Name: Identyfikacja klas kodujących i niekodujących RNA wyrażonych we krwi pełnej świń (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę izolacji mRNA i ncRNA z pełnej krwi świń z redukcją globiny. Protokół umożliwia badanie interakcji gospodarz-patogen poprzez analizę ekspresji RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była głównie wspierana przez USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236, a częściowo przez USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Badanie to zostało częściowo wsparte powołaniem do Programu Uczestnictwa w Badaniach Rolniczych (Agricultural Research Service Research Participation Program) zarządzanego przez Oak Ridge Institute for Science and Education (ORISE) na mocy umowy międzyagencyjnej między Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych (DOE) a Departamentem Rolnictwa USA. ORISE jest zarządzany przez Oak Ridge Associated Universities na podstawie umowy DOE nr 1. DE-AC05-06LUB2310.
Chcielibyśmy podziękować dr Kay Faaberg za zakaźne klony HP-PRRSV, dr Susan Brockmeier za pomoc w pracy ze zwierzętami biorącymi udział w eksperymencie oraz Sue Ohlendorf za pomoc sekretarską w przygotowaniu manuskryptu.

<ol><li>Finotello, F., Di Camillo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+differential+gene+expression+with+RNA-seq%3A+challenges+and+strategies+for+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).</li>
<li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084(2014).</li>
<li>Koltes, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+putative+quantitative+trait+nucleotide+in+guanylate+binding+protein+5+for+host+response+to+PRRS+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection.</a> BMC Genomics. 16, 412(2015).</li>
<li>Miller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+signature+genes+in+PRRSV-infected+porcine+monocyte-derived+cells+to+different+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli.</a> PLoS One. 12 (7), 0181256(2017).</li>
<li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+construction+for+next-generation+sequencing%3A+overviews+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+RNA+Depletion+for+Efficient+Use+of+RNA-Seq+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).</li>
<li>Pollet, S. FR-AgEncode: a French pilot project to enrich the annotation of livestock genomes- RNA Extraction Protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf">ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf</a> (2015).</li>
<li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+small+non-coding+RNA+classes+expressed+in+swine+whole+blood+during+HP-PRRSV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection.</a> Virology. 517, 56-61 (2018).</li>
<li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+non-coding+RNA+expression+status+in+animals+faced+with+highly+pathogenic+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+%28HP-PRRSV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+World+Congress+on+Genetics+Applied+to+Livestock+Production%22%5BJournal%5D)">Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV).</a> Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), Species - Porcine 2 (2018).</li>
<li>Bivens Nathan, J., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+Library+Construction+Methods+for+Transcriptome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).</li>
<li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+ribo-minus+RNA-sequencing+and+polyA-selected+RNA-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing.</a> Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAseq+by+Total+RNA+Library+Identifies+Additional+RNAs+Compared+to+Poly%28A%29+RNA+Library%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library.</a> BioMed Research International. 2015, 9(2015).</li>
<li>Choi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+gene+discovery+and+coverage+using+RNA-seq+of+globin+RNA+reduced+porcine+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples.</a> BMC Genomics. 15, 954(2014).</li>
<li>Wu, K., Miyada, G., Martin, J., Finkelstein, D. Globin reduction protocol: A method for processing whole blood RNA samples for improved array results. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf">http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf</a> (2007).</li>
<li>TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Illumina%22">Illumina</a>. , (2018).</li>
<li>New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018).</li>
<li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041(2014).</li>
<li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916(2010).</li>
<li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tym artykule służy wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznacza rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. USDA jest dostawcą równych szans i pracodawcą.

Pierwszym krytycznym krokiem w protokole, który umożliwił jego optymalizację, były dodatkowe etapy zubożania globiny, które umożliwiły uzyskanie wysokiej jakości odczytów z próbek krwi pełnej. Jednym z największych ograniczeń w stosowaniu krwi pełnej w badaniach sekwencjonowania jest duża liczba odczytów w próbce, które będą mapować na cząsteczki globiny i zmniejszać odczyty, które mogą mapować na inne cząsteczki będące przedmiotem zainteresowania18. W związku z tym, optymalizując protokół dla nas...

