmiar piksela (w nm), rozmiar obrazu wyjściowego i max_xy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw trzeci zestaw parametrów dotyczących wyjściowego zestawu danych, takich jak rozmiar obrazów wyjściowych, liczba kafelków na każdym obrazie i łączna liczba obrazów w pliku "simulator/generate_batch_parallel.py".</li>
	<li>Uruchom plik "simulator/generate_batch_parallel.py", aby rozpocząć symulację.</li>
	<li>Aby uzyskać obraz o ostatecznym rozmiarze, utwórz kopię folderu o nazwie "5. Przygotowanie i szkolenie danych/przygotowanie danych" w folderze domowym i przejdź do niego. 
	UWAGA: Każdy obraz syntetycznego zestawu danych jest tworzony przez utworzenie montażu czterech symulowanych obrazów o wymiarach 128 x 128 pikseli, co daje ostateczny rozmiar obrazu 256 x 256 pikseli. W ten sposób najpierw generowanych jest wiele pojedynczych kafelków (około 12 000) zarówno dla obrazów mikroskopowych (w folderze "output"), jak i segmentacji prawdy podstawowej (w folderze "output/physics_gt").
	<ol>
		<li>Ustaw parametry numeru partii, liczbę obrazów na partię i zakres szumu w "data_generator.py".</li>
		<li>Uruchom plik "data_generator.py", aby utworzyć obrazy montażowe.</li>
		<li>Skopiuj foldery o nazwach "obraz" i "segment" do folderu "5. Data Preparation and Training/datatrain/train" z folderu "5. Przygotowanie i szkolenie danych/przygotowanie danych/dane".</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Segmentacja oparta na głębokim uczeniu
<ol>
	<li>Trenowanie modelu segmentacji na symulowanych obrazach w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Aby wytrenować model segmentacji dla nowego mikroskopu, przejdź do "5. Data Preparation and Training/train" i ustaw parametry wielkości partii, model szkieletowy dla segmentacji, liczbę epok oraz szybkość uczenia się dla trenowania w pliku "train_UNet.py".</li>
		<li>Uruchom "train_UNet.py", aby rozpocząć trening. W procesie trenowania jest wyświetlana metryka dotycząca wydajności segmentacji w symulowanym zestawie walidacji. 
		UWAGA: Po zakończeniu trenowania model jest zapisywany jako "best_model.h5" w polu "5. Przygotowanie danych i szkolenie/szkolenie".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetestuj model na rzeczywistych obrazach mikroskopowych, które są podzielone na rozmiar pożądany dla wytrenowanego modelu, wykonując następujące kroki.
	<ol>
		<li>Przejdź do "6. Przygotuj dane testowe" i skopiuj plik ". png" w formacie danych do folderu "PNG".</li>
		<li>Uruchom plik "split_1024_256.py", aby podzielić obrazy do rozmiaru, który jest pożądany dla wytrenowanego modelu. Spowoduje to utworzenie kadrów obrazów o wymiarach 256 x 256 pikseli w folderze "data".</li>
		<li>Skopiuj utworzony folder "dane" do folderu "7. Test Segmentation".</li>
		<li>Przejdź do folderu "7. Segmentacja testowa" i ustaw nazwę zapisanego modelu, który ma być używany.</li>
		<li>Aby podzielić uprawy na segmenty, uruchom plik "segment.py". Podzielone na segmenty obrazy są zapisywane w folderze "wyjściowym".</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Analiza morfologiczna: Analiza morfologii mitochondriów dwóch grup danych, "Glukoza" i "CCCP"
<ol>
	<li>Uporządkuj dane do analizy (jeden folder dla każdego obrazu, przy czym każdy folder zawiera podzielone na segmenty kadry wyjściowe jednego obrazu).</li>
	<li>Pobierz i umieść plik uzupełniający o nazwie "make_montage.py" w folderze o nazwie "7. Segmentacja testów".</li>
	<li>Uruchom plik "make_montage.py", aby zszyć podzielony na segmenty wynik z powrotem do oryginalnego rozmiaru obrazu.</li>
	<li>Utwórz nowy folder o nazwie "9. Analiza morfologiczna" w folderze "src".</li>
	<li>Zainstaluj pakiety Skan16 i Seaborn Python w środowisku za pomocą polecenia "install seaborn[stats] skan". 
	UWAGA: Maski segmentacji są szkieletowane przy użyciu biblioteki o nazwie Skan, aby umożliwić analizę topologii każdego pojedynczego mitochondrium.</li>
	<li>Umieść plik uzupełniający "analyze_mitochondria.py" w folderze "9. Analiza morfologiczna".</li>
	<li>Ułóż obrazy różnych grup eksperymentu w różnych folderach w folderze "7. Segmentacja testów".</li>
	<li>Ustaw parametry "rozmiar piksela" i "ścieżkę wejściową" w pliku "analyze_mitochondria.py".</li>
	<li>Uruchom plik "analyze_mitochondria.py", aby uruchomić kod w celu szkieletyzacji i utworzenia wykresów analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Sekh, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physics-based+machine+learning+for+subcellular+segmentation+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Machine+Intelligence%22%5BJournal%5D)">Physics-based machine learning for subcellular segmentation in living cells.</a> Nature Machine Intelligence. 3, 1071-1080 (2021).</li>
<li>Pernas, L., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mito-morphosis%3A+Mitochondrial+fusion%2C+fission%2C+and+cristae+remodeling+as+key+mediators+of+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mito-morphosis: Mitochondrial fusion, fission, and cristae remodeling as key mediators of cellular function.</a> Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+macrophage+mitochondria+dynamics+in+vivo+reveals+cellular+activation+phenotype+for+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Imaging of macrophage mitochondria dynamics in vivo reveals cellular activation phenotype for diagnosis.</a> Theranostics. 10 (7), 2897-2917 (2020).</li>
<li>Xu, X., Xu, S., Jin, L., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+analysis+of+Otsu+threshold+and+its+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pattern+Recognition+Letters%22%5BJournal%5D)">Characteristic analysis of Otsu threshold and its applications.</a> Pattern Recognition Letters. 32 (7), 956-961 (2011).</li>
