Wysokowydajny i kompleksowy nadzór nad lekami za pomocą wielosegmentowej elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas

Obecne strategie badań przesiewowych na obecność narkotyków w moczu są kosztowne w przypadku rutynowej analizy coraz większych paneli nadużywanych narkotyków, zgodnie z wymaganiami testów w miejscu pracy, a także zastosowań terapeutycznych w monitorowaniu leków. Ponadto metody oparte na testach aminowych są podatne na błędy systematyczne i ostatecznie ograniczają się do analizy docelowej znanych paneli leków. Główną zaletą naszej metody, która jest określana jako MSI-CE-MS, jest to, że pozwala ona na szybkie badanie przesiewowe nieograniczonego panelu leków i ich metabolitów z dużą dokładnością i minimalną obróbką próbki.

Istnieje pilna potrzeba opracowania wysokowydajnej i przystępnej cenowo metody badań przesiewowych w celu poprawy wyników leczenia pacjentów poprzez potwierdzenie przestrzegania zaleceń lekarskich i optymalizację reżimów dawkowania leków, przy jednoczesnym ujawnieniu nielegalnego zażywania narkotyków. Ta multipleksowana platforma separacji może być stosowana w wielu innych obszarach badawczych związanych z celowanym lub nieukierunkowanym profilowaniem metabolitów w złożonych próbkach biologicznych. Zacznij od rozmrożenia pozbawionych elementów identyfikujących porannych próbek moczu pobranych od pacjentów ze znaną historią leków na receptę do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na lodzie i wirowania rozmrożonych próbek przez 30 sekund.

Następnie osadź próbki przez odwirowanie i połącz trzy 10-mikrolitrowe podwielokrotności każdej próbki z 10 mikrolitrami deuterowanych wzorców wewnętrznych, pięcioma mikrolitrami roztworu 4-fluoro-L-fenyloalaniny i 3-chloro-L-tyrozyny oraz 25 mikrolitrami wody dejonizowanej. Następnie odwirować mieszaniny przez jedną minutę i przenieść 20 mikrolitrów każdej próbki do indywidualnych fiolek polipropylenowych. Aby ustawić parametry kondycjonowania kapilary z topionej krzemionki bez powłoki, należy wyciąć ze szpuli kapilę o długości 135 centymetrów, średnicy wewnętrznej 50 mikrometrów i średnicy zewnętrznej 360 mikrometrów.

Użyj maszyny do okien kapilarnych, aby usunąć około 7 milimetrów powłoki poliamidowej z obu końców każdej kapilary. Następnie zainstaluj wloty kapilar w elektroforezie kapilarnej lub kartridżu CE, zapętlając każdą kapilarnę przez dwa obroty o 360 stopni, uważając, aby wystawać około dwóch milimetrów wylotów kapilar z igły opryskiwacza CE. Po zainstalowaniu wszystkich kapilar ostrożnie załaduj wkład CE do systemu CE i przechowuj rozpylacz CE poza źródłem jonów.

Umieść chromatografię cieczową lub rozpylacz LC w źródle jonów i wybierz płukanie w oprogramowaniu systemu, aby skonfigurować kondycjonowanie kapilarne. Ustaw czas przepłukiwania metanolem, jednym molowym wodorotlenkiem sodu, wodą dejonizowaną i elektrolitem tła na 30 minut na płukanie i przełącz pompę izokratyczną w tryb czuwania w okresie kondycjonowania kapilarnego. Po ostatnim spłukiwaniu wyczyść spektrometr mas do elektroforezy kapilarnej lub opryskiwacz CE-MS oraz elektrodę CE chusteczkami nasączonymi metanolem.

Wyczyść interfejs CE-MS roztworem wodnym izopropanolu jeden do jednego, aby usunąć wszelkie resztki osadów soli. Wymień opryskiwacz LC na oczyszczony opryskiwacz CE-MS i nowo kondycjonowaną kapilarnę do interfejsu cieczy ze współosiową osłoną. Następnie włącz pompę izokratyczną i przyłóż napięcie 30 kilowoltów przez 15 minut, aby upewnić się, że przed analizą moczu zostanie osiągnięty stabilny profil prądu CE.

W oprogramowaniu systemowym wybierz kondycjonowanie wstępne, ustaw spłukiwanie na 600 sekund i określ pozycję pliku elektrolitu tła. Ustawić wtrysk tak, aby hydrodynamicznie wstrzykiwać próbki pod ciśnieniem 100 milibarów przez pięć sekund i elektrokinetycznie wstrzykiwać przekładki elektrolitu tła o napięciu 30 kilowoltów przez 75 sekund. Ustaw przyłożone napięcie na 30 kilowoltów, temperaturę wkładu na 25 stopni Celsjusza, a całkowity czas pracy na 40 minut.

