Oddzielanie bakterii według ilości kapsułek za pomocą nieciągłego gradientu gęstości
7 stycznia 2019
Pokazujemy użycie nieciągłych gradientów gęstości do rozdzielania populacji bakterii na podstawie produkcji kapsułek. Metoda ta służy do porównywania ilości kapsułek między kulturami, izolowania mutantów o określonym fenotypie kapsułki lub do identyfikacji regulatorów kapsułki. Opisano tutaj optymalizację i przebieg testu.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie Klebsiella, takie jak to, które geny są używane do regulacji kapsułki i związanych z nią wirulentów. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że zapewnia ona środki do fizycznego oddzielenia szczepów kapsułkowanych i niekapsułkowanych, a także może być wykorzystywana do szybkich porównań między szczepami do produkcji kapsułek. Chociaż metoda ta została opracowana w celu zbadania regulacji kapsułek u Klebsiella, można ją również zastosować do różnych gatunków bakterii.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ nalewanie gradientów i dodawanie komórek do gradientów może być dość trudne. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ pokazujemy techniki, które są trudne do opanowania, podając sugestie i wskazówki, które pomogą użytkownikowi. Na początek wybierz pojedynczą kolonię z talerza podstawowego ze sterylną pętlą i zaszczep 10 mililitrów odpowiedniego bulionu.
Inkubuj kulturę przez noc. Następnie przenieś kulturę do 15-mililitrowej probówki i odwiruj. Następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach PBS.
Powtórzyć wirowanie i odrzucić powstały supernatant. Następnie ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach PBS. Aby utworzyć rozcieńczenia gradientu gęstości, należy połączyć podłoże o gradiencie gęstości z PBS.
Następnie podniec 600 mikrolitrów każdego rozcieńczenia gradientowego na pojedyncze dwumililitrowe probówki. Weź 100 mikrolitrów komórek za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów i umieść końcówkę pipety z boku rurki tuż pod menisku jednego z wielu gradientów. Odsysaj komórki bakteryjne do gradientu bardzo powoli, uważając, aby nie zmieszać interfejsu.
Odwirować przygotowane probówki przez 10 minut przy stężeniu 8 000 g. Następnie przenieś probówki do stojaka, aby zobrazować minimalne rozcieńczenie gradientu wymagane do utrzymania komórek tuż nad warstwą gradientu. Najpierw przenieś jeden mililitr najbardziej rozcieńczonego rozcieńczenia gradientu gęstości do pięciomililitrowej probówki z okrągłym dnem.
Za pomocą strzykawki z igłą o średnicy 1,5 cala pobierz jeden mililitr następnego najbardziej skoncentrowanego gradientu gęstości. Umieścić igłę na dnie probówki i bardzo powoli wstrzykiwać zawartość strzykawki. Na każdym etapie gradientu gęstości musi znajdować się wyraźny interfejs.
Jeśli warstwy się zmieszają, nie osiągniesz czystej separacji bakterii. Delikatnie wyjąć igłę z gradientu, aby nie naruszyć granicy faz między rozcieńczeniami gradientu. Następnie umieść rurkę w stojaku.
Ostrożnie dodaj 600 mikrolitrów przygotowanych komórek do górnej części gradientu w probówce. Następnie umieść rurkę w adapterze do probówki i zważ rurkę z adapterem, aby zapewnić równowagę. Następnie umieść adapter probówki w wirniku o stałym kącie w wirówce stołowej i odwiruj probówkę przez 30 minut przy 3 000 g.
Na koniec, po odwirowaniu, ostrożnie wyjmij probówkę, umieść ją na stojaku i sfotografuj wyniki. W tym protokole zastosowano wirowanie w gradiencie gęstości do oddzielenia szczepów bakteryjnych na podstawie ilości wytwarzanych przez nie kapsułek. Chociaż dokładne wyniki zależą od gatunku bakterii, większość szczepów będzie migrować do jednego miejsca w gradiencie.
