Name: Oddzielanie bakterii według ilości kapsułek za pomocą nieciągłego gradientu gęstości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Poznaj metodę nieciągłego gradientu gęstości do separacji bakterii według produkcji kapsuł w badaniach nad regulacją wirulencji u Klebsiella. Technika umożliwia izolację szczepów z określonymi fenotypami kapsułowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jin-Town Wang i Susannah Salter za dostarczenie szczepów, a także członkom grupy Parkhill za pomocne dyskusje. Praca ta została sfinansowana przez Wellcome Sanger Institute (Wellcome grant 206194) oraz przez stypendium podoktorskie Sir Henry'ego Wellcome'a dla F.L.S. (grant 106063/A/14/Z). M.J.D. jest wspierany przez stypendium doktoranckie Wellcome Sanger Institute.

UWAGA: Upewnij się, że wszelkie oceny ryzyka dotyczące szczepów bakteryjnych są przestrzegane podczas hodowli i obchodzenia się z próbkami. Należy pamiętać, że ustawienie zbyt wielu gradientów jednocześnie może prowadzić do zaburzeń układu mięśniowo-szkieletowego spowodowanych naciskiem na stawy spowodowanym powolnym pipetowaniem. Zaplanuj pracę i podejmij środki ostrożności, aby uniknąć obrażeń.
1. Przygotowanie szczepów bakteryjnych lub bibliotek mutantów
<ol>
	<li>Szczepy, które mają być testowane, należy rozmieścić na odpowiednich płytkach agarowych. Są to standardowe tabliczki do eksperymentu.
	<ol>
		<li>Inkubuj płytki przez noc w żądanej temperaturze, aby uzyskać pojedyncze kolonie. W tym eksperymencie posiewu posiewu K. pneumoniae (NTUH-K2044 i szczepy ATCC43816) na agarze z bulionu Luria (LB) w temperaturze 37 °C, a S. pneumoniae (23F typu dzikiego i 23F Δcps) na agarze z krwią w nawilżonym słoiku ze świecą w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz pojedynczą kolonię z talerza podstawowego (krok 1.1), aby zaszczepić 10 ml odpowiedniego bulionu za pomocą sterylnej pętli lub patyczka koktajlowego. W celu przesiewu bibliotek losowych mutantów należy zaszczepić bulion 10 μl zapasu biblioteki losowych mutantów (biblioteka TraDIS).
	<ol>
		<li>Szczepy K. pneumoniae inkubować w pożywkach LB o niskiej zawartości soli w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem, a szczepy S. pneumoniae w pożywce do infuzji serca (BHI) statycznie w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przenieść kulturę przez noc do probówki o pojemności 15 ml i odwirować w wirówce stołowej przez 10 minut przy 3 200 x g w odchylanych wiadrach z wkładkami do probówek o pojemności 15 ml i szczelnymi pokrywkami aerozolowymi.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). 
		nuta: Supernatant należy usunąć w laboratorium odpowiednią drogą ciekłych odpadów biologicznych. Celem etapów wirowania i ponownego zawieszania (ppkt 1.2.2 i 1.2.3) jest zagęszczenie bakterii w celu łatwej wizualizacji na nachyleniu. W razie potrzeby kultury bakteryjne można załadować bezpośrednio na gradient. Mocno kapsułkowane szczepy mogą nie tworzyć szczelnego osadu. W takim przypadku należy usunąć jak najwięcej supernatantu bez usuwania jakichkolwiek komórek bakteryjnych, dodać 1x PBS do końcowej objętości 5 ml i ponownie zawiesić osad. Kontynuuj postępowanie z krokiem 1.2.5.</li>
		<li>W przypadku szczepów nieśluzowatych przejdź do kroku 2.</li>
		<li>Odwirować probówki zgodnie z opisem w kroku 1.2.2.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml 1x PBS. Komórki są teraz gotowe do użycia. 
		nuta: Gęstość zawiesiny komórek bakteryjnych nie jest krytyczna, ale musi być wystarczająca do wizualizacji w gradiencie. Sugerowana jest minimalna wartość OD600 (gęstość optyczna przy 600 nm) wynosząca 4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie rozcieńczeń gradientowych i testu mini-gradientu
<ol>
	<li>Przygotować rozcieńczenia gradientowe. 
	nuta: Dokładne stężenia podłoża o gradiencie gęstości (np. Percoll) potrzebne w gradientach gęstości do uzyskania dobrej separacji będą się różnić w zależności od zastosowanego szczepu bakterii i warunków wzrostu. Najpierw przeprowadza się testy mini-gradientowe, aby określić stężenia, które zapewnią najlepszą separację. Zawierają one 500 μl pojedynczego rozcieńczenia w probówce o pojemności 2 ml. Jeśli bakterie mają zostać wyekstrahowane z gradientu i poddane hodowli do dalszych zastosowań, kroki te należy wykonać w warunkach aseptycznych.
	<ol>
		<li>Połącz podłoże o gradiencie gęstości z 1x PBS, aby uzyskać rozcieńczenia gradientu gęstości. Rozcieńczyć 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% i 80% (np. 2 ml pożywki o gradiencie gęstości plus 8 ml 1x PBS = 10 ml pożywki o gradiencie gęstości 20%).</li>
		<li>Porcję 500 μl 20% rozcieńczenia gradientowego do probówki o pojemności 2 ml dla każdego badanego szczepu (np. 4 szczepy = 4 probówki zawierające 500 μl 20% rozcieńczenia gradientowego).</li>
		<li>Powtórzyć krok 2.1.2 dla pozostałych rozcieńczeń gradientu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastosuj bakterie do gradientu.
	<ol>
		<li>Nałożyć 100 μl komórek bakteryjnych przygotowanych w krokach 1.2.3 i 1.2.6 na wierzch każdego rozcieńczenia gradientowego, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
		<ol>
			<li>Pobrać 100 μl komórek za pomocą pipety o pojemności 200 μl i umieścić końcówkę pipety z boku probówki tuż poniżej menisku minigradientu.</li>
			<li>Odsysanie komórek bakteryjnych do gradientu bardzo powoli, tak aby utworzyły warstwę na górze gradientu, bez mieszania interfejsu.</li>
			<li>Powtórzyć kroki 2.2.1.1–2.2.1.2 dla wszystkich szczepów, które mają być badane.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Za pomocą wirnika o stałym kącie z pokrywą szczelną w aerozolu, odwirować przygotowane probówki w mikrowirówce przez 10 minut przy 8 000 x g.</li>
		<li>Po odwirowaniu przenieś probówki na stojak, aby uwidocznić minimalne rozcieńczenie gradientu wymagane do zatrzymania komórek tuż nad warstwą gradientu po odwirowaniu.</li>
		<li>Jeżeli wyniki nie są jednoznaczne, należy powtórzyć badanie z minigradientem z przyrostami 5% rozcieńczeń podłoża o gradiencie gęstości powyżej i poniżej stężeń określonych w kroku 2.1.1 (np. należy zbadać rozcieńczenia 25% i 35%, jeżeli wynik przy 30% jest niejednoznaczny). 
		nuta: Zobacz Rysunek 2A, aby zapoznać się z typowymi wynikami przy pojedynczym rozcieńczeniu medium o gradiencie gęstości.</li>
		<li>Skorzystaj z wyników z kroków 2.2.3–2.2.4, aby określić idealne rozcieńczenia gradientu, które można zastosować do rozdzielenia komórek w nieciągłych gradientach na większą skalę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek do głównego eksperymentu
<ol>
	<li>Przygotować świeże kultury przez noc, zaszczepiając 10 ml odpowiedniego bulionu, jak opisano w kroku 1.2.
	<ol>
		<li>Inkubować kultury przez noc w odpowiednich warunkach, jak opisano w kroku 1.2.1.</li>
		<li>Osadzać nocną kulturę w osadach zgodnie z opisem w kroku 1.2.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj komórki zgodnie z opisem w kroku 1.2.3.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml 1x PBS. Jeśli szczep jest śluzowaty i nie osadza się łatwo, należy ponownie zawiesić osad w objętości do 2 ml PBS lub pożywki resztkowej. Ogniwa są teraz gotowe do użycia.</li>
</ol>
4. Przygotowanie nieciągłych gradientów gęstości
