Metoda oparta na mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt
8 listopada 2018
Ten artykuł opisuje prostą metodę przygotowania mózgów małych zwierząt do obrazowania mikro-CT, w którym zmiany chorobowe mogą być określane ilościowo, a elektrody lokalizowane z dużą precyzją w kontekście całego mózgu.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, zapewniając prostszą, mniej podatną na błędy i bardziej ilościową metodę weryfikacji zmian chorobowych i lokalizacji elektrod. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na weryfikację zmian chorobowych i miejsc elektrod w całym mózgu bez konieczności wykonywania sekcji. Produktem końcowym jest cyfrowa objętość 3D mózgu, a wiele mózgów może być przetwarzanych równolegle.
Chociaż metoda ta zostanie zademonstrowana na szczurach, można ją również zastosować do innych organizmów, takich jak myszy i zeberki. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ niektóre kroki wymagają szczególnej ostrożności, aby zapewnić najlepsze wyniki. Na początek umieść wyekstrahowany mózg w obfitym roztworze w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów.
Przechowuj próbkę przez dwa do trzech dni, delikatnie wstrząsając w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Upewnij się, że osm jest rozcieńczony w wodzie, a nie w buforze. Dzieje się tak, ponieważ woda będzie działać jak łagodny detergent, umożliwiając osmowi wniknięcie w głąb tkanki.
Przygotuj 50 mililitrów 2% tetratlenku osmu w podwójnie destylowanej wodzie. Następnie umieść mózg w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów i dodaj roztwór tetratlenku osmu. Zamknij rurkę i uszczelnij ją folią parafinową, aby zapobiec wyciekom.
Przechowuj zamkniętą probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając przez dwa tygodnie. Upewnij się, że rurka jest umieszczona poziomo. Mózg jest bardzo gruby i ma długą drogę do pokonania przez dyfuzję.
Umieszczenie rurki poziomo pozwoli osmowi wniknąć głębiej w tkankę. Po inkubacji próbki przez dwa tygodnie przemyć ją pięciokrotnie wodą podwójnie destylowaną, aby usunąć z próbki cały niezwiązany tetratlenek osmu. Następnie przemyć próbkę podwójnie destylowaną wodą przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Zastąp podwójnie destylowaną wodę czterema rozcieńczeniami etanolu w celu odwodnienia próbki. Aby rozpocząć proces infiltracji żywicy, przeprowadź próbkę przez trzy rozcieńczenia acetonu i trzy rozcieńczenia żywicy acetonowej, a następnie zanurz próbkę w 100% żywicy w temperaturze pokojowej, aby kontynuować proces infiltracji. Następnie przenieś próbkę do jednorazowej formy.
Nasycić próbkę świeżą 100% żywicą przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Odgazować próbkę w piecu próżniowym przez 15 minut w temperaturze 45 stopni Celsjusza. Następnie próbkę utwardzamy w piekarniku przez 48 godzin w temperaturze 60 stopni Celsjusza.
Na koniec, gdy próbka zakończy utwardzanie, zdejmij jednorazową formę i zeskanuj ją za pomocą urządzenia Micro-CT. W tradycyjnym dzieleniu na sekcje orientacja mózgu musi być z góry określona. Korzystając z tej metody Micro-CT, cyfrowa objętość próbki mózgu może być manipulowana w trzech wymiarach i wirtualnie cięta w dowolnym kierunku.
Skaningowa mikroskopia elektronowa przygotowanego mózgu szczura potwierdza, że tkanka nie została znacząco uszkodzona na potrzeby obrazowania Micro-CT. Przygotowano również mózg zeberki i zeskanowano go zgodnie z tym protokołem, aby przetestować użyteczność tej metody na innych mózgach małych zwierząt. Technika ta może być wykorzystana do znalezienia powierzchniowych zmian w mózgu, a także zmian głęboko w mózgu.
Technika ta może być również stosowana do lokalizacji pojedynczych tetrod in situ, zmian elektrolitycznych, ścieżek elektrod, układów tetrod in situ i sond krzemowych in situ. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać, aby pozwolić mózgowi na inkubację wystarczająco długo i z wystarczającym pobudzeniem. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak optogenetyka i obrazowanie dwufotonowe, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące roli, jaką różne obszary mózgu odgrywają w różnych zachowaniach.
Technika ta może pozwolić naukowcom z dziedziny neurobiologii na lepsze badanie relacji struktura-funkcja między mózgiem a zachowaniem szczurów, myszy, ptaków śpiewających i innych małych zwierząt. Nie zapominaj, że praca z osmem może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i praca w okapie próżniowym.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę przygotowywania mózgu małego zwierzęcia, szczególnie mózgu szczura, do mikro-tomografii komputerowej. Technika ta ma na celu ilościowe określenie uszkodzeń i precyzyjne zlokalizowanie elektrod bez konieczności przekrojów, tworząc kompleksowy 3D obraz mózgu w postaci cyfrowej objętości.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Techniki obrazowania
- Analiza uszkodzeń
Tło
- Mikro-tomografia komputerowa umożliwia nieniszczącą analizę struktur mózgu.
- Tradicyjne metody przekrójki mogą być podatne na błędy i ograniczają elastyczność orientacji.
- Ta metoda poprawia zdolność do analizy uszkodzeń i umieszczenia elektrod.
- Może być zastosowana do różnych małych zwierząt, takich jak myszy i świstunki.
Cel badania
- Opracowanie uproszczonej i mniej podatnej na błędy metody przygotowania próbki do mikro-tomografii komputerowej.
- Dostarczenie dokładnej lokalizacji uszkodzeń i elektrod.
- Ułatwienie 3D manipulacji próbkami mózgu dla lepszej analizy.
Zastosowane metody
- Główną platformą jest mikro-tomografia komputerowa przygotowanych próbek mózgu.
- Kluczowym modelem biologicznym jest mózg szczura, ale metoda ta jest przystosowana do innych małych zwierząt.
- Metoda obejmuje określone okresy inkubacji i stosowanie nadtlenku osmu do przygotowania tkanki.
- Kluczowe kroki obejmują umieszczenie rury poziomo i wielokrotne kroki mycia, aby zapewnić przenikanie nadtlenku osmu.
- Ostateczna przygotowanie obejmuje utwardzenie żywicy i skanowanie za pomocą mikro-tomografii komputerowej.
Główne wyniki
- Ta metoda umożliwia wizualizacje zarówno powierzchniowych, jak i głębokich uszkodzeń mózgu.
- Umożliwia dokładne zidentyfikowanie śladów elektrod i uszkodzeń, zachowując integralność tkanki.
- Skanowanie próbek pokazuje, że uszkodzenia tkanki są minimalne, co potwierdza przydatność techniki.
- Procedura ta może wspierać dalsze eksperymenty, takie jak optogenetyka i obrazowanie dwufotonowe.
Wnioski
- Badanie to udowadnia efektywną metodę przygotowywania mózgu zwierząt do szczegółowej analizy za pomocą mikro-tomografii komputerowej.
- Technika ta umożliwia badaczom zbadanie zachowania neuronów i strukturalnych relacji bez uszkadzania próbek.
- Ogólnie rzecz biorąc, poprawia zdolności badań neuronaukowych do zrozumienia mechaniki mózgu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate lesion characterization and electrode localization are critical for validating mechanistic hypotheses in neuroscience-driven drug discovery. This micro-CT-based workflow enables high-resolution, quantitative mapping of brain interventions, reducing manual error and supporting reproducible, cross-study comparisons. The approach enhances predictive confidence at the target validation and preclinical model inflection points, directly impacting translational continuity and portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise verification of lesion placement and electrode localization for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by providing 3D anatomical context for intervention sites.
- Facilitates quantitative comparison of experimental manipulations across studies and models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain models for downstream functional assays and behavioral studies.
- Standardizes lesion and electrode mapping, improving reproducibility and assay reliability.
- Generates digital volumes suitable for automated or manual segmentation and analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns anatomical intervention data with behavioral and functional outcomes in disease-relevant systems.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting multi-modal data integration.
- Reduces biological ambiguity in preclinical models, informing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This micro-CT method integrates at the interface of discovery biology and preclinical model validation, bridging anatomical verification with functional and behavioral readouts.
- Discovery Biology: Provides quantitative, 3D verification of experimental manipulations for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, high-resolution anatomical data to support assay readiness and cross-study standardization.
- Analytics: Enables digital measurement and comparison of lesion volumes and electrode positions across conditions.
- Translational Research: Supports alignment of anatomical and functional data for disease-relevant model validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, digital workflow adaptable to multiple small animal models and experimental paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation studies.
- Operational Value: Streamlines verification processes, enabling parallel sample processing and digital archiving.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by standardizing anatomical validation across programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust, quantitative anatomical data for model selection and advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue preparation, micro-CT imaging, and digital volume analysis.
- Demands access to micro-CT instrumentation and compatible analysis software (free or proprietary).
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample handling and imaging protocols.
- Adaptable to various small animal models with protocol adjustments for tissue size and composition.
- Safety precautions are essential due to hazardous reagents such as osmium tetroxide.