Zastosowanie tej metody do biblioteki mutantów bakteryjnych powinno wytworzyć główne pasmo powyżej gradientu, mniej gęste pasmo przez najwyższą warstwę gradientu i niewielką frakcję a-torebkową na dole. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że interfejsy gradientu nie powinny być mieszane, a gradient nie powinien zawierać pęcherzyków powietrza. Po procedurze należy wykonać metody walidacji, takie jak test kwasu uronowego lub mikroskopia, w celu zbadania ilości kapsułek.
Jest to szczególnie ważne w przypadku stosowania tej techniki w przypadku nowych szczepów. Nie zapominaj, że praca z patogenami z grupy zagrożenia 2 może być niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak korekcyjne wyposażenie ochronne, przestrzeganie ocen ryzyka i prawidłowa utylizacja kultur.
Przegląd
Niniejszy artykuł demonstruje zastosowanie nieciągłych gradientów gęstości do rozdzielania populacji bakteryjnych na podstawie produkcji kapsuły. Metoda ta umożliwia porównanie ilości kapsuły między kulturami, izolację mutantów o specyficznych fenotypach kapsuły oraz identyfikację regulatorów kapsuły.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Biologia komórki
- Badania nad patogenami
Wprowadzenie
- Produkcja otoczki u bakterii jest powiązana z wirulencją.
- Zrozumienie regulacji produkcji otoczki może pomóc w opracowaniu strategii leczenia.
- Nieciągłe gradienty gęstości zapewniają fizyczną metodę rozdziału.
- Technikę tę można zastosować do różnych gatunków bakterii.
Cel badania
- Optymalizacja metody rozdzielania szczepów bakteryjnych otoczkowanych i nieotoczkowanych.
- Ułatwienie szybkiego porównywania produkcji otoczki między różnymi szczepami.
- Zapewnienie wizualnej demonstracji techniki w celu lepszego zrozumienia.
Zastosowane metody
- Inokulacja kultur bakteryjnych i inkubacja przez noc.
- Wirowanie i ponowne zawieszenie osadów bakteryjnych w PBS.
- Przygotowanie rozcieńczeń gradientu gęstości i ostrożne nakładanie warstw komórek.
- Wirowanie w celu uzyskania rozdziału na podstawie produkcji kapsuły.
Główne wyniki
- Skuteczna separacja szczepów bakteryjnych w zależności od poziomu produkcji kapsuły.
- Identyfikacja wyraźnych prążków odpowiadających frakcjom kapsułowanym i akapsularnym.
- Metody walidacji, takie jak testy na kwas uronowy, potwierdziły ilość kapsuły.
- Wykazanie znaczenia utrzymania granic gradientu dla uzyskania czystej separacji.
Wnioski
- Metoda ta jest skuteczna w badaniu regulacji otoczki u bakterii z rodzaju Klebsiella oraz innych bakterii.
- Demonstracje wizualne są kluczowe dla opanowania tej techniki.
- Środki ostrożności są niezbędne podczas pracy ze szczepami patogennymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia zespołom badawczo-rozwojowym w branży biofarmaceutycznej fizyczną izolację subpopulacji bakteryjnych na podstawie ekspresji kapsuły, która jest kluczowym czynnikiem wirulencji wpływającym na unikanie odpowiedzi immunologicznej i oporność terapeutyczną. Dzięki zapewnieniu półilościowego narzędzia separacji, metoda ta wspiera walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w programach opracowywania leków przeciwdrobnoustrojowych i szczepionek. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną podczas oceny fenotypów związanych z kapsułą w bibliotekach szczepów lub kolekcjach mutantów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie szlaków biosyntezy kapsuły poprzez oddzielenie szczepów o wysokiej i niskiej produkcji w celu przeprowadzenia dalszych analiz genetycznych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia szybki screening fenotypowy bibliotek mutantów w celu identyfikacji regulatorów produkcji kapsuły.