UWAGA: Alternatywna metoda przygotowania gradientu od dołu (najbardziej skoncentrowany) do góry (najmniej skoncentrowany) za pomocą pipety jest opisana w kroku 7.
<ol>
	<li>Odpipetować 1 ml najbardziej rozcieńczonego gradientu gęstości do 5 ml polipropylenowej probówki z okrągłym dnem, aby utworzyć górną, najbardziej rozcieńczoną warstwę gradientu. 
	UWAGA: Kolejne warstwy bardziej skoncentrowanych rozcieńczeń gradientowych będą dodawane poniżej tej warstwy za pomocą igły, aby nie naruszyć warstw. Zalecane są co najmniej dwie i maksymalnie trzy warstwy gradientowe po 1 ml każda, aby zapewnić solidną separację i łatwą wizualizację bakterii.
	<ol>
		<li>Używając jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml z dołączoną igłą o długości 1,5 cala, pobrać do strzykawki 1 ml następnego najbardziej stężonego podłoża o gradionym gradiencie gęstości. Unikaj pobierania powietrza, ponieważ pęcherzyki mogą zakłócić warstwy gradientu.</li>
		<li>Umieścić koniec igły na dnie probówki zawierającej pierwszą warstwę. Zawartość strzykawki należy odsysać bardzo powoli, aby uniknąć pomieszania interfejsu. 
		nuta: Granica faz dwóch rozcieńczeń wzrośnie w miarę dodawania bardziej skoncentrowanego rozcieńczenia gradientowego. Obserwuj interfejs, trzymając go w pozycji do światła lub okna zewnętrznego. Jeśli nie zostanie zaobserwowany żaden wyraźny interfejs, odrzuć gradient i zacznij od nowa.
		<ol>
			<li>Usunąć igłę z gradientu bardzo delikatnie, aby nie naruszyć granicy faz między różnymi rozcieńczeniami gradientu. Umieść rurkę w odpowiednim stojaku, aby utrzymać ją w pozycji pionowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku stosowania trzech różnych rozcieńczeń należy powtórzyć kroki 4.1.1–4.1.2.1 tak, aby najgęstsze rozcieńczenie znajdowało się na dole. Jeśli gradient został pomyślnie skonstruowany, będą trzy odrębne warstwy bez mieszania na interfejsach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Dodawanie przygotowanych komórek do gradientów i rozdzielanie przez wirowanie
<ol>
	<li>Dodaj 600 μl przygotowanych komórek z kroku 3.3 do górnej części gradientu w probówce bardzo powoli i bez mieszania interfejsu, jak opisano w kroku 2.2.</li>
	<li>Umieść probówki w adapterach rur i zważ połączone łączniki i rurki, aby upewnić się, że są wyważone.
	<ol>
		<li>Umieść adaptery probówek w wirniku o stałym kącie w wirówce stołowej. Wirować przez 30 minut przy 3 000 x g.</li>
		<li>Po odwirowaniu ostrożnie wyjmij probówki, umieść je w odpowiednim stojaku i sfotografuj wyniki jako zapis.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odzyskaj frakcje bakteryjne do kwantyfikacji kwasu uronowego lub ekstrakcji DNA, wykonując krok 6.
	<ol>
		<li>Jeżeli dalsze zastosowania nie są wymagane, próbki/gradienty należy usunąć w laboratorium odpowiednią drogą do płynnych odpadów biologicznych. 
		nuta: Ważne jest, aby potwierdzić separację dla nowych gatunków/szczepów bakterii. Poszczególne frakcje z gradientu należy zbadać pod mikroskopem, za pomocą testu kwasu uronowego (etap 8) lub innego odpowiedniego testu ilościowego w celu potwierdzenia fenotypu kapsułki każdej frakcji. Jeżeli celem jest rozdzielenie na podstawie agregacji lub wielkości komórek, należy zastosować niezależne odpowiednie testy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Odzyskiwanie frakcji próbki i opcjonalny etap wzrostu
<ol>
	<li>Odzyskaj frakcje z gradientu, usuwając i odrzucając jakąkolwiek ciecz z górnego rozcieńczenia, jeśli w tej warstwie nie ma frakcji bakteryjnej.
	<ol>
		<li>Aby usunąć górną frakcję, użyj pipety P200 i delikatnie przełóż końcówkę pipety przez gradient do frakcji i podnieś frakcję. Umieść frakcję w probówce o pojemności 1,5 ml i odpowiednio oznacz.</li>
		<li>Aby odzyskać dalsze frakcje, nadal używając pipety P200, delikatnie przełóż końcówkę przez gradient do frakcji i odzyskaj frakcję do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml. Usuń nadmiar gradientu, gdy uzyskuje się dostęp do ułamków znajdujących się niżej w gradiencie.</li>
		<li>Jeśli wymagana jest ekstrakcja DNA z frakcji zawierającej bardzo niską liczbę komórek (np. w przypadku gęstości-TraDISort), należy przeprowadzić subkulturę frakcji, postępując zgodnie z protokołem z kroku 6.2 w celu opcjonalnego wzrostu w celu uzyskania większej liczby komórek. 
		nuta: Będzie niski poziom przenoszenia z komórek na górze gradientu do niższych frakcji, ponieważ frakcje są usuwane od góry do dołu. Zminimalizuj to, pracując ostrożnie, aby nie mieszać gradientu, używając igły do usuwania niższych frakcji i wykonując ponowne oczyszczanie próbek o bardzo niskiej obfitości, w przypadku których przeniesienie może wpłynąć na wyniki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść komórki z frakcji o niskiej liczebności odzyskanej w krokach 6.1.1–6.1.2 do 5 ml odpowiedniej pożywki płynnej. Umieścić w inkubatorze i rosnąć przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
	<ol>
		<li>Po 2 godzinach wzrostu lub gdy próbka osiągnie OD600 równe 1, przenieść kulturę do probówki o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę przez 10 minut przy stężeniu 3 200 x g w wirówce z odchylanymi wiadrami i pokrywkami szczelnymi jak aerozol. Odrzucić supernatant</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 ml 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować świeży gradient gęstości pojedynczego stężenia w probówce polipropylenowej o pojemności 5 ml. Użyj stężenia gradientu tuż nad położeniem frakcji w pierwotnym gradiencie (np. do oczyszczania mutanta ΔslyA pokazanego na <silna klasa="xfig">Rysunek 2D, użyto by pożywki o gradinie gęstości 15%). 
	UWAGA: Ten etap ponownego oczyszczania jest opcjonalny.
	<ol>
		<li>Nałożyć komórki na wierzch gradientu i odwirować zgodnie z opisem w krokach 2.2 i 5.1.</li>
		<li>Wyjmij probówki z wirówki i umieść je w odpowiednim stojaku. Sfotografować gradient i odzyskać frakcję do ekstrakcji DNA, jak opisano w 6.1–6.1.2. 
		nuta: Próbka jest teraz gotowa do ekstrakcji DNA lub innych dalszych zastosowań.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Alternatywna metoda przygotowania gradientu od dołu (najbardziej skoncentrowany) do góry (najmniej skoncentrowany) za pomocą pipety
<ol>
	<li>Użyć rozcieńczeń gradientowych określonych w kroku 2.2.3. Używając pipety o pojemności 1 000 μl, dodaj 1 ml najgęstszego rozcieńczenia gradientowego do probówki o pojemności 5 ml.
	<ol>
		<li>Używając pipety o pojemności 200 μl, bardzo powoli dodać 200 μl następnego gęstego rozcieńczenia gradientowego na wierzch warstwy w probówce, aby nie mieszać granicy faz. Dodaj kolejne 200 μl, a następnie końcowe 600 μl. Dodanie wielu mniejszych objętości daje większą kontrolę nad szybkością pipetowania i zapobiega mieszaniu się międzyfazy. Jeśli interfejs się miesza, odrzuć i zacznij od nowa.</li>
		<li>Powtórzyć krok 7.1.1 z trzecim, najmniej gęstym stężeniem gradientu, jeżeli stosowane są trzy rozcieńczenia. Probówka powinna teraz mieć nachylenie 2 ml lub 3 ml, w zależności od wyników z kroku 2.2.3.</li>
		<li>Przejdź do kroku 5 protokołu, aby dodać komórki i kontynuować eksperyment.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Pomiar ilości kapsułki za pomocą testu kwasu uronowego
<ol>
	<li>Dostosować OD600 każdej odzyskanej frakcji do 4,0 przez rozcieńczenie PBS. Kontynuuj kwantyfikację kwasów uronowych zgodnie z wcześniejszymi publikacjami1.</li>
</ol>

