Name: Izolacja i charakterystyka cytometryczna mysich limfocytów jelita cienkiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Naucz się izolacji limfocytów jelita cienkiego myszy do analizy cytometrycznej. Ta metoda umożliwia badanie immunologii błony śluzowej i roli mikrobioty w odpowiedzi immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NKS jest wspierany przez nagrodę NIH K08 AI108690.

Wszystkie badania zostały przeprowadzone pod ścisłym nadzorem i wytycznymi zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Harvard Medical School, która spełnia standardy weterynaryjne określone przez Amerykańskie Stowarzyszenie Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (AALAS).
1. Pozioma transmisja bakterii przez co-housing (opcjonalnie) 
<ol>
	<li>Aby zminimalizować zanieczyszczenie egzogenne (szczególnie w przypadku myszy gnotobiotycznych), należy stosować technikę aseptyczną podczas montażu sterylnych jednorazowych klatek, używając żywności i wody, które zostały autoklawowane.</li>
	<li>Użyj dziurkaczy w uszach lub zawieszek, aby indywidualnie oznaczyć 6-tygodniowe myszy C57BL/6, które mają różne mikrobioty i umieścić je w tej samej klatce. Biorąc pod uwagę, że myszy są koprofagiczne i jedzą granulki kału z podłogi klatki, drobnoustroje będą naturalnie przenoszone poziomo między myszami.</li>
	<li>Myszy należy hodować wspólnie przez ≥1 tydzień, aby dać czas na transfer drobnoustrojów i zmiany immunologiczne przed analizą.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki z warstwy śródnabłonkowej jelita cienkiego i blaszki właściwej
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę ekstrakcyjną (na jelito cienkie): 30 ml RPMI + 93 μl 5% (w/v) ditiotreitolu (DTT) + 60 μl 0,5 M EDTA + 500 μl płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Dodaj naziemną telewizję cyfrową bezpośrednio przed użyciem.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę wytrawiającą (na jelito cienkie): 25 ml RPMI + 12,5 mg dyspazy + 37,5 mg kolagenazy II + 300 μl FBS. Dodaj dypazę i kolagenazę bezpośrednio przed użyciem.</li>
		<li>We wszystkich inkubacjach przeprowadzanych w temperaturze 37 °C należy wstępnie podgrzać roztwory do temperatury 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Połóż mysz grzbietem do dołu i spryskaj brzuch 70% etanolem. Za pomocą nożyczek wykonaj laparotomię, sekwencyjnie przecinając skórę, a następnie powięź otrzewnową wzdłuż brzusznej linii środkowej od spojenia łonowego do wyrostka mieczykowatego, odsłaniając w ten sposób jamę otrzewnej.</li>
	<li>Użyj nożyczek, aby oddzielić jelito cienkie od żołądka poprzez przecięcie zwieracza odźwiernika. Delikatnie usuń jelito cienkie z otrzewnej, usuwając tłuszcz krezkowy.
	<ol>
		<li>Aby całkowicie usunąć jelito cienkie, wykonaj drugie nacięcie na połączeniu krętniczo-kątniczym. Umieść wyizolowane jelito cienkie w zimnym (tj. 4 °C) RPMI zawierającym 10% FBS, aby zmaksymalizować żywotność komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie usuń duże kawałki tłuszczu za pomocą zakrzywionych kleszczy. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć rozerwania samej tkanki jelitowej podczas próby usunięcia tłuszczu.</li>
	<li>Aby usunąć zawartość jelitową, delikatnie przepłukać jelita 15 - 20 ml zimnego PBS za pomocą igły do karmienia 18 G przymocowanej do strzykawki.</li>
	<li>Użyj nożyczek do wycięcia PP i umieść je w zimnym RPMI zawierającym 5% FBS. PP znajdują się po stronie antykrezkowej jelita cienkiego i występują jako wielopłatkowa biała masa. W zależności od konkretnego szczepu, mysz ma zazwyczaj 8 - 12 PP.</li>
	<li>Pokrój jelito cienkie na 3-4 calowe segmenty.</li>
	<li>Usuń resztki tłuszczu, zwijając każdy segment jelita cienkiego na ręczniku papierowym zwilżonym RPMI, używając skalpela, aby usunąć tłuszcz z tkanki.</li>
	<li>Odwróć tkankę na lewą stronę, kaniulując segmenty jelita zakrzywionymi kleszczami i chwytając dystalny koniec tkanki. Następnie użyj pary prostych kleszczy, aby delikatnie usunąć segment tkanki z zakrzywionych kleszczy (zaczynając od bliższego końca), co spowoduje odwrócenie tkanki.</li>
