Name: Automatyczne multipleksowanie próbek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę cPILOT do multipleksowania próbek w badaniach proteomicznych. Technika ta umożliwia równoległą analizę wielu próbek, zwiększając przepustowość i dokładność w badaniach nad chorobami takimi jak Alzheimer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Vanderbilt University Start-up Funds i nagrodzie NIH (R01GM117191) dla RASR.

<ol><li>Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+as+a+diagnostic+and+a+cancer+biomarker+discovery+tool%3A+opportunities+and+potential+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations.</a> Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).</li>
<li>Qian, W. -J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+liquid+chromatography-mass+spectrometry-based+proteomics+profiling+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).</li>
<li>Arul, A. B., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Multiplexing+Strategies+in+Quantitative+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).</li>
<li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+Throughput+in+Targeted+Proteomics+Assays%3A+54-Plex+Quantitation+in+a+Single+Mass+Spectrometry+Run%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run.</a> Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li>
<li>Shiio, Y., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteome+analysis+using+isotope-coded+affinity+tags+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry.</a> Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).</li>
<li>Gygi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMTpro%3A+Design%2C+Synthesis%2C+and+Initial+Evaluation+of+a+Proline-Based+Isobaric+16-Plex+Tandem+Mass+Tag+Reagent+Set%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).</li>
<li>Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((21-plex+DiLue+Isobaric+Tags+for+High-Throughput+Quantitative+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics.</a> Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).</li>
<li>Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging+%28cPILOT%29+approach+with+selective+MS%283%29+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition.</a> Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).</li>
<li>Robinson, R. A., Evans, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sample+multiplexing+for+nitrotyrosine-modified+proteins+using+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).</li>
<li>King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Sample+Multiplexing+of+Tissues+Using+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+%28cPILOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT).</a> Journal of Visual Experiments. (123), e55406(2017).</li>
<li>King, C. D., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Performance+on+Orbitraps+To+Study+the+Peripheral+Proteome+of+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease.</a> Analytical Chemistry. , (2020).</li>
<li>Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cPILOT+analysis+of+the+APP%2FPS-1+mouse+liver+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+%26+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome.</a> Proteomics & Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).</li>
<li>Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+multiplexing+with+cysteine-selective+approaches%3A+cysDML+and+cPILOT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+of+Mass+Spectrometer%22%5BJournal%5D)">Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).</li>
<li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li>
<li>Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+N%2CN-Dimethyl+Leucine+Isobaric+Tag+Multiplexing+by+a+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach.</a> Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).</li>
<li>Gu, L., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+endogenous+measurement+of+S-nitrosylation+in+Alzheimer%27s+disease+using+oxidized+cysteine-selective+cPILOT%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT.</a> Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).</li>
<li>Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+to+study+aging+in+rabbit+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

cPILOT to ulepszona strategia multipleksowania, która może analizować do 24 próbek w jednym eksperymencie. Zdolność multipleksowania zależy od liczby dostępnych kombinacji znakowania izotopowego i izobarycznego. Wprowadzenie TMTpro7, który jest w stanie oznaczyć 16 próbek w jednym eksperymencie, może przesunąć granice cPILOT do 32-plex. cPILOT składa się z wielu etapów pipetowania, a przygotowanie próbki wymaga dużej staranności i umiejętności użytkownika. Nawet w przypadku doświadczonego użytkownika błędy ręczne są nieuniknione, co zachęca do korzystania z platform robotycznych do przetwarzania próbek w strategii cPILOT. Ponieważ cPILOT wykorzystuje znakowanie peptydów w zależności od pH, pH musi być utrzymane dla lekkiego i ciężkiego zestawu próbek dimetylowanych. Łagodnie kwaśno-zasadowe pH może powodować dimetylację zarówno reszt N-końców, jak i lizyny. Zaletą cPILOT jest to, że wymaga tylko połowy znaczników izobarycznych, ponieważ N-końce peptydów są zajęte przez grupy dimetylowe. Pozwala to na etykietowanie większej liczby próbek przy kosztach o połowę niższych. Obsługa większej liczby próbek wymaga, aby czasy ekspozycji na odczynniki były podobne dla pierwszej i ostatniej próbki w partii. Dozownik do pipet, który może pomieścić do 32 próbek równolegle, można najlepiej osiągnąć przy użyciu zrobotyzowanych urządzeń do obsługi cieczy.
W celu przetwarzania wielu próbek przez cPILOT, ręczny przepływ pracy został zmodyfikowany w celu uwzględnienia automatyzacji. Zrobotyzowana maszyna do obsługi cieczy wykorzystana w tym badaniu jest wyposażona w dwie saszetki z 96-kanałową i 8-kanałową możliwością pipetowania, z chwytakiem do umieszczania płytek w dostępnych 28 lokalizacjach pokładu. Ciecz jest zintegrowana z aparatem nadciśnieniowym, wytrząsarką orbitalną oraz urządzeniem do podgrzewania/chłodzenia próbek w płytce 96-dołkowej. Aparat nadciśnieniowy pomaga w przeprowadzaniu wymiany w płytkach SPE podczas czyszczenia, podczas gdy wytrząsarka orbitalna pomaga w wirowaniu/mieszaniu próbek. Platforma robotyczna została zaprogramowana do zasysania i dozowania i próbek na płytki 96-dołkowe, inkubacji, próbek wirowych i płytek transferowych. Ciecze o różnej lepkości, takie jak acetonitryl i woda, wymagają szczególnych zasad pipetowania, które można również zaprogramować w tej metodzie.
Przebieg pracy w ramach projektu cPILOT, począwszy od kwantyfikacji białka za pomocą BCA, a skończywszy na znakowaniu peptydów znacznikami izobarycznymi (tj. TMT), został przeprowadzony w systemie obsługi cieczy. Cały protokół został przeskalowany tak, aby zawierał 96 płytek z głębokimi dołkami, które mogą pomieścić 2 ml na studzienkę. przygotowano przed rozpoczęciem eksperymentu i dodano do płytki 96-dołkowej, aby umożliwić równoległe przetwarzanie próbki. W niniejszym badaniu 22 powtórzenia przepływu pracy homogenatu wątroby myszy dodano do płytek głębokich i pobrano za pomocą protokołu cPILOT. Na koniec pojedynczą próbkę składającą się z 22-pleksowych peptydów oznaczonych równomolową wątrobą myszy wstrzyknięto do spektrometru mas. Natężenia jonów reporterowych odpowiadające obfitości peptydów w próbkach wykazały, że próbki przetwarzane za pomocą urządzenia do obsługi cieczy mają niższe CV niż w protokole ręcznym (dane nie pokazane). Platforma robotyczna znacznie poprawiła również odtwarzalność przetwarzania próbek. Powtarzalność i wytrzymałość są bardzo ważnymi czynnikami podczas przetwarzania dużej liczby próbek. Błędy pipetowania mogą prowadzić do całkowicie błędnej interpretacji danych, a w tym przypadku platforma robotyczna zapewniła niską zmienność między próbkami. Również zastosowanie platformy robotycznej do projektu cPILOT skróciło czas potrzebny na przygotowanie próbek. Na przykład, po opracowaniu metody automatycznej