Automatyczne multipleksowanie próbek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Nasz zautomatyzowany protokół cPILOT ułatwia badaczom analizę próbek w sposób wysoce przepustowy. Jest to istotne, ponieważ pozwala nam znacznie szybciej dotrzeć do informacji biologicznych o chorobach lub różnych stanach. Główną zaletą tej techniki jest to, że pomaga ona w równoległym przetwarzaniu wielu próbek, zmniejszając w ten sposób liczbę błędów, które można wykonać, przy użyciu próbek o wysokiej przepustowości.

Nasze laboratorium jest zainteresowane zastosowaniami związanymi ze starzeniem się i chorobą Alzheimera. Jednak technika ta może być również wykorzystana do badania dowolnej choroby lub wyzwania, w którym zaangażowane są tkanki biologiczne. Zacznij od włączenia aparatu nadciśnieniowego, urządzenia grzewczego i chłodzącego oraz pomp próżniowych.

Podłącz wszystkie akcesoria do urządzenia do obsługi cieczy, które będzie świecić niebieskim światłem, gdy zostanie podłączone do komputera i będzie gotowe do pracy. Porcję 300 mikrolitrów wątroby homogenate do probówki o pojemności 500 mikrolitrów i umieszczenie na dwumililitrowej płytce o głębokości studzienki. Próbkę należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu rozpoczęcia protokołu.

Otwórz metodę w oprogramowaniu i umieść wymagane końcówki i sprzęt laboratoryjny w swoich miejscach. Następnie sprawdź ostateczny układ talii i kliknij Dalej, aby kontynuować protokół. Załaduj końcówki o pojemności 230 mikrolitrów i odessaj 90 mikrolitrów ośmiomolowego mocznika ze zbiornika.

Następnie dozuj go do wyłożenia jednej z czarnych płytek o głębokości dwóch mililitrów. Rozładuj końcówki TL1 i powtarzaj ten krok, aż mocznik zostanie dodany do wszystkich studzienek. Po dodaniu buforu denaturacyjnego użyj końcówek o pojemności 90 mikrolitrów, aby przenieść 10 mikrolitrów homogenatu wątroby myszy na płytkę z głęboką studzienką.

Rozładuj końcówki, a następnie załaduj jeden rząd końcówek o pojemności 90 mikrolitrów i zastrzyj trzy mikrolitry DTT z pierwszej płytki odczynnika. Dozuj naziemną telewizję cyfrową do rzędów pierwszego i drugiego płytki głębokiej studzienki. Uszczelnić płytkę z próbką folią aluminiową i inkubować ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 600 sekund, obracając z prędkością 300 obr./min.

Po inkubacji załaduj jeden rząd końcówek o pojemności 90 mikrolitrów, zassaj sześć mikrolitrów IAM z płytki odczynnika pierwszej w rzędzie trzecim i dozuj ją do pierwszego rzędu płytki próbki. Uszczelnić płytkę do pobierania próbek i inkubować ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut, obracając się z prędkością 300 obr./min na urządzeniu chłodzącym. Następnie rozszczelnić płytkę próbki i załadować jeden rząd końcówek o pojemności 90 mikrolitrów.

Odessać pięć mikrolitrów cystyny z płytki odczynnika numer jeden w drugim rzędzie i dozować ją do pierwszego i drugiego rzędu płytki z próbką. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po inkubacji wykonuj wstrząs z prędkością 1800 obr./min przez 30 minut.

Następnie dodaj 800 mikrolitrów 20-milimolowego buforu Tris z 10 milimolowym chlorkiem wapnia do każdego dołka na płytce z próbką, aby rozcieńczyć stężenie mocznika do dwóch molowców. Dodaj 20 mikrolitrów trypsyny do pierwszego rzędu płytki 96-dołkowej i umieść płytkę w określonym miejscu na pokładzie. Po dodaniu trypsyny do płytki z próbką zamknij ją i inkubuj przez 15 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 600 obr./min na urządzeniu do ogrzewania i chłodzenia.

Zatrzymaj trawienie, zasysając 150 mikrolitrów 5% kwasu mrówkowego z trzeciego rzędu płytki z kwasem mrówkowym i dozując go do płytki próbki w rzędzie pierwszym i drugim. Przystąp do odsolenia peptydów. Użyj końcówek o pojemności 1070 mikrolitrów, aby zassać 600 mikrolitrów acetonitrylu.

Następnie dozuj go w pierwszym i drugim rzędzie ekstrakcji do fazy stałej lub płytki SPE, aby aktywować C-18. Następnie załadować strawioną próbkę na płytkę SPE w dwóch przejściach. Załaduj dwa rzędy końcówek, odessaj 534 mikrolitry strawionych próbek i dozuj je do pierwszego i drugiego rzędu płytki SPE.

Docisnąć płytkę i powtarzać ten krok, aż wszystkie próbki zostaną załadowane. Oczyść peptydy, przemywając je wodą i rozcieńcz peptydy 60 do 40 acetonitrylu w 0,1% kwasie mrówkowym. Następnie umieść płytkę na wierzchu płytki zbiorczej, aby wymyć peptydy za pomocą aparatu nadciśnieniowego.