	<li>Umieść segmenty tkanek w kubku zawierającym 30 ml pożywki ekstrakcyjnej i mieszadło. Zabezpiecz pokrywkę na kubku i mieszaj z prędkością 500 obr./min przez 15 minut w temperaturze 37 °C; Mieszanie powinno być energiczne, ale nie burzliwe.</li>
	<li>Po inkubacji należy użyć stalowego sitka, aby oddzielić kawałki tkanek od supernatantu zawierającego nabłonek, które powinny wydawać się mętne. Ten supernatant zawiera limfocyty śródnabłonkowe, które w razie potrzeby można dalej analizować, przystępując do filtrowania próbki w krokach 2.18 - 2.23.</li>
	<li>Ręcznie wymieszaj kawałki tkanki w RPMI, aby zmyć resztki pożywki ekstrakcyjnej.</li>
	<li>Umieść chusteczkę na suchym ręczniku papierowym i kilkakrotnie odwróć ją końcem na koniec, aby ułatwić usunięcie resztek śluzu, który nie został uwolniony przez podłoże ekstrakcyjne.</li>
	<li>Umieść fragmenty tkanek w probówce o pojemności 1,5 ml z 600 μl pożywki wytrawiającej.</li>
	<li>Użyj nożyczek, aby zmielić tkankę, aż kawałki przestaną przyklejać się do nożyczek, a roztwór będzie wyglądał na jednorodny. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia pełnego trawienia enzymatycznego tkanki.</li>
	<li>Dodaj zmielone jelito cienkie do kubka zawierającego 25 ml pożywki trawiącej. Mieszać z prędkością 500 obr./min przez 30 minut w temperaturze 37 °C. W połowie trawienia (tj. po 15 minutach) pipetować pipetą w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej, aby pomóc rozbić duże kawałki tkanki.</li>
	<li>Przefiltrować strawioną tkankę (lub warstwę nabłonkową z kroku 2.12 w przypadku przetwarzania IELs) przez sitko do komórek 100 μm do probówki o pojemności 50 ml. Przepłucz sitko 20 ml RPMI zawierającego 10% FBS.</li>
	<li>Odwirować przefiltrowany roztwór o stężeniu 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml RPMI zawierającym 10% FBS.</li>
	<li>Przefiltrować zawieszone komórki przez sitko o długości 40 μm do probówki o pojemności 50 ml. Przepłucz sitko 20 ml RPMI zawierającym 10% FBS.</li>
	<li>Odwirować przefiltrowany roztwór o stężeniu 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml RPMI zawierającym 2% FBS.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki z plastrów Peyera
<ol>
	<li>Przenieść wycięte PP do kubka z 25 ml pożywki wytrawiającej i mieszadłem. Zabezpiecz pokrywę i wiruj z prędkością 500 obr./min przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przefiltrować strawione PP przez sitko o wielkości 40 μm do probówki o pojemności 50 ml. Jeśli pozostaną jakieś grudki, przecisnąć je przez sitko za pomocą płaskiego końca tłoka ze strzykawki o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Przepłucz sitko 10 ml RPMI zawierającego 10% FBS.</li>
	<li>Odwirować przefiltrowany roztwór o stężeniu 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml RPMI zawierającym 2% FBS.</li>
</ol>
4. Barwienie powierzchni w cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Podzielić odpowiednią objętość komórek (np. 200 μl LPL) na 96-dołkową płytkę okrągłodenną.</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant przez odwrócenie płytki.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 90 μl RPMI zawierającym 2% FBS i rozcieńczeniu anty-CD16/32 (blok Fc) w stosunku 1:100. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 10 μl PBS. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant przez odwrócenie płytki.</li>
	<li>Zawieś komórki w 250 μl PBS. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant przez odwrócenie płytki.</li>
	<li>(Opcjonalnie) W razie potrzeby wybarwić ogniwa barwnikiem żywotności, postępując zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Zawieś komórki w 100 μl 1% formaliny, aby utrwalić komórki. Inkubować przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 200 μl PBS. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant przez odwrócenie płytki.</li>
	<li>Zawieś komórki w 250 μl PBS. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant przez odwrócenie płytki.</li>
	<li>Zawieś komórki w 200 μl PBS. Analizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego.</li>
</ol>