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) stało się potężnym narzędziem do badania zmian zachodzących na poziomie genomu organizmów biologicznych. Przygotowanie próbek do metod NGS może być zróżnicowane w zależności od organizmu, rodzaju tkanki, a co ważniejsze, pytań, na które naukowcy chcą odpowiedzieć. Wiele badań zwróciło się ku NGS jako sposobowi badania różnic w ekspresji genów między stanami, takimi jak osoby zdrowe i chore1,2,3,4. Sekwencjonowanie odbywa się na podstawie całego genomu i pozwala badaczowi uchwycić większość, jeśli nie całość, informacji genomowych dla określonego markera genetycznego w danym punkcie czasowym.
Najczęstszymi markerami ekspresji są informacyjne RNA (mRNA). Najczęściej stosowane procedury przygotowywania bibliotek do sekwencjonowania RNA są zoptymalizowane pod kątem odzyskiwania cząsteczek mRNA poprzez zastosowanie serii oczyszczania, fragmentacji i ligacji5,6. Jednak decyzja o tym, w jaki sposób protokół ma zostać wykonany, zależy w dużej mierze od rodzaju próbki i pytań stawianych w związku z tą próbką. W większości przypadków ekstrahuje się całkowity RNA; jednak nie wszystkie cząsteczki RNA są interesujące, a w przypadkach takich jak badania nad ekspresją mRNA zbyt obfite gatunki RNA, takie jak rybosomalne RNA (rRNA), muszą zostać usunięte, aby zwiększyć liczbę wykrywalnych transkryptów związanych z mRNA. Najpopularniejszą i najszerzej stosowaną metodą usuwania licznych cząsteczek rRNA jest redukcja poliadenylowanych transkryptów RNA, określana jako zubożenie poliA7. Takie podejście dobrze sprawdza się w analizie ekspresji mRNA, ponieważ nie wpływa na transkrypty mRNA. Jednak w badaniach, które są zainteresowane niekodującymi lub wirusowymi RNA, zubożenie poliA również usuwa te cząsteczki.
Wiele badań skupia się na przygotowaniu biblioteki sekwencji RNA w celu zbadania ekspresji (kodowania) mRNA lub określonej klasy małego lub dużego niekodującego RNA. Chociaż istnieją inne procedury8 takie jak nasza, które pozwalają na przygotowanie podwójnej próbki, wiele badań przygotowuje biblioteki z oddzielnych próbek do oddzielnych badań, jeśli są dostępne. W przypadku badania takiego jak nasze, zwykle wymagałoby to wielu próbek krwi, co wydłuża czas, materiały eksploatacyjne i stres zwierząt. Celem naszego badania było wykorzystanie pełnej krwi pochodzącej od zwierząt do identyfikacji i ilościowego określenia różnych klas zarówno mRNA, jak i niekodującego RNA wyrażonych między zdrowymi i wysoce zjadliwymi świniami zakażonymi wirusem zespołu rozrodczości i oddechowości świń (HP-PRRSV)9,10, mimo że mamy tylko jedną próbkę krwi pełnej (2,5 ml) od każdej świni. Aby to zrobić, musieliśmy zoptymalizować typowe protokoły ekstrakcji i tworzenia bibliotek, aby wygenerować odpowiednie dane, które umożliwią analizę ekspresji zarówno mRNA, jak i niekodującego RNA (ncRNA) 11 z pojedynczej próbki.
To spowodowało potrzebę wprowadzenia protokołu, który pozwalałby na analizę mRNA i niekodujących RNA, ponieważ dostępne standardowe zestawy i metody ekstrakcji RNA i tworzenia bibliotek były przeznaczone głównie dla mRNA i wykorzystywały etap depulacji poli-A12. Ten krok uniemożliwiłby odzyskanie niekodującego RNA lub wirusowych transkryptów z próbki. Dlatego potrzebna była zoptymalizowana metoda, która pozwoliłaby na całkowitą ekstrakcję RNA bez zubożenia próbki poliA. Metoda przedstawiona w tym manuskrypcie została zoptymalizowana, aby umożliwić użycie krwi pełnej jako rodzaju próbki oraz zbudować biblioteki sekwencjonowania zarówno dla mRNA, jak i ncRNA o małych, i dużych rozmiarach. Metoda została zoptymalizowana, aby umożliwić analizę wszystkich wykrywalnych niekodujących RNA, a także zachować wirusowe RNA do późniejszych badań13. Podsumowując, nasz zoptymalizowany protokół przygotowania biblioteki pozwala na badanie wielu cząsteczek RNA z jednej próbki krwi pełnej.
Ogólnym celem zastosowania tej metody było opracowanie procesu, który pozwolił na pobranie zarówno niekodującego RNA, jak i mRNA z jednej próbki krwi pełnej. Dzięki temu możemy mieć mRNA, ncRNA i wirusowe RNA dla każdego zwierzęcia w naszym badaniu pochodzące z pojedynczej próbki9. To ostatecznie pozwala na więcej odkryć naukowych bez dodatkowych kosztów zwierzęcych i daje pełniejszy obraz ekspresji każdej pojedynczej próbki. Opisana metoda pozwala na badanie regulatorów ekspresji genów, a także pozwala na przeprowadzenie badań korelacyjnych porównujących ekspresję mRNA i niekodującego RNA przy użyciu pojedynczej próbki krwi pełnej. W naszym badaniu wykorzystaliśmy ten protokół do zbadania zmian w ekspresji genów i możliwych regulatorów epigenetycznych u zakażonych wirusem 9-tygodniowych samców świń komercyjnych.

