Identyfikacja klas kodujących i niekodujących RNA wyrażonych we krwi pełnej świń

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniu interakcji gospodarz-patogen, umożliwiając badanie kodującej, niekodującej i wirusowej ekspresji RNA zaangażowanej w odpowiedź aminową gospodarza, a także tego, jak patogen może wpływać na funkcje biologiczne gospodarza. Główną zaletą tej techniki jest to, że przedstawia protokół zoptymalizowany pod kątem przetwarzania mRNA i niekodującego RNA z bibliotek RNAseq o obniżonej ilości globiny z pojedynczej próbki krwi pełnej. Technikę zademonstruje Sarah Anderson, technik z mojego laboratorium.

Zacznij od odwirowania probówek z krwią w temperaturze 50 do 20 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego, po usunięciu supernatantu, dodaj do granulatu osiem mililitrów wody wolnej od RNaz. Zamknij probówki i wiruj osad, aż zostanie widocznie rozpuszczony, a następnie odwiruj probówki przy 50 20 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby odzyskać osad.

Pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego, wyrzuć supernatant i zachowaj osad. Aby wyizolować całkowite RNA, zacznij od odpipetowania 300 mikrolitrów buforu wiążącego lizę do osadu. Po wirowaniu przenieś mieszaninę z każdej probówki do nowej oznakowanej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra.

Dodaj 30 mikrolitrów dodatku homogenatycznego z zestawu do izolacji miRNA. Zwiruj rurki i umieść na lodzie na 10 minut. Pracując w dygestorium, wyjmij rurki z lodu i dodaj 300 mikrolitrów kwaśnego odczynnika chloroformowego fenolu z zestawu i ponownie wymieszaj.

Po odwirowaniu w temperaturze 10 000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, ostrożnie usuń fazę wodną do nowej probówki. W oparciu o ilość odzysku wodnego z poprzedniego etapu, dodaj 1,25-krotność objętości 100% etanolu do wodnego faga w każdej probówce i odpipetuj do wymieszania. Dla każdej próbki należy przygotować świeże probówki zbiorcze zawierające wkład filtrujący.

Odpipetować około 675 mikrolitrów mieszaniny lizatu i etanolu na wkład filtra. Odwirować krótko pod ciśnieniem 10 000 razy G, aby przepuścić ciecz przez filtr. Odrzuć przepływ.

Powtórzyć mieszaninę lizatu i etanolu, dodając do filtra i odwirowując, aż zostanie całkowicie zużyta. Dodaj 700 mikrolitrów roztworu myjącego jeden z zestawu do wkładu filtra. Odwirować na krótko, aby przeciągnąć roztwór przez filtry.

Wyrzuć przepływ i zachowaj te same wkłady filtracyjne i rurki zbiorcze. Dodaj 500 mikrolitrów roztworu myjącego dwa-trzy do każdego wkładu filtra. Po ponownym odwirowaniu wyrzuć przepływowy płyn i powtórz etap mycia.

Aby usunąć resztki płynu z wkładów filtra, obracaj je przez dodatkowe 60 sekund. Przenieść wkłady do świeżych probówek zbiorczych. Dodaj 100 mikrolitrów podgrzanej wody bez nukleaz o temperaturze 95 stopni Celsjusza do środka każdego wkładu filtrującego.

Odwiruj wkłady przez około 20 do 30 sekund w wirówce stołowej z maksymalną prędkością. Aby przygotować hybrydyzację z oligonukleotydami redukującymi globinę, najpierw denaturuj RNA, dodając każdą wyekstrahowaną próbkę do 0,2 mililitra, cienkościennej probówki reakcyjnej wolnej od nukleaz. Umieść probówki w termocyklerze w temperaturze 70 stopni Celsjusza na dwie minuty.

Następnie natychmiast umieść probówki na lodzie, aby uzyskać optymalną jakość RNA. Podczas gdy probówki stygną, przygotuj 400 mikrolitrów 10-krotnej mieszanki oligonów redukujących globinę i 10-krotnego buforu hybrydyzacyjnego oligonucyklocytów w dwumililitrowej probówce. Aby przygotować mieszaninę hybrydyzacyjną, dodaj sześć mikrogramów próbki RNA, dwa mikrolitry 10-mililitrowej mieszanki oligonów redukujących globinę, jeden mikrolitr 10-krotnego buforu do hybrydyzacji oligologicznej i wodę wolną od nukleaz do końcowej objętości 10 mikrolitrów do każdej cienkościennej, wolnej od nukleaz rurki reakcyjnej o wielkości 0,2 mililitra.

Umieść probówki w termocyklerze w temperaturze 70 stopni Celsjusza na dwie minuty. Następnie natychmiast umieść rurki na lodzie. Aby przeprowadzić mineralizację RNazy H, najpierw rozcieńczyć 10X RNazę H do jednej X RNazy H za pomocą jednego buforu X RNazy H.

