Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy
5 września 2018
Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak analiza struktury i funkcji kory nowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona ujawnić wielkoskalową trójwymiarową strukturę mózgu. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w korę nową, może być również stosowana do innych układów nerwowych, takich jak rdzeń kręgowy.
Aby wstrzyknąć znacznik do mostu dorosłych myszy, najpierw pobierz jeden mikrolitr znakowanej fluorescencyjnie podjednostki B toksyny do strzykawki Hamiltona o rozmiarze 26. Umieść pompę wtryskową na strzykawce, a następnie umieść strzykawkę i pompę na uchwycie narzędziowym manipulatora na instrumencie stereotaktycznym. Przechyl manipulator o 12 stopni do tyłu od osi pionowej.
Następnie umieść mysz na instrumencie stereotaktycznym. Za pomocą żyletki usuń włosy, aby zapobiec infekcji. Następnie odetnij 10 milimetrów skóry głowy, tak aby bregma i lambda były widoczne.
Podawać 0,1 mililitra 1% lidokainy za pomocą pipety. Ustaw kąt nachylenia główki, regulując pionową pozycję ustnika na instrumencie stereotaktycznym tak, aby bregma i lambda miały ten sam poziom Z. Następnie wyreguluj położenie manipulatora, wsuwając go na instrument stereotaktyczny tak, aby końcówka strzykawki znajdowała się blisko bregmy.
Zapisz pozycję manipulatora. Wycofać strzykawkę, przesuwając uchwyt narzędziowy na manipulatorze. Następnie przesuń manipulator o 5,4 milimetra do tyłu i 0,4 milimetra na boki.
Przesunąć strzykawkę tak, aby końcówka znalazła się blisko punktu wejścia na czaszce, a następnie wycofać strzykawkę i zaznaczyć punkt wejścia. W zaznaczonym miejscu wywierć otwór o średnicy około jednego milimetra. Włożyć końcówkę strzykawki przez otwór tak, aby głębokość końcówki była o 6,9 milimetra większa niż zmierzona na bregmie.
Następnie wstrzyknąć jeden mikrolitr znaczników za pomocą pompy w tempie 0,2 mikrolitra na minutę. Po wstrzyknięciu należy wyjąć strzykawkę z mózgu. W razie potrzeby przykryj odsłonięty mózg małymi fragmentami hemostatu mikrofibrylarnego i klejem błyskawicznym.
Przetrzyj odsłonięty mózg solą fizjologiczną, aby zapobiec infekcji i zszyj skórę głowy. Następnie wyjmij mysz z instrumentu stereotaktycznego. Pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu w inkubatorze w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez około godzinę.
Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Przywróć mysz do towarzystwa innych zwierząt po jej całkowitym wyzdrowieniu. Aby zebrać tkankę mózgową, przetnij skórę głowy za pomocą nożyczek, aby odsłonić czaszkę.
Następnie przetnij linię środkową odsłoniętej czaszki za pomocą nożyczek. Następnie usuń czaszkę za pomocą kleszczy. Jeśli konieczne jest oznaczenie pozycji bregmy i lambdy, najpierw usuń jedną stronę czaszki.
Następnie wbij cienkie igły wolframowe do mózgu w miejscach bregmy i lambdy, a następnie usuń pozostałą czaszkę. Następnie umieść próbkę mózgu na platformie wibratomowej. Pokrój odcinki o grubości do 500 mikrometrów w PBS w temperaturze pokojowej.
W tej procedurze przenieś plastry do pięciomililitrowej plastikowej rurki zawierającej cztery mililitry roztworu Scale S0. Następnie inkubuj je przez 12 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 12 godzinach wyjmij roztwór z probówki za pomocą pipety i dodaj cztery mililitry roztworu skali A2.
Inkubuj plastry przez 36 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 36 godzinach wyjmij roztwór z probówki i dodaj cztery mililitry roztworu Scale B4. Inkubuj plastry przez 24 godziny, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po 24 godzinach wyjmij roztwór z probówki i dodaj cztery mililitry roztworu skali A2. Inkubuj plastry przez 12 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 12 godzinach wyjmij roztwór z probówki i dodaj cztery mililitry PBS.
Inkubuj plastry przez sześć godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie wyjmij plastry do dwumililitrowej plastikowej tuby. Inkubuj je z przeciwciałem pierwszorzędowym w jednym mililitrze roztworu AB Scale przez 48 do 72 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając.