<table><tbody><tr><td>Probówki PAXgene</td><td>PreAnalytix</td><td>762165</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy biologii molekularnej</td><td>ThermoFisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji miRNA mirVana</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Clean Up Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Probówki cienkościenne 0,2 ml</td><td>ThermoFisher</td><td>98010540</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówki bez RNazy/DNaz</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-dołkowy termocykler</td><td>ThermoFisher</td><td>4375786R</td><td></td></tr><tr><td>Oligo do redukcji globiny (&alfa; 1)</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td>Sekwencja GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td></tr><tr><td>Oligo do redukcji globiny (&alpha; 2)</td> <td>Dowolny dostawca</td><td></td><td>Sekwencja TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA</td></tr><tr><td>Globin Reduction Oligo (&beta; 1)</td> <td>Dowolny dostawca</td><td></td><td>Sekwencja AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT</td></tr><tr><td>Oligo Globin Reduction Oligo (&beta; 2)</td> <td>Dowolny dostawca</td><td></td><td>Sekwencja GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT</td></tr><tr><td>10X Oligo Hybridization</td> Buffer-Tris-HCl<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, pH 7.6</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1757-100-KCl</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Millipore Sigma</td><td>60142-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>10X RNase H Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-Tris-HCl, pH 7,6</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-DTT</td><td>ThermoFisher</td><td>Y00147</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-MgCl2</td><td>Promega</td><td>A351B</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-Biologia molekularna Klasa Woda</td><td>ThermoFisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>RNaza H</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2292</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-IN</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2694</td><td>Inhibitor rnazy</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 2100 Elektroforeza BioAnalyzer Instrument</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA o wysokiej czułości&nbsp; Zestaw</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Zestaw do przygotowania biblioteki całkowitego RNA z Ribo-Zero&nbsp;</td><td>Zestaw</td> mRNA <td>Illumina RS-122-2201</td><td>; Zestaw ludzi/myszy/szczurów A&nbsp; (48 próbek, 12 indeksów)</td></tr><tr><td>TruSeq Stranded Total RNA Sample Przewodnik Illumina</td><td></td><td></td><td>Dostępny on-line</td></tr><tr><td>RNAClean XP Beads</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 8-rurkowy pasek</td><td>ThermoFisher</td><td>N8010580</td><td>0,2 ml cienkościenne rurki</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 8-rurkowa nasadka paskowa</td><td>ThermoFisher</td><td>N801-0535</td><td></td></tr><tr><td>RNaza/DNaza - wolne od odczynników zbiorniki</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Odwrotna transkryptaza</td><td>ThermoFisher</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-dołkowe płytki</td><td>ThermoFisher</td><td>N8010560</td><td>W razie potrzeby zastosowano je zamiast płytek o pojemności 3 ml</td></tr><tr><td>MicroAmp Optyczna folia samoprzylepna</td><td>ThermoFisher</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Zestaw do przygotowania małej biblioteki RNA dla Illumina&reg; (Zestaw 1)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E73005</td><td>mały zestaw RNA</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Zestaw do przygotowania małej biblioteki RNA dla Illumina&reg; (Zestaw 2)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E75805</td><td>mały zestaw RNA</td></tr><tr><td>QIAQuick Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>96S Super Magnet Plate</td><td>ALPAQUA</td><td>A001322</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja klas kodujących i niekodujących rna wyrażonych we krwi pełnej świń

