Name: Metoda oparta na mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Poznaj metodę mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt. Technika umożliwia precyzyjną analizę 3D bez konieczności preparowania przekrojów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Gregowi Linowi i Arthurowi McClellandowi za ich ekspertyzę w zakresie mikro-tomografii komputerowej, Davidowi Richmondowi i Hunterowi Elliottowi z Image and Data Analysis Core (IDAC) w Harvard Medical School za ich porady dotyczące przetwarzania obrazów, oraz Williamowi Libertiemu z Boston University za łaskawe dostarczenie mózgu zeberki. Prace te zostały częściowo wykonane w Center for Nanoscale Systems (CNS), będącym członkiem National Nanotechnology Coordinated Infrastructure Network (NNCI), która jest wspierana przez National Science Foundation w ramach nagrody NSF nr 1541959. CNS jest częścią Uniwersytetu Harvarda. Prace te były wspierane przez Fundację Rodziny Richarda i Susan Smithów oraz IARPA (kontrakt #D16PC00002). S.B.E.W. był wspierany przez stypendia z Human Frontier Science Program (HFSP; LT000514/2014) oraz Europejskiej Organizacji Biologii Molekularnej (EMBO; ALTF1561-2013). G.G. był wspierany przez National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship Program (GRFP).

Wszystkie metody opieki i eksperymentalne manipulacje na zwierzętach zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Harvard Institutional Animal Care and Use Committee. Opisana tutaj perfuzja jest specyficzna dla szczurów, ale procedura ma zastosowanie do wszystkich zwierząt z mniejszymi lub podobnymi rozmiarami mózgów.
1. Perfuzja
<ol>
	<li>Przygotować 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Dla szczura (wiek: 0,5–1,5 roku, waga: 250–600 g) powinno wystarczyć 800–1000 ml. Użyj 400 ml do perfuzji zwierzęcia i dodatkowych 400 ml do rozcieńczenia utrwalacza</li>.
	<li>Przygotować utrwalacz składający się z 2% (w/v) paraformaldehydu (PFA) i 2,5% (w/v) aldehydu glutarowego (GA) w 1x PBS. Dla szczura wystarczy 400 ml. Zachowaj 50 ml w stożkowej probówce o pojemności 50 ml do utrwalenia mózgu po perfuzji.</li>
	<li>Znieczulać szczura 4–5% izofluranem gazowym (o stężeniu 0,8 l/minO2 przy 1,0 barze w temperaturze 21 °C) przez 15 minut.</li>
	<li>Wstrzyknąć dootrzewnowo śmiertelną dawkę pentobarbitalu sodu (180 mg/kg).</li>
	<li>Przetestuj utratę odruchów u zwierzęcia, przeprowadzając badanie odruchu szczypania palców u stóp. Poczekaj z rozpoczęciem perfuzji, aż zwierzę straci odruchową reakcję.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z wcześniej opisanym protokołem perfuzji wewnątrzsercowej i ekstrakcji mózgu14 z następującymi roztworami: przeprowadź perfuzję zwierzęcia za pomocą 400 ml 1x PBS przy 125 mm Hg, aby usunąć krew. Po usunięciu całej krwi i zastąpieniu ją 1x PBS, rozpocznij perfuzję z 400 ml roztworu 2% PFA i 2,5% GA rozpuszczonego w 1x PBS przy 125 mm Hg. 
	UWAGA: Jeśli zabieg przeprowadzany jest na zwierzęciu, które nie jest szczurem, jedynymi ważnymi elementami procedury perfuzji jest użycie 1x PBS i 2% PFA, 2,5% GA w 1x PBS. Objętość roztworu i ciśnienie perfuzji można regulować w zależności od gatunku.</li>
</ol>
2. Po fiksacji
<ol>