Narysuj przepływ i skonfiguruj wymagane wskazówki i sprzęt laboratoryjny w oprogramowaniu, sprawdź krzyżowo z układem pokładu i kliknij Dalej, aby kontynuować protokół dimetylacji. Rozpuść peptydy w 1% kwasie octowym. Aby wykonać znakowanie dimetylu, załaduj 90 mikrolitrowych końcówek i odessaj 16 mikrolitrów 60-milimolowego lekkiego formaldehydu z drugiego rzędu płytki odczynnika.

Dozuj go, aby ułożyć jedną z płytek próbnych, a następnie rozładuj końcówki. Załaduj jeden rząd końcówek o pojemności 90 mikrolitrów i zastrzyj 16 mikrolitrów 60-milimolowego ciężkiego formaldehydu z trzeciego rzędu drugiej płytki odczynnika. Dozuj go w drugim rzędzie płytki próbki i rozładuj końcówki.

Załaduj dwa rzędy końcówek o pojemności 90 mikrolitrów i odessaj 16 mikrolitrów 24-milimolowego cyjanoborowodorku sodu i 24-milimolowego cyjanoborodeuterku sodu z pierwszego i drugiego rzędu trzeciej płytki odczynnika, a następnie dozuj odczynniki do pierwszego i drugiego rzędu płytki próbki, aby rozpocząć reakcję dimetylacji. Rozładuj końcówki i użyj wytrząsarki orbitalnej, aby wykonać czasowe wstrząsy przez 15 minut przy 1800 obr./min. Następnie załaduj dwa rzędy końcówek o pojemności 90 mikrolitrów i zastrzyj 32 mikrolitry 1% amoniaku z rzędów trzeciego i czwartego płytki odczynnika.

Dozować go do pierwszego i drugiego rzędu drugiej płytki próbki, aby zatrzymać reakcję. Połącz równe objętości lekkich i ciężkich peptydów dimetylowanych w nowej dwumililitrowej płytce głębinowej do odsalania. Po odsoleniu połączonych lekkich i ciężkich peptydów należy je wysuszyć i przeprowadzić znakowanie izobaryczne.

Rozpuść peptydy w 100 mikrolitrach 100-milimolowego buforu wodorowęglanu trietyloniowego na wytrząsarce orbitalnej. Następnie użyj końcówek o pojemności 90 mikrolitrów, aby zassać 25 mikrolitrów połączonych dimetylozowanych peptydów i dozować je do pierwszego rzędu płytki przetwarzającej TMT. Załaduj jeden rząd końcówek o pojemności 90 mikrolitrów i zastrzyj 10 mikrolitrów TMT.

Dozuj go w pierwszym rzędzie płytki obróbczej TMT, rozładuj końcówki, a następnie wykonuj wstrząs z czasem przez godzinę z prędkością 1800 obr./min. Odessać osiem mikrolitrów hydroksyloaminy z drugiego rzędu płytki TEAB i dozować ją do pierwszego rzędu płytki do przetwarzania TMT. Po 15-minutowym wstrząsaniu przy 1800 obr./min przenieś 30,5 mikrolitra peptydów znakowanych TMT do 1,5 mililitrowej probówki.

Następnie przystąp do zbierania i analizy danych zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Reprezentatywne dane MS peptydu zidentyfikowanego we wszystkich 22 kanałach jonów reporterowych z połączonego eksperymentu znakowania izotopowego prekursora i znakowania izobarycznego 22 Plex przedstawiono tutaj. Sekwencja peptydu odpowiada S-metylotransferazie betainy-homocysteiny.

Najintensywniejsze jony fragmentacyjne zarówno dla lekkich, jak i ciężkich pików dimetylowanych zostały dodatkowo wyizolowane pod kątem fragmentacji MS3. Intensywność jonów reporterowych jest wprost proporcjonalna do obfitości peptydów w próbce. Ogólnie rzecz biorąc, ten połączony eksperyment znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego skrócił czas przetwarzania próbki i umożliwił wizualizację ekspresji białka w wielu kanałach lub warunkach.

Wykres pudełkowy obfitości logarytmu 10 w funkcji całkowitej intensywności jonów reporterowych we wszystkich 22 kanałach wykazuje mniejszą zmienność między dołkami lub między próbkami. Ocenę całkowitej automatyzacji przeprowadzono poprzez zbadanie błędu w obfitości jonów reporterowych w każdym białku w 22 próbkach. Przetwarzanie próbek za pomocą platformy robotycznej skutkowało bardzo niskimi współczynnikami zmienności.

W 3098 peptydach średni współczynnik zmienności obfitości jonów reporterowych wynosił 12,36 i 15,03% odpowiednio dla lekkich i ciężkich peptydów dimetylowanych. Próbując zastosować ten protokół, należy pamiętać, że poziomy izotopowe i izobaryczne są używane w jednym eksperymencie. W związku z tym należy przeprowadzić staranne planowanie, aby oznaczyć każdą próbkę znacznikami przeznaczonymi do użycia w eksperymencie.

Metodę tę można łatwo zintegrować z innymi systemami robotycznymi i można ją zastosować do różnych tkanek, takich jak lizaty tkankowe lub komórkowe oraz inne płyny biologiczne.