Przygotuj mieszaninę reakcyjną RNazy H, łącząc dwa mikrolitry 10-krotnego buforu RNazy, jeden mikrolitr inhibitora RNazy i dwa mikrolitry jednego X RNazy H oraz pięć mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do całkowitej objętości 10 mikrolitrów. Dodać 10 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej RNazy H do próbek hybrydyzacji redukcyjnej globiny i dokładnie wymieszać. Strawij tę reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie ostudź do czterech stopni Celsjusza.

Przerwij trawienie, dodając jeden mikrolitr 0,5 molowego EDTA do probówki i przenieś całą zawartość probówki do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Natychmiast po tym dodaj 80 mikrolitrów wody wolnej od RNaz, 350 mikrolitrów buforu do lizy, a następnie 250 mikrolitrów 100% etanolu do każdej probówki i dobrze wymieszaj pipetując. Przenieść każdą próbkę o pojemności 700 mikrolitrów do oddzielnego wkładu filtra elucyjnego umieszczonego w dwumililitrowej probówce zbiorczej w celu zebrania przepływu.

Wirować przez 15 sekund przy 8 000 razy G lub większej, a następnie odrzucić przepływ. Umieść te same wkłady filtra elucyjnego w nowych dwumililitrowych probówkach zbiorczych. Aby umyć membrany wkładu filtra, dodaj 500 mikrolitrów łagodnego buforu myjącego do wkładów filtracyjnych i wiruj przez 15 sekund przy 8 000 razy G lub więcej.

Odrzuć przepływ. Następnie, używając tych samych probówek zbiorczych, dodaj 500 mikrolitrów 80% etanolu do wkładów filtracyjnych. Wirować przez dwie minuty w temperaturze 8 000 razy G i większej.

Odrzucić zarówno probówki przepływowe, jak i probówki zbiorcze, a także zachować wirowe kolumny elucji. Umieść każdą kolumnę wirową elucji w nowej dwumililitrowej probówce zbiorczej. Wirować z pełną prędkością przez pięć minut z otwartą pokrywą wkładów filtracyjnych, aby wysuszyć membrany kolumny wirowej i zapobiec przenoszeniu etanolu.

Po wyrzuceniu probówek zbiorczych umieść każdy wysuszony wkład filtra w świeżej probówce zbiorczej o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj 14 mikrolitrów wody wolnej od RNaz bezpośrednio do środka membrany wkładu filtrującego. Aby wymyć RNA, należy odwirować probówki przez 60 sekund z pełną prędkością, a następnie kontynuować dalszą ocenę i przygotowanie RNA.

Próbka zubożona w globinę może być teraz podzielona i wykorzystana do przygotowania małych, niekodujących bibliotek RNA, a także bibliotek mRNA zubożonych w rybo i długich, niekodujących RNA. Po przygotowaniu bibliotek ekspresji próbek krwi pełnej zubożonej w globinę i zubożonej w rybo przy użyciu tego protokołu, podsumowanie przebiegu pliku elektroforezy wykazało próbkę biblioteki zubożoną w globinę o liczbach integralności RNA w zakresie od 6,3 do 9,2. Okazało się to poprawą w porównaniu z innymi badaniami, w których stosowano metody zmniejszania zużycia globiny i były one w stanie osiągnąć liczbę RIN tylko na poziomie lub w pobliżu sześciu.

Pre-globin-reducing i post-globin-reducing pojedynczej próbki krwi pełnej świń wykazał, że proporcje stężeń od 260 do 280 nanometrów są równe lub wyższe niż dwa. Korzystając z tego protokołu, uzyskano elektroferogramy oparte na chipach próbek biblioteki mRNA krwi pełnej zubożonej w globinę i rybo przed łączeniem i sekwencjonowaniem. W przypadku bibliotek mRNA reprezentatywny elektroferogram ma pik na około 280 parach zasad.

W przypadku małych ncRNA reprezentatywne elektroferogramy oparte na chipach zawierają zakres pików od około 100 do 400 par zasad. Piki przy około 143 parach zasad odpowiadają miRNA, a piki przy około 153 parach zasad odpowiadają piRNA. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zalodzeniu rurek natychmiast tam, gdzie jest to zaznaczone.

Zgodnie z tą procedurą należy przeprowadzić inne metody, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ekspresja różnicowa, zmiany epigenetyczne i ich wpływ na szlaki i procesy biologiczne. Nie zapominaj, że praca z odczynnikiem fenolowo-chloroformowym jest niezwykle niebezpieczna i należy zachować środki ostrożności, takie jak praca pod wyciągiem. Również w przypadku pracy z krwią pełną lub organizmami zakaźnymi przed aktywacją organizmu zakaźnego należy wykonać prace w komorze bezpieczeństwa biologicznego.