	<li>Umieść wyekstrahowany mózg w 2% PFA, 2,5% GA w 1x roztworze PBS (ten sam roztwór, który wcześniej był używany do perfuzji zwierzęcia). Upewnij się, że objętość roztworu jest co najmniej 10 razy większa niż objętość mózgu. W przypadku szczurów umieść mózg w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 50 ml roztworu. Przechowywać próbkę w miejscu po utrwaleniu przez 2–3 dni, lekko wstrząsając w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Jeśli próbka znajduje się w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, umieszczenie jej poziomo na wytrząsarce orbitalnej zapewni najlepsze wyniki.</li>
	<li>Po wystarczająco długim utrwaleniu próbki należy ją przemyć w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O), wodzie dejonizowanej (diH2O) lub wodzie ultraczystej (patrz tabela materiałów) cztery razy przez następujące czasy: 1, 1, 1 i 15 min. 
	UWAGA: W przypadku tego protokołu ddH2O, diH2O lub woda ultraczysta powinny być wymienne. Dla uproszczenia ddH2O będzie odtąd używane w odniesieniu do wody oczyszczonej.</li>
</ol>
3. Barwienie
UWAGA: Na tym etapie wszystkie przygotowania roztworu przeprowadzaj pod kapturem, używając rękawiczek.
<ol>
	<li>Przygotuj co najmniej 10-krotność objętości roztworu barwiącego do mózgu. W przypadku mózgów szczurów należy przygotować 50 ml 2% (w/v) tetratlenku osmu (OsO4) w ddH2O, łącząc 25 ml podstawowego 4% roztworu OsO4 i 25 ml ddH2O. 
	UWAGA: Tetratlenek osmu jest lotny i może powodować tymczasową ślepotę i problemy z oddychaniem, jeśli nie jest odpowiednio traktowany. Wyrzuć wszystkie materiały, które mają kontakt z tetratlenkiem osmu, w odpowiednim pojemniku na zagrożenia chemiczne w pojemniku wtórnym.</li>
	<li>Umieść mózg w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodaj roztwór OsO4. Mózg powinien zacząć brązowieć, gdy OsO4 reaguje z lipidami w tkance.</li>
	<li>Zamknij probówkę i dokładnie uszczelnij ją folią parafinową (patrz Tabela materiałów), aby upewnić się, że nie przecieka podczas inkubacji. 
	UWAGA: Osm jest lotny i będzie łagodnie reagował z plastikiem rurki, dlatego prawidłowe uszczelnienie rurki jest bardzo ważne. Tuba może być owinięta folią aluminiową dla dodatkowej ochrony.</li>
	<li>Szczelnie zamkniętą probówkę przechowywać w temperaturze 4 °C, lekko wstrząsając na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 50 obr./min przez 2 tygodnie. Umieść rurkę poziomo, aby zapewnić najlepsze mieszanie. Upewnij się, że próbka jest całkowicie zanurzona w roztworze podczas wstrząsania. 
	UWAGA: Jeśli osm nie może krążyć w sposób ciągły, może nie przeniknąć w pełni do próbki, dlatego bardzo ważne jest poziome umieszczenie na wytrząsarce.</li>
</ol>
4. Osadzanie
<ol>
	<li>Po inkubacji próbki w OsO4 przez 2 tygodnie, przemyć ją ddH2O 5 razy w temperaturze pokojowej (RT) przez następujące czasy: 1, 1, 1, 15 i 60 minut w celu usunięcia całego niezwiązanego OsO4 z próbki. 
	UWAGA: Wielokrotna wymiana, w tym ostatnia 60-minutowa wymiana, jest konieczna, aby umożliwić dyfuzję całego osmu w układzie krążenia.</li>
	<li>Przemywać próbkę za pomocą ddH2O przez 30 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Osm może nadal dyfundować z próbki, ale jego ilość powinna być znacznie zmniejszona w porównaniu z poprzednim etapem.</li>