<ol><li>Favre-Bonté, S., Licht, T. R., Forestier, C., Krogfelt, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klebsiella+pneumoniae+capsule+expression+is+necessary+for+colonization+of+large+intestines+of+streptomycin-treated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Klebsiella pneumoniae capsule expression is necessary for colonization of large intestines of streptomycin-treated mice.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 6152-6156 (1999).</li>
<li>Bachman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Klebsiella+pneumoniae+fitness+genes+during+lung+infection%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Klebsiella pneumoniae fitness genes during lung infection.</a> mBio. 6 (3), 1-9 (2015).</li>
<li>Paczosa, M. K., Mecsas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klebsiella+pneumoniae%3A+Going+on+the+offense+with+a+strong+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews+%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Klebsiella pneumoniae: Going on the offense with a strong defense.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews : MMBR. 80 (3), 629-661 (2016).</li>
<li>Shon, A. S., Bajwa, R. P. S., Russo, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypervirulent+%28hypermucoviscous%29+Klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Hypervirulent (hypermucoviscous) Klebsiella pneumoniae.</a> Virulence. 4 (2), 107-118 (2014).</li>
<li>Fang, C. -T., Chuang, Y. -P., Shun, C. -T., Chang, S. -C., Wang, J. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+virulence+gene+in+Klebsiella+pneumoniae.+strains+causing+primary+liver+abscess+and+septic+metastatic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel virulence gene in Klebsiella pneumoniae. strains causing primary liver abscess and septic metastatic complications.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199 (5), 697-705 (2004).</li>
<li>Lai, Y. -C., Peng, H. -L., Chang, H. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RmpA2%2C+an+activator+of+capsule+biosynthesis+in+Klebsiella+pneumoniae+CG43%2C+regulates+K2+cps+gene+expression+at+the+transcriptional+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">RmpA2, an activator of capsule biosynthesis in Klebsiella pneumoniae CG43, regulates K2 cps gene expression at the transcriptional level.</a> Journal of Bacteriology. 185 (3), 788-800 (2003).</li>
<li>Menck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+monocytes+by+double+gradient+centrifugation+and+their+differentiation+to+macrophages+in+Teflon-coated+cell+culture+bags%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in Teflon-coated cell culture bags.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 1-10 (2014).</li>
<li>Dorman, M. J., Feltwell, T., Goulding, D. A., Parkhill, J., Short, F. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDorman%2C+MJ+%22The+capsule+regulatory+network+of+Klebsiella+pneumoniae+defined+by+density-TraDISort%22">The capsule regulatory network of Klebsiella pneumoniae defined by density-TraDISort</a>. , (2018).</li>
<li>Geno, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumococcal+capsules+and+their+types%3A+Past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Pneumococcal capsules and their types: Past, present, and future.</a> Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 871-899 (2015).</li>
<li>Weber, B. S., Harding, C. M., Feldman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+Acinetobacter%3A+From+the+cell+surface+to+infinity+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Pathogenic Acinetobacter: From the cell surface to infinity and beyond.</a> Journal of Bacteriology. 1986 (6), 880-887 (2016).</li>
<li>Mubaiwa, T. D., Semchenko, E. A., Hartley-Tassell, L. E., Day, C. J., Jennings, M. P., Seib, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sweet+side+of+the+pathogenic+Neisseria.%3A+The+role+of+glycan+interactions+in+colonisation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The sweet side of the pathogenic Neisseria.: The role of glycan interactions in colonisation and disease.</a> Pathogens and Disease. 75 (5), 1-9 (2017).</li>
<li>Wu, K. -M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequencing+and+comparative+analysis+of+Klebsiellapneumoniae.+NTUH-K2044%2C+a+strain+causing+liver+abscess+and+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Genome sequencing and comparative analysis of Klebsiellapneumoniae. NTUH-K2044, a strain causing liver abscess and meningitis.</a> Journal of Bacteriology. 191 (14), 4492-4501 (2009).</li>
<li>Broberg, C. A., Wu, W., Cavalcoli, J. D., Miller, V. L., Bachman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+Klebsiellapneumoniae.+Strain+ATCC+43816+KPPR1%2C+a+rifampin-resistant+mutant+commonly+used+in+animal%2C+genetic%2C+and+molecular+biology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announcements%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of Klebsiellapneumoniae. Strain ATCC 43816 KPPR1, a rifampin-resistant mutant commonly used in animal, genetic, and molecular biology studies.</a> Genome Announcements. 2 (5), (2014).</li>
<li>Croucher, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+conjugative+elements+in+the+evolution+of+the+multidrug-resistant+pandemic+clone+Streptococcuspneumoniae+Spain23F+ST81%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role of conjugative elements in the evolution of the multidrug-resistant pandemic clone Streptococcuspneumoniae Spain23F ST81.</a> Journal of Bacteriology. 191 (5), 1480-1489 (2009).</li>
<li>Croucher, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+genetic+constraints+on+Pneumococcal+serotype+switching%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Selective and genetic constraints on Pneumococcal serotype switching.</a> PLoS Genetics. 11 (3), 1-21 (2015).</li>
<li>Pertoft, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+gradients+prepared+from+colloidal+silica+particles+coated+by+polyvinylpyrrolidone+%28Percoll%29%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll).</a> Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).</li>
<li>Breakwell, D. P., Moyes, R. B., Reynolds, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+staining+of+bacteria%3A+Capsule+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Differential staining of bacteria: Capsule stain.</a> Current Protocols in Microbiology. 15 (1), 1-4 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych interesów finansowych do ujawnienia.

