Izolacja i charakterystyka cytometryczna mysich limfocytów jelita cienkiego

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie pojedynczych populacji komórek z różnych przedziałów jelita cienkiego, które można następnie wykorzystać do analizy cytometrii przepływowej lub alternatywnego sposobu charakteryzacji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w immunologii błony śluzowej, takie jak wpływ mikrobioty na rozwój jelitowego układu odpornościowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że są szybkie, powtarzalne i nie wymagają pracochłonnych gradientów perkolowych.

Aby rozpocząć tę procedurę, połóż mysz grzbietowo do dołu i spryskaj brzuch 70 procentami etanolu, wykonaj laparotomię, sekwencyjnie przecinając skórę, a następnie powięź otrzewnową wzdłuż brzusznej linii środkowej od spojenia łonowego do wyrostka mieczykowatego, odsłaniając w ten sposób jamę otrzewnej. Następnie oddziel jelito cienkie od żołądka, przecinając zwieracz odźwiernika. Delikatnie wyjmij jelito cienkie z otrzewnej i zetrzyj tłuszcz krezkowy.

Aby całkowicie usunąć jelito cienkie, wykonaj drugie nacięcie na skrzyżowaniu krętniczo-kątniczym. Umieść wyizolowane jelito cienkie w pożywce RPMI o temperaturze czterech stopni Celsjusza zawierającej 10 procent FBS, aby zmaksymalizować żywotność komórek. Delikatnie usuń duże kawałki tłuszczu za pomocą zakrzywionych kleszczy i zachowaj ostrożność, aby uniknąć rozerwania samej tkanki jelitowej podczas tego procesu.

Aby usunąć zawartość jelita, należy kanniulować proksymalny koniec jelita cienkiego za pomocą igły do karmienia o rozmiarze 18 przymocowanej do strzykawki i delikatnie przepłukać jelito 15 do 20 mililitrami zimnego PBS. Użyj nożyczek, aby wyciąć plastry Peyera, które znajdują się po stronie antykrezkowej jelita cienkiego i pojawiają się jako wielopłatkowa biała masa. Następnie umieść je na zimnym podłożu RPMI zawierającym pięć procent FBS.

Następnie pokrój jelito cienkie na trzy-czterocalowe segmenty, usuń resztki tłuszczu, zwijając każdy segment jelita cienkiego na ręczniku papierowym zwilżonym RPMI i użyj skalpela, aby usunąć tłuszcz z tkanki. Zwrócenie szczególnej uwagi na całkowite usunięcie tłuszczu krezkowego ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia żywotności limfocytów, ponieważ nawet niewielkie kawałki tłuszczu mogą spowodować śmierć komórek. Następnie odwróć tkankę na lewą stronę, kaniulując segmenty jelita zakrzywionymi kleszczami i chwytając dystalny koniec tkanki, a następnie użyj pary prostych kleszczy, aby delikatnie usunąć segment tkanki z bliższego końca, co spowoduje odwrócenie tkanki.

Umieść segmenty tkanki w kubku zawierającym 30 mililitrów pożywki ekstrakcyjnej i mieszadło. Przykryj pokrywkę nakrętką i mieszaj przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Mieszanie powinno być energiczne, ale nie burzliwe.

Po 15 minutach za pomocą stalowego sitka oddzielić kawałki tkanki od nabłonka zawierającego supernatant, które powinny wydawać się mętne. Ręcznie wymieszaj kawałki tkanki w pożywce RPMI, aby zmyć resztki pożywki ekstrakcyjnej. Następnie umieść chusteczkę na suchym ręczniku papierowym i odwróć ją kilka razy, aby ułatwić usunięcie resztek śluzu, który nie został uwolniony przez pożywkę ekstrakcyjną.

Następnie umieść fragmenty tkanek w jednopunktowej pięciomililitrowej probówce z 600 mikrolitrami pożywki wytrawiającej. Zmiel tkankę, aż kawałki przestaną przylegać do nożyczek, a roztwór będzie wyglądał na jednorodny. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia pełnego trawienia enzymatycznego tkanki.

Mielenie tkanki do momentu, gdy kawałki przestaną przyklejać się do nożyczek, a roztwór będzie wydawał się jednorodny, ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia wydajności komórkowej, a także zapewnienia powtarzalności wyników. Dodaj zmielone jelito cienkie do filiżanki zawierającej 25 mililitrów pożywki wytrawiającej i mieszaj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W połowie trawienia przetrzyj go w górę iw dół za pomocą pipety serologicznej, aby pomóc rozbić duże kawałki tkanki.

Następnie przefiltruj tkankę trawienną przez sitko o średnicy 100 mikrometrów do 15-mililitrowej probówki. Przepłucz sitko 20 mililitrami pożywki RPMI zawierającej 10 procent FBS. Następnie odwirować przefiltrowany roztwór przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Ostrożnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki RPMI zawierającej 10 procent FBS. Przefiltruj ponownie zawieszone komórki przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do 15-mililitrowej probówki. Przepłucz sitko 20 mililitrami RPMI zawierającymi 10 procent FBS.

Następnie odwirować przefiltrowany roztwór przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki RPMI, zawierającej dwa procent FBS. W tej procedurze przenieś wycięte plastry Peyera do kubka z 25 mililitrami pożywki trawiącej i mieszadłem.

Zabezpiecz pokrywkę i wiruj przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przefiltruj strawione plastry Peyera przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do 15-mililitrowej probówki. Jeśli pozostaną jakieś grudki, przeciśnij je przez sitko za pomocą płaskiego końca tłoka z jednomililitrowej strzykawki.

Następnie przepłucz sitko 10 mililitrami pożywki RPMI, zawierającej 10 procent FBS. Odwirowywać przefiltrowany roztwór przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki RPMI zawierającej dwa procent FBS.

Analiza cytometryczna przepływowa zawiesin pojedynczych komórek limfocytów jelita cienkiego powinna dać dyskretną populację komórek, które mają podobną charakterystykę rozpraszania do przodu i na boki jak splenocyty. Limfocyty mogą zacząć obumierać, jeśli tkanka nie jest utrzymywana w temperaturze czterech stopni Celsjusza podczas początkowych etapów izolacji, co powoduje, że populacja limfocytów ma mniejsze rozproszenie do przodu i jest trudniejsza do oddzielenia od innych komórek nabłonkowych i martwych. Co więcej, jeśli tłuszcz krezkowy nie zostanie całkowicie usunięty z tkanki jelita cienkiego, nastąpi praktycznie całkowita utrata limfocytów.

Zazwyczaj uzyskuje się 80-procentową żywotność limfocytów LP jelita cienkiego. Po opanowaniu można przetworzyć cztery myszy i uzyskać zawiesiny pojedynczych komórek gotowe do barwienia w mniej niż cztery godziny. Podczas tej procedury ważne jest, aby całkowicie usunąć cały tłuszcz krezkowy i dobrze zmielić tkankę, aby zapewnić pełne trawienie.

Zgodnie z tą procedurą, zawiesiny pojedynczych komórek mogą być używane do celów innych niż cytometria przepływowa, takich jak eksperymenty en vitro, analiza ekspresji genów lub transfer adoptywny w celu dalszego scharakteryzowania funkcji tych komórek. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się immunologią błony śluzowej do zbadania ontogenezy i funkcjonalnych implikacji jelitowego układu odpornościowego u myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować zawiesiny pojedynczych komórek z różnych przedziałów jelita cienkiego, oczyszczając tłuszcz krezkowy, ekstrahując warstwę nabłonkową i trawiąc tkankę kolagenazą.