<li>Legland, D., Arganda-Carreras, I., Schindelin, J. MorphoLibJ: MorphoLibJ v1.2.0. Zenodo. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://zenodo.org/record/50694#.Y8qfo3bP23A">https://zenodo.org/record/50694#.Y8qfo3bP23A</a> (2016).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., et al. Trainable_Segmentation: Release v3.1.2. Zenodo. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://zenodo.org/record/59290#.Y8qf13bP23A">https://zenodo.org/record/59290#.Y8qf13bP23A</a> (2016).</li>
<li>Chu, C. H., Tseng, W. W., Hsu, C. M., Wei, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+analysis+of+the+mitochondrial+network+morphology+with+applications+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research.</a> Frontiers in Physics. 10, 289(2022).</li>
<li>Xue, F., Li, J., Blu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+three-dimensional+point+spread+function+computation+for+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Optical+Society+of+America+A%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate three-dimensional point spread function computation for fluorescence microscopy.</a> Journal of the Optical Society of America A. 34 (6), 1029-1034 (2017).</li>
<li>Lanni, F., Gibson, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffraction+by+a+circular+aperture+as+a+model+for+three-dimensional+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Optical+Society+of+America+A%22%5BJournal%5D)">Diffraction by a circular aperture as a model for three-dimensional optical microscopy.</a> Journal of the Optical Society of America A. 6 (9), 1357-1367 (1989).</li>
<li>Sekh, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physics+based+machine+learning+for+sub-cellular+segmentation+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Machine+Intelligence%22%5BJournal%5D)">Physics based machine learning for sub-cellular segmentation in living cells.</a> Nature Machine Intelligence. 3, 1071-1080 (2021).</li>
<li>Liu, Y., Song, X. D., Liu, W., Zhang, T. Y., Zuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+deprivation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+PC12+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glucose deprivation induces mitochondrial dysfunction and oxidative stress in PC12 cell line.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 7 (1), 49-56 (2003).</li>
<li>Dott, W., Mistry, P., Wright, J., Cain, K., Herbert, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mitochondrial+bioenergetics+in+a+skeletal+muscle+cell+line+model+of+mitochondrial+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Modulation of mitochondrial bioenergetics in a skeletal muscle cell line model of mitochondrial toxicity.</a> Redox Biology. 2, 224-233 (2014).</li>
<li>Ishihara, N., Jofuku, A., Eura, Y., Mihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+morphology+by+membrane+potential%2C+and+DRP1-dependent+division+and+FZO1-dependent+fusion+reaction+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial morphology by membrane potential, and DRP1-dependent division and FZO1-dependent fusion reaction in mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (4), 891-898 (2003).</li>
<li>Miyazono, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupled+mitochondria+quickly+shorten+along+their+long+axis+to+form+indented+spheroids%2C+instead+of+rings%2C+in+a+fission-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner.</a> Scientific Reports. 8, 350(2018).</li>
<li>Ganote, C. E., Armstrong, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+CCCP-induced+mitochondrial+uncoupling+and+cyclosporin+A+on+cell+volume%2C+cell+injury+and+preconditioning+protection+of+isolated+rabbit+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Effects of CCCP-induced mitochondrial uncoupling and cyclosporin A on cell volume, cell injury and preconditioning protection of isolated rabbit cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (7), 749-759 (2003).</li>
<li>Nunez-Iglesias, J., Blanch, A. J., Looker, O., Dixon, M. W., Tilley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+Python+library+to+analyse+skeleton+images+confirms+malaria+parasite+remodelling+of+the+red+blood+cell+membrane+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">A new Python library to analyse skeleton images confirms malaria parasite remodelling of the red blood cell membrane skeleton.</a> PeerJ. 2018, 4312(2018).</li>
<li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fight+club%3A+Assessment+of+2D+and+3D+single-molecule+localization+microscopy+software%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fight club: Assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software.</a> Nature Methods. 16, 387-395 (2019).</li>
<li>Yin, Z., Kanade, T., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+phase+contrast+optics+to+restore+artifact-free+microscopy+images+for+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Image+Analysis%22%5BJournal%5D)">Understanding the phase contrast optics to restore artifact-free microscopy images for segmentation.</a> Medical Image Analysis. 16 (5), 1047-1062 (2012).</li>
<li>Malm, P., Brun, A., Bengtsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulation+of+bright-field+microscopy+images+depicting+pap-smear+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Simulation of bright-field microscopy images depicting pap-smear specimen.</a> Cytometry. Part A. 87 (3), 212-226 (2015).</li>
<li>Bifano, T., Ünlü, S., Lu, Y., Goldberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberration+compensation+in+aplanatic+solid+immersion+lens+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+Express%22%5BJournal%5D)">Aberration compensation in aplanatic solid immersion lens microscopy.</a> Optical Express. 21 (23), 28189-28197 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma konfliktu interesów związanego z tym artykułem.

