Name: Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Poznaj metodę trójwymiarowego obrazowania organizacji komórkowej w korze nowej myszy. Technika ta umożliwia wizualizację struktur neuronalnych i może być zastosowana w badaniach nad układem nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Atsushi Miyawaki i Hiroshi Hama za ich rady dotyczące eksperymentów AbScale, Charlesowi Yokoyamie za redakcję manuskryptu, Eriko Ohshimie i Miyuki Kishino za ich pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez fundusze badawcze z RIKEN dla T.H. oraz granty na badania naukowe z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT) Japonii dla T.H. (Innowacyjne Obszary "Mezoskopowe Obwody Nerwowe"; 22115004) i S.S. (25890023).

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Eksperymentów na Zwierzętach RIKEN Wako oraz Komitet Bezpieczeństwa Eksperymentów Genetycznych Rekombinowanych RIKEN i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi obiektów dla zwierząt Instytutu Nauk o Mózgu RIKEN.
1. Przygotowanie komór obrazowania
<ol>
	<li>Komora obrazowania19
	<ol>
		<li>Za pomocą arkuszy kauczuku silikonowego przygotuj komorę o grubości około 5 mm oraz płyty podłogowe o różnej grubości. Przygotuj również szalki Petriego z dnem szklanym i bez niego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekładka do plastrów
	<ol>
		<li>Przygotuj przekładki do przechowywania próbek, używając arkuszy gumy silikonowej o grubości 0,5 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wstrzyknięcie znacznika
UWAGA: Zrób zastrzyki do mostu (2.1) lub górnego wzgórka (2.2). Wstrzyknięcie do mostu oznacza neurony projekcyjne podmózgowe w szerokim obszarze mózgu, w tym w obszarze wzrokowym i motorycznym, podczas gdy wstrzyknięcie do górnego wzgórka oznacza neurony projekcyjne podmózgowe w obszarze wzrokowym. W eksperymentach kontrolnych wstrzyknąć sól fizjologiczną zamiast znakowanej fluorescencyjnie podjednostki B toksyny. Do utrzymania stanu sterylnego należy używać wysterylizowanego sprzętu i plastikowych rękawiczek oczyszczonych etanolem.
<ol>
	<li>Wykonaj zastrzyki do mostu dorosłych myszy.
	<ol>
		<li>Pobierz 1 μl znakowanej fluorescencyjnie podjednostki B toksyny (25 μg/μL w PBS) do strzykawki Hamiltona 26G.</li>
		<li>Umieścić pompę wtryskową na strzykawce.</li>
		<li>Umieść strzykawkę i pompę na uchwycie narzędziowym manipulatora umieszczonego na przyrządzie stereotaktycznym. Przechylić manipulator o 12° do tyłu od osi pionowej.</li>
		<li>Znieczulenie dorosłej myszy płci męskiej lub żeńskiej (C57BL/6J lub Tlx3-cre/Ai9) należy wstrzyknąć dootrzewnowo pentobarbital sodu (60 mg/kg masy ciała) lub podać izofluran (2–3%). Poczekaj, aż mysz nie zareaguje, gdy jej ogon zostanie ściśnięty kleszczami, co oznacza, że mysz jest w pełni znieczulona.</li>
		<li>Umieść mysz na instrumencie stereotaktycznym.</li>
		<li>Ostrożnie usuń włosy za pomocą żyletki, aby zapobiec infekcji i przyciąć 10 mm skóry głowy, aby widoczna była bregma i lambda. Podawać 0,1 ml 1% lidokainy za pomocą pipety. Ustaw kąt nachylenia główki, regulując pionową pozycję ustnika na instrumencie stereotaktycznym tak, aby bregma i lambda miały ten sam poziom z.</li>
		<li>Dostosuj położenie manipulatora, przesuwając go po przyrządzie stereotaktycznym tak, aby końcówka strzykawki znajdowała się blisko bregmy i zapisz pozycję manipulatora. Wycofać strzykawkę, przesuwając uchwyt narzędziowy na manipulatorze.</li>
		<li>Przesuń manipulator o 5.4 mm do tyłu i 0.4 mm na boki. Przesunąć strzykawkę tak, aby końcówka znajdowała się blisko punktu wejścia na czaszce. Wycofać strzykawkę i zaznaczyć punkt wejścia.</li>
		<li>W zaznaczonym miejscu wywierć otwór o średnicy około 1 mm.</li>
		<li>Włożyć końcówkę strzykawki przez otwór tak, aby głębokość końcówki była o 6,9 mm większa niż zmierzona na bregmie.</li>
		<li>Wstrzyknąć 1 μl znaczników za pomocą pompy w tempie 0,2 μl/min.</li>
		<li>Wyjąć strzykawkę z mózgu.</li>
		<li>W razie potrzeby przykryj odsłonięty mózg małymi fragmentami hemostatu mikrofibrylarnego i klejem błyskawicznym.</li>
		<li>Opłucz odsłonięty mózg solą fizjologiczną dostarczaną pipetą, aby zapobiec infekcji i zszyć skórę głowy.</li>
		<li>Wyjmij mysz z instrumentu stereotaktycznego. Pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu w inkubatorze w temperaturze 30 °C, zwykle przez 1 godzinę. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Przywróć mysz do towarzystwa innych zwierząt, gdy w pełni wyzdrowieje.</li>
		<li>Utrzymuj mysz przez 3–7 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj zastrzyki do górnego wzgórka dorosłych myszy.
	<ol>
		<li>Przygotuj szklaną pipetę o średnicy końcówki 30–50 μm.</li>
		<li>Podłącz szklaną pipetę do strzykawki Hamilton przez plastikową rurkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
		<li>Napełnij szklaną pipetę, plastikową rurkę i strzykawkę Hamilton płynem parafinowym.</li>
		<li>Umieścić pompę wtryskową na strzykawce.</li>
		<li>Umieść szklaną pipetę na manipulatorze i przechyl manipulator o 60° do tyłu od osi pionowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
		<li>Wykonać czynności 2.1.4–2.1.9. Położenie manipulatora wynosi 1,4 mm z tyłu, 0,5 mm z boku do lambdy.</li>
		<li>Umieść małą plastikową folię parafinową na czaszce, a następnie nałóż na nią około 1 μl roztworu znacznikowego. Szybko przesunąć szklaną pipetę i napełnić ją co najmniej 0,5 μl roztworu znacznikowego.</li>
		<li>Włóż szklaną pipetę tak, aby głębokość końcówki wynosiła 3,0 mm od powierzchni mózgu.</li>
		<li>Wstrzyknąć 0,5 μl znaczników za pomocą pompy z prędkością 0,2 μl/min.</li>
		<li>Wyjmij szklaną pipetę z mózgu.</li>
		<li>Wykonaj czynności 2.1.13–2.1.16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Utrwalanie i przycinanie
<ol>
	<li>Wstrzykiwać pentobarbital sodu (60 mg/kg masy ciała) dootrzewnowo myszom (C57BL/6J lub Tlx3-cre/Ai9, z wstrzyknięciem znacznika lub bez, jak opisano w kroku 2. Poczekaj, aż mysz nie zareaguje, gdy jej ogon zostanie ściśnięty kleszczami, co oznacza, że mysz jest w pełni znieczulona.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji w sposób humanitarny, poddając ją transcardially20 0,9% soli fizjologicznej.</li>
	<li>Napraw mouse20 poprzez perfuzję 4% paraformaldehydu (PFA) w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,5).</li>
	<li>Wytnij skórę głowy za pomocą nożyczek, aby odsłonić czaszkę zgodnie z opisem20.
	<ol>
		<li>Wytnij linię środkową odsłoniętej czaszki za pomocą nożyczek. Usuń czaszkę za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Jeśli konieczne jest zaznaczenie pozycji bregmy i lambdy, najpierw usuń jedną półkulę czaszki. Włóż cienkie igły wolframowe do mózgu w miejscach bregmy i lambdy na czaszce pozostałej na mózgu, a następnie usuń pozostałą czaszkę. 