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Pojawienie się innowacyjnych i coraz bardziej potężnych technik sekwencjonowania nowej generacji otworzyło nowe możliwości w zakresie możliwości badania podstawowej ekspresji genów związanych z interesującymi procesami biologicznymi. Innowacje te pozwalają naukowcom nie tylko obserwować ekspresję sekwencji mRNA, które kodują geny wpływające na funkcję komórkową, ale także cząsteczki niekodującego RNA (ncRNA), które pozostają nietranslowane, ale nadal pełnią funkcje regulacyjne. Chociaż naukowcy mają możliwość obserwowania zarówno ekspresji mRNA, jak i ncRNA, zwyczajowo badanie koncentruje się na jednym lub drugim. Jednak, gdy badania są zainteresowane zarówno ekspresją mRNA, jak i ncRNA, często używają oddzielnych próbek do badania kodujących lub niekodujących RNA ze względu na różnicę w przygotowaniach bibliotecznych. Może to prowadzić do konieczności pobrania większej liczby próbek, co może wydłużyć czas, materiały eksploatacyjne i stres zwierząt. Dodatkowo może to spowodować, że badacze zdecydują się przygotować próbki tylko do jednej analizy, zwykle mRNA, ograniczając liczbę pytań biologicznych, które można zbadać. Jednak ncRNA obejmują wiele klas z rolami regulacyjnymi, które wpływają na ekspresję mRNA. Ponieważ ncRNA są ważne dla podstawowych procesów biologicznych i zaburzeń tych procesów podczas infekcji, mogą stanowić atrakcyjne cele terapeutyczne. Manuskrypt ten demonstruje zmodyfikowany protokół generowania mRNA i niekodujących bibliotek ekspresji RNA, w tym wirusowego RNA, z pojedynczej próbki krwi pełnej. Optymalizacja tego protokołu, poprawa czystości RNA, zwiększona ligacja w celu odzyskania metylowanych RNA i pominięcie wyboru rozmiaru, aby umożliwić wychwytywanie większej liczby gatunków RNA.

Reprezentatywnymi próbkami w naszym badaniu są próbki krwi pełnej z usuniętą globiną i rybosomami. Reprezentatywny wynik protokołu obejmuje próbkę biblioteki z usuniętą globiną o wskaźniku integralności RNA (RIN) powyżej 7 (Rysunek 1a) oraz stosunkach stężeń 260/280 nm równych lub wyższych od 2 (Rysunek 1b i 1c). Walidację uzyskanego wyniku przeprowadzono za pomocą spektrofotometru w celu wyznacz...

Tutaj prezentujemy protokół zoptymalizowany do przetwarzania kodujących (mRNA) i niekodujących (ncRNA) bibliotek sekwencyjnych RNA zredukowanych globiną z pojedynczej próbki krwi pełnej.