<ol><li>Cummings, D. E., Overduin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+regulation+of+food+intake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal regulation of food intake.</a> J Clin Invest. 117 (1), 13-23 (2007).</li>
<li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).</li>
<li>Round, J. L., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+shapes+intestinal+immune+responses+during+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).</li>
<li>Sartor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+influences+in+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microbial influences in inflammatory bowel diseases.</a> Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).</li>
<li>Tlaskalova-Hogenova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+bacteria+%28normal+microflora%29%2C+mucosal+immunity+and+chronic+inflammatory+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases.</a> Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).</li>
<li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+and+intestinal+microbiota+in+the+development+of+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes.</a> Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).</li>
<li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+lymphocytes+and+plasma+cells+and+the+role+of+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut.</a> Trends Immunol. 29 (5), author reply 209-210 206-208 (2008).</li>
<li>Surana, N. K., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin+yang+of+bacterial+polysaccharides%3A+lessons+learned+from+B.+fragilis+PSA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA.</a> Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).</li>
<li>Surana, N. K., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+tete-a-tete+between+the+microbiota+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system.</a> J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).</li>
<li>Gauguet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+microbiota+of+mice+influences+resistance+to+Staphylococcus+aureus+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia.</a> Infect Immun. , (2015).</li>
<li>Ochoa-Reparaz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polysaccharide+from+the+human+commensal+Bacteroides+fragilis+protects+against+CNS+demyelinating+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease.</a> Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).</li>
<li>Wu, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-residing+segmented+filamentous+bacteria+drive+autoimmune+arthritis+via+T+helper+17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells.</a> Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).</li>
<li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li>
<li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+immune+maturation+depends+on+colonization+with+a+host-specific+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota.</a> Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).</li>
<li>Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striking+phenotypic+and+functional+differences+in+lamina+propria+lymphocytes+from+the+large+and+small+intestine+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice.</a> Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).</li>
<li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lymphocyte+isolation+methods+for+endoscopic+biopsy+specimens+from+the+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa.</a> J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li>
<li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Przedstawiamy protokół izolacji i charakterystyki cytometrii przepływowej limfocytów jelita cienkiego, w tym LPL, IEL i limfocytów w PP. Dla osób zainteresowanych oceną, w jaki sposób zmiany w mikrobiocie wpływają na układ odpornościowy jelita cienkiego, szczegółowo opisujemy proste kroki związane z poziomym przenoszeniem organizmów między myszami posiadającymi różne mikrobioty. Chociaż protokół ten koncentruje się na jelicie cienkim, procedura jest taka sama w przypadku analizy jelita grubego, z tą różnicą, że nie ma PP...