Następnie, korzystając z harmonogramu, zastosuj gradient ciśnienia dwóch milibarów na minutę od zera do 40 minut podczas separacji. Po zakończeniu pobierania próbki przepłucz kapilarnę pod ciśnieniem 50 milibarów z elektrolitami tła przez noc, podczas gdy kapilara znajduje się w rozpylaczu CE w źródle jonów. Ustaw detekcję jonów dodatnich TOF-MS tak, aby obejmowała stosunek masy do ładunku 50 do 1 700, z szybkością akwizycji danych 500 milisekund na widmo i potwierdź, że zarówno profil, jak i dane środka ciężkości są przechowywane w formacie pliku D.

Ustaw warunki jonizacji elektrorozpylania na kapilarne i na napięcie dyszy 2000 woltów każde, gaz nebulizatora na 10 funtów na cal kwadratowy, a dostarczanie gazu suszącego na osiem litrów na minutę przy 300 stopniach Celsjusza przy przepływie gazu w osłonie 3,5 litra na minutę w temperaturze 195 stopni Celsjusza podczas akwizycji. Następnie ustaw ustawienia napięcia MS fragmentera, skimmera i ośmiopola o jednej częstotliwości radiowej odpowiednio na 120, 65 i 750 woltów oraz ustaw parametry sterowania instrumentem i akwizycji danych zgodnie z projektem eksperymentu. W celu analizy danych otwórz wielosegmentowe dane CE-MS w oprogramowaniu systemowym.

W obszarze chromatogramy ustaw dane ekstrakcji oraz formaty chromatogramu i danych widma masowego w tryb profilu. W obszarze wygładzanie wybierz kwadratową sześcienną Savitzky'ego-Golaya i ustaw szerokość funkcji na 15 punktów. Następnie kliknij Integrate MS i ustaw integrator na agile.

W obszarze Filtry szczytów ustaw maksymalną liczbę szczytów na 11. W obszarze Widok kliknij pozycję Lista szczytów integracji i wybierz liczbę szczytu, czas przechowywania, obszar szczytu, wysokość piku i stosunek sygnału do szumu. Następnie zapisz parametry pod unikatową nazwą metody i zastosuj metodę do procesu interpretacji każdego zestawu danych.

W tej reprezentatywnej analizie różnych izobarycznych leków izomerycznych nadużywanych i ich metabolitów wykryto 30 rozdzielczych pików z 10 niezależnych próbek mieszaniny leków bez przenoszenia próbek. Dwa inne opioidy izobaryczne mogą być w pełni rozwiązane jako 20 odrębnych pików dzięki pełnej akwizycji danych skanowania. Podobnie, dwa izomery pozycyjne amfetaminy zostały w pełni rozwiązane w tej wielosegmentowej analizie CE-MS, aby odróżnić nielegalne nadużywanie metamfetaminy od potencjalnego niewłaściwego stosowania Fentermina, przepisanego stymulanta, który jest stosowany jako środek tłumiący apetyt dla utraty wagi.

W tej reprezentatywnej analizie przesiewowej leków pozytywny wynik testu przesiewowego na obecność metadonu wywnioskowano poprzez wykrycie dużego piku sygnału współmigrującego z pikiem metadonu-d3 z niskim błędem masy. Nie wykryto żadnych innych sygnałów w żadnych innych próbkach moczu w tym samym przebiegu, a wykryte stężenie metadonu przekroczyło 13-krotnie zalecaną granicę odcięcia w porównaniu z zmierzonym stosunkiem odpowiedzi jonowej w próbce i skorygowane o czterokrotny współczynnik rozcieńczenia moczu, potwierdzając przestrzeganie przez pacjentów leczenia podtrzymującego metadonem. W tym przypadku konfiguracja do wstrzykiwań seryjnych w wielosegmentowym CE-MS, składająca się z pięciu różnych kalibrów leków, została przeanalizowana w dwóch egzemplarzach w ramach jednego cyklu wraz z syntetyczną ślepą próbą moczu.

Metabolity leków zostały wykryte jako ich potenowane jony molekularne powyżej ich granic odcięcia przesiewowego. Po tej procedurze duża liczba metabolitów polarnych i jonowych w moczu może być również analizowana przez MSI CMS w celu wsparcia badań metabolicznych opartych na odkryciach. Ponadto można osiągnąć kompleksowy nadzór nad szeroką gamą leków egzogennych i ich metabolitów, w tym leków bez recepty i nielegalnych narkotyków podatnych na nadużywanie.

Ta zoptymalizowana metoda może być również stosowana do rutynowego badania przesiewowego innych narkotyków. Mogą to być metabolity konopi indyjskich lub alkoholu, a nasza metoda może również odróżnić syntetyczną lub fałszywą matrycę moczu od naturalnej, prawdziwej, autentycznie oddanej próbki moczu. Pamiętaj, aby zawsze zachować ostrożność podczas pracy z płynami biologicznymi.