		UWAGA: Mózg może być przechowywany w PBS w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przeprowadzić barwienie przeciwciałami neuronów hamujących, pokrój próbki mózgu na plasterki.
	<ol>
		<li>Umieść próbkę mózgu na wibratomie.</li>
		<li>Pokrój plastry o grubości do 500 μm w PBS w temperaturze pokojowej i przejdź do kroku 5 (metoda AbScale).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli barwienie przeciwciałami nie jest konieczne, przytnij próbkę mózgu do bloków (o grubości do 3 mm) za pomocą żyletki (Rysunek 3) i przejdź do kroku 4 (metoda SeeDB). 
	UWAGA: Mózg może być przechowywany w PBS w temperaturze 4 °C po ścięciu lub przycięciu. Metoda SeeDB jest preferowana, gdy barwienie przeciwciałami nie jest konieczne, ponieważ wymaga mniej czasu niż metoda AbScale.</li>
</ol>
4. Czyszczenie bez barwienia przeciwciałami (metoda SeeDB)
<ol>
	<li>Przenieść próbkę za pomocą szpatułki do plastikowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml 0,5% α-tioglicerolu i 20% (m/v) fruktozy i inkubować przez 4 godziny, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść próbkę za pomocą szpatułki do plastikowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml 0,5% α-tioglicerolu i 40% (m/v) fruktozy i inkubować przez 4 godziny, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść próbkę za pomocą szpatułki do plastikowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml 0,5% α-tioglicerolu i 60% (m/v) fruktozy i inkubować przez 4 godziny, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść próbkę za pomocą szpatułki do plastikowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml 0,5% α-tioglicerolu i 80% (m/v) fruktozy i inkubować przez 12 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść próbkę za pomocą szpatułki do plastikowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml 0,5% α-tioglicerolu i 100% (m/v) fruktozy i inkubować przez 12 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść próbkę za pomocą szpatułki do plastikowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml 0,5% α-tioglicerolu i 80,2% (m/m) fruktozy i inkubować przez 24 godziny, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Z próbką należy obchodzić się ostrożnie, aby deformacje były jak najmniejsze. Nie należy inkubować próbek dłużej niż wskazano, ponieważ próbki mogą szybko stać się nieprzezroczyste.</li>
	<li>Osadź próbkę w komorze obrazowania wypełnionej 80,2% roztworem fruktozy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). W razie potrzeby utrwal próbkę, umieszczając wokół nią małe kawałki kleju kauczukowego. Jeśli komora jest zbyt głęboka, przed umieszczeniem próbek należy umieścić w niej płytę podłogową.</li>
	<li>Umieścić szalkę Petriego ze szklaną pokrywą na komorze obrazowania i wlać wodę do naczynia, a następnie zobrazować za pomocą mikroskopii konfokalnej lub dwufotonowej z obiektywem o dużej odległości roboczej zanurzonym w wodzie. Długości fal wzbudzenia i filtry emisyjne opisano w tabeli 1. W razie potrzeby użyj zmotoryzowanego stolika.</li>
</ol>
5. Oczyszczanie za pomocą barwienia przeciwciałami (metoda AbScale)
<ol>
	<li>Przygotować odczynniki zgodnie z opisem w Tabeli 2.</li>
	<li>Przenieść plastry za pomocą szpatułki do plastikowej probówki o pojemności 5 ml zawierającej 4 ml roztworu Sca/eS0 i inkubować je przez 12 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 °C (<klasa mocna = "xfig">Rysunek 4B).</li>
	<li>Wyjąć roztwór z probówki za pomocą pipety i dodać 4 ml roztworu Sca/eA2 i inkubować plastry przez 36 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wyjąć roztwór z probówki za pomocą pipety i dodać 4 ml roztworu Sca/eB4 i inkubować plastry przez 24 godziny, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wyjąć roztwór z probówki za pomocą pipety i dodać 4 ml roztworu Sca/eA2 i inkubować plastry przez 12 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wyjąć roztwór z probówki za pomocą pipety i dodać 4 ml PBS i inkubować plastry przez 6 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij plastry do plastikowej probówki o pojemności 2 ml za pomocą szpatułki.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi (Tabela 3) w 1 ml roztworu AbScale przez 48-72 godzin w temperaturze 37 °C (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 4C) delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij plastry do plastikowej probówki o pojemności 5 ml za pomocą szpatułki.</li>
	<li>Inkubować w 4 ml roztworu AbScale przez 2 godziny 2 razy w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij plastry do plastikowej probówki o pojemności 2 ml za pomocą szpatułki.</li>
	<li>Inkubować z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi (tabela materiałów, 1:100) w 1 ml roztworu AbScale przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Ostrożnie wyjąć plastry za pomocą szpatułki do plastikowej probówki o pojemności 5 ml zawierającej 4 ml roztworu AbScale i inkubować plastry przez 6 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyjąć roztwór z probówki za pomocą pipety i dodać 4 ml roztworu AbScale i inkubować plastry przez 2 godziny 2 razy, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyjmij roztwór z probówki za pomocą pipety i dodaj 4 ml 4% PFA i inkubuj plastry przez 1 godzinę, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyjąć roztwór z probówki za pomocą pipety i dodać 4 ml PBS i inkubować plastry przez 1 godzinę, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyjąć roztwór z probówki za pomocą pipety i dodać 4 ml roztworu Sca/eS4 i inkubować plastry przez 12 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umieść przekładkę na szkiełku podstawowym i umieść plastry w ramce dystansowej, a następnie zanurz plastry w roztworze Sca/eS4. Uszczelnij przekładkę szkłem nakrywkowym (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D).</li>
	<li>Nałóż wodę na szkło nakrywkowe i obraz za pomocą mikroskopii konfokalnej lub dwufotonowej z obiektywem o dużej odległości roboczej zanurzonym w wodzie. W razie potrzeby użyj zmotoryzowanego stolika. 
	UWAGA: Sprawdź, czy głębokie części próbki są oznaczone podobnie jak części powierzchowne, aby potwierdzić brak znaczącego odchylenia etykietowania. 
	UWAGA: Przenikanie badanych przeciwciał opisano w tabeli 3.</li>
</ol>
6. Określanie pozycji komórki
<ol>
	<li>Dla każdej pozycji na zeskanowanych obrazach oblicz wartości korelacji za pomocą trójwymiarowego filtra obrazu14 (Rysunek 5A-5D).</li>
	<li>Określ położenie pików wartości korelacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 5D).</li>
	<li>Zbadaj obrazy wokół szczytów, aby zlokalizować komórki (Rysunek 5E).</li>
</ol>