Głównym zadaniem jelita cienkiego jest często uważane trawienie i wchłanianie składników odżywczych1. Chociaż ta funkcja metaboliczna jest oczywiście niezbędna, jelito cienkie odgrywa równie istotną rolę w ochronie gospodarza przed ciągłym zaporem antygenów środowiskowych znajdujących się w świetle2. Przewód pokarmowy oddziela świat zewnętrzny (np. antygeny świetlne) od środowiska wewnętrznego gospodarza za pomocą warstwy nabłonka o grubości tylko jednej warstwy komórkowej. W związku z tym układ odpornościowy jelita cienkiego ma ogromne zadanie zrównoważenia swojego progu reaktywności, umożliwiając obcym antygenom z diety i mikroorganizmom komensalnym przedostanie się do błony śluzowej przy minimalnej, jeśli w ogóle, odpowiedzi immunologicznej, jednocześnie budując silną odpowiedź przeciwko atakującym patogenom i innym "szkodliwym" antygenom. Nadmierna lub niewłaściwa odpowiedź immunologiczna na te antygeny może prowadzić do choroby patologicznej (np. nieswoiste zapalenie jelit, cukrzyca typu I, stwardnienie rozsiane) i należy jej unikać3-6.
Ogólnie rzecz biorąc, uważa się, że przewód pokarmowy stanowi największy organ odpornościowy w organizmie, zawierający ponad 70% wszystkich komórek wydzielających przeciwciała7. Układ odpornościowy jelita cienkiego składa się z 3 głównych przedziałów - blaszki właściwej (LP), warstwy śródnabłonkowej i plam Peyera (PP) - z których każdy zawiera charakterystyczną grupę limfocytów2. Limfocyty LP (LPL) to przede wszystkim limfocyty T TCRαβ+ z ~20% komórek B; limfocyty śródnabłonkowe (IEL) zawierają bardzo mało limfocytów B z większą liczbą limfocytów T TCRγδ+ niż limfocyty T TCRαβ+; a PPs, które są wtórnymi narządami limfatycznymi osadzonymi w ścianie jelita cienkiego, zawierają ~80% komórek B. Chociaż każdy z tych regionów anatomicznych ma nieco odrębne funkcje i podstawy ontologiczne, funkcjonują one w zharmonizowany sposób, aby chronić gospodarza przed patogennymi zniewagami.
Ponadto, coraz częściej docenia się, że mikrobiota jest krytycznym czynnikiem determinującym rozwój jelitowego układu odpornościowego, wraz z rosnącym uznaniem pokrewnego związku między określonymi mikrobami a ontogenezą poszczególnych linii komórkowych8,9. Ponadto, biorąc pod uwagę, że edukacja jelitowego układu odpornościowego wpływa na odpowiedź immunologiczną w anatomicznie odległych miejscach (np. zapalenie stawów, stwardnienie rozsiane, zapalenie płuc), stało się jasne, że rozwój jelitowego układu odpornościowego jest istotny dla większej liczby procesów chorobowych niż wcześniej sądzono. W związku z tym zainteresowanie ilościową oceną jelitowego układu odpornościowego wykroczyło poza interakcje gospodarz-patogen i obecnie obejmuje interakcje gospodarz-komensal oraz patogenezę wielu chorób ogólnoustrojowych.
Biorąc pod uwagę zmienność obecnych metod izolacji limfocytów jelitowych, coraz bardziej krytyczna jest metoda, która jest zoptymalizowana pod kątem wydajności, żywotności i spójności, przy jednoczesnym równoważeniu wymaganego czasu. Protokoły, które obejmują gradienty Percoll, są czasochłonne i pracochłonne oraz potencjalnie bardziej podatne na błędy ludzkie, co prowadzi do zmiennej wydajności i żywotności13. W niniejszym dokumencie przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji i charakterystyki limfocytów ze wszystkich 3 przedziałów immunologicznych jelita cienkiego. Dodatkowo, biorąc pod uwagę rosnące zainteresowanie zmianami w układzie odpornościowym błony śluzowej wywołanymi przez drobnoustroje, uwzględniamy kroki, które można zastosować, aby umożliwić poziomą transmisję mikroorganizmów między myszami, aby ocenić, jak te zmiany wpływają ilościowo na jelitowy układ odpornościowy.