Kapsułka jest ważnym czynnikiem wirulencji u wielu gatunków bakterii, w tym K. pneumoniae3, Streptococcus pneumoniae9, Acinetobacter10 i Neisseria11 . Chociaż istnieją różne metody kwantyfikacji i wizualizacji kapsułek bakteryjnych, obecnie nie ma powszechnie stosowanej metody fizycznego oddzielania komórek otoczkowanych i niekapsułkowanych. W tym artykule zademonstrowaliśmy solidną metodę separacji populacji bakterii na podstawie kapsułek, z wieloma potencjalnymi zastosowaniami w połączeniu z różnymi protokołami upstream lub downstream.
Obecność kapsułki powierzchniowej może zmniejszyć gęstość komórek bakteryjnych, co umożliwia separację przez wirowanie w gradiacji gęstości (ryc. 2D). Zwalidowaliśmy tę metodę u K. pneumoniae NTUH-K204412 i ATCC4381613, a także u Streptococcus pneumoniae 23F14 i jego mutanta Δcps 15. W tej metodzie wykorzystuje się Percoll16 jako główny składnik gradientu gęstości, który jest zawiesiną powlekanych cząstek krzemionki koloidalnej, która ma niską lepkość i nie jest toksyczna dla bakterii - w zasadzie do wyznaczenia gradientu gęstości można zastosować inne substancje spełniające te kryteria.
Zapewnienie, że warstwy o różnej gęstości nie mieszają się podczas konstruowania gradientów gęstości, może być trudne, a jeśli dojdzie do mieszania, metoda separacji nie da czystych wyników. Uwzględniliśmy dwie alternatywne metody nalewania gradientów, za pomocą igły lub pipety - obie są skuteczne, a to, którą metodę zastosować, jest po prostu kwestią preferencji. W przypadku wszystkich etapów, które obejmują pipetowanie substancji (zawiesiny bakteryjnej lub bardziej rozcieńczonej warstwy gradientu) powyżej warstwy gradientowej, pipetowanie wielu porcji o mniejszych objętościach może ułatwić uzyskanie ostrej granicy faz bez mieszania warstw.
Ograniczeniem tego protokołu jest to, że nie można zagwarantować jego działania z innymi gatunkami bakterii. Dlatego tak ważne jest, aby podczas badania nowego gatunku lub szczepu bakterii zweryfikować separację na podstawie gęstości przy użyciu dodatkowej, niezależnej metody kwantyfikacji kapsułek. Wizualizacja bakterii obecnych w każdej frakcji za pomocą mikroskopii z odpowiednimi barwnikami na kapsułkach jest niezawodną metodą, dla której dostępne są szczegółowe protokoły17. Alternatywnie, kapsułki zawierające kwasy uronowe (takie jak Escherichia coli i K. pneumoniae) można określić ilościowo za pomocą specjalnego testu, jak pokazano na rysunku 2B1. Test lepkości śluzowej oparty na wirowaniu nie nadaje się jako niezależna metoda walidacji, ponieważ test ten zależy również od gęstości komórek bakteryjnych.
Innym ograniczeniem tej metody jest to, że produkcja kapsułek jest bardzo wrażliwa na warunki hodowli i nawet niewielkie zmiany pożywki, temperatury lub napowietrzenia mogą wpłynąć na wyniki tego testu. Aby zminimalizować ten problem, badacze mogą użyć zdefiniowanej pożywki wzrostowej lub złożonej pożywki spójnej z partią, zachować identyczność wszystkich innych parametrów wzrostu między eksperymentami i uwzględnić odpowiednie szczepy kontrolne, aby umożliwić interpretację nieoczekiwanych wyników. Niektóre kapsułki bakteryjne są delikatne i mogą odciąć się od komórki podczas pipetowania kultur. Aby uniknąć ścinania kapsułek, kultury należy odwirować i ponownie zawiesić nie więcej niż dwa razy podczas przygotowania do załadunku na gradiacji. Jeśli utrata torebki podczas koncentracji kultur pozostaje problematyczna, kultury bakteryjne można zastosować bezpośrednio do gradientu gęstości, dodając większą objętość zawiesiny bakteryjnej, jeśli to konieczne w celu wizualizacji.
Przyszłe zastosowania tej metody polegają na zastosowaniu jej do innych gatunków bakterii i wykorzystaniu tej separacji w połączeniu z różnymi technologiami poprzedzającymi i następczymi. Oprócz gęstości-TraDISort8 sugerujemy, że separacja w gradinie gęstości bakterii otoczkowanych może być stosowana do izolacji mutantów ze zmienioną kapsułką, do oczyszczania otoczkowanych komórek z mieszanych kultur lub złożonych próbek oraz do szybkiego profilowania produkcji kapsułek w wielu szczepach. Wreszcie, technologia ta może być wykorzystana do badania innych fenotypów bakteryjnych, takich jak agregacja.