Następnie ostrożnie wyjmij plastry do pięciomililitrowej plastikowej tuby. Inkubuj je w czterech mililitrach roztworu AB Scale przez dwie godziny, dwa razy w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Następnie ostrożnie wyjmij plastry do dwumililitrowej plastikowej tuby.
Inkubować z fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym w jednym mililitrze roztworu AB Scale przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając. Ostrożnie wyjmij plastry do pięciomililitrowej plastikowej probówki zawierającej cztery mililitry roztworu przeciwciała Scale i inkubuj plastry przez sześć godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór i dodaj cztery mililitry roztworu AB Scale i inkubuj plastry przez dwie godziny dwa razy, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
Następnie usuń roztwór i dodaj cztery mililitry 4% PFA i inkubuj plastry przez godzinę, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. Następnie usuń roztwór i dodaj cztery mililitry PBS i inkubuj plastry przez godzinę, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór i dodaj cztery mililitry roztworu Scale S4 i inkubuj plastry przez 12 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie umieść przekładkę na szklanym szkiełku podstawowym i umieść plastry w ramce dystansowej, a następnie zanurz plastry w roztworze Scale S4. Uszczelnij przekładkę szkłem nakrywkowym. Nałóż trochę wody na szkło nakrywkowe i zobrazuj plastry za pomocą mikroskopii konfokalnej lub dwufotonowej z obiektywem do pracy na duże odległości zanurzonym w wodzie.
W tym badaniu neurony projekcyjne kory zostały oznaczone na zielono przez ekspresję tdTomato u transgenicznych myszy Tlx3-cre AI9, a neurony projekcyjne podmózgowe w kolorze magenta zostały uwidocznione przez wstrzyknięcie wstecznego znacznika CTB488 do mostu w wieku siedmiu tygodni. Jest to widok z góry, aby pokazać przybliżone położenie obszarów kory mózgowej. Oto ukośne widoki fluorescencji CTB488 pokazujące neurony projekcyjne podmózgowe i fluorescencja tdTomato pokazujące neurony projekcyjne kory mózgowej i jest to połączony obraz.
Ciała komórkowe obu typów komórek były widoczne w szerokim zakresie obszarów mózgu, a przekroje optyczne wykazywały okresowe mikrokolumny. Ten obraz pokazuje ciała komórkowe i dendryty wierzchołkowe neuronów projekcyjnych podmózgowych eksprymujących eGFP w sekcji optycznej myszy Crym-eGFP, a ten obraz pokazuje komórki wyrażające parwalbuminę oznaczone na zielono i neurony projekcyjne podmózgowe oznaczone w kolorze magenta przez wstrzyknięcie CTB488 do mostu myszy C57 Black 6 metodą skali przeciwciał. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak przetwarzanie obrazu 3D, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ilościowa charakterystyka organizacji mózgowej.
Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią kory mózgowej do zbadania nowej organizacji modułowej w mózgu myszy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia szczegółowy protokół przejaśniania tkanek, znakowania fluorescencyjnego oraz obrazowania wielkoskalowego tkanki mózgu myszy. Metodyka ta umożliwia badaczom wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w neokorze, dostarczając cennych informacji na temat jej struktury i funkcji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Obrazowanie tkanek
- Znakowanie fluorescencyjne
Wprowadzenie
- Struktura i funkcja neocortex mają fundamentalne znaczenie w neuronauce.
- Zrozumienie organizacji komórkowej może pomóc w rozwiązaniu kluczowych pytań badawczych.
- Technikę tę można rozszerzyć na inne obszary układu nerwowego, takie jak rdzeń kręgowy.
Cel badania
- Opracowanie metodologii usprawniającej wizualizację struktur mózgu.
- Zbadanie organizacji typów komórek w obrębie neocortex.
- Stworzenie ram badawczych możliwych do zastosowania w szerszym zakresie studiów nad układem nerwowym.
Zastosowane metody
- Obrazowanie wielkoskalowe z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej lub dwufotonowej.
- Wykorzystany model obejmuje dorosłe myszy oraz konkretne obszary mózgu, takie jak most.
- Protokół szczegółowo opisuje etapy procedury wstrzykiwania markerów oraz przygotowania tkanki.
- Kluczowymi etapami były inkubacja w roztworach takich jak Scale S0, A2, B4 oraz zastosowanie przeciwciał fluorescencyjnych.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na uwidocznienie wielkoskalowych struktur trójwymiarowych w tkance mózgu myszy.
- Osiągnięto specyficzne znakowanie neuronów projekcyjnych kory oraz innych typów komórek.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia solidną metodę wizualizacji organizacji neuronalnej.
- Wyniki znacząco przyczyniają się do zrozumienia struktury i funkcji nowokory.
- Metodykę tę można dostosować do różnorodnych zastosowań w badaniach neurobiologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Zrozumienie trójwymiarowej architektury komórkowej złożonych tkanek, takich jak neocortex, wspomaga walidację celów terapeutycznych poprzez ujawnienie rozdzielcze przestrzennie organizacji podtypów neuronów. Ta wiedza mechanistyczna umożliwia zmniejszenie ryzyka związanych z hipotezami terapeutycznymi dzięki bezpośredniej wizualizacji zaangażowania celu oraz organizacji na poziomie sieci w systemach istotnych dla danej choroby. Metoda ta zapewnia pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych poprzez powiązanie organizacji anatomicznej z odczytami funkcjonalnymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez mapowanie specyficznej dla typu komórek organizacji mikrokolumn w neocortex.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez bezpośrednią wizualizację podtypów neuronów i ich relacji przestrzennych.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność w wyborze celu terapeutycznego poprzez rozdzielenie okresowych modułów funkcjonalnych istotnych dla efektów działania leków na poziomie sieci.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje walidowane systemy biologiczne do standaryzacji dalszych analiz poprzez zachowanie trójwymiarowej architektury tkanki.
- Wartość operacyjna: Umożliwia powtarzalne procesy obrazowania dzięki standaryzowanym protokołom utrudniania i znakowania tkanek.
- Skalowalność: Ułatwia ponowne wykorzystanie platformy w różnych obszarach mózgu i złożonych tkankach dzięki zastosowaniu skanowania za pomocą zmotoryzowanego stołu oraz obiektywów o dużej odległości roboczej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy spostrzeżenia dotyczące organizacji na etapie odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez modelowanie systemów istotnych dla danej choroby.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju dostosowane do poziomu ryzyka poprzez wizualizację angażowania celu w rozproszonych sieciach neuronalnych.
- Korelacja z biomarkerami: Umożliwia korelację fenotypów strukturalnych z wynikami funkcjonalnymi w celu opracowania translacyjnych biomarkerów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania – od testowania hipotez dotyczących celu, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną – dostarczając ilościowe dane anatomiczne o wysokiej rozdzielczości przestrzennej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez rozstrzyganie organizacji specyficznej dla danego typu komórek w nienaruszonych tkankach.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki powtarzalnemu przygotowaniu tkanek i ilościowym odczytom fluorescencji.
- Analityka: Umożliwia analizę porównawczą za pomocą obrazowania trójwymiarowego i liczenia komórek w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez zachowanie architektury tkanek istotnej dla przebiegu choroby w badaniach podłużnych.
- Zastosowania wielokrotne: Służy jako wielokrotnego użytku platforma obrazowania, którą można zastosować w wielu obszarach mózgu i złożonych tkankach poza nowokorą.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez bezpośrednią wizualizację organizacji neuronalnej i periodyczności mikrokolumn.
- Wartość operacyjna: Gwarantuje standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanym procesom przejrzyszczania tkanki, znakowania i obrazowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w złożonych systemach tkankowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez powiązanie fenotypów anatomicznych z wynikami funkcjonalnymi w modelach chorób.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu neuronauki, preparatyki tkanek oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Zależność od dostępu do mikroskopów konfokalnych lub dwufotonowych z obiektywami o dużej odległości roboczej i zmotoryzowanymi stolikami.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie przejaśniania tkanek, znakowania przeciwciałami oraz protokołów obrazowania.
- Konieczność rozważenia adaptacji metody podczas stosowania jej w różnych systemach modelowych, takich jak rdzeń kręgowy lub substytuty tkanek ludzkich.
- Ograniczenie ze względu na rozmiar tkanki i głębokość penetracji optycznej, co może ograniczać obrazowanie całych próbek mózgu bez konieczności ich sekcjonowania.