<ol><li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li>
<li>Defelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), aac9462(2015).</li>
<li>Sorensen, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+gene+expression+and+target+specificity+demonstrate+excitatory+projection+neuron+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity.</a> Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347, 1138-1142 (2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li>
<li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell-type+classification%3A+Challenges%2C+opportunities+and+the+path+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li>
<li>Horton, J. C., Adams, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cortical+column%3A+a+structure+without+a+function%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The cortical column: a structure without a function.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).</li>
<li>Costa, N. M., Martin, K. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whose+cortical+column+would+that+be%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Whose cortical column would that be?</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, Article 16 (2010).</li>
<li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).</li>
<li>Hioki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+inhibitory+inputs+to+dendritic+and+somatic+compartments+of+parvalbumin-expressing+neocortical+interneuron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron.</a> Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).</li>
<li>Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+organization+of+a+major+subtype+of+pyramidal+neurons+in+neocortical+layer+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V.</a> Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).</li>
<li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-dependent+posttranscriptional+regulation+of+NOS1+by+FMRP+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex.</a> Cell. 149 (4), 899-911 (2012).</li>
<li>Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+system+of+functionally+distinct+cell+types+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex.</a> Science. 358 (6363), 610-615 (2017).</li>
<li>Treweek, J. B., Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+structural+and+functional+features+of+widely+distributed+biological+circuits+with+single+cell+resolution+via+tissue+clearing+and+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors.</a> Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).</li>
<li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Principles+in+Tissue+Clearing+and+Staining+Protocols+for+Whole-Body+Cell+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).</li>
<li>Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENSAT+BAC+cre-recombinase+driver+lines+to+study+the+functional+organization+of+cerebral+cortical+and+basal+ganglia+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits.</a> Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Kim, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li>
<li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+scalable+proteomic+imaging+for+high-dimensional+profiling+of+intact+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li>
<li>Ke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+mapping+of+neuronal+circuitry+with+an+index-optimized+clearing+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent.</a> Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).</li>
<li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACT-PRESTO%3A+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+%283D%29+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Scientific Reports. 6, 18631(2016).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li>
<li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li>
<li>Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex%2C+quantitative+cellular+analysis+in+large+tissue+volumes+with+clearing-enhanced+3D+microscopy+%28Ce3D%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).</li>
<li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+%28SDS%29-based+tissue+clearing+%28FASTClear%29%3A+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+three-dimensional+visualization+of+human+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiliśmy procedury uzyskiwania wielkoskalowych trójwymiarowych obrazów specyficznej dla typu komórki organizacji głównych typów komórek w warstwie 5 kory nowej myszy. W porównaniu z konwencjonalnym barwieniem plastrów, metoda ta jest bardziej przydatna w określaniu trójwymiarowej organizacji kory nowej. Metoda ta umożliwia pozyskiwanie obrazu z szerszych i głębszych obszarów mózgu w porównaniu z typową mikroskopią 2-fotonową in vivo lub konwencjonalną mikroskopią konfokalną, a tym samym może pozwolić na k...