Wiele gatunków bakterii wytwarza kapsułkę polisacharydową, która chroni komórkę bakteryjną przed różnymi stresami fizycznymi oraz przed rozpoznaniem i zabiciem przez układ odpornościowy. U Klebsiella pneumoniae produkcja kapsułek jest bezwzględnym wymogiem infekcji1,2. Kapsułka K. pneumoniae pośredniczy w oporności na peptydy przeciwdrobnoustrojowe, oporności na zabijanie za pośrednictwem dopełniacza, zapobieganiu fagocytozie i tłumieniu wrodzonej odpowiedzi immunologicznej3. Nadmierna produkcja kapsułek wiąże się ze zwiększoną zjadliwością i zakażeniami pozaszpitalnymi (a nie szpitalnymi)4.
Dostępny jest szereg testów ilościowych i jakościowych do badania produkcji kapsułek. W przypadku gatunków Klebsiella należą do nich test ciągu5, w którym wykałaczka przyłożona do kolonii jest ciągnięta w górę i mierzona jest długość wytworzonego sznurka, oraz test lepkości śluzowej6, który polega na powolnym odwirowaniu kultury, a następnie pomiarze gęstości optycznej supernatantu. Metody te są proste i szybkie, ale brakuje im czułości, gdy są stosowane na klasycznych szczepach Klebsiella, a nie na szczepach nadprodukcyjnych w kapsułkach. Inną metodą oznaczania ilościowego kapsułek jest test kwasu uronowego, który jest trudny technicznie i wymaga użycia stężonego kwasu siarkowego1. Wreszcie, kapsułka jest widoczna bezpośrednio pod mikroskopem (ryc. 1A). Spośród tych metod tylko mikroskopia pozwala użytkownikowi obserwować różne stany kapsułkowania w jednej populacji, a żadna z tych metod nie umożliwia fizycznego oddzielenia bakterii w kapsułkach i bez nich.
Separacje oparte na gęstości metodą wirowania gradientowego są rutynowo stosowane w biologii komórki do oczyszczania różnych typów komórek eukariotycznych7, ale rzadko stosowane w badaniach mikrobiologicznych. Test lepkości śluzowej dla Klebsiella opiera się na obserwacji, że wysoce kapsułkowane bakterie potrzebują więcej czasu na osadzanie się przez wirowanie i doszliśmy do wniosku, że może to być spowodowane zmniejszoną ogólną gęstością otoczkowanych komórek. Przedstawiona tutaj metoda została opracowana w celu fizycznego oddzielenia populacji K. pneumoniae według ilości kapsułki, przy użyciu wirowania w gradiacji gęstości (ryc. 1). Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do Streptococcus pneumoniae, co wskazuje, że ma ona zastosowanie do innych gatunków bakterii. Separacja gradientu gęstości nasyconej biblioteki mutantów transpozonów w połączeniu z sekwencjonowaniem transpozonowo-insercyjnym (gęstość-TraDISort) została wykorzystana do identyfikacji genów zaangażowanych w produkcję i regulację kapsułki8. Podobnie, metodę tę zastosowano w połączeniu z losową reakcją łańcuchową polimerazy (PCR) poszczególnych kolonii w celu wyizolowania nieotoczkowanych mutantów K. pneumoniae. Metoda ta może być również stosowana do szybkich porównań produkcji kapsułek między różnymi populacjami i warunkami lub do oczyszczania bakterii w kapsułkach ze złożonych próbek (ryc. 1B). Wreszcie, istnieje możliwość oznaczenia innych fenotypów, które wpływają na gęstość, takich jak wielkość komórki lub agregacja.
Ten manuskrypt pokazuje, jak zoptymalizować procedurę dla nowego gatunku lub szczepu bakterii oraz demonstruje konstrukcję i przebieg nieciągłego gradientu gęstości w celu oddzielenia bakterii hiperkapsułkowanych, kapsułkowanych i niekapsułkowanych.