<table><tbody><tr><td>Sterylne rękawiczki</td><td>Kimberly-Clark</td><td>555092</td><td></td></tr><tr><td>sterylna klatka dla myszy</td><td>Innovive</td><td>MS2-AD</td><td>zawiera pokrywę, dno klatki i ściółkę alpha-dri</td></tr><tr><td>Podajnik metalowy</td><td>Innovive</td><td>M-FEED</td><td></td></tr><tr><td>Butelka na wodę</td><td>Innovive</td><td>M-WB-300</td><td></td></tr><tr><td>Etui na karty</td><td>Innovive</td><td>CRD-HLD-H</td><td></td></tr><tr><td>Autoklawowalny gryzoń chow (NIH-31M)</td><td>Zeigler</td><td>4131207530</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Ambion</td><td>AM9262</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>GemBio</td><td>100-510</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>stężenie w protokole opiera się na poziomie aktywności 1,878 U/mg</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17101-015</td><td>stężenie w protokole opiera się na poziomie aktywności 245 U/mg</td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Igła do karmienia (18 G, długość 2 ")</td> <td>Roboz</td><td>FN-7905</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Strzykawka</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy skalpel (15 ostrzy)</td><td>Miltex</td><td>4-415</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze zakrzywione</td><td>Roboz</td><td>RS-5211</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze proste</td><td>Roboz</td><td>RS-5132</td><td></td></tr><tr><td>Kubki uniwersalne, 120 ml</td><td>VWR</td><td>89009-662</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło</td><td>VWR</td><td>58949-062</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło wielopozycyjne, 9-pozycyjne</td><td>VWR</td><td>12621-048</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe ze stali nierdzewnej sitko, 3 cale&nbsp;</td><td>RSVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tubka</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m Sitko do komórek</td><td>Falcon</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Sitko do komórek</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubka stożkowa</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Strzykawka</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa, okrągłodenna</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/32 (blok Fc)</td> <td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr> <tr><td>(opcjonalnie) Barwnik żywotności eFluor 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-18</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalina, neutralnie buforowana</td><td>Thermo Scientific</td><td>5725</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka cytometryczna mysich limfocytów jelita cienkiego

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Jelita - które zawierają największą liczbę komórek odpornościowych ze wszystkich organów w ciele - są stale narażone na działanie obcych antygenów, zarówno mikrobiologicznych, jak i dietetycznych. Biorąc pod uwagę rosnące zrozumienie, że te antygeny luminalne pomagają kształtować odpowiedź immunologiczną i że edukacja komórek odpornościowych w jelicie ma kluczowe znaczenie dla wielu chorób ogólnoustrojowych, wzrosło zainteresowanie charakteryzacją jelitowego układu odpornościowego. Jednak wiele opublikowanych protokołów jest żmudnych i czasochłonnych. Przedstawiamy tutaj uproszczony protokół izolacji limfocytów z blaszki właściwej jelita cienkiego, warstwy śródnabłonkowej i plam Peyera, który jest szybki, powtarzalny i nie wymaga pracochłonnych gradientów Percolla. Chociaż protokół koncentruje się na jelicie cienkim, nadaje się również do analizy jelita grubego. Ponadto zwracamy uwagę na niektóre aspekty, które mogą wymagać dodatkowej optymalizacji w zależności od konkretnego pytania naukowego. Podejście to prowadzi do wyizolowania dużej liczby żywotnych limfocytów, które można następnie wykorzystać do analizy cytometrii przepływowej lub alternatywnych sposobów charakteryzacji.

Analiza cytometryczna przepływowa zawiesin pojedynczych komórek limfocytów jelita cienkiego powinna wykazać odrębną populację komórek o charakterystyce rozpraszania światła w przód i pod kątem zbliżonej do splenocytów (Ryc. 1A i 1B). Limfocyty mogą zacząć obumierać, jeśli tkanka nie będzie utrzymywana w temperaturze 4 °C podczas początkowych etapów izolacji, co skutkuje obniżeniem rozpraszania światła w przód dla populacji limfocytów i utrudnionym oddzieleniem ich od inny...

Rośnie zainteresowanie ilościową charakterystyką limfocytów jelitowych ze względu na coraz większą świadomość, że komórki te odgrywają kluczową rolę w różnych chorobach jelitowych i ogólnoustrojowych. W tym protokole opisujemy, jak izolować populacje pojedynczych komórek z różnych przedziałów jelita cienkiego w celu późniejszej charakterystyki cytometrii przepływowej.

Izolacja i charakterystyka cytometryczna mysich limfocytów jelita cienkiego

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja populacji pojedynczych komórek z różnych odcinków jelita cienkiego, które mogą być następnie wykorzystane do analizy cytometrycznej lub innej metody charakterystyki. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii błon śluzowych, takie jak wpływ mikrobioty na rozwój układu odpornościowego jelit. Głównymi zaletami tej techniki są szybkość, powtarzalność oraz brak konieczności stosowania pracochłonnych gradientów Percoll.Aby rozpocząć tę procedurę, należy położyć mysz stroną grzbietową w dół i spryskać brzuch 70% etanolem, a następnie wykonać laparotomię poprzez sekwencyjne nacięcie skóry, a następnie powięzi otrzewnej wzdłuż linii środkowej brzucha od spojszenia łonowego do wyrostka xyfoidego, odsłaniając jamę otrzewną. Następnie należy oddzielić jelito cienkie od żołądka poprzez przecięcie zwieracza odbytniczego. Ostrożnie usuwamy jelito cienkie z otrzewnej i oddzielamy tłuszcz krezkowy.Aby całkowicie usunąć jelito cienkie, wykonaj drugie cięcie w miejscu połączenia jelita krętego z kątnicą. Umieść wyizolowane jelito cienkie w pożywce RPMI w temperaturze 4 °C zawierającej 10% FBS, aby zmaksymalizować żywotność komórek. Ostrożnie usuń duże fragmenty tłuszczu za pomocą zakrzywionej pęsety, zachowując ostrożność, aby uniknąć przerwania tkanki jelitowej podczas tego procesu.Aby usunąć zawartość jelit, kaniuluj proksymalny koniec jelita cienkiego za pomocą igły do karmienia o rozmiarze 18 G przymocowanej do strzykawki i delikatnie przepłucz jelito od 15 do 20 ml zimnego PBS. Użyj nożyczek, aby wyciąć kępki Peyera, które znajdują się po stronie antymezentalnej jelita cienkiego i wyglądają jak wieloklapkowa biała masa. Następnie umieść je w zimnym medium RPMI zawierającym 5% FBS.Następnie podziel jelito cienkie na odcinki o długości od trzech do czterech cali, usuń pozostałości tłuszczu, tocząc każdy odcinek jelita cienkiego po ręczniku papierowym zwilżonym medium RPMI, i użyj tępego skalpela, aby oddzielić tłuszcz od tkanki. Ścisłe przestrzeganie zasady całkowitego usunięcia tłuszczu krezkowego jest kluczowe dla zapewnienia żywotności limfocytów, ponieważ nawet niewielkie fragmenty tłuszczu mogą spowodować obumarcie komórek. Po tym etapie wywiń tkankę na drugą stronę, kaniulując odcinki jelita pęsetą zakrzywioną i chwytając dystalny koniec tkanki, a następnie użyj pęsety prostej, aby delikatnie wysunąć odcinek tkanki z końca proksymalnego, co spowoduje inwersję tkanki.Umieść fragmenty tkanki w naczyniu zawierającym 30 ml medium ekstrakcyjnego oraz mieszadełko magnetyczne. Zamknij szczelnie pokrywkę i mieszaj przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Mieszanie powinno być intensywne, ale nie turbulentne.Po 15 minutach należy użyć stalowego sitka, aby oddzielić fragmenty tkanki od naddatku zawierającego nabłonek, który powinien być mętny. Fragmenty tkanki należy ręcznie wymieszać w medium RPMI, aby wypłukać pozostałości medium do ekstrakcji. Następnie tkankę należy położyć na suchym ręczniku papierowym i kilkakrotnie obrócić, aby ułatwić usunięcie resztek śluzu, które nie zostały uwolnione przez medium do ekstrakcji.Następnie umieść fragmenty tkanki w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 600 µl medium do trawienia. Rozdrobnij tkankę do momentu, aż kawałki przestaną przyklejać się do nożyczek, a roztwór stanie się jednorodny. Krok ten jest kluczowy dla zapewnienia pełnego trawienia enzymatycznego tkanki.Rozdrabnianie tkanki do momentu, aż kawałki przestaną przyklejać się do nożyczek, a roztwór stanie się jednorodny, jest kluczowe dla zapewnienia uzyskania odpowiedniej liczby komórek oraz powtarzalności wyników. Przenieść rozdrobnione jelito cienkie do kubka zawierającego 25 milliliters medium trawiennego i mieszać przez 30 minut w temperaturze 37 degrees Celsius. W połowie procesu trawienia pipetować zawiesinę w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej, aby pomóc w rozbiciu większych fragmentów tkanki.Następnie przefiltruj tkankę trawienną przez sito komórkowe o oczkach 100 µm do probówki o pojemności 15 ml. Przepłucz sito 20 ml pożywki RPMI zawierającej 10% FBS. Następnie odwiruj przefiltrowany roztwór przez 10 minut w temperaturze 4°C.Ostrożnie odlej supernatant i resuspenduj osad w jednym mililitrze pożywki RPMI zawierającej 10% FBS. Przefiltruj resuspendowane komórki przez sitko komórkowe o rozmiarze 40 µm do probówki o pojemności 15 ml. Przepłucz sitko 20 ml pożywki RPMI zawierającej 10% FBS.Następnie odwiruj przefiltrowany roztwór przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie odlej supernatant i resuspender pellet w jednym mililitrze medium RPMI zawierającego dwa procent FBS. W tej procedurze przenieś wycięte kępki Peyera do naczynia z 25 mililitrami medium do trawienia oraz mieszadełkiem magnetycznym.Zamknij szczelnie pokrywkę i wiruj przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Następnie przefiltruj strawione kępki Peyera przez sitko komórkowe o oczkach 40 µm do probówki o pojemności 15 ml. Jeśli pozostaną jakiekolwiek grudki, przeciśnij je przez sitko, używając płaskiego końca tłoka z strzykawki o pojemności 1 ml.Następnie opłucz sitko 10 mililitrami pożywki RPMI zawierającej 10% FBS. Odwiruj przefiltrowany roztwór przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie odlej nadsącz i resuspenduj osad w jednym mililitrze pożywki RPMI zawierającej 2% FBS.Analiza cytometryczna przepływowa zawiesin pojedynczych komórek limfocytów jelita cienkiego powinna wykazać wyraźną populację komórek o charakterystyce rozproszenia światła w przód (forward scatter) i pod kątem (side scatter) zbliżonej do splenocytów. Limfocyty mogą zacząć obumierać, jeśli tkanka nie będzie utrzymywana w temperaturze 4°C podczas początkowych etapów izolacji, co spowoduje obniżenie wartości rozproszenia w przód populacji limfocytów i utrudni ich oddzielenie od komórek nabłonkowych oraz komórek martwych. Ponadto, jeśli tłuszcz krezkowy nie zostanie całkowicie usunięty z tkanki jelita cienkiego, dojdzie do niemal całkowitej utraty limfocytów.Zazwyczaj uzyskuje się 80-procentową przeżywalność limfocytów LP jelita cienkiego. Po opanowaniu tej metody można przetworzyć cztery myszy i przygotować zawiesiny pojedynczych komórek do barwienia w czasie krótszym niż cztery godziny. Podczas tej procedury ważne jest całkowite usunięcie całego tłuszczu krezowego oraz dokładne posiekanie tkanki, aby zapewnić pełną trawienie.Po zastosowaniu tej procedury zawiesiny pojedynczych komórek mogą być wykorzystywane do celów innych niż cytometria przepływowa, takich jak eksperymenty in vitro, analiza ekspresji genów lub transfer adopcyjny w celu dalszej charakterystyki funkcji tych komórek. Po opracowaniu technika ta otworzyła badaczom zajmującym się immunologią błon śluzowych drogę do zgłębienia ontogenezy i implikacji funkcjonalnych układu odpornościowego jelit u myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak izolować zawiesiny pojedynczych komórek z różnych odcinków jelita cienkiego poprzez oczyszczenie tłuszczu krezkowego, wyodrębnienie warstwy nabłonkowej i trawienie tkanki kolagenazą.

isolation-flow-cytometric-characterization-murine-small-intestinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym opracowaniu szczegółowo opisano metodologię szybkiej izolacji komórek dendrytycznych (DCs) oraz makrofagów z jelit myszy. Charakterystyka fenotypowa jelitowych komórek dendrytycznych i makrofagów jest przeprowadzana za pomocą wielokolorowej analizy cytometrycznej, natomiast wzbogacanie za pomocą kulek magnetycznych z następującym po nim sortowaniem komórek jest stosowane w celu uzyskania populacji o wysokiej czystości do badań funkcjonalnych.

Izolacja i charakterystyka komórek dendrytycznych oraz makrofagów z jelit myszy

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Ten artykuł opisuje cytometrię spektralną, nowe podejście w cytometrii przepływowej, które wykorzystuje kształty widm emisyjnych do rozróżniania fluorochromów. Algorytm zastępuje kompensacje i może traktować autofluorescencję jako niezależny parametr. To nowe podejście pozwala na prawidłową analizę komórek wyizolowanych z narządów stałych.

Analiza zawiesin komórkowych wyizolowanych z tkanek stałych za pomocą spektralnej cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych, w tym tkanki limfatycznej związanej z jelitami, plam Peyera i drenujących węzłów chłonnych krezkowych, oraz miejsc efektorowych, w tym blaszki właściwej i nabłonka jelitowego układu odpornościowego jelita cienkiego.

Izolowanie limfocytów od układu odpornościowego myszy w jelicie cienkim

Celem tego protokołu jest identyfikacja populacji komórek śródbłonka limfatycznego w wątrobie za pomocą opisanych markerów. Wykorzystujemy kolagenazę IV i DNazę oraz delikatne mielenie tkanki w połączeniu z cytometrią przepływową, aby zidentyfikować odrębną populację komórek śródbłonka limfatycznego.

Trawienie mysiej wątroby do analizy cytometrycznej przepływowej komórek śródbłonka limfatycznego

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania pojedynczych komórek z mysiej grasicy, węzła chłonnego drenującego trzustkę i śledziony do dalszego badania tych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto protokół ten wykorzystano do określenia podzbiorów regulatorowych limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej.

Oznaczanie podzbiorów regulatorowych limfocytów T w grasicy myszy, węźle chłonnym drenującym trzustkę i śledzionie za pomocą cytometrii przepływowej

Opisujemy tutaj prostą analizę heterogeniczności przedziału mysich komórek odpornościowych B w tkankach otrzewnej, śledziony i szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół można dostosować i rozszerzyć na inne tkanki myszy.

Charakterystyka cytometrii przepływowej rozwoju mysich komórek B

To jest metoda izolowania komórek limfoidalnych macicy zarówno od ciężarnych, jak i nieciężarnych myszy. Metoda ta może być stosowana w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak fenotypowanie FACS, sortowanie komórek, testy funkcjonalne, sekwencja RNA i proteomika. Protokół tutaj pokazuje, jak fenotypować wrodzone komórki limfoidalne macicy grupy 1 za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja wrodzonych komórek limfatycznych macicy do analizy metodą cytometrii przepływowej

W tym badaniu prezentujemy skuteczny i powtarzalny protokół izolowania populacji immunologicznych mysiego układu oddechowego. Zapewniamy również metodę identyfikacji wszystkich wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych, które znajdują się w płucach zdrowych myszy, przy użyciu 9-kolorowego panelu cytometrii przepływowej.

Analiza cytometrii przepływowej w celu identyfikacji wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych płuc myszy

Ten protokół oferuje szczegółowe instrukcje dotyczące tworzenia mysich organoidów jelita cienkiego, izolowania wrodzonych komórek limfoidalnych typu 1 od mysiej blaszki jelita cienkiego oraz ustanawiania trójwymiarowych (3D) kokultur między oboma typami komórek w celu zbadania dwukierunkowych interakcji między komórkami nabłonka jelitowego a wrodzonymi komórkami limfoidalnymi typu 1.

Współhodowla organoidów nabłonkowych mysiego jelita cienkiego z wrodzonymi komórkami limfoidalnymi

Ten artykuł opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka z naczyń włosowatych limfatycznych skóry za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane komórki śródbłonka limfatycznego można wykorzystać do dalszych eksperymentów in vitro i analizy ekspresji białek.

Mysia izolacja komórek śródbłonka limfatycznego skóry

Naucz się izolacji limfocytów jelita cienkiego myszy do analizy cytometrycznej. Ta metoda umożliwia badanie immunologii błony śluzowej i roli mikrobioty w odpowiedzi immunologicznej.

Izolacja i charakterystyka cytometryczna mysich limfocytów jelita cienkiego

Przeglądaj więcej filmów