Kora nowa ssaków składa się z dużej liczby typów komórek, z których każda ma specyficzne wzorce ekspresji genów, właściwości elektrofizjologiczne i biochemiczne, połączenia synaptyczne i funkcje in vivo1,2,3,4,5,6,7. Nie jest jasne, czy te typy komórek są zorganizowane w powtarzające się struktury. Kolumny korowe, w tym kolumny orientacji wzrokowej i beczki somatosensoryczne, mają powtarzające się struktury, ale ich organizacja komórkowa pozostaje niejasna8,9. Są one obecne w określonych obszarach kory mózgowej i nie są systemem obejmującym cały mózg.
W warstwie 5 kory nowej, zdecydowana większość neuronów jest podzielona na cztery główne typy. Główny typ neuronów pobudzających, neurony projekcyjne podmózgowe, rzutuje aksony na cele podkorowe, w tym most, rdzeń kręgowy i wzgórek górny, a zatem reprezentuje główną korową ścieżkę wyjściową10. Neurony projekcyjne kory, inny główny typ neuronów pobudzających, unerwiają korę10. Neurony hamujące zawierają również dwie główne klasy: komórki wyrażające parwalbuminę i komórki wyrażające somatostatynę11.
Ostatnie analizy wskazują, że cztery typy komórek są zorganizowane w powtarzające się struktury12,13,14. Zarówno neurony projekcyjne podmózgowe12,13,14 i neurony projekcyjne kory mózgowej14 organizują się w mikrokolumny specyficzne dla typu komórki o średnicy 1–2 komórek. Komórki wyrażające parwalbuminę i somatostatynę wyrównują się specyficznie z mikrokolumnami neuronów projekcyjnych podmózgowych, ale nie z mikrokolumnami neuronów projekcyjnych kory mózgowej14. Same mikrokolumny okresowo wyrównują się, tworząc sześciokątną siatkową tablicę14 i są obecne w wielu obszarach korowych, w tym wzrokowych, somatosensorycznych i motorycznych w mózgu myszy12,14 oraz w obszarach językowych ludzkiego mózgu13. Neurony w pojedynczej mikrokolumnie wykazują zsynchronizowaną aktywność i mają podobne reakcje sensoryczne14. Obserwacje te wskazują, że typy komórek warstwy 5 organizują się w strukturę siatki mikrokolumnowej, reprezentującą pierwszą znaną organizację powtarzających się modułów funkcjonalnych w całym mózgu.
Mikrokolumny mają promień około 10 μm i okresowość przestrzenną około 40 μm. Ponadto orientacja mikrokolumn jest równoległa do ich dendrytów wierzchołkowych i zmienia się w zależności od ich położenia w korze mózgowej14. W związku z tym układ mikrokolumn jest trudny do analizy przy użyciu konwencjonalnych wycinków korowych o typowej grubości kilkudziesięciu mikrometrów. Ponadto analiza okresowości wymaga trójwymiarowych danych z szerokiego zakresu obszarów mózgu, a zatem typowy obszar obrazowania mikroskopii konfokalnej lub obrazowania 2-fotonowego in vivo jest zbyt wąski.
Ostatnio opracowano techniki usuwania grubych tkanek15,16. W tym miejscu opisujemy zastosowanie tych metod do uzyskania wielkoskalowych, trójwymiarowych obrazów głównych typów komórek w warstwie 5 kory nowej myszy, które składają się na system mikrokolumn. Podmózgowe neurony projekcyjne są znakowane przez etykietowanie wsteczne lub przez ekspresję wzmocnionego białka zielonej fluorescencji u myszy transgenicznych Crym-egfp12, a neurony projekcyjne kory są znakowane albo przez etykietowanie wsteczne, albo przez ekspresję tdTomato u myszy Tlx3-cre / Ai9<sup class="xref">17. Komórki wyrażające parwalbuminę i somatostatynę są znakowane przez immunohistochemię. Metoda AbScale (Antibody Scale S) 18 jest używana do eksperymentów z barwieniem przeciwciał, podczas gdy metoda (See Deep Brain) SeeDB19 jest używana do innych eksperymentów. Metody te przezwyciężają wyżej wymienione trudności konwencjonalnych metod obrazowania i ujawniają dokładną organizację komórkową warstwy 514.