<table><tbody><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5810R z wirnikiem A-4-81 i wiadrami 500 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5810 718.007</td><td></td></tr><tr><td>Adaptery do probówek 15 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5810 722.004</td><td></td></tr><tr><td>Stały wirnik andgle F-34-6-38</td><td>Eppendorf</td><td>5804 727.002</td><td></td></tr><tr><td>Adapter probówek 2,6 do 7 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5804 739.000</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5424 z wirnikiem FA-45-24-11</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.460</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td></td></tr><tr><td>5 mL polipropylenowa rurka z okrągłym dnem</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>1 mL jednorazowa strzykawka Luer slip</td><td>Becton Dickinson</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Igła AGANI 21G Zielona x 1,5"</td> <td>Terumo</td><td>AN 2138R1</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipeta i końcówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta i końcówki</td><td></td><td></td><td></td> P200</tr></tbody></table>

oddzielanie bakterii według ilości kapsułek za pomocą nieciągłego gradientu gęstości

Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient

Kapsułka jest kluczowym czynnikiem wirulencji u wielu gatunków bakterii, pośrednicząc w unikaniu odporności i odporności na różne stresy fizyczne. Chociaż dostępnych jest wiele metod ilościowego określania i porównywania produkcji kapsułek między różnymi szczepami lub mutantami, nie ma powszechnie stosowanej metody sortowania bakterii na podstawie ilości wytwarzanych przez nie kapsułek. Opracowaliśmy metodę rozdzielania bakterii według ilości kapsułek, wykorzystując nieciągły gradient gęstości. Metodę tę stosuje się do półilościowego porównywania ilości kapsułek między kulturami, do izolowania mutantów ze zmienioną produkcją kapsułek oraz do oczyszczania bakterii w kapsułkach ze złożonych próbek. Metodę tę można również połączyć z sekwencjonowaniem insercji transpozonów w celu identyfikacji genów zaangażowanych w regulację kapsułki. W tym miejscu szczegółowo zademonstrowano metodę, w tym sposób optymalizacji warunków gradientu dla nowego gatunku lub szczepu bakterii oraz sposób konstruowania i uruchamiania gradientu gęstości.

Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 2. Dokładny oczekiwany wynik będzie zależał od gatunku bakterii, konfiguracji gradientów gęstości oraz od tego, czy użytkownik bada pojedynczy szczep, czy pulę mutantów. Większość szczepów migruje do jednego miejsca w gradiencie, co pokazano na Rysunku 2A i 2D. Zastosowanie tej metody do biblioteki mutantów bakteryjnych doprowadzi do powstania głównego prążka powyżej gradientu, mniej gęstego prążka rozprzestrzenionego w górnej warstwie gradientu oraz niewielkiej frakcji akapsularnej na dnie (Rysunek 2B). Frakcje te różnią się ilością kapsuły, co wykazano w teście na kwasy uronowe (Rysunek 2B). Sekwencjonowanie insercji transpozonalnych poszczególnych frakcji pozwala na wyraźną lokalizację specyficznych mutantów w różnych frakcjach gradientu, co pokazano dla locus biosyntezy kapsuły K. pneumoniae ATCC43816 (Rysunek 2C). Reprezentatywne wyniki dla czystych kultur K. pneumoniae NTUH-K2044 i S. pneumoniae oraz różnych mutantów biosyntezy lub regulacji kapsuły przedstawiono na Rysunku 2D.
<img alt="Schemat oczyszczania hodowli bakteryjnej; metoda wirowania w celu izolacji DNA i sekwencjonowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58679/58679fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat metody wirowania gradientowego w celu oddzielenia bakterii na podstawie obecności kapsułki oraz jej zastosowania. (A) Obraz z mikroskopu elektronowego komórki otoczkowanej Klebsiella pneumoniae. Kapsułka jest widoczna jako gęsta warstwa na zewnątrz komórki. (B) Zastosowania wirowania gradientowego w badaniach bakterii otoczkowanych. (Bi) Rozdzielanie według gęstości może być wykorzystane do generowania frakcji o wysokim, niskim lub braku kapsułki z biblioteki mutantów transpozonowych, po czym następuje sekwencjonowanie miejsc insercji transpozonów w celu zdefiniowania genów wpływających na produkcję kapsułki. (Bii) Oczyszczanie bakterii otoczkowanych z próbki złożonej. (Biii) Wykorzystanie rozdzielania opartego na gęstości do szybkiego porównywania ilości kapsułki pomiędzy próbkami. Metoda ta pozwala również na wizualizację heterogenicznej produkcji kapsułki w populacjach bakteryjnych, jak pokazano w (Biii). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58679/58679fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wirowanie w gradiencie gęstości Percoll bakterii K. pneumoniae; schemat analizy locus genu z wykresem liczby odczytów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58679/58679fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki. (A) Przykład wyników testów z mini-gradientem. Dwa różne szczepy K. pneumoniae wirowano w 1 mL 15% medium w gradiencie gęstości. Hipermutkowiskozowy szczep NTUH-K2044 pozostaje powyżej warstwy medium gradientowego, podczas gdy ATCC43816 (który wytwarza mniej kapsuły) migruje na dno warstwy. (Bi) Wykorzystanie gradientu gęstości do rozdzielenia biblioteki mutantów transpozonowych na trzy frakcje. Należy zauważyć, że dolna frakcja zawiera niewielki odsetek mutantów i nie jest widoczna na tym zdjęciu. (Bii) Walidacja różnych ilości kapsuły w frakcjach górnej, środkowej i dolnej za pomocą testu na kwasy uronowe. Komórki z frakcji górnej, środkowej i namnożonej frakcji dolnej wyizolowano i resuspenderowano w PBS do OD600 wynoszącej 4, następnie wyekstrahowano polisacharydy kapsuły i zmierzono ilość kwasów uronowych1. (C) Przykładowe wyniki density-TraDISort. Zidentyfikowane lokalizacje mutacji są zaznaczone niebieskimi liniami nad schematem chromosomu. Mutanty pozbawione kapsuły można zidentyfikować jako te, które są obecne w bibliotece wejściowej, ale występują w zmniejszonej ilości w frakcji górnej, będąc jednocześnie wzbogaconymi w frakcji dolnej, co pokazano tutaj dla locus biosyntezy kapsuły8. (D) Przykład wykorzystania wirowania w gradiencie gęstości do porównania ilości kapsuły między szczepami typu dzikiego a mutantami K. pneumoniae NTUH-K2044 oraz S. pneumoniae 23F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58679/58679fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Pokazujemy użycie nieciągłych gradientów gęstości do rozdzielania populacji bakterii na podstawie produkcji kapsułek. Metoda ta służy do porównywania ilości kapsułek między kulturami, izolowania mutantów o określonym fenotypie kapsułki lub do identyfikacji regulatorów kapsułki. Opisano tutaj optymalizację i przebieg testu.

Oddzielanie bakterii według ilości kapsułek za pomocą nieciągłego gradientu gęstości

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie Klebsiella, takie jak to, które geny są używane do regulacji kapsułki i związanych z nią wirulentów. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że zapewnia ona środki do fizycznego oddzielenia szczepów kapsułkowanych i niekapsułkowanych, a także może być wykorzystywana do szybkich porównań między szczepami do produkcji kapsułek. Chociaż metoda ta została opracowana w celu zbadania regulacji kapsułek u Klebsiella, można ją również zastosować do różnych gatunków bakterii.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ nalewanie gradientów i dodawanie komórek do gradientów może być dość trudne. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ pokazujemy techniki, które są trudne do opanowania, podając sugestie i wskazówki, które pomogą użytkownikowi. Na początek wybierz pojedynczą kolonię z talerza podstawowego ze sterylną pętlą i zaszczep 10 mililitrów odpowiedniego bulionu.Inkubuj kulturę przez noc. Następnie przenieś kulturę do 15-mililitrowej probówki i odwiruj. Następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach PBS.Powtórzyć wirowanie i odrzucić powstały supernatant. Następnie ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach PBS. Aby utworzyć rozcieńczenia gradientu gęstości, należy połączyć podłoże o gradiencie gęstości z PBS.Następnie podniec 600 mikrolitrów każdego rozcieńczenia gradientowego na pojedyncze dwumililitrowe probówki. Weź 100 mikrolitrów komórek za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów i umieść końcówkę pipety z boku rurki tuż pod menisku jednego z wielu gradientów. Odsysaj komórki bakteryjne do gradientu bardzo powoli, uważając, aby nie zmieszać interfejsu.Odwirować przygotowane probówki przez 10 minut przy stężeniu 8 000 g. Następnie przenieś probówki do stojaka, aby zobrazować minimalne rozcieńczenie gradientu wymagane do utrzymania komórek tuż nad warstwą gradientu. Najpierw przenieś jeden mililitr najbardziej rozcieńczonego rozcieńczenia gradientu gęstości do pięciomililitrowej probówki z okrągłym dnem.Za pomocą strzykawki z igłą o średnicy 1,5 cala pobierz jeden mililitr następnego najbardziej skoncentrowanego gradientu gęstości. Umieścić igłę na dnie probówki i bardzo powoli wstrzykiwać zawartość strzykawki. Na każdym etapie gradientu gęstości musi znajdować się wyraźny interfejs.Jeśli warstwy się zmieszają, nie osiągniesz czystej separacji bakterii. Delikatnie wyjąć igłę z gradientu, aby nie naruszyć granicy faz między rozcieńczeniami gradientu. Następnie umieść rurkę w stojaku.Ostrożnie dodaj 600 mikrolitrów przygotowanych komórek do górnej części gradientu w probówce. Następnie umieść rurkę w adapterze do probówki i zważ rurkę z adapterem, aby zapewnić równowagę. Następnie umieść adapter probówki w wirniku o stałym kącie w wirówce stołowej i odwiruj probówkę przez 30 minut przy 3 000 g.Na koniec, po odwirowaniu, ostrożnie wyjmij probówkę, umieść ją na stojaku i sfotografuj wyniki. W tym protokole zastosowano wirowanie w gradiencie gęstości do oddzielenia szczepów bakteryjnych na podstawie ilości wytwarzanych przez nie kapsułek. Chociaż dokładne wyniki zależą od gatunku bakterii, większość szczepów będzie migrować do jednego miejsca w gradiencie.Zastosowanie tej metody do biblioteki mutantów bakteryjnych powinno wytworzyć główne pasmo powyżej gradientu, mniej gęste pasmo przez najwyższą warstwę gradientu i niewielką frakcję a-torebkową na dole. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że interfejsy gradientu nie powinny być mieszane, a gradient nie powinien zawierać pęcherzyków powietrza. Po procedurze należy wykonać metody walidacji, takie jak test kwasu uronowego lub mikroskopia, w celu zbadania ilości kapsułek.Jest to szczególnie ważne w przypadku stosowania tej techniki w przypadku nowych szczepów. Nie zapominaj, że praca z patogenami z grupy zagrożenia 2 może być niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak korekcyjne wyposażenie ochronne, przestrzeganie ocen ryzyka i prawidłowa utylizacja kultur.