Środki ostrożności związane z krytycznymi krokami w protokole omawiamy w akapitach dotyczących "generowania geometrii" i "parametrów symulatora". Akapit zatytułowany "uczenie transferowe" omawia modyfikacje w celu zwiększenia przepustowości podczas adaptacji do wielu mikroskopów. Ustępy dotyczące "analizy cząstek" i "generowania innych struktur subkomórkowych" odnoszą się do przyszłych zastosowań tej metody. Akapit o "różnicy w stosunku do prawdy biologicznej" omawia różne powody, dla których symulacje mogą różnić się od rzeczywistych danych i czy te powody mają wpływ na naszą aplikację. Na koniec omawiamy trudny scenariusz dla naszej metody w akapicie "gęsto upakowane struktury".
Generowanie geometrii Aby wygenerować geometrię 3D mitochondriów, prosta struktura 2D utworzona z krzywych b-splajn jako szkieletów dobrze sprawdza się w tworzeniu syntetycznego zestawu danych. Te syntetyczne kształty ściśle naśladują kształty mitochondriów obserwowane w hodowlach komórkowych 2D. Jednak w przypadku tkanek 3D, takich jak tkanka serca, kształt i układ mitochondriów są zupełnie inne. W takich przypadkach wydajność modelu segmentacji może ulec poprawie dzięki dodaniu kierunkowości w symulowanych obrazach.
Parametry symulatora Należy zachować ostrożność podczas ustawiania parametrów symulatora, aby upewnić się, że są one zgodne z parametrami danych, na podstawie których ma być uruchamiane wnioskowanie, ponieważ niewykonanie tej czynności może prowadzić do niższej wydajności segmentacji. Jednym z takich parametrów jest zakres stosunku sygnału do szumu (SNR). Zakres SNR danych, które mają być badane, powinien być zgodny z wartościami symulowanego zbioru danych. Ponadto zastosowane poliestrowe włókna odcinkowe powinny być zgodne z docelowymi danymi testowymi. Na przykład, obrazy wytrenowane na modelu z konfokalnego PSF nie powinny być używane do testowania obrazów z mikroskopu epifluorescencyjnego. Kolejnym parametrem, na który należy zwrócić uwagę, jest zastosowanie dodatkowego powiększenia w danych testowych. Jeżeli w danych testowych zastosowano dodatkowe powiększenie, symulator również powinien być odpowiednio ustawiony.
Transfer wiedzy Uczenie transferowe to zjawisko polegające na wykorzystaniu wyuczonego modelu wytrenowanego na jednym zadaniu do wykorzystania w innym zadaniu. Zjawisko to ma również zastosowanie do naszego problemu w odniesieniu do różnych typów danych mikroskopowych. Wagi modelu segmentacji (dostarczonego z kodem źródłowym), który jest trenowany na jednym typie danych mikroskopowych, mogą być użyte do zainicjowania modelu segmentacji, który ma być używany na innym rodzaju danych mikroskopu optycznego. Dzięki temu możemy trenować na znacznie mniejszym podzbiorze zbioru danych treningowych (3 000 obrazów w porównaniu do 10 000), zmniejszając w ten sposób koszty obliczeniowe symulacji.
Analiza cząstek Analiza cząstek może być również przeprowadzana na maskach podzielonych na segmenty. Może to dostarczyć informacji na temat obszaru i krzywizny itp. poszczególnych mitochondriów. Informacje te mogą również służyć jako wskaźniki do ilościowego porównania mitochondriów (niewykorzystane w tym eksperymencie). Na przykład obecnie definiujemy morfologię kropki za pomocą progu opartego na długości mitochondriów. W niektórych przypadkach przydatne może być włączenie eliptyczności, aby lepiej oddzielić małe mitochondria przypominające pręciki od mitochondriów puncta lub mitochondriów przypominających kropki. Alternatywnie, jeśli pewne warunki biologiczne powodują zwijanie się mitochondriów, kwantyfikacja krzywizny może być interesująca w celu analizy populacji mitochondriów.
Generowanie innych struktur subkomórkowych Wykazano opartą na fizyce segmentację struktur subkomórkowych dla mitochondriów i pęcherzyków1. Chociaż pęcherzyki mają różne kształty, ich rozmiary są mniejsze i wyglądają jak proste kule, gdy są obserwowane przez mikroskop fluorescencyjny. W związku z tym geometria pęcherzyków jest symulowana za pomocą kulistych struktur o odpowiednim zakresie średnic. Oznacza to zmianę funkcji, która generuje geometrię (cylindry w przypadku mitochondriów i kule w przypadku pęcherzyków) struktur i odpowiednich parametrów (krok 5.4 w sekcji protokołu). Geometrycznie retikulum endoplazmatyczne i mikrotubule zostały również zasymulowane jako struktury rurkowe17. Modelowanie retikulum endoplazmatycznego o średnicy 150 nm i mikrotubul o średniej średnicy zewnętrznej 25 nm oraz wewnętrznej pustej rurki o średnicy 15 nm zapewnia przybliżenia kształtów tych struktur. Innym parametrem, który będzie się różnił dla każdej z tych struktur subkomórkowych, jest gęstość fluoroforu. Oblicza się to na podstawie rozkładu biocząsteczki, z którą wiążą się fluorofory, oraz prawdopodobieństwa wiązania.
Różnica w stosunku do prawdy o podstawach biologicznych Symulowane dane używane do trenowania nadzorowanego przez symulację modelu uczenia głębokiego różnią się od danych rzeczywistych pod wieloma względami. (i) Brak niespecyficznego oznakowania w symulowanych danych różni się od danych rzeczywistych, ponieważ w rzeczywistych danych często występują swobodnie unoszące się fluorofory. Powoduje to wyższą średnią wartość tła na rzeczywistym obrazie. Różnica ta jest łagodzona przez dopasowanie sygnału do szumu (SNR) i ustawienie wartości tła w taki sposób, aby odpowiadała obserwowanym wartościom rzeczywistym. (ii) Ruch struktur subkomórkowych i fotokinetyka są dwoma źródłami dynamiki systemu. Poruszające się struktury w aktywnych komórkach (które poruszają się w zakresie kilku milisekund) powodują rozmycie ruchu. Czas naświetlania jest skracany podczas pozyskiwania rzeczywistych danych, aby uniknąć efektu rozmycia. Z drugiej strony nie symulujemy timelapse i nie zakładamy nieruchomych konstrukcji; To założenie jest słuszne, gdy czas ekspozycji w rzeczywistych danych jest krótki. Jednak to założenie może spowodować błąd w danych wyjściowych, jeśli czas ekspozycji rzeczywistych danych jest wystarczająco duży, aby wprowadzić rozmycie ruchu. Z drugiej strony fotokinetyka jest rzędu nanosekund do mikrosekund i można ją pominąć w symulacji, ponieważ zwykłe czasy ekspozycji eksperymentów są wystarczająco długie (rzędu milisekund), aby uśrednić efekty fotokinetyki. (iii) Szum na obrazach mikroskopowych ma różne źródła, a źródła te mają różne funkcje gęstości prawdopodobieństwa. Zamiast modelować te indywidualne źródła szumu, przybliżamy go jako szum Gaussa na stałym tle. Różnica ta nie wpływa istotnie na rozkład danych w warunkach niskiego stosunku sygnału do tła (w zakresie 2-4) oraz gdy mamy do czynienia z makrogęstością fluoroforów1. (iv) Artefakty w obrazowaniu mogą powstawać w wyniku aberracji, dryfu i systematycznych rozmyć. Zakładamy, że mikroskop jest dobrze wyrównany, a obszary wybrane do analizy w rzeczywistych danych są pozbawione tych artefaktów. Istnieje również możliwość modelowania niektórych z tych artefaktów w PSF 18,19,20.
Gęsto upakowane struktury Trudności związane z niemożnością odróżnienia nakładających się prętów od sieci są stałym problemem w segmentacji danych mikroskopowych 2D. Niezwykle trudny scenariusz przedstawiono na rysunku 5, gdzie mitochondria są gęsto upakowane, co prowadzi do nieoptymalnych wyników w modelu segmentacji i następującej po nim analizie. Pomimo tego wyzwania, użycie operatorów morfologicznych w takich sytuacjach w celu odchudlenia szkieletyzacji może pomóc w przerwaniu tych nadmiernie połączonych sieci, jednocześnie umożliwiając wykrycie znaczących zmian we wszystkich kategoriach morfologii mitochondriów. Ponadto użycie mikroskopu konfokalnego, a nie szerokokątnego do obrazowania, jest jedną z metod częściowego złagodzenia tego problemu poprzez wyeliminowanie nieostrego światła. Co więcej, w przyszłości przydatne byłoby przeprowadzenie segmentacji 3D w celu odróżnienia mitochondriów, które przecinają się (tj. fizycznie tworzą sieć) od mitochondriów pręcikowatych, których projekcje w jednej płaszczyźnie nakładają się na siebie.
Segmentacja oparta na głębokim uczeniu jest obiecującym narzędziem, które oferuje rozszerzenie możliwości analitycznych użytkowników mikroskopii, otwierając w ten sposób możliwość zautomatyzowanej analizy złożonych danych i dużych zbiorów danych ilościowych, co wcześniej byłoby niemożliwe do opanowania.