<table><tbody><tr><td>Myszy transgeniczne Crym-egfp</td><td>MMRRC</td><td>012003-UCD</td><td></td></tr><tr><td>Tlx3-cre myszy transgeniczne</td><td>MMRRC</td><td>36547-UCD</td><td></td></tr><tr><td>ROSA-CAG-flox-tdMyszy pomidorowe</td><td>Jackson Laboratory</td><td>JAX #7909</td><td></td></tr><tr><td>Arkusz gumy silikonowej</td><td>AS ONE</td><td>6-611-01</td><td>o grubości 0,5 mm</td></tr><tr><td>Arkusz gumy silikonowej</td><td>AS ONE</td><td>6-611-02</td><td>o grubości 1,0 mm</td></tr><tr><td>Arkusz kauczuku silikonowego</td><td>AS ONE</td><td>6-611-05</td><td>o grubości 3,0 mm</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Falcon</td><td>351008</td> Szkło nakrywkowe Matsunami C022241 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toksyna podjednostka B (rekombinowana), koniugat Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>C22841</td><td></td></tr><tr><td>Toksyna podjednostka B (rekombinowana), Alexa Fluor 555 koniugat</td><td>Invitrogen</td><td>C22843</td><td></td></tr><tr><td>Toksyna podjednostka B (rekombinowana), Alexa Fluor 594 koniugat</td><td>Invitrogen</td><td>C22842</td><td></td></tr><tr><td>Podjednostka B toksyny (rekombinowana), Alexa Fluor 647 koniugat</td><td>Invitrogen</td><td>C34778</td><td></td></tr><tr><td>26 G Strzykawka Hamilton</td><td></td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>Pompa wtryskowa</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 310</td><td>Pons wtrysk</td></tr><tr><td>Pompa wtryskowa</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 100</td><td>Superior manipulator do wstrzykiwań colliculus</td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td>Somnopentyl</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>AstraZeneca</td><td>Xylocaine iniekcja 1% z epinefryną</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło</td><td>Toyo Associates</td><td>HP-200</td><td></td></tr><tr><td>Avitene microfibrillar hemostat</td><td>Davol Inc</td><td>1010090</td><td></td></tr><tr><td>Alonalfa</td><td>Daiichi-Sankyo</td><td>Alonalpha A</td><td></td></tr><tr><td>Jedwab chirurgiczny</td><td>Inkubator Ethicon</td><td>K881H</td><td></td></tr><tr><td></td><td>UVP</td><td>HB-1000 Hybrydyzator</td><td></td></tr><tr><td>Szklana pipeta</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>2-000-075</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz elektrod</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Parafina w płynie, lekka</td><td>Nacalai tesque</td><td>26132-35</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Otsuka</td><td>1326</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Nacalai tesque</td><td>26126-54</td><td></td></tr><tr><td>Igła wolframowa</td><td>Inter medical</td><td>&Phi; 0,1 * L200 mm</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>50 ml plastikowa rurka</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-tioglicerol</td><td>Nacalai tesque</td><td>33709-62</td><td></td></tr><tr><td>D(-) Fruktoza</td><td>Nacalai tesque</td><td>16315-55</td><td></td></tr><tr><td>BluTack</td><td>Bostik</td><td>CKBT-450000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop dwufotonowy</td><td>Nikon</td><td>A1RMP</td><td></td></tr><tr><td>Zanurzenie w wodzie Obiektywy o dużym zasięgu roboczym</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>Zanurzone w wodzie obiektywy o dużej odległości roboczej</td><td>Nikon</td><td>CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm</td><td></td></tr><tr><td>Stopień z napędem</td><td>COMS</td><td>PT100C-50XY</td><td></td></tr><tr><td>Filtr</td><td>Semrock</td><td>FF01-492/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>Filtr</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr><tr><td>Filtr</td><td>Semrock</td><td>FF03-575/25-25</td><td></td></tr><tr><td>Filtr</td><td>Semrock</td><td>FF01-629/56</td><td></td></tr><tr><td>Filtr</td><td>Chroma</td><td>D605/55m</td><td></td></tr><tr><td>5 mL plastikowa tubka</td><td>AS ONE</td><td>VIO-5B</td><td></td></tr><tr><td>2 mL plastikowa tubka</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>0030120094</tr><tr><td>Mocznik</td><td>Nacalai tesque</td><td>35905-35</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Glyserol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>191612</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-sorbitol</td><td>Wako</td><td>191-14735</td><td></td></tr><tr><td>Metylo-&beta;-cyklodekstryna</td><td>Tokio przemysł chemiczny</td><td>M1356</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;- Cyklodekstryna</td><td>Wako</td><td>037-10643</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylo-L-hydroksyprolina</td><td>Skin Essential Actives</td><td>33996-33-7</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Nacalai tesque</td><td>13445-45</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 (1,1 g / mL)</td> <td>Nacalai tesque</td><td>35624-15</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG (H + L) Adsorbowana krzyżowo wtórna Przeciwciało, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (H + L), Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) wysoce adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe anty-królikowe IgG (H+L) o wysokim stopniu adsorbcji krzyżowej, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Zanurzenie w wodzie Obiektywy o dużej odległości roboczej</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>ABN78</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CTIP2</td><td>Abcam</td><td>ab18465</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Statb2</td><td>Abcam</td><td>ab51502</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAD67</td><td>Millipore</td><td>MAB5406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GABA</td><td>Sigma</td><td>A2052</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Swant</td><td>235</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Frontier Institute</td><td>PV-Go-Af460</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Parwalbumina</td><td>Sigma</td><td>P3088</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Parwalbumina</td><td>Abcam</td><td>ab11427</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoria Półwyspu</td><td>Anty-Somatostatynowego</td><td>T-4103</td><td></td></tr><tr><td>Anti-c-Fos</td><td>CalbioChem</td><td>PC38</td><td></td></tr></tbody></table>

wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Kora nowa ssaków składa się z wielu typów neuronów pobudzających i hamujących, z których każdy ma specyficzne właściwości elektrofizjologiczne i biochemiczne, połączenia synaptyczne i funkcje in vivo, ale ich podstawowa funkcjonalna i anatomiczna organizacja od skali komórkowej do sieciowej jest słabo poznana. Tutaj opisujemy metodę trójwymiarowego obrazowania neuronów znakowanych fluorescencyjnie na dużych obszarach mózgu w celu zbadania organizacji komórkowej kory mózgowej. Określone typy neuronów są znakowane przez wstrzyknięcie fluorescencyjnych wstecznych znaczników neuronalnych lub ekspresję białek fluorescencyjnych u myszy transgenicznych. Blokowe próbki mózgu, np. półkuli, są przygotowywane po utrwaleniu, stają się przezroczyste za pomocą metod oczyszczania tkanek i poddawane fluorescencyjnemu znakowaniu immunologicznemu określonych typów komórek. Duże obszary są skanowane za pomocą mikroskopów konfokalnych lub dwufotonowych wyposażonych w obiektywy o dużej odległości roboczej i zmotoryzowane stoliki. Ta metoda może rozwiązać okresową organizację modułów funkcjonalnych mikrokolumn specyficznych dla typu komórki w korze nowej myszy. Procedura może być przydatna do badania trójwymiarowej architektury komórkowej w różnych obszarach mózgu i innych złożonych tkankach.

Neurony projekcyjne kory oznakowaliśmy poprzez ekspresję tdTomato w transgenicznych myszach Tlx3-cre/Ai9, natomiast neurony projekcyjne podmózgowiowe zwizualizowano poprzez wstrzyknięcie retrogradnego znacznika CTB48 do mostu. Lewą półkulę mózgu poddano metodzie SeeDB i zeskanowano za pomocą mikroskopu dwufotonowego wyposażonego w obiektyw z zanurzeniem w wodzie o długim dystansie roboczym (25X, N.A. 1.1, dystans roboczy 2 mm) oraz zmotoryzowany stolik. Uzyskano stos 401...