separating-bacteria-capsule-amount-using-discontinuous-density

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Źródło: Cian, M. B. et al., Separation of the cell envelope for Gram-negative bacteria into Inner and Outer membrane fractions with Technical Adjustment for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje oddzielenie wewnętrznej i zewnętrznej frakcji błonowej bakterii Gram-ujemnych za pomocą ultrawirowania w gradionym poziomie sacharozy. Frakcje membranowe są oczyszczane i przechowywane w niskich temperaturach w celu ukierunkowanej analizy składników specyficznych dla membrany.

Separacja wewnętrznych i zewnętrznych frakcji błonowych bakterii Gram-ujemnych

Źródło: Feltwell, T., et.al. Oddzielanie bakterii według ilości kapsułki za pomocą nieciągłego gradientu gęstości. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia przygotowanie i charakterystykę szczepów bakteryjnych o różnej produkcji kapsułek. Szczepy chorobotwórcze niosące różne mutacje w genach związanych z kapsułkami są hodowane, hodowane w płynnych pożywkach i poddawane wirowaniu w celu rozróżnienia fenotypów kapsułek na podstawie gęstości osadów. Leczenie buforowe stosuje się w celu...

Hodowla i izolacja chorobotwórczych szczepów bakterii tworzących kapsułki

Źródło: Watson, D. C., et al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości z porowatymi kulkami żywicy do izolowania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu kultury bakteryjnej. Większe EV eluują się wcześnie, omijając pory żywicy, podczas gdy mniejsze białka dostają się do porów i wymywają później.

Izolacja bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość 

Source: Rustad, M., et.al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the purification of bacteriophages from a suspension containing host bacterial debris using a sucrose density gradient. It shows how the density gradient separates phages by buoyant density, enabling recovery of a visible band for resuspension and further analysis.

Purification of Bacteriophages Using a Sucrose Density Gradient

W tym filmie demonstrujemy technikę - chromatografię wykluczania wielkości - do oddzielania heterogenicznej populacji pęcherzyków błony zewnętrznej lub OMV pochodzących od bakterii. Pęcherzyki te są sferycznymi strukturami o rozmiarach nano i są dzielone na duże i małe subpopulacje na podstawie ich wielkości za pomocą chromatografii wykluczania wielkości.

Chromatografia wykluczania wielkości Separacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych bakterii: technika oddzielania heterogenicznej populacji pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych na podstawie ich wielkości

W tym artykule staramy się opisać wydajność techniki wirowania w gradiacji gęstości i jej zastosowanie w badaniach nad fizjologią plemników.

Pobieranie nasienia o zróżnicowanej jakości za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

Bakterie Gram-ujemne wytwarzają dwie przestrzennie oddzielone błony. Błona zewnętrzna jest oddzielona od błony wewnętrznej warstwą peryplazmy i peptydoglikanu. Zdolność do wyizolowania podwójnych warstw tych drobnoustrojów miała kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich fizjologii i patogenezy.

Rozdzielenie otoczki komórkowej dla bakterii Gram-ujemnych na frakcje błony wewnętrznej i zewnętrznej z dostosowaniami technicznymi dla Acinetobacter baumannii

Pęcherzyki bakteryjne odgrywają ważną rolę w patogenezie i mają obiecujące zastosowania biotechnologiczne. Niejednorodność pęcherzyków komplikuje analizę i użytkowanie; Dlatego konieczna jest prosta, powtarzalna metoda oddzielania pęcherzyków o różnych rozmiarach. Tutaj pokazujemy zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości do oddzielania heterogenicznych pęcherzyków wytwarzanych przez Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Chromatografia wykluczania wielkości do analizy niejednorodności pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii

To badanie opisuje metodę izolacji i oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (BEV) wzbogaconych z ludzkiego kału poprzez wirowanie w gradifikacji gęstości (DGC), identyfikuje fizyczne cechy BEV na podstawie morfologii, wielkości cząstek i stężenia, oraz omawia potencjalne zastosowania podejścia DGC w badaniach klinicznych i naukowych.

Izolacja i oczyszczanie bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkiego kału za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

Przedstawiamy protokół urządzenia do ciągłej kultury mikrofluidalnej (MCCD), które umożliwia uprawę populacji bakteryjnych w stałych warunkach niskiego pożywienia (aż do setek nanomolarnych stężeń) lub czasowych fluktuacji składników odżywczych w skali minut.

Urządzenie mikrofluidyczne do ciągłej hodowli przeznaczone do badania Escherichia coli w warunkach niskich i wahających się stężeń składników odżywczych

Poznaj metodę nieciągłego gradientu gęstości do separacji bakterii według produkcji kapsuł w badaniach nad regulacją wirulencji u Klebsiella. Technika umożliwia izolację szczepów z określonymi fenotypami kapsułowymi.

Oddzielanie bakterii według ilości kapsułek za pomocą nieciągłego gradientu gęstości

Przeglądaj więcej filmów