Identyfikacja klas kodujących i niekodujących RNA wyrażonych we krwi pełnej świń

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniu interakcji gospodarz-patogen, umożliwiając badanie kodującej, niekodującej i wirusowej ekspresji RNA zaangażowanej w odpowiedź aminową gospodarza, a także tego, jak patogen może wpływać na funkcje biologiczne gospodarza. Główną zaletą tej techniki jest to, że przedstawia protokół zoptymalizowany pod kątem przetwarzania mRNA i niekodującego RNA z bibliotek RNAseq o obniżonej ilości globiny z pojedynczej próbki krwi pełnej. Technikę zademonstruje Sarah Anderson, technik z mojego laboratorium.Zacznij od odwirowania probówek z krwią w temperaturze 50 do 20 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego, po usunięciu supernatantu, dodaj do granulatu osiem mililitrów wody wolnej od RNaz. Zamknij probówki i wiruj osad, aż zostanie widocznie rozpuszczony, a następnie odwiruj probówki przy 50 20 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby odzyskać osad.Pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego, wyrzuć supernatant i zachowaj osad. Aby wyizolować całkowite RNA, zacznij od odpipetowania 300 mikrolitrów buforu wiążącego lizę do osadu. Po wirowaniu przenieś mieszaninę z każdej probówki do nowej oznakowanej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra.Dodaj 30 mikrolitrów dodatku homogenatycznego z zestawu do izolacji miRNA. Zwiruj rurki i umieść na lodzie na 10 minut. Pracując w dygestorium, wyjmij rurki z lodu i dodaj 300 mikrolitrów kwaśnego odczynnika chloroformowego fenolu z zestawu i ponownie wymieszaj.Po odwirowaniu w temperaturze 10 000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, ostrożnie usuń fazę wodną do nowej probówki. W oparciu o ilość odzysku wodnego z poprzedniego etapu, dodaj 1,25-krotność objętości 100% etanolu do wodnego faga w każdej probówce i odpipetuj do wymieszania. Dla każdej próbki należy przygotować świeże probówki zbiorcze zawierające wkład filtrujący.Odpipetować około 675 mikrolitrów mieszaniny lizatu i etanolu na wkład filtra. Odwirować krótko pod ciśnieniem 10 000 razy G, aby przepuścić ciecz przez filtr. Odrzuć przepływ.Powtórzyć mieszaninę lizatu i etanolu, dodając do filtra i odwirowując, aż zostanie całkowicie zużyta. Dodaj 700 mikrolitrów roztworu myjącego jeden z zestawu do wkładu filtra. Odwirować na krótko, aby przeciągnąć roztwór przez filtry.Wyrzuć przepływ i zachowaj te same wkłady filtracyjne i rurki zbiorcze. Dodaj 500 mikrolitrów roztworu myjącego dwa-trzy do każdego wkładu filtra. Po ponownym odwirowaniu wyrzuć przepływowy płyn i powtórz etap mycia.Aby usunąć resztki płynu z wkładów filtra, obracaj je przez dodatkowe 60 sekund. Przenieść wkłady do świeżych probówek zbiorczych. Dodaj 100 mikrolitrów podgrzanej wody bez nukleaz o temperaturze 95 stopni Celsjusza do środka każdego wkładu filtrującego.Odwiruj wkłady przez około 20 do 30 sekund w wirówce stołowej z maksymalną prędkością. Aby przygotować hybrydyzację z oligonukleotydami redukującymi globinę, najpierw denaturuj RNA, dodając każdą wyekstrahowaną próbkę do 0,2 mililitra, cienkościennej probówki reakcyjnej wolnej od nukleaz. Umieść probówki w termocyklerze w temperaturze 70 stopni Celsjusza na dwie minuty.Następnie natychmiast umieść probówki na lodzie, aby uzyskać optymalną jakość RNA. Podczas gdy probówki stygną, przygotuj 400 mikrolitrów 10-krotnej mieszanki oligonów redukujących globinę i 10-krotnego buforu hybrydyzacyjnego oligonucyklocytów w dwumililitrowej probówce. Aby przygotować mieszaninę hybrydyzacyjną, dodaj sześć mikrogramów próbki RNA, dwa mikrolitry 10-mililitrowej mieszanki oligonów redukujących globinę, jeden mikrolitr 10-krotnego buforu do hybrydyzacji oligologicznej i wodę wolną od nukleaz do końcowej objętości 10 mikrolitrów do każdej cienkościennej, wolnej od nukleaz rurki reakcyjnej o wielkości 0,2 mililitra.Umieść probówki w termocyklerze w temperaturze 70 stopni Celsjusza na dwie minuty. Następnie natychmiast umieść rurki na lodzie. Aby przeprowadzić mineralizację RNazy H, najpierw rozcieńczyć 10X RNazę H do jednej X RNazy H za pomocą jednego buforu X RNazy H.Przygotuj mieszaninę reakcyjną RNazy H, łącząc