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak analiza struktury i funkcji kory nowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona ujawnić wielkoskalową trójwymiarową strukturę mózgu. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w korę nową, może być również stosowana do innych układów nerwowych, takich jak rdzeń kręgowy.Aby wstrzyknąć znacznik do mostu dorosłych myszy, najpierw pobierz jeden mikrolitr znakowanej fluorescencyjnie podjednostki B toksyny do strzykawki Hamiltona o rozmiarze 26. Umieść pompę wtryskową na strzykawce, a następnie umieść strzykawkę i pompę na uchwycie narzędziowym manipulatora na instrumencie stereotaktycznym. Przechyl manipulator o 12 stopni do tyłu od osi pionowej.Następnie umieść mysz na instrumencie stereotaktycznym. Za pomocą żyletki usuń włosy, aby zapobiec infekcji. Następnie odetnij 10 milimetrów skóry głowy, tak aby bregma i lambda były widoczne.Podawać 0,1 mililitra 1% lidokainy za pomocą pipety. Ustaw kąt nachylenia główki, regulując pionową pozycję ustnika na instrumencie stereotaktycznym tak, aby bregma i lambda miały ten sam poziom Z. Następnie wyreguluj położenie manipulatora, wsuwając go na instrument stereotaktyczny tak, aby końcówka strzykawki znajdowała się blisko bregmy.Zapisz pozycję manipulatora. Wycofać strzykawkę, przesuwając uchwyt narzędziowy na manipulatorze. Następnie przesuń manipulator o 5,4 milimetra do tyłu i 0,4 milimetra na boki.Przesunąć strzykawkę tak, aby końcówka znalazła się blisko punktu wejścia na czaszce, a następnie wycofać strzykawkę i zaznaczyć punkt wejścia. W zaznaczonym miejscu wywierć otwór o średnicy około jednego milimetra. Włożyć końcówkę strzykawki przez otwór tak, aby głębokość końcówki była o 6,9 milimetra większa niż zmierzona na bregmie.Następnie wstrzyknąć jeden mikrolitr znaczników za pomocą pompy w tempie 0,2 mikrolitra na minutę. Po wstrzyknięciu należy wyjąć strzykawkę z mózgu. W razie potrzeby przykryj odsłonięty mózg małymi fragmentami hemostatu mikrofibrylarnego i klejem błyskawicznym.Przetrzyj odsłonięty mózg solą fizjologiczną, aby zapobiec infekcji i zszyj skórę głowy. Następnie wyjmij mysz z instrumentu stereotaktycznego. Pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu w inkubatorze w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez około godzinę.Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Przywróć mysz do towarzystwa innych zwierząt po jej całkowitym wyzdrowieniu. Aby zebrać tkankę mózgową, przetnij skórę głowy za pomocą nożyczek, aby odsłonić czaszkę.Następnie przetnij linię środkową odsłoniętej czaszki za pomocą nożyczek. Następnie usuń czaszkę za pomocą kleszczy. Jeśli konieczne jest oznaczenie pozycji bregmy i lambdy, najpierw usuń jedną stronę czaszki.Następnie wbij cienkie igły wolframowe do mózgu w miejscach bregmy i lambdy, a następnie usuń pozostałą czaszkę. Następnie umieść próbkę mózgu na platformie wibratomowej. Pokrój odcinki o grubości do 500 mikrometrów w PBS w temperaturze pokojowej.W tej procedurze przenieś plastry do pięciomililitrowej plastikowej rurki zawierającej cztery mililitry roztworu Scale S0. Następnie inkubuj je przez 12 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 12 godzinach wyjmij roztwór z probówki za pomocą pipety i dodaj cztery mililitry roztworu skali A2.Inkubuj plastry przez 36 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 36 godzinach wyjmij roztwór z probówki i dodaj cztery mililitry roztworu Scale B4. Inkubuj plastry przez 24 godziny, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po 24 godzinach wyjmij roztwór z probówki i dodaj cztery mililitry roztworu skali A2. Inkubuj plastry przez 12 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 12 godzinach wyjmij roztwór z probówki i dodaj cztery mililitry PBS.Inkubuj plastry przez sześć godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie wyjmij plastry do dwumililitrowej plastikowej tuby. Inkubuj je z przeciwciałem pierwszorzędowym w jednym mililitrze roztworu AB Scale przez 48 do 72 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając.Następnie ostrożnie wyjmij plastry do pięciomililitrowej plastikowej tuby. Inkubuj je w czterech mililitrach roztworu AB Scale przez dwie godziny, dwa razy w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Następnie ostrożnie wyjmij plastry do dwumililitrowej plastikowej tuby.Inkubować z fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym w jednym mililitrze roztworu AB Scale przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając. Ostrożnie wyjmij plastry do pięciomililitrowej plastikowej probówki zawierającej cztery mililitry roztworu przeciwciała Scale i inkubuj plastry przez sześć godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór i dodaj cztery mililitry roztworu AB Scale i inkubuj plastry przez dwie godziny dwa razy, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.Następnie usuń roztwór i dodaj cztery mililitry 4% PFA i inkubuj plastry przez godzinę, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. Następnie usuń roztwór i dodaj cztery mililitry PBS i inkubuj plastry przez godzinę, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór i dodaj cztery mililitry roztworu Scale S4 i inkubuj plastry przez 12 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie umieść przekładkę na szklanym szkiełku podstawowym i umieść plastry w ramce dystansowej, a następnie zanurz plastry w roztworze Scale S4. Uszczelnij przekładkę szkłem nakrywkowym. Nałóż trochę wody na szkło nakrywkowe i zobrazuj plastry za pomocą mikroskopii konfokalnej lub dwufotonowej z obiektywem do pracy na duże odległości zanurzonym w wodzie.W tym badaniu neurony projekcyjne kory zostały oznaczone na zielono przez ekspresję tdTomato u transgenicznych myszy Tlx3-cre AI9, a neurony projekcyjne podmózgowe w kolorze magenta zostały uwidocznione przez wstrzyknięcie wstecznego znacznika CTB488 do mostu w wieku siedmiu tygodni. Jest to widok z góry, aby pokazać przybliżone położenie obszarów kory mózgowej. Oto ukośne widoki fluorescencji CTB488 pokazujące neurony projekcyjne podmózgowe i fluorescencja tdTomato pokazujące neurony projekcyjne kory mózgowej i jest to połączony obraz.Ciała komórkowe obu typów komórek były widoczne w szerokim zakresie obszarów mózgu, a przekroje optyczne wykazywały okresowe mikrokolumny. Ten obraz pokazuje ciała komórkowe i dendryty wierzchołkowe neuronów projekcyjnych podmózgowych eksprymujących eGFP w sekcji optycznej myszy Crym-eGFP, a ten obraz pokazuje komórki wyrażające parwalbuminę oznaczone na zielono i neurony projekcyjne podmózgowe oznaczone w kolorze magenta przez wstrzyknięcie CTB488 do mostu myszy C57 Black 6 metodą skali przeciwciał. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak przetwarzanie obrazu 3D, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ilościowa charakterystyka organizacji mózgowej.Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią kory mózgowej do zbadania nowej organizacji modułowej w mózgu myszy.