W tym artykule demonstrujemy użyteczność opartego na fizyce narzędzia do analizy segmentacji subkomórkowej1 w obrazach mikroskopii fluorescencyjnej utrwalonych kardiomioblastów wyrażających fluorescencyjne markery mitochondriów.
Mitochondria są głównymi organellami produkującymi energię w komórkach ssaków. W szczególności mitochondria są bardzo dynamicznymi organellami i często znajdują się w sieciach, które stale zmieniają długość i rozgałęzienia. Kształt mitochondriów wpływa na ich funkcję, a komórki mogą szybko zmieniać morfologię mitochondriów, aby dostosować się do zmian w środowisku2. Aby zrozumieć to zjawisko, morfologiczna klasyfikacja mitochondriów jako kropek, pręcików lub sieci jest wysoce pouczająca3.
Segmentacja mitochondriów jest kluczowa dla analizy morfologii mitochondriów w komórkach. Obecne metody segmentacji i analizy obrazów mitochondriów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opierają się na ręcznej segmentacji lub konwencjonalnych podejściach do przetwarzania obrazu. Podejścia oparte na progach, takie jak Otsu4, są mniej dokładne ze względu na wysoki poziom szumów w obrazach mikroskopowych. Zazwyczaj obrazy do analizy morfologicznej mitochondriów zawierają dużą liczbę mitochondriów, co sprawia, że ręczna segmentacja jest żmudna. Podejścia matematyczne, takie jak MorphoLibJ5 i częściowo nadzorowane podejścia do uczenia maszynowego, takie jak Weka6, są bardzo wymagające i wymagają specjalistycznej wiedzy. Przegląd technik analizy obrazu dla mitochondriów7 wykazał, że techniki oparte na głębokim uczeniu mogą być przydatne w tym zadaniu. Rzeczywiście, segmentacja obrazów w życiu codziennym do zastosowań takich jak autonomiczna jazda została zrewolucjonizowana dzięki zastosowaniu modeli opartych na głębokim uczeniu.
Głębokie uczenie to podzbiór uczenia maszynowego, który dostarcza algorytmy uczące się na podstawie dużych ilości danych. Nadzorowane algorytmy głębokiego uczenia uczą się relacji na podstawie dużych zestawów obrazów, które są oznaczone etykietami prawdy podstawowej (GT). Wyzwania związane z wykorzystaniem nadzorowanego uczenia głębokiego do segmentacji mitochondriów w obrazach mikroskopii fluorescencyjnej są dwojakie. Po pierwsze, nadzorowane uczenie głębokie wymaga dużego zestawu danych obrazów treningowych, a w przypadku mikroskopii fluorescencyjnej dostarczenie tak dużego zestawu danych byłoby rozległym zadaniem w porównaniu z łatwiejszym dostępem do tradycyjnych obrazów opartych na kamerach. Po drugie, obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej wymagają adnotacji GT interesujących obiektów na obrazach treningowych, co jest żmudnym zadaniem wymagającym wiedzy eksperckiej. To zadanie może z łatwością zająć godziny lub dni czasu eksperta na pojedynczy obraz komórek z fluorescencyjnie znakowanymi strukturami subkomórkowymi. Co więcej, różnice między adnotatorami stanowią problem. Aby wyeliminować potrzebę ręcznego dodawania adnotacji i móc wykorzystać doskonałą wydajność technik głębokiego uczenia, zastosowano tutaj model segmentacji oparty na głębokim uczeniu, który został przeszkolony na symulowanych obrazach. Symulatory oparte na fizyce umożliwiają naśladowanie i kontrolowanie procesu powstawania obrazu w mikroskopie, umożliwiając tworzenie obrazów o znanych kształtach. Wykorzystując symulator oparty na fizyce, stworzono w tym celu duży zestaw danych symulowanych obrazów mitochondriów z mikroskopii fluorescencyjnej.
Symulacja rozpoczyna się od generowania geometrii przy użyciu krzywych parametrycznych do generowania kształtów. Emitery są losowo umieszczane na powierzchni kształtu w sposób równomiernie rozłożony, tak aby gęstość odpowiadała wartościom eksperymentalnym. Funkcja rozproszenia punktowego 3D (PSF) mikroskopu jest obliczana przy użyciu wydajnego obliczeniowo przybliżenia8 modelu Gibsona-Lanniego9. Aby ściśle dopasować symulowane obrazy do obrazów eksperymentalnych, zarówno ciemny prąd, jak i szum ujęcia są emulowane w celu uzyskania realizmu fotograficznego. Fizyczny GT jest generowany w postaci mapy binarnej. Kod służący do generowania zestawu danych i trenowania modelu symulacyjnego jest dostępny10, a krok tworzenia tego symulowanego zestawu danych jest opisany w Rysunek 1.
Prezentujemy użyteczność segmentacji opartej na głębokim uczeniu, trenowanej całkowicie na symulowanym zestawie danych, analizując obrazy mikroskopii konfokalnej utrwalonych kardiomioblastów. Te kardiomioblasty wykazywały ekspresję markera fluorescencyjnego w zewnętrznej błonie mitochondrialnej, co pozwalało na wizualizację mitochondriów na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej. Przed przeprowadzeniem eksperymentu podanego tutaj jako przykład, komórki zostały pozbawione glukozy i przystosowane do galaktozy przez 7 dni w hodowli. Zastąpienie glukozy w pożywce wzrostowej galaktozą zmusza komórki w hodowli do stania się bardziej oksydacyjnymi, a tym samym zależnymi od ich mitochondriów w zakresie produkcji energii11,12. Co więcej, sprawia to, że komórki są bardziej wrażliwe na uszkodzenia mitochondriów. Zmiany morfologii mitochondriów można eksperymentalnie indukować przez dodanie mitochondrialnego środka rozprzęgającego, takiego jak cyjanek karbonylu m-chlorofenylohydrazon (CCCP) do pożywki do hodowli komórkowych13. CCCP prowadzi do utraty potencjału błony mitochondrialnej (ΔΨm), a tym samym powoduje zmiany w morfologii mitochondriów z bardziej rurkowatej (pręcikowatej) na bardziej kulistą (kropkowatą)14. Ponadto mitochondria mają tendencję do pęcznienia podczas leczenia CCCP15. Pokazujemy rozkład morfologiczny zmian mitochondriów, gdy kardiomioblasty przystosowane do galaktozy były leczone mitochondrialnym rozprzęgaczem CCCP. Segmentacja mitochondriów w ramach głębokiego uczenia pozwoliła nam sklasyfikować je jako kropki, pręciki lub sieci. Następnie uzyskaliśmy wskaźniki ilościowe, aby ocenić długość gałęzi i obfitość różnych fenotypów mitochondrialnych. Etapy analizy są opisane w Rysunek 2, a szczegóły dotyczące hodowli komórek, obrazowania, tworzenia zestawów danych do segmentacji opartej na głębokim uczeniu, a także analizy ilościowej mitochondriów, są podane poniżej.