dwa mikrolitry 10-krotnego buforu RNazy, jeden mikrolitr inhibitora RNazy i dwa mikrolitry jednego X RNazy H oraz pięć mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do całkowitej objętości 10 mikrolitrów. Dodać 10 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej RNazy H do próbek hybrydyzacji redukcyjnej globiny i dokładnie wymieszać. Strawij tę reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie ostudź do czterech stopni Celsjusza.Przerwij trawienie, dodając jeden mikrolitr 0,5 molowego EDTA do probówki i przenieś całą zawartość probówki do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Natychmiast po tym dodaj 80 mikrolitrów wody wolnej od RNaz, 350 mikrolitrów buforu do lizy, a następnie 250 mikrolitrów 100% etanolu do każdej probówki i dobrze wymieszaj pipetując. Przenieść każdą próbkę o pojemności 700 mikrolitrów do oddzielnego wkładu filtra elucyjnego umieszczonego w dwumililitrowej probówce zbiorczej w celu zebrania przepływu.Wirować przez 15 sekund przy 8 000 razy G lub większej, a następnie odrzucić przepływ. Umieść te same wkłady filtra elucyjnego w nowych dwumililitrowych probówkach zbiorczych. Aby umyć membrany wkładu filtra, dodaj 500 mikrolitrów łagodnego buforu myjącego do wkładów filtracyjnych i wiruj przez 15 sekund przy 8 000 razy G lub więcej.Odrzuć przepływ. Następnie, używając tych samych probówek zbiorczych, dodaj 500 mikrolitrów 80% etanolu do wkładów filtracyjnych. Wirować przez dwie minuty w temperaturze 8 000 razy G i większej.Odrzucić zarówno probówki przepływowe, jak i probówki zbiorcze, a także zachować wirowe kolumny elucji. Umieść każdą kolumnę wirową elucji w nowej dwumililitrowej probówce zbiorczej. Wirować z pełną prędkością przez pięć minut z otwartą pokrywą wkładów filtracyjnych, aby wysuszyć membrany kolumny wirowej i zapobiec przenoszeniu etanolu.Po wyrzuceniu probówek zbiorczych umieść każdy wysuszony wkład filtra w świeżej probówce zbiorczej o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj 14 mikrolitrów wody wolnej od RNaz bezpośrednio do środka membrany wkładu filtrującego. Aby wymyć RNA, należy odwirować probówki przez 60 sekund z pełną prędkością, a następnie kontynuować dalszą ocenę i przygotowanie RNA.Próbka zubożona w globinę może być teraz podzielona i wykorzystana do przygotowania małych, niekodujących bibliotek RNA, a także bibliotek mRNA zubożonych w rybo i długich, niekodujących RNA. Po przygotowaniu bibliotek ekspresji próbek krwi pełnej zubożonej w globinę i zubożonej w rybo przy użyciu tego protokołu, podsumowanie przebiegu pliku elektroforezy wykazało próbkę biblioteki zubożoną w globinę o liczbach integralności RNA w zakresie od 6,3 do 9,2. Okazało się to poprawą w porównaniu z innymi badaniami, w których stosowano metody zmniejszania zużycia globiny i były one w stanie osiągnąć liczbę RIN tylko na poziomie lub w pobliżu sześciu.Pre-globin-reducing i post-globin-reducing pojedynczej próbki krwi pełnej świń wykazał, że proporcje stężeń od 260 do 280 nanometrów są równe lub wyższe niż dwa. Korzystając z tego protokołu, uzyskano elektroferogramy oparte na chipach próbek biblioteki mRNA krwi pełnej zubożonej w globinę i rybo przed łączeniem i sekwencjonowaniem. W przypadku bibliotek mRNA reprezentatywny elektroferogram ma pik na około 280 parach zasad.W przypadku małych ncRNA reprezentatywne elektroferogramy oparte na chipach zawierają zakres pików od około 100 do 400 par zasad. Piki przy około 143 parach zasad odpowiadają miRNA, a piki przy około 153 parach zasad odpowiadają piRNA. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zalodzeniu rurek natychmiast tam, gdzie jest to zaznaczone.Zgodnie z tą procedurą należy przeprowadzić inne metody, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ekspresja różnicowa, zmiany epigenetyczne i ich wpływ na szlaki i procesy biologiczne. Nie zapominaj, że praca z odczynnikiem fenolowo-chloroformowym jest niezwykle niebezpieczna i należy zachować środki ostrożności, takie jak praca pod wyciągiem. Również w przypadku pracy z krwią pełną lub organizmami zakaźnymi przed aktywacją organizmu zakaźnego należy wykonać prace w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