	<li>Odwodnić próbkę etanolem, aby ostatecznie przeniknąć do niej żywicą. W celu odwodnienia należy zastąpić ddH2O 10–20 ml następujących rozcieńczeń etanolu (po 30 minut w temperaturze 4 °C): 20% (v/v) etanolu i 80% (v/v)ddH2O; 50% (v/v) etanolu i 50% (v/v) ddH2O; 70% (v/v) etanolu i 30% (v/v)ddH2O; 90% (v/v) etanolu i 10% (v/v)ddH2O; 100% etanolu.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenia acetonu/żywicy w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Przygotuj 100 ml żywicy do zatopienia (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Aby przygotować 33% (v/v) roztwór żywicy i 67% acetonu, wlej 15 ml żywicy do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodaj 30 ml 100% acetonu destylowanego ze szkła.</li>
		<li>Aby uzyskać 50% (v/v) żywicy-50% acetonu, wlej 22,5 ml żywicy do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodaj 22,5 ml 100% acetonu destylowanego ze szkła.</li>
		<li>Aby przygotować 67% (v/v) roztwór żywicy i 33% acetonu, wlej 30 ml żywicy do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodaj 15 ml 100% acetonu destylowanego ze szkła.</li>
		<li>Użyj pozostałych 32,5 ml żywicy jako pierwszego roztworu 100% żywicy poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Proces infiltracji żywicy należy rozpocząć od przepuszczenia próbki przez 10-20 ml następujących roztworów acetonu i acetonu/żywicy: 100% aceton przez 30 minut w temperaturze 4 °C; 100% aceton przez 30 minut w temperaturze 4 °C i 100% aceton przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT). 
	UWAGA: Pozostała część procesu infiltracji będzie miała miejsce w RT.</li>
	<li>Zanurz próbkę w 33% (v/v) żywicy 67% acetonie przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, następnie w 50% (v/v) acetonie i 50% acetonie przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, 67% (v/v) żywicy 33% przez 3 godziny w temperaturze pokojowej i 100% żywicy przez 12 godzin w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj świeżą partię żywicy o pojemności 50 ml, postępując zgodnie z instrukcjami na butelce. Przenieść próbkę do pojemnika, w którym będzie ona utwardzana (np. jednorazowe formy opisane w Tabeli Materiałów). Nasycić próbkę świeżą 100% żywicą przez 4 godziny w temperaturze RT. 
	UWAGA: Jeśli świeża żywica nie zostanie użyta, żywica wyprodukowana poprzedniego dnia zacznie przedwcześnie twardnieć, a próbka będzie trudna do manipulowania.</li>
	<li>Odgazować próbkę w piecu próżniowym przez 15 minut w temperaturze 45 °C. 
	UWAGA: Ten krok pomoże usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza w próbce, ale nie jest niezbędny i nie wpłynie na jakość danych.</li>
	<li>Na koniec utwardzić próbkę w piecu przez 48 godzin w temperaturze 60 °C.</li>
</ol>
5. mikro-tomografia komputerowa
<ol>
	<li>Po utwardzeniu próbki zdejmij jednorazową formę i zeskanuj ją za pomocą mikrotomografu komputerowego. 
	UWAGA: W zależności od używanej maszyny ustawienia będą się różnić. Dla skanera używanego przez autorów wymienionych w Tabeli Materiałów zalecane ustawienia to 130 kV, 135 μA z filtrem miedzianym 0,1 mm i źródłem molibdenu, 1-sekundowa ekspozycja i średnio 4 klatki na projekcję. Eksperymentatorzy powinni jednak kalibrować skaner indywidualnie, ponieważ wiele czynników będzie miało wpływ na optymalne ustawienia podczas danej sesji.</li>
	<li>Po zakończeniu skanowania zrekonstruuj próbkę z zalecanymi parametrami dla kombinacji skaner/oprogramowanie eksperymentatora na komputerze z oprogramowaniem skanera.</li>
	<li>Na koniec zwizualizuj i przeanalizuj zrekonstruowaną wolumin cyfrowy za pomocą wybranego przez eksperymentatora oprogramowania (przykłady znajdują się w Tabeli Materiałów).</li>
</ol>

<ol><li>Scoville, W., Milner, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10678523">Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions.</a> Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).</li>
<li>Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+return+of+Phineas+Gage%3A+clues+about+the+brain+from+the+skull+of+a+famous+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient.</a> Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).</li>
<li>Kawai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+cortex+is+required+for+learning+but+not+for+executing+a+motor+skill%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill.</a> Neuron. 86, 800-812 (2015).</li>
<li>Otchy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+off-target+effects+of+neural+circuit+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Acute off-target effects of neural circuit manipulations.</a> Nature. 528, 358-363 (2015).</li>
<li>Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+the+anterior+thalamus+in+directing+attention+to+task-relevant+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli.</a> Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).</li>
<li>Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+exposure+to+combination+paradigm+of+environmental+enrichment%2C+physical+exercise+and+diet+reverses+the+spatial+memory+deficits+and+restores+hippocampal+neurogenesis+in+ventral+subicular+lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).</li>
<li>Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+NBM-+lesion+on+synaptic+plasticity+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats.</a> Brain Research. 1655, 122-127 (2017).</li>
<li>Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+visual+motion+representation+in+mouse+area+V1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Complex visual motion representation in mouse area V1.</a> Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).</li>
<li>Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28063155">Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).</li>
<li>Wood, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+honeycomb+maze+provides+a+novel+test+to+study+hippocampal-dependent+spatial+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation.</a> Nature. , (2018).</li>
<li>Vermaercke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specialization+in+rat+occipital+and+temporal+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).</li>
<li>Jun, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+silicon+probes+for+high-density+recording+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity.</a> Nature. 551, 232-236 (2017).</li>
<li>Masís, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((micro-CT-based+method+for+quantitative+brain+lesion+characterization+and+electrode+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization.</a> Scientific Reports. 8, 5184(2018).</li>
<li>Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 65, 3564(2012).</li>
<li>Helander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+studies+of+formaldehyde+binding+in+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue.</a> Biotechnic & Histochemistry. , (1994).</li>
<li>Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+aldehyde+fixation+for+electron+microscopy%3A+stabilization+of+rat+brain+tissue+to+withstand+osmotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress.</a> Histochemical Journal. , (1979).</li>
<li>Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0922338X91902315">Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds.</a> Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).</li>
<li>Bahr, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmium+tetroxide+and+ruthenium+tetroxide+and+their+reactions+with+biologically+important+substances%3A+electron+stains+III%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III.</a> Experimental Cell Research. , (1954).</li>
<li>Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reactions+of+osmium+tetroxide+with+lipids+and+other+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).</li>
<li>Riemersma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmium+tetroxide+fixation+of+lipids+for+electron+microscopy+a+possible+reaction+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).</li>
<li>Mikula, S., Binding, J., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+and+embedding+the+whole+mouse+brain+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy.</a> Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).</li>
<li>Mikula, S., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+whole-brain+staining+for+electron+microscopic+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction.</a> Nature Methods. 12, 541-546 (2015).</li>
<li>Crespigny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+micro-CT+imaging+of+the+postmortem+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">3D micro-CT imaging of the postmortem brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).</li>
<li>Anderson, R., Maga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+rapid+imaging+of+adult+mouse+brains+with+MicroCT+using+Iodine-Based+contrast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast.</a> PLoS One. 10, 0142974(2015).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27027284">Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling.</a> Nature. 532, 122-126 (2016).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+imaging+reveals+mekk3+heterozygosity+prevents+cerebral+cavernous+malformations+in+Ccm2-Deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice.</a> PloS One. 11, 0160833(2016).</li>
<li>Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+Micro-CT+imaging+of+cerebral+cavernous+malformations+in+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li>
<li>Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10860789">Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain.</a> Neuroimage. 11, 601-611 (2000).</li>
<li>Weninger, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+episcopic+microscopy%3A+a+rapid+technique+for+high+detailed+3D+analysis+of+gene+activity+in+the+context+of+tissue+architecture+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol%22%5BJournal%5D)">High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology.</a> Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).</li>
<li>Schneider, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-throughput+magnetic+paragraph+sign+resonance+imaging+of+mouse+embryonic+paragraph+sign+anatomy+using+a+fast+gradient-echo+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22MAGMA%22%5BJournal%5D)">high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence.</a> MAGMA. 16, 43-51 (2003).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 6, 209-228 (2004).</li>
<li>Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Three-Dimensional+microelectrode+brain+mapping+using+stereo+microfocal+x-ray+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging.</a> Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).</li>
<li>Borg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+metal+electrodes+in+the+intact+rat+brain+using+registration+of+3D+microcomputed+tomography+images+to+a+magnetic+resonance+histology+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas.</a> eNeuro. 2, (2015).</li>
<li>Fu, T. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+long-term+chronic+brain+mapping+at+the+single-neuron+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level.</a> Nature Methods. 13, 875-882 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Następujące kroki są krytycznymi krokami protokołu: po pierwsze, zastosowanie kombinacji PFA i GA do perfuzji zwierzęcia, a następnie po utrwaleniu mózgu, miało kluczowe znaczenie dla osiągnięcia konsekwentnej, pełnej penetracji tkanki przez osm. Chociaż nie testowaliśmy tego wyraźnie, prawdopodobnym wyjaśnieniem jest to, że fiksacja PFA jest odwracalna15, podczas gdy fiksacja GA nie jest odwracalna16,17. Ponieważ do pełnej infiltracji tka...

Neurobiolodzy od dawna polegają na zmianach chorobowych, aby zrozumieć związek między funkcją a lokalizacją w mózgu. Na przykład, nasze rozumienie hipokampa jako niezbędnego do uczenia się i zapamiętywania oraz kory przedczołowej jako kluczowej dla kontroli impulsów było wynikiem przypadkowych zmian u ludzi1,2. Wykorzystanie modeli zwierzęcych pozwoliło jednak neurobiologom okiełznać moc zmian chorobowych, wychodząc poza przypadkowy zbieg okoliczności, a funkcja niezliczonych obszarów mózgu została wyjaśniona dzięki systematycznym badaniom relacji struktura-funkcja poprzez lesions3,4.
Aby poprawnie przypisać funkcję strukturze, badania zmian wymagają precyzyjnych procedur kwantyfikacji, czego do tej pory brakowało. Obecnym złotym standardem w ilościowym określaniu zmian chorobowych jest cięcie, montowanie i obrazowanie mózgu za pomocą mikroskopu świetlnego. Zobrazowane wycinki są następnie dopasowywane do najbliższych sekcji atlasu, a przybliżone współrzędne zmian chorobowych u badanych są raportowane pośrednio, często za pomocą obrazów camera lucida lub przykładowych wycinków histologicznych3,4,5,6,7,8,9,10.
Poza niedokładnością obecnych procedur kwantyfikacji zmian, techniki te są czasochłonne i podatne na niepowodzenia. Niewielkie zmiany w sztywności mózgu, ostrości ostrza i temperaturze mogą prowadzić do spartaczonych, wypaczonych lub rozdartych sekcji. Sekcje mogą również plamić się nierównomiernie i być nieprawidłowo obrazowane z powodu pęcherzyków powietrza w medium montażowym. Co ważne, po przeprowadzeniu sekcji trójwymiarowy kontekst lokalizacji zmiany w mózgu zostaje utracony, co sprawia, że precyzyjna rekonstrukcja 3D zmiany w mózgu jest trudna.
Innym powszechnym zastosowaniem zmian było określenie lokalizacji zapisów pojedynczych i wielokrotnych elektrod w mózgu. Pod koniec końcowej sesji nagraniowej naukowcy indukują małe zmiany elektrolityczne na końcówce elektrody i przetwarzają mózg histologicznie, tak jak w konwencjonalnym eksperymencie z uszkodzeniem11. Technika ta ma te same wady, które opisano powyżej, a dodatkowym problemem jest to, że zmiany elektrolityczne są zwykle większe niż elektrody użyte do ich wykonania, ale zwykle są na tyle małe, że trudno je znaleźć histologicznie. W przypadku wprowadzenia wielu elektrod, jak w przypadku matrycy tetrodowej, weryfikacja przez uszkodzenia elektrolityczne jest jeszcze trudniejsza. Alternatywą dla zmian elektrolitycznych jest użycie barwnika na elektrodzie w celu późniejszej weryfikacji histologicznej12, ale ta technika ma te same wady, które mają konwencjonalną histologię.
Tutaj szczegółowo opisujemy niedawno opisaną metodę13 opartą na technikach barwienia w mikroskopii elektronowej (EM) i rentgenowskiej tomografii komputerowej (micro-CT), która określa ilościowo zmiany chorobowe i lokalizuje elektrody w mózgach małych zwierząt lepiej niż obecne metody. Mikro-CT to technika obrazowania, w której promienie rentgenowskie są wystrzeliwane na próbkę, która jest obracana o 360°, podczas gdy scyntylator zbiera promienie rentgenowskie, które nie są odchylane przez próbkę. Rezultatem jest cyfrowa rekonstrukcja 3D próbki w wysokiej rozdzielczości, którą można wizualizować w dowolnej orientacji i precyzyjnie określić ilościowo. Wiele instytucji akademickich posiada mikrotomografy komputerowe, które są również dostępne na rynku.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Mikroskopia elektronowa (EMS)</td><td>15710</td><td>2% (w/v/) in 1X</td></tr><tr><td>PBS Aldehyd glutarowy (GA)</td><td>EMS</td><td>16220</td><td>2,5% (w/v) GA w 1x PBS</td></tr><tr><td>OsO4</td><td>EMS</td><td>19190</td><td>Praca pod wyciągiem</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>Koptec</td><td>140, 190, 200 proof</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>EMS</td><td>10015</td><td>Destylowana w szkle</td></tr><tr><td>żywica Durcupan ACM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44610</td><td>Składniki A, B, C i D, żywica do zatapiania</td></tr><tr><td>Formy jednorazowe</td><td>Ted Pella</td><td>27114</td><td>Sugerowana</td></tr><tr><td>woda milliQ (woda ultraczysta)</td><td>Millipore Sigma</td><td>QGARD00R1 (lub pokrewny oczyszczacz)</td><td>Sugerowany</td></tr><tr><td>Parafilm (folia parafinowa)</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7793</td><td>Sugerowana folia parafinowa</td></tr><tr><td>Skaner mikrotomograficzny</td><td>Nikon Metrology Ltd., Tring, Wielka Brytania</td><td>X-Tek HMS ST 225</td><td>Używany przez autorów</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do wizualizacji i analizy skanów mikro-CT:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Volume Graphics</td><td>VG Studio Max</td><td>Używane przez autorów</td></tr><tr><td></td><td>FEI / Thermo Scientific</td><td>Avizo</td><td>Używane przez autorów</td></tr><tr><td></td><td>FEI / Thermo Scientific</td><td>Amira</td><td>Podobne do Avizo</td></tr><tr><td></td><td>Mark Sutton & Russell Garwood</td><td>Spiers</td><td>za darmo, http://spiers-software.org/</td></tr> <tr><td></td><td>Pixmeo Sarl</td><td>Osirix Lite</td><td>za darmo, https://www.osirix-viewer.com/</td></tr> <tr><td></td><td>Open Source</td><td>FIJI</td><td>Free, https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td></td><td>Adobe</td><td>Photoshop</td><td>Dobry do analizowania jednego wycinka na raz</td></tr></tbody></table>

metoda oparta na mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt

A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

Weryfikacja zmian chorobowych i lokalizacji elektrod odbywa się tradycyjnie poprzez badanie histologiczne barwionych wycinków mózgu, co jest czasochłonną procedurą, która wymaga ręcznego oszacowania. W tym miejscu opisujemy prostą, nieskomplikowaną metodę ilościowego określania zmian chorobowych i lokalizowania elektrod w mózgu, która jest mniej pracochłonna i daje bardziej szczegółowe wyniki. Całe mózgi są barwione tetratlenkiem osmu, zatopione w żywicy i obrazowane za pomocą mikrotomografu komputerowego. Wynikiem skanów są cyfrowe objętości 3D mózgów z rozdzielczościami i wirtualnymi grubościami przekrojów zależnymi od wielkości próbki (12-15 i 5-6 μm na woksel odpowiednio dla mózgów szczurów i zeberek). Można scharakteryzować zmiany powierzchniowe i głębokie, a także lokalizować pojedyncze tetrody, układy tetrodowe, zmiany elektrolityczne i sondy krzemowe. Darmowe i zastrzeżone oprogramowanie pozwala eksperymentatorom badać objętość próbki z dowolnej płaszczyzny i segmentować objętość ręcznie lub automatycznie. Ponieważ metoda ta generuje całą objętość mózgu, zmiany chorobowe i elektrody mogą być oznaczane ilościowo w znacznie wyższym stopniu niż w przypadku obecnych metod, co pomoże ustandaryzować porównania w ramach badań i między nimi.

Tradycyjnie mózgi są przecinane i barwione w celu ilościowego określenia zmian chorobowych oraz lokalizacji elektrod, jednak metoda ta jest podatna na błędy, pracochłonna i zazwyczaj wymaga szacowania wyników. Dzięki przygotowaniu całych mózgów do obrazowania mikro-CT znacznie zmniejsza się prawdopodobieństwo uszkodzenia próbek, analizowane cechy mogą być badane w kontekście całego mózgu, a metoda ta pozwala na równoległe przetwarzanie wielu próbek, co znacznie przyspiesza ich przygotowan...

Ten artykuł opisuje prostą metodę przygotowania mózgów małych zwierząt do obrazowania mikro-CT, w którym zmiany chorobowe mogą być określane ilościowo, a elektrody lokalizowane z dużą precyzją w kontekście całego mózgu.

Metoda oparta na mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, zapewniając prostszą, mniej podatną na błędy i bardziej ilościową metodę weryfikacji zmian chorobowych i lokalizacji elektrod. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na weryfikację zmian chorobowych i miejsc elektrod w całym mózgu bez konieczności wykonywania sekcji. Produktem końcowym jest cyfrowa objętość 3D mózgu, a wiele mózgów może być przetwarzanych równolegle.Chociaż metoda ta zostanie zademonstrowana na szczurach, można ją również zastosować do innych organizmów, takich jak myszy i zeberki. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ niektóre kroki wymagają szczególnej ostrożności, aby zapewnić najlepsze wyniki. Na początek umieść wyekstrahowany mózg w obfitym roztworze w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów.Przechowuj próbkę przez dwa do trzech dni, delikatnie wstrząsając w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Upewnij się, że osm jest rozcieńczony w wodzie, a nie w buforze. Dzieje się tak, ponieważ woda będzie działać jak łagodny detergent, umożliwiając osmowi wniknięcie w głąb tkanki.Przygotuj 50 mililitrów 2% tetratlenku osmu w podwójnie destylowanej wodzie. Następnie umieść mózg w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów i dodaj roztwór tetratlenku osmu. Zamknij rurkę i uszczelnij ją folią parafinową, aby zapobiec wyciekom.Przechowuj zamkniętą probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając przez dwa tygodnie. Upewnij się, że rurka jest umieszczona poziomo. Mózg jest bardzo gruby i ma długą drogę do pokonania przez dyfuzję.Umieszczenie rurki poziomo pozwoli osmowi wniknąć głębiej w tkankę. Po inkubacji próbki przez dwa tygodnie przemyć ją pięciokrotnie wodą podwójnie destylowaną, aby usunąć z próbki cały niezwiązany tetratlenek osmu. Następnie przemyć próbkę podwójnie destylowaną wodą przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Zastąp podwójnie destylowaną wodę czterema rozcieńczeniami etanolu w celu odwodnienia próbki. Aby rozpocząć proces infiltracji żywicy, przeprowadź próbkę przez trzy rozcieńczenia acetonu i trzy rozcieńczenia żywicy acetonowej, a następnie zanurz próbkę w 100% żywicy w temperaturze pokojowej, aby kontynuować proces infiltracji. Następnie przenieś próbkę do jednorazowej formy.Nasycić próbkę świeżą 100% żywicą przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Odgazować próbkę w piecu próżniowym przez 15 minut w temperaturze 45 stopni Celsjusza. Następnie próbkę utwardzamy w piekarniku przez 48 godzin w temperaturze 60 stopni Celsjusza.Na koniec, gdy próbka zakończy utwardzanie, zdejmij jednorazową formę i zeskanuj ją za pomocą urządzenia Micro-CT. W tradycyjnym dzieleniu na sekcje orientacja mózgu musi być z góry określona. Korzystając z tej metody Micro-CT, cyfrowa objętość próbki mózgu może być manipulowana w trzech wymiarach i wirtualnie cięta w dowolnym kierunku.Skaningowa mikroskopia elektronowa przygotowanego mózgu szczura potwierdza, że tkanka nie została znacząco uszkodzona na potrzeby obrazowania Micro-CT. Przygotowano również mózg zeberki i zeskanowano go zgodnie z tym protokołem, aby przetestować użyteczność tej metody na innych mózgach małych zwierząt. Technika ta może być wykorzystana do znalezienia powierzchniowych zmian w mózgu, a także zmian głęboko w mózgu.Technika ta może być również stosowana do lokalizacji pojedynczych tetrod in situ, zmian elektrolitycznych, ścieżek elektrod, układów tetrod in situ i sond krzemowych in situ. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać, aby pozwolić mózgowi na inkubację wystarczająco długo i z wystarczającym pobudzeniem. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak optogenetyka i obrazowanie dwufotonowe, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące roli, jaką różne obszary mózgu odgrywają w różnych zachowaniach.Technika ta może pozwolić naukowcom z dziedziny neurobiologii na lepsze badanie relacji struktura-funkcja między mózgiem a zachowaniem szczurów, myszy, ptaków śpiewających i innych małych zwierząt. Nie zapominaj, że praca z osmem może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i praca w okapie próżniowym.

a-micro-ct-based-method-for-characterizing-lesions-locating

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Film demonstruje procedurę wszczepienia bezprzewodowej dwukierunkowej wielokanałowej elektrody do mózgu szczura w celu nagrywania i stymulowania wielokanałowych sieci neuronowych.

Wszczepienie bezprzewodowego dwukierunkowego systemu mikroelektrod do mózgu szczura

Źródło: Choi, J. P. et al. Obrazowanie indukcji i mikrotomografii komputerowej malformacji jamistych mózgu na modelu mysim. J. vis. exp. ( 2017)Ten film pokazuje zastosowanie obrazowania mikro-CT do wizualizacji zmian w malformacji jamistych mózgu (CCM) w mózgu myszy. Szczegółowo opisano w nim etapy przygotowania próbki, obrazowania i rekonstrukcji obrazu 3D w celu oceny gęstości i lokalizacji zmian CCM w tkance mózgowej.

Obrazowanie mikrotomografii komputerowej ze wzmocnieniem kontrastowym zmian w malformacjach jamistych mózgu w mózgu myszy

Tutaj prezentujemy histologiczną metodę przechwytywania, znakowania, optycznego oczyszczania i obrazowania nienaruszonego interfejsu tkanki mózgowej wokół przewlekle wszczepionych mikrourządzeń w tkance mózgowej gryzoni.  Wyniki technik obejmujących tę metodę są przydatne do zrozumienia wpływu różnych penetrujących implantów mózgowych na otaczające je tkanki.

Nienaruszona charakterystyka histologiczna mikrourządzeń z implantami do mózgu i otaczających tkanek

Ten protokół demonstruje indukcję choroby malformacji jamistych mózgu w modelu mysim i wykorzystuje mikrotomografię komputerową wzmocnioną kontrastem do pomiaru obciążenia zmianami. Metoda ta zwiększa wartość uznanych modeli mysich w celu zbadania podstaw molekularnych i potencjalnych terapii malformacji jamistych mózgu i innych chorób naczyń mózgowych.

Indukcja i obrazowanie mikro-tomografią malformacji jamistych mózgu w modelu mysim

Podczas gdy obrazowanie wielofotonowe jest skuteczne tylko na ograniczonych głębokościach od powierzchni tkanki, możliwe jest osiągnięcie obrazowania o rozdzielczości 3 μm na dowolnej głębokości za pomocą pCLE. W tym miejscu przedstawiamy protokół do przeprowadzania obrazowania pCLE w celu pomiaru dynamiki mikronaczyniowej w hipokampie myszy ictal i dzikich myszy.

Przedkliniczna konfokalna endomikroskopia laserowo-skaningowa (pCLE) in vivo sprzężona z włóknami światłowodowymi naczyń włosowatych hipokampa u obudzonych myszy

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Tutaj prezentujemy metodę długoterminowej oceny wydajności i bezpieczeństwa miękkich matryc elektrod podtwardówkowych w modelu minipig, opisując metodę i narzędzia chirurgiczne, pooperacyjny rezonans magnetyczny, elektrofizjologię kory słuchowej, właściwości elektrochemiczne implantu oraz immunochemię pośmiertną.

Implantacja matrycy podtwardówkowej miękkiej elektrokortykografii (ECoG) i długotrwała rejestracja kory mózgowej u świnek miniaturowych

To badanie opisuje etapy uzyskiwania obrazów mózgów noworodków myszy w wysokiej rozdzielczości poprzez połączenie mikrotomografii komputerowej (mikro-CT) i środka kontrastowego w próbkach ex vivo. Opisujemy podstawowe analizy morfometryczne w celu ilościowego określenia wielkości i kształtu mózgu na tych obrazach.

Obrazowanie mikro-CT i analiza morfometryczna mózgów noworodków myszy

Opisujemy protokół oceny krzywych dawka-odpowiedź dla stymulacji pozaczaszkowej pod względem pomiarów pola elektrycznego mózgu i odpowiedniego biomarkera przepływu krwi w mózgu. Ponieważ protokół ten obejmuje inwazyjne umieszczenie elektrod w mózgu, potrzebne jest znieczulenie ogólne, w którym preferowane jest spontaniczne oddychanie, a nie kontrolowane oddychanie.

Umieszczenie zewnątrzczaszkowych elektrod stymulujących i pomiar przepływu krwi w mózgu i wewnątrzczaszkowych pól elektrycznych u znieczulonych myszy

Proponuje się tani system zapisu elektroencefalograficznego w połączeniu z cewką o rozmiarach milimetrowych do napędzania przezczaszkowej stymulacji magnetycznej mózgu myszy in vivo. Korzystając z konwencjonalnych elektrod śrubowych z niestandardowym, elastycznym podłożem z matrycą wieloelektrodową, można przeprowadzić zapis w wielu miejscach z mózgu myszy w odpowiedzi na przezczaszkową stymulację magnetyczną.

Niedrogi elektroencefalograficzny system zapisu w połączeniu z cewką o rozmiarach milimetrowych do przezczaszkowej stymulacji mózgu myszy in vivo

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do rejestracji mikro-elektrokortykografii o wysokiej gęstości (μEcoG) u szczurów i myszy, w tym metody chirurgiczne, implantacyjne i rejestracyjne. Zapisy μECoG są wykonywane w połączeniu z zapisem laminarnej politrody w korze słuchowej szczura lub z optogenetycznym manipulowaniem aktywnością neuronalną w korze somatosensorycznej myszy.

Wieloskalowe badania przetwarzania kory mózgowej poprzez integrację politrod laminarnych i optogenetyki z mikroelektrokortykografią u gryzoni

Poznaj metodę mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt. Technika umożliwia precyzyjną analizę 3D bez konieczności preparowania przekrojów.

Metoda oparta na mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt (Wideo) | JoVE Journal

Metoda oparta na mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt

Przeglądaj więcej filmów