<table><tbody><tr><td>12-dołkowa płytka</td><td>FALCON</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Wodny aldehyd glutarowy EM Grade 25%</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>16200</td><td></td></tr><tr><td>Axio Vert.A1</td><td>Mikroskop Zeiss</td><td></td><td>Brightfield</td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>Komputer</td><td>nie</td><td>dotyczy dotyczy</td><td>Musi być uruchomiony system operacyjny Linux/Windows z procesorem graficznym NVIDIA z co najmniej 4 GB pamięci</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>631-0150</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (plama)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>gibco</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka podstawowe (matowa krawędź)</td><td>epredia</td><td>AA00000112E01MNZ10</td><td></td></tr><tr><td>H9c2 mCherry-EGFP-OMP25</td><td></td><td></td><td>Własna stabilna linia komórkowa pochodząca z zakupionej linii komórkowej</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51033557</td><td></td></tr><tr><td>LSM 800</td><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss Media montażowe</td><td></td></tr><tr><td>(szkło)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36980</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór paraformaldehydu, 4% w PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>Plan-apochromatyczny obiektyw olejowy 63x (M27) o współczynniku NA 1,4</td><td>Zeiss</td><td>420782-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny kaptur z przepływem laminarnym</td><td>Labogene</td><td></td><td>SCANLAF MARS</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>System aspiracji</td><td>Vacusafe VACUUBRAND</td><td>20727400</td><td></td></tr><tr><td>ZEN 2.6</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza morfologii mitochondriów za pomocą symulacji uczenia nadzorowanego

Analyzing Mitochondrial Morphology Through Simulation Supervised Learning

Analiza ilościowa organelli subkomórkowych, takich jak mitochondria, na obrazach z mikroskopii fluorescencyjnej komórek jest wymagającym zadaniem ze względu na nieodłączne wyzwania związane z segmentacją tych małych i morfologicznie zróżnicowanych struktur. W tym artykule demonstrujemy wykorzystanie procesu segmentacji i analizy wspomaganego uczeniem maszynowym do ilościowego określania morfologii mitochondriów w obrazach mikroskopii fluorescencyjnej komórek stałych. Narzędzie do segmentacji oparte na głębokim uczeniu jest trenowane na symulowanych obrazach i eliminuje konieczność stosowania adnotacji o prawdziwości gruntowej na potrzeby nadzorowanego uczenia głębokiego. Pokazujemy użyteczność tego narzędzia na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej utrwalonych kardiomioblastów ze stabilną ekspresją fluorescencyjnych markerów mitochondriów i wykorzystujemy określone warunki hodowli komórek do wywołania zmian w morfologii mitochondriów.

Wyniki segmentacji mitochondriów za pomocą głębokiego uczenia na obrazach konfokalnych utrwalonych kardiomioblastów wykazujących ekspresję fluorescencyjnych markerów mitochondriów potwierdzają użyteczność tej metody. Metoda ta jest kompatybilna z innymi typami komórek i systemami mikroskopowymi, wymagając jedynie ponownego wytrenowania modelu.
Kardiomioblasty H9c2 zaadaptowane do galaktozy z fluorescencyjnymi mitochondriami poddano działaniu CCCP lub nie w czasie 2 h. Następnie komórki utrwalono, zabarwiono barwnikiem jądrowym i osadzono na szkiełkach przedmiotowych do analizy w mikroskopii fluorescencyjnej. Do wykonania obrazów komórek kontrolnych oraz tych traktowanych CCCP wykorzystano mikroskop konfokalny. Analizę przeprowadzono na 12 obrazach konfokalnych, obejmujących około 60 komórek dla każdego stanu. Następnie określono i określono ilościowo stan morfologiczny mitochondriów na każdym obrazie. Maski segmentacji uzyskane z wytrenowanego modelu poddano szkieletyzacji, aby umożliwić analizę topologii każdego pojedynczego mitochondrium w tym eksperymencie. Jako parametr klasyfikacji wykorzystano długość odgałęzień poszczególnych mitochondriów. Poszczególne mitochondria zaklasyfikowano do klas morfologicznych według następującej reguły. Konkretnie, każdy szkielet mitochondrialny o długości mniejszej niż 1 500 nm uznano za kropkę (dot), a dłuższe mitochondria podzielono dalej na sieci (network) lub pręty (rod). Jeśli występował co najmniej jeden węzeł, w którym przecinały się dwie lub więcej gałęzie, definiowano to jako sieć (network); w przeciwnym razie mitochondrium klasyfikowano jako pręt (rod). Przykładowy obraz ze szkieletami mitochondrialnymi oznaczonymi klasami morfologicznymi przedstawiono na Rysunku 3.
Kategoryzacja morfologii mitochondriów na Rysunku 4A pokazuje, że możliwe jest wykrycie istotnych zmian po 2 h aplikacji CCCP; jest to najwyraźniej widoczne poprzez zwiększenie liczby kropek w komórkach traktowanych CCCP.
Średnia długość odgałęzień przedstawiona na Rysunku 4B stanowi kolejny sposób zilustrowania wykrywalnych i istotnych zmian w morfologii. Zgodnie z oczekiwaniami, zarówno w przypadku pręcików (rods), jak i sieci (networks), odnotowano istotny spadek w porównaniu z grupą kontrolną po potraktowaniu komórek związkiem CCCP. Istotny wzrost średniej długości odgałęzień w przypadku kropek (dots) był również przewidywany, biorąc pod uwagę obrzęk, któremu ulegają mitochondria pod wpływem CCCP.
<img alt="Schemat równowagi statycznej; zilustrowano fotokinetykę, splot PSF, szum i proces binaryzacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat symulacji obrazów mikroskopii fluorescencyjnej. Schemat obejmuje (i) generowanie geometrii 3D, (ii) emulację emiterów i fotokinetyki, (iii) splot 3D PSF, (iv) dodawanie szumu oraz (v) binaryzację. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat przetwarzania obrazów dla analizy morfologicznej; segmentacja, model ML, diagram szkieletowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Etapy analizy morfologii mitochondriów opartej na uczeniu maszynowym. (1) Obrazy przeznaczone do segmentacji są najpierw przycinane do rozmiarów akceptowalnych dla modelu segmentacji. (2) Do przyciętych fragmentów obrazu stosowana jest segmentacja oparta na głębokim uczeniu. (3) Segmentowane fragmenty wyjściowe są ponownie łączone do ich pierwotnego rozmiaru. (4) Zmontowane segmentacje są szkieletowane. (6) Analiza morfologiczna jest przeprowadzana w oparciu o topologię uzyskaną z szkieletowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces segmentacji komórek; po lewej: wynik segmentacji, po prawej: nałożony szkielet; analiza mikroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Szkielet mitochondrialny nałożony na wynik segmentacji obrazów mikroskopowych. (A) Wynik segmentacji. (B) Szkielet liniowy (odległość euklidesowa między punktami początkowym a końcowym odgałęzienia) nałożony na wynik segmentacji. Kodowanie kolorystyczne szkieletu obrazuje klasę mitochondriów. Sieci są koloru czerwonego, pręciki zielonego, a kropki fioletowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rozkład długości mitochondriów; wykres słupkowy; grupa kontrolna vs CCCP; zaznaczono istotność statystyczną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Analiza morfologii mitochondriów. (A) Przegląd względnego procentowego udziału różnych kategorii morfologicznych w oparciu o całkowitą długość mitochondriów. (B) Porównanie średniej długości odgałęzień mitochondriów pomiędzy warunkami eksperymentalnymi oraz pomiędzy kategoriami morfologicznymi. Oś X przedstawia kategorie morfologiczne, a oś Y średnią długość odgałęzień mitochondriów w nanometrach (nm). Istotność statystyczną w formie wartości p oznaczono jako * p &lt; 0,05, ** p &lt; 0,01, *** p &lt; 0,001 i **** p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza struktury komórki, obraz mikroskopowy o wysokim kontraście, podkreślający szczegółowe wzory komórkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig05v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Przypadek niepowodzenia segmentacji. Wysoka gęstość mitochondriów stanowi trudny scenariusz dla modelu segmentacji. Kolorowy szkielet przedstawia najdłuższe pojedyncze mitochondrium wykryte na obrazie. Poprzez analizę pomiarów długości można zidentyfikować takie przypadki i pracować nad nimi w celu poprawy wyników segmentacji przy użyciu operatora morfologicznego erode (zwęża wykryty szkielet). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig05laregv2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Pliki uzupełniające. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/supplementary_files.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać pliki.</a>

Ten artykuł wyjaśnia, jak używać nadzorowanego symulacji uczenia maszynowego do analizy morfologii mitochondriów w obrazach z mikroskopii fluorescencyjnej stałych komórek.

Analiza morfologii mitochondriów za pomocą symulacji uczenia nadzorowanego

The quantitative analysis of subcellular organelles such as mitochondria in cell fluorescence microscopy images is a demanding task because of the ...

Demonstrujemy zastosowanie narzędzia uczenia maszynowego nadzorowanego przez symulację do analizy mitochondriów w obrazach mikroskopii fluorescencyjnej utrwalonych komórek. Obecne metody segmentacji mitochondriów na obrazach mikroskopowych obejmują metody oparte na automatycznym progowaniu, takie jak Ostu lub segmentacja ręczna. Techniki oparte na progowaniu działają słabo, gdy stosunek sygnału do tła jest niski.Zazwyczaj obrazy do analizy morfologicznej zawierają dużą liczbę mitochondriów, co sprawia, że ręczna segmentacja jest żmudna. Nadzorowane metody głębokiego uczenia wykonują segmentację z dużą dokładnością, ale wymagają dużej liczby danych wejściowych par prawda podstawowa do trenowania. Podejście to wykorzystuje symulator oparty na fizyce do generowania par obrazów mikroskopowych i ich maski kształtu 2D, eliminując w ten sposób potrzebę ręcznej adnotacji.Model wytrenowany na symulowanych obrazach jest następnie wykorzystywany do segmentacji mitochondriów na rzeczywistych obrazach mikroskopowych. Używamy narzędzia do segmentacji opartego na głębokim uczeniu, które umożliwia automatyzację tego zadania z dużą dokładnością i nie wymaga do trenowania zestawu danych z adnotacjami. Symulacja rozpoczyna się od wygenerowania geometrii przy użyciu krzywych parametrycznych do generowania kształtów.Emitery są równomiernie rozmieszczone i losowo rozmieszczone na powierzchni wygenerowanego kształtu tak, aby gęstość odpowiadała wartościom eksperymentalnym. Trójwymiarowy PSF mikroskopu jest obliczany przy użyciu modelu Gibsona-Lanniego. Aby uzyskać fotorealizm między symulowanymi obrazami a obrazami eksperymentalnymi, emulujemy zarówno ciemne, jak i sfotografowane odgłosy.Podstawa fizyczna jest generowana w postaci mapy binarnej. Oceniamy wpływ leczenia CCCP na morfologię mitochondriów kardiomyoblastów stałych obrazowanych za pomocą mikroskopu konfokalnego. Hodowla komórkowa.Przygotować do wysiewu komórek, działając w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym, umieszczając szkiełko nakrywkowe dla każdego warunku doświadczalnego w studzience na płytce 12-dołkowej. Upewnij się, że zawiesina rozcieńczonych komórek jest odpowiednio wymieszana, pipetując zawartość probówki wirówkowej kilka razy w górę iw dół przed dozowaniem odpowiedniej objętości do każdej studzienki. Procedura eksperymentalna.Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z dołków płytki 12-dołkowej, a następnie szybko nanieść świeżą podgrzaną pożywkę do studzienek kontrolnych, a podgrzaną pożywkę z 10-mikromolowym roztworem CCCP do studzienek testowych. Inkubować w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych ze studzienek i zastosować podgrzany roztwór utrwalający.Barwienie i mocowanie komórek na szkiełkach nakrywkowych. Dodaj 10 mikrolitrów materiału montażowego do przygotowanego szkiełka podstawowego, aby zamontować szkiełko nakrywkowe. Za pomocą pęsety podnieś szkiełko nakrywkowe z płytki 12-dołkowej i zetrzyj wilgoć z szkiełek nakrywkowych, krótko dotykając krawędzi i tyłu szkiełka nakrywkowego do przygotowanego niestrzępiącego się ręcznika papierowego.Delikatnie opuść pokrywę w dół na oczekującą kroplę nośnika montażowego. Mikroskop i obrazowanie. Za pomocą okularów ręcznie wyreguluj poziom Z, aby próbka była ostra.Przełącz się na zakładkę nabyte w oprogramowaniu. Użyj inteligentnej konfiguracji, aby wybrać kanał fluorescencji, który ma być używany do obrazowania. Wyśrodkowany w szyku na środku szkiełka nakrywkowego z łączną liczbą 12 pozycji do zobrazowania.Ustawić RA wyśrodkowany na środku szkiełka nakrywkowego. Możliwe jest obrazowanie wielu lokalizacji w sposób zautomatyzowany. Generowanie symulowanych danych treningowych.Pobierz kod i rozpakuj zawartość. Postępuj zgodnie z instrukcjami i plikiem readme, aby skonfigurować środowisko. Przejdź do folderu o nazwie src"Utwórz kopię lub użyj folderu 2.symulacja mitochondriów przewiewna"i zmień jego nazwę. Ten folder zawiera wszystkie pliki związane z symulacją danych treningowych. Istnieją trzy zestawy parametrów, które należy ustawić dla symulacji.Najpierw ustaw parametry liczby mitochondriów, zakresu średnicy, zakresu osi Z i gęstości fluoroforów dla symulatora w pliku konfiguracyjnym partii. Następnie ustaw parametry optyczne apertury numerycznej, powiększenia i minimalnej długości fali zestawu danych w mikroskopie plikowym PSFmode. py"Ustaw żądaną wartość rozmiaru piksela i długości fali emisji w generate_batch_parallel pożaru.py"Ustaw trzeci zestaw parametrów dotyczących wyjściowego zestawu danych, takich jak rozmiar obrazów wyjściowych, liczba kafelków na każdym obrazie i liczba wszystkich obrazów w pliku generate_batch_parallel. py"Uruchom plik generate_batch_parallel. py"aby rozpocząć symulację.Aby uzyskać obraz o ostatecznym rozmiarze, utwórz kopię folderu o nazwie 5. Przygotowanie danych i szkolenie/przygotowanie danych" i przejdź do niego. Ustaw parametry numeru partii i liczby obrazów w partii, zakres szumu, który ma być dodany do pliku Data_generator.py"Uruchom plik Data_generator. py"utwórz obrazy montażowe. Skopiuj foldery o nazwie image"i segment"do folderu datatrain/train".Segmentacja oparta na głębokim uczeniu. Aby wytrenować model segmentacji dla nowego ustawienia obrazu mikroskopu, przejdź do folderu o nazwie "pociąg" i ustaw parametry rozmiaru Bacha, modelu szkieletu dla segmentacji, liczby epok i szybkości uczenia się do trenowania w pliku o nazwie train_unet. py"Uruchom plik train_unet.py"aby rozpocząć szkolenie. W procesie trenowania jest wyświetlana metryka służąca do oceny modelu segmentacji w symulowanym zestawie walidacji. Po zakończeniu trenowania model jest zapisywany jako best_model.h5"w folderze o nazwie pociąg"Aby przetestować model na obrazach mikroskopowych, obrazy muszą zostać podzielone do rozmiaru pożądanego przez model pociągu. W tym celu przejdź do folderu o nazwie 6. Przygotuj dane testowe"i skopiuj pliki danych w formacie PNG do folderu PNG"i uruchom plik split_1024_256.py"Spowoduje to utworzenie kadrów obrazów w folderze danych o wymiarach 256 na 256. Aby podzielić przycięte obrazy na segmenty, przejdź do folderu o nazwie 7. Przetestuj segmentację"i uruchom plik o nazwie segment.py"po ustawieniu nazwy zapisanego modelu, który ma być używany. Podzielone na segmenty obrazy są zapisywane w folderze wyjściowym. Analiza morfologiczna.Umieść plik o nazwie make_montage. py" w folderze o nazwie 7. Przetestuj segmentację"i uruchom plik, aby zszyć podzielony na segmenty wynik z powrotem do oryginalnego rozmiaru obrazu.Utwórz nowy folder o nazwie 9. Analiza morfologiczna"w folderze źródłowym i przejdź do niego. Zainstaluj biblioteki skan i seaborn za pomocą polecenia install seaborn skan"Maski segmentacji są szkieletowane przy użyciu biblioteki o nazwie skan"aby umożliwić analizę topologii poszczególnych mitochondrium.Umieść plik w folderze 9. Analiza morfologiczna"Ułóż obrazy różnych grup eksperymentu w różnych folderach w folderze 7. Segmentacja testowa"Uruchom plik, aby utworzyć wykresy do analizy. Wyniki.Analiza ilościowa, którą należy przeprowadzić, zależy od pytań badawczych lub hipotezy. W naszym eksperymencie interesowały nas trzy różne morfologie mitochondriów, a mianowicie kropki"małe bity mitochondriów, pręciki"mitochondria przypominające włókna lub sznurki oraz sieci wielogałęziowe"Aby zidentyfikować morfologię, najpierw szkieletyzujemy wynik segmentacji i analizujemy ogniwa rozgałęzione różnych klas. Przedstawiamy wyniki analizy dla dwóch grup komórek przystosowanych do galaktozy, grupy kontrolnej i grupy leczonej CCCP.Obserwujemy znaczny wzrost średniej długości gałęzi kropek, co jest oczekiwane, biorąc pod uwagę pęcznienie mitochondriów pod wpływem CCCP. Procent mitochondriów w poszczególnych długościach zarówno pręcików, jak i klas sieci jest znacznie zmniejszony w stosunku do kontroli, gdy komórki zostały potraktowane CCCP, co potwierdza naszą hipotezę. Trudnym scenariuszem dla naszej metody jest sytuacja, w której obraz ma gęsto upakowane mitochondria.Kolor różowy oznacza najdłuższe pojedyncze mitochondrium wykryte na obrazie, co jest spowodowane zwiększonym błędem w wynikach segmentacji. Te przypadki niepowodzeń można wykryć poprzez kontrolę długości mitochondriów i użycie operatorów morfologicznych. Chociaż nasza aplikacja jest przykładem tego, jak przeprowadziliśmy analizę morfologii mitochondriów, uważamy, że taka analiza i pytania badawcze wokół niej mogą być sformułowane dla różnych aspektów mitofagii i powiązanych eksperymentów biologicznych.

analyzing-mitochondrial-morphology-through-simulation-supervised

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wizualizacja i analiza mitochondriów z tkanki mózgowej ssaków to trudne zadanie. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób trójwymiarowa (3D) analiza rekonstrukcji z seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (SBFSEM) może być wykorzystana do uzyskania wglądu w morfologiczną i wolumetryczną analizę tego krytycznego organcelli generującej energię.

Analiza mitochondriów mózgowych z wykorzystaniem seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej z obrazowaniem powierzchni bloku (SBF-SEM)

Upośledzony transport i morfologia mitochondriów są zaangażowane w różne choroby neurodegeneracyjne. Prezentowany protokół wykorzystuje indukowane pluripotencjalne neurony przodomózgowia pochodzące z komórek macierzystych do oceny transportu mitochondrialnego i morfologii w dziedzicznej paraplegii spastycznej. Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie transportu mitochondrialnego wzdłuż aksonów i analizę ich morfologii, co ułatwi badanie chorób neurodegeneracyjnych.

Analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej

Opisujemy szczegółowy protokół generowania ludzkich organoidów mózgowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych i ich wykorzystania w modelowaniu chorób mitochondrialnych.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu do modelowania chorób mitochondrialnych

Sieć mitochondrialna jest niezwykle złożona, co czyni ją bardzo trudną do analizy. Nowatorskie narzędzie MATLAB analizuje na żywo mitochondria zobrazowane konfokalnie na zdjęciach poklatkowych, ale skutkuje dużą objętością wyjściową wymagającą indywidualnej uwagi ręcznej. Aby rozwiązać ten problem, opracowano rutynową optymalizację, która pozwala na szybką analizę plików.

Zoptymalizowana zautomatyzowana analiza modulacji homeostazy mitochondriów neuronalnych w żywych organizmach neuronalnych przez specyficzne dla izoform receptory kwasu retinowego

To badanie przedstawia metodę analizy morfologii mitochondriów na podstawie barwienia immunologicznego i analizy obrazu w tkance mózgowej myszy in situ. Opisano również, w jaki sposób pozwala to na wykrycie zmian w morfologii mitochondriów wywołanych przez agregację białek w modelach choroby Parkinsona.

Badanie histologiczne morfologii mitochondriów w modelu choroby Parkinsona

Ten protokół przedstawia proces propagacji, różnicowania i barwienia hodowanych komórek SH-SY5Y oraz pierwotnych neuronów hipokampa szczura do wizualizacji i analizy ultrastruktury mitochondriów za pomocą mikroskopii stymulowanego zubożenia emisji (STED).

Wykorzystanie obrazowania STED na żywych komórkach do wizualizacji ultrastruktury wewnętrznej błony mitochondrialnej w modelach komórek neuronalnych

Ten protokół zapewnia ustandaryzowane podejście do obrazowania morfologii mitochondriów w wielu tkankach C. elegans podczas starzenia.

Obrazowanie i ilościowe określanie morfologii mitochondriów u C. elegans podczas starzenia

W tym badaniu opisujemy krok po kroku protokół i kładziemy nacisk na kluczowe szczegóły dotyczące określania cech morfologicznych mitochondriów w żywych komórkach, w tym przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i analizę danych. Ta metoda jest powszechnie stosowana do badania morfologii mitochondriów w celu badania różnych schorzeń.

Oznaczanie morfologii mitochondriów w żywych komórkach za pomocą mikroskopii konfokalnej

W tym miejscu opisujemy lokalizator zdarzeń mitochondrialnych (MEL), wtyczkę ImageJ przydatną w ilościowym określaniu trójwymiarowych zmian w rozszczepieniu mitochondriów i aktywności fuzyjnej w czasie. Opisujemy również potok przetwarzania obrazu przydatny do czyszczenia mikrofotografii przed analizą w ImageJ.

Zrozumienie zmian w morfologii mitochondriów za pomocą dynamicznych i trójwymiarowych mikrofotografii fluorescencyjnych

Organoidy mózgowe stanowią cenny model dla badań nad encefalomiopatią mitochondrialną, kwasicą mlekową oraz epizodami podobnymi do udaru (MELAS), oferując wgląd w ich podstawową patofizjologię i stanowiąc platformę do badań przesiewowych leków. Organoidy pochodzące z linii komórkowych o różnym poziomie heteroplazmy genów wywołujących chorobę wykazują istotne różnice fenotypowe.

Modelowanie chorób mitochondrialnych za pomocą organoidów mózgowych: Skupienie się na encefalomiopatii mitochondrialnej, kwasicy mlekowej oraz epizodach podobnych do udaru

Poznaj metodę symulacyjnego uczenia nadzorowanego do analizy morfologii mitochondriów w obrazach mikroskopii fluorescencyjnej. To podejście automatyzuje segmentację bez konieczności ręcznej adnotacji danych.

Analiza morfologii mitochondriów za pomocą symulacji uczenia nadzorowanego

Przeglądaj więcej filmów