identification-coding-non-coding-rna-classes-expressed-swine-whole

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne zostały wykorzystane do identyfikacji znacząco i różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych w subpopulacjach Lin-CD34+ i Lin-CD34- mysich komórek EML. Te czynniki transkrypcyjne mogą odgrywać ważną rolę w określaniu przełączania między samoodnawiającymi się komórkami Lin-CD34 + a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-CD34.

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

Zdolność komórek do adaptacji do stresu jest kluczowa dla ich przetrwania. Regulacja translacji mRNA jest jedną z takich strategii adaptacyjnych, zapewniającą szybką regulację proteomu. W tym miejscu zapewniamy ustandaryzowany protokół profilowania polisomów w celu identyfikacji określonych mRNA, które ulegają selektywnej translacji w warunkach stresu.

Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

Czynniki epigenetyczne mogą wchodzić w interakcje z programami genetycznymi, aby modulować ekspresję genów i regulować funkcję komórek B. Łącząc stymulację komórek B in vitro, qRT-PCR oraz wysokoprzepustowe sekwencje mikroRNA i sekwencje mRNA, możemy analizować epigenetyczną modulację miRNA i ekspresję genów w komórkach B.

Analiza całego genomu modulacji mikroRNA i mRNA za pośrednictwem inhibitora HDAC w komórkach B indukowanych do rekombinacji DNA ze zmianą klasy i różnicowania komórek plazmatycznych

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Sekwencjonowanie nanoporowe to nowatorska technologia, która pozwala na efektywne kosztowo sekwencjonowanie w odległych lokalizacjach i miejscach o ograniczonych zasobach. W tym miejscu przedstawiamy protokół sekwencjonowania mRNA z krwi pełnej, który jest zgodny z takimi warunkami.

Sekwencjonowanie mRNA z krwi pełnej za pomocą sekwencjonowania nanoporowego

Tutaj opisujemy immunoprecypitację rybosomów i związanego z nimi RNA z wybranych populacji dorosłych męskich komórek rozrodczych myszy za pomocą systemu RiboTag. Strategiczna hodowla i staranna immunoprecypitacja skutkują czystymi, powtarzalnymi wynikami, które informują o translatomie komórek rozrodczych i dostarczają wglądu w mechanizmy zmutowanych fenotypów.

Immunoprecypitacja RiboTag w komórkach rozrodczych samca myszy

Ten protokół opisuje, jak wygenerować profil polisomowy bez użycia automatycznych kreatorów gradientów lub systemów frakcjonowania gradientów.

Profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w modyfikacjach powstających łańcuchów, celowaniu, składaniu i ścieżkach montażu. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelu eukarionta Saccharomyces cerevisiae.

Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

Translacja rybosomów dekoduje trzy nukleotydy na kodon na peptydy. Ich ruch wzdłuż mRNA, wychwycony przez profilowanie rybosomów, wytwarza ślady wykazujące charakterystyczną okresowość trypletową. Protokół ten opisuje, w jaki sposób używać RiboCode do rozszyfrowania tej wyróżniającej się cechy na podstawie danych profilowania rybosomów w celu identyfikacji aktywnie translowanych otwartych ramek odczytu na poziomie całego transkryptomu.

De novo Identyfikacja aktywnie translowanych otwartych ramek odczytu z danymi profilowania rybosomów

Bezwzględna kwantyfikacja Sekwencjonowanie RNA (AQRNA-seq) to technologia opracowana do ilościowego określania krajobrazu wszystkich małych RNA w mieszaninach biologicznych. W tym miejscu zademonstrowano zarówno etapy przygotowania biblioteki, jak i przetwarzania danych AQRNA-seq, określając ilościowo zmiany w puli transferu RNA (tRNA) w Mycobacterium bovis BCG podczas spoczynku wywołanego głodem.

AQRNA-seq do ilościowego oznaczania małych RNA

Poznaj zoptymalizowaną metodę izolacji mRNA i ncRNA z pełnej krwi świń z redukcją globiny. Protokół umożliwia badanie interakcji gospodarz-patogen poprzez analizę ekspresji RNA.

Identyfikacja klas kodujących i niekodujących RNA wyrażonych we krwi pełnej świń

Przeglądaj więcej filmów