Metoda oparta na mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt
8 listopada 2018
Ten artykuł opisuje prostą metodę przygotowania mózgów małych zwierząt do obrazowania mikro-CT, w którym zmiany chorobowe mogą być określane ilościowo, a elektrody lokalizowane z dużą precyzją w kontekście całego mózgu.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, zapewniając prostszą, mniej podatną na błędy i bardziej ilościową metodę weryfikacji zmian chorobowych i lokalizacji elektrod. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na weryfikację zmian chorobowych i miejsc elektrod w całym mózgu bez konieczności wykonywania sekcji. Produktem końcowym jest cyfrowa objętość 3D mózgu, a wiele mózgów może być przetwarzanych równolegle.
Chociaż metoda ta zostanie zademonstrowana na szczurach, można ją również zastosować do innych organizmów, takich jak myszy i zeberki. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ niektóre kroki wymagają szczególnej ostrożności, aby zapewnić najlepsze wyniki. Na początek umieść wyekstrahowany mózg w obfitym roztworze w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów.
Przechowuj próbkę przez dwa do trzech dni, delikatnie wstrząsając w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Upewnij się, że osm jest rozcieńczony w wodzie, a nie w buforze. Dzieje się tak, ponieważ woda będzie działać jak łagodny detergent, umożliwiając osmowi wniknięcie w głąb tkanki.
Przygotuj 50 mililitrów 2% tetratlenku osmu w podwójnie destylowanej wodzie. Następnie umieść mózg w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów i dodaj roztwór tetratlenku osmu. Zamknij rurkę i uszczelnij ją folią parafinową, aby zapobiec wyciekom.
Przechowuj zamkniętą probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając przez dwa tygodnie. Upewnij się, że rurka jest umieszczona poziomo. Mózg jest bardzo gruby i ma długą drogę do pokonania przez dyfuzję.
Umieszczenie rurki poziomo pozwoli osmowi wniknąć głębiej w tkankę. Po inkubacji próbki przez dwa tygodnie przemyć ją pięciokrotnie wodą podwójnie destylowaną, aby usunąć z próbki cały niezwiązany tetratlenek osmu. Następnie przemyć próbkę podwójnie destylowaną wodą przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Zastąp podwójnie destylowaną wodę czterema rozcieńczeniami etanolu w celu odwodnienia próbki. Aby rozpocząć proces infiltracji żywicy, przeprowadź próbkę przez trzy rozcieńczenia acetonu i trzy rozcieńczenia żywicy acetonowej, a następnie zanurz próbkę w 100% żywicy w temperaturze pokojowej, aby kontynuować proces infiltracji. Następnie przenieś próbkę do jednorazowej formy.
Nasycić próbkę świeżą 100% żywicą przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Odgazować próbkę w piecu próżniowym przez 15 minut w temperaturze 45 stopni Celsjusza. Następnie próbkę utwardzamy w piekarniku przez 48 godzin w temperaturze 60 stopni Celsjusza.
Na koniec, gdy próbka zakończy utwardzanie, zdejmij jednorazową formę i zeskanuj ją za pomocą urządzenia Micro-CT. W tradycyjnym dzieleniu na sekcje orientacja mózgu musi być z góry określona. Korzystając z tej metody Micro-CT, cyfrowa objętość próbki mózgu może być manipulowana w trzech wymiarach i wirtualnie cięta w dowolnym kierunku.
Skaningowa mikroskopia elektronowa przygotowanego mózgu szczura potwierdza, że tkanka nie została znacząco uszkodzona na potrzeby obrazowania Micro-CT. Przygotowano również mózg zeberki i zeskanowano go zgodnie z tym protokołem, aby przetestować użyteczność tej metody na innych mózgach małych zwierząt. Technika ta może być wykorzystana do znalezienia powierzchniowych zmian w mózgu, a także zmian głęboko w mózgu.
Technika ta może być również stosowana do lokalizacji pojedynczych tetrod in situ, zmian elektrolitycznych, ścieżek elektrod, układów tetrod in situ i sond krzemowych in situ. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać, aby pozwolić mózgowi na inkubację wystarczająco długo i z wystarczającym pobudzeniem. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak optogenetyka i obrazowanie dwufotonowe, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące roli, jaką różne obszary mózgu odgrywają w różnych zachowaniach.
Technika ta może pozwolić naukowcom z dziedziny neurobiologii na lepsze badanie relacji struktura-funkcja między mózgiem a zachowaniem szczurów, myszy, ptaków śpiewających i innych małych zwierząt. Nie zapominaj, że praca z osmem może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i praca w okapie próżniowym.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę przygotowania mózgów małych zwierząt, a konkretnie mózgów szczurów, do obrazowania micro-CT. Technika ta ma na celu ilościowe określenie zmian chorobowych oraz precyzyjną lokalizację elektrod bez konieczności wykonywania przekrojów, co pozwala na uzyskanie kompleksowej cyfrowej objętości 3D mózgu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Techniki obrazowania
- Analiza zmian
Wstęp
- Obrazowanie mikro-CT umożliwia nieniszczącą analizę struktur mózgu.
- Tradycyjne metody sekcjonowania mogą być podatne na błędy i ograniczać elastyczność w orientacji.
- Metoda ta zwiększa możliwości analizy zmian chorobowych oraz rozmieszczenia elektrod.
- Metoda jest stosowalna u różnych małych zwierząt, takich jak myszy i zięby zebrowe.
Cel badania
- Opracowanie uproszczonej i mniej podatnej na błędy metody przygotowania próbek do obrazowania micro-CT.
- Zapewnienie precyzyjnej lokalizacji zmian chorobowych oraz elektrod.
- Umożliwienie manipulacji trójwymiarowej próbkami mózgu w celu usprawnienia analizy.
Zastosowane metody
- Główną platformą wykorzystywaną w badaniach jest obrazowanie micro-CT przygotowanych próbek mózgu.
- Kluczowym modelem biologicznym jest mózg szczura, jednak metoda ta może zostać dostosowana do innych małych zwierząt.
- Metoda obejmuje określone okresy inkubacji oraz zastosowanie czterotlenku osmu do przygotowania tkanki.
- Krytyczne etapy obejmują poziome ułożenie probówek oraz wielokrotne etapy płukania w celu zapewnienia penetracji osmu.
- Końcowy etap przygotowania obejmuje utwardzanie żywicy oraz skanowanie za pomocą urządzenia do micro-CT.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na wizualizację zmian zarówno powierzchniowych, jak i głębokich w mózgu.
- Umożliwia ona dokładną identyfikację torów elektrod oraz zmian przy jednoczesnym zachowaniu integralności tkanki.
- Przeskanowane próbki wykazują minimalne uszkodzenia tkanki, co potwierdza przydatność tej techniki.
- Procedura ta może stanowić wsparcie dla dalszych eksperymentów, takich jak optogenetyka i obrazowanie dwufotonowe.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia skuteczną metodę przygotowania mózgów zwierząt do szczegółowej analizy z wykorzystaniem mikro-CT.
- Technika ta umożliwia badaczom analizę zachowania neuronów oraz zależności strukturalnych bez uszkadzania próbek.
- Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta zwiększa możliwości badań neurobiologicznych w zakresie rozumienia mechaniki mózgu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Precyzyjna charakterystyka zmian oraz lokalizacja elektrod są kluczowe dla walidacji hipotez mechanistycznych w procesie odkrywania leków napędzanego neuronauką. Ten oparty na mikro-CT schemat postępowania umożliwia wysokorozdzielcze, ilościowe mapowanie interwencji w mózgu, ograniczając błędy manualne i wspierając powtarzalne porównania międzybadawcze. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną w punktach zwrotnych walidacji celu i modeli przedklinicznych, bezpośrednio wpływając na ciągłość translacyjną i podejmowanie decyzji dotyczących portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną weryfikację umiejscowienia zmiany i lokalizacji elektrod w celu mechanistycznej redukcji ryzyka.
- Wspiera walidację celu funkcjonalnego poprzez zapewnienie trójwymiarowego kontekstu anatomicznego dla miejsc interwencji.
- Ułatwia ilościowe porównywanie manipulacji eksperymentalnych w różnych badaniach i modelach.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane modele mózgu do dalszych analiz funkcjonalnych i badań behawioralnych.
- Standaryzuje mapowanie zmian chorobowych i elektrod, zwiększając powtarzalność oraz wiarygodność testów.
- Generuje wolumetry cyfrowe odpowiednie do automatycznej lub manualnej segmentacji i analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje dane dotyczące interwencji anatomicznych z wynikami behawioralnymi i funkcjonalnymi w układach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez wspieranie integracji danych multimodalnych.
- Zmniejsza niejednoznaczność biologiczną w modelach przedklinicznych, dostarczając informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o dalszych etapach badań w oparciu o analizę ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda mikro-CT integruje obszar biologii odkrywczej z walidacją modeli przedklinicznych, łącząc weryfikację anatomiczną z odczytami funkcjonalnymi i behawioralnymi.
- Biologia odkrywcza: zapewnia ilościową weryfikację manipulacji eksperymentalnych w 3D w celu testowania hipotez i wyjaśniania szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: dostarcza powtarzalne dane anatomiczne o wysokiej rozdzielczości, wspierając gotowość testów oraz standaryzację między badaniami.
- Analityka: umożliwia cyfrowy pomiar i porównanie objętości zmian oraz pozycji elektrod w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: wspierają uzgadnianie danych anatomicznych i funkcjonalnych w celu walidacji modeli istotnych dla danej choroby.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwach: oferuje skalowalny, cyfrowy przepływ pracy, który można dostosować do wielu modeli małych zwierząt i paradygmatów eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Usprawnia procesy weryfikacji, umożliwiając równoległe przetwarzanie próbek oraz archiwizację cyfrową.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go poprzez standaryzację walidacji anatomicznej we wszystkich programach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, dostarczając rzetelnych, ilościowych danych anatomicznych do wyboru i rozwoju modeli.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowaniu tkanek, obrazowaniu mikro-CT oraz cyfrowej analizie objętościowej.
- Wymaga dostępu do aparatury mikro-CT oraz kompatybilnego oprogramowania do analizy (bezpłatnego lub komercyjnego).
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów obrazowania i obchodzenia się z próbkami w ramach całego zespołu.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych modeli małych zwierząt poprzez modyfikację protokołu w zależności od wielkości i składu tkanki.
- Niezbędne jest przestrzeganie zasad bezpieczeństwa ze względu na stosowanie niebezpiecznych odczynników, takich jak tetrautlenek osmu.