large-scale-three-dimensional-imaging-cellular-organization-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wprowadzenie prawokątnych mikropryzmatów do nowokory mózgu myszy umożliwia głębokie obrazowanie wielu warstw kory z perspektywy typowej dla preparatów przekrojowych. Mikropryzmaty o rozmiarze jednego milimetra zapewniają szerokie pole widzenia (~900 μm) oraz rozdzielczość przestrzenną wystarczającą do zobrazowania kolców dendrytycznych. Prezentujemy obrazowanie neuronów warstwy V oraz obrazowanie naczyń krwionośnych nowokory z wykorzystaniem mikropryzmatów.

Obrazowanie in vivo głębokich warstw kory mózgowej z wykorzystaniem mikropryzmatu

W tym filmie i materiałach uzupełniających przedstawiamy protokół przewlekłego obrazowania in vivo nienaruszonego mózgu z wykorzystaniem preparacji z cienkiej czaszki.

Przewlekłe obrazowanie kory wzrokowej myszy z wykorzystaniem preparatu z pocienioną czaszką

Mikroskopia wielofotonowa całych organów myszy jest możliwa dzięki optycznemu klarowaniu organu przed obrazowaniem, jednak nie wszystkie protokoły zachowują sygnał fluorescencyjny białek fluorescencyjnych. Stosując metodę klarowania optycznego z dehydratacją opartą na etanolu oraz klarowaniem za pomocą mieszaniny alkoholu benzylowego i benzojanu benzylowego, prezentujemy wysokorozdzielcze obrazy wielofotonowe całego mózgu myszy wykazującego ekspresję YFP.

Mikroskopia wielofotonowa oczyszczonego mózgu mysiego z ekspresją YFP

Opisujemy protokół obrazowania wideo w czasie rzeczywistym migracji neuronów w przedmózgowiu myszy. Migrację prekursorów neuronalnych oznakowanych wirusowo lub przeszczepionych rejestrowano w ostrych żywych skrawkach, wykorzystując szerokopolowe obrazowanie fluorescencyjne z relatywnie krótkim odstępem między akwizycjami, aby zbadać różne fazy migracji komórek, w tym czas trwania fazy stacjonarnej i migracyjnej oraz prędkość migracji.

Obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w ostrych skrawkach przedmózgowia dorosłej myszy

W tym artykule opisujemy pełną procedurę eksperymentalną mającą na celu zrekonstrukcję, z wysoką rozdzielczością, anatomii mózgu fluorescencyjnie znakowanych myszy. Opisany protokół obejmuje przygotowanie i oczyszczanie próbki, montaż próbki do obrazowania, przetwarzanie końcowe danych oraz wizualizację wieloskalową.

Tomografia optyczna całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową z konfokalną mikroskopią arkuszową światła

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Używając wielu kątów do cięcia mózgu szczeniaka myszy, ulepszamy poprzednio opisany ostry wycinek mózgu, który rejestruje połączenia między większością głównych struktur słuchowych śródmózgowia i przodomózgowia.

Modyfikacja kolikulo-wzgórzowo-korowego wycinka mózgu myszy, obejmująca drukowanie 3D elementów komory i wieloskalowe obrazowanie optyczne

Tutaj prezentujemy procedurę wykonywania wielkoskalowego obrazowania Ca2+ z rozdzielczością komórkową w wielu warstwach kory mózgowej u swobodnie poruszających się myszy. Setki aktywnych komórek można obserwować jednocześnie za pomocą miniaturowego mikroskopu montowanego na głowie w połączeniu z wszczepioną sondą pryzmatyczną.

Wielowarstwowe obrazowanie kory Ca2+ u swobodnie poruszających się myszy z sondami pryzmatycznymi i zminiaturyzowaną mikroskopią fluorescencyjną

Ten protokół opisuje metody przeprowadzania rezonansu magnetycznego, oczyszczania i znakowania immunologicznego nienaruszonych mózgów myszy za pomocą iDISCO+, a następnie szczegółowy opis obrazowania za pomocą mikroskopii świetlnej i dalszych analiz za pomocą NuMorph.

Obrazowanie i analiza pojedynczych komórek całego mózgu nienaruszonych mózgów noworodków myszy za pomocą rezonansu magnetycznego, oczyszczania tkanek i mikroskopii świetlnej

To badanie opisuje etapy uzyskiwania obrazów mózgów noworodków myszy w wysokiej rozdzielczości poprzez połączenie mikrotomografii komputerowej (mikro-CT) i środka kontrastowego w próbkach ex vivo. Opisujemy podstawowe analizy morfometryczne w celu ilościowego określenia wielkości i kształtu mózgu na tych obrazach.

Obrazowanie mikro-CT i analiza morfometryczna mózgów noworodków myszy

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę trójwymiarowego obrazowania organizacji komórkowej w korze nowej myszy. Technika ta umożliwia wizualizację struktur neuronalnych i może być zastosowana w badaniach nad układem nerwowym.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Przeglądaj więcej filmów