- Wartość translacyjna: Wspiera izolację mutantów akapsularnych lub hiperkapsularnych do zastosowania w modelowaniu wirulencji i doboru antygenów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie frakcjonowanych populacji odpowiednich do ilościowych analiz kapsułek, takich jak pomiar kwasu uronowego.
- Wartość operacyjna: Umożliwia stworzenie zestandaryzowanych, powtarzalnych materiałów wejściowych do wysokoprzepustowego przesiewu związków lub perturbacji genetycznych wpływających na ekspresję kapsułki.
- Gotowość do analizy: Pozwala na otrzymanie oczyszczonych frakcji kapsułkowanych, co poprawia stosunek sygnału do szumu w późniejszych analizach funkcjonalnych lub immunologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy genotyp z fenotypem, umożliwiając korelację miejsc insercji transpozonów z poziomami kapsuły w procesach sekwencjonowania.
- Wartość operacyjna: Dostarcza skalowalną metodę generowania szczepów izogenicznych o określonej ilości kapsuły do badań farmakokinetycznych lub badań skuteczności.
- Ciągłość translacyjna: Wspiera rozwój z uwzględnieniem analizy ryzyka, pozwalając zespołom na redukcję ryzyka związanego z celami terapeutycznymi w oparciu o zwalidowaną modulację kapsuły.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum wczesnego etapu odkrywania leków, umożliwiając przejście od przesiewu fenotypowego do identyfikacji celu i walidacji przedklinicznej, szczególnie w programach przeciwinfekcyjnych, w których otoczka jest determinantą patogenności.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie fizycznej separacji szczepów w celu wyjaśnienia roli kapsuły w unikaniu odpowiedzi immunologicznej lub odporności na stres.
- Przesiewanie: Umożliwia zbieranie frakcji gotowych do analizy w celu ilościowego porównania produkcji kapsuły w różnych wariantach szczepów lub warunkach traktowania.
- Analityka: Generuje wyraźne, wizualne prążki, które służą jako półilościowe odczyty do sortowania i dalszej walidacji analitycznej.
- Badania translacyjne: Łączy modulację kapsuły z fazy odkryć z modelami przedklinicznymi poprzez dostarczenie zdefiniowanych szczepów fenotypowych do badań nad infekcją lub testów wyzywalnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę do fenotypowania kapsuły, którą można ponownie wykorzystać dla wielu celów bakteryjnych w obrębie portfolio.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w zakresie wirulencji związanej z otoczką poprzez umożliwienie bezpośredniej korelacji fenotypu z genotypem.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację analizy otoczki w porównaniu do pomiarów prowadzonych na kulturach zbiorczych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań w procesie wyboru celu dzięki dostarczeniu empirycznych danych na temat skuteczności modulacji otoczki.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów dla środków przeciwdrobnoustrojowych lub szczepionek z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowane fenotypy otoczki.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w prowadzeniu kultur bakteryjnych i przygotowywaniu gradientów gęstości.
- Zależność od dostępu do wirówek umożliwiających precyzyjną kontrolę prędkości i temperatury.
- Konieczność zastosowania starannej techniki, aby uniknąć mieszania warstw gradientu lub wprowadzenia pęcherzyków powietrza podczas przygotowania.
- Metoda musi być dostosowana do każdego gatunku bakterii poprzez optymalizację stężeń gradientu i parametrów wirowania.
- Opiera się na metodach walidacji po separacji, takich jak testy biochemiczne lub mikroskopia, w celu potwierdzenia poziomu otoczki w frakcjach.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:48
Preparation of Bacterial Strains of Mutant Libraries
1:40
Preparation of Gradient Dilutions and Mini-gradient Test
2:39
Preparation of Discontinuous Density Gradients
3:39
Adding Prepared Cells to Gradients and Separation by Centrifuge
4:30
Results: Density Gradient Centrifugation Used to Separate Bacterial Strains Based on Capsule Production
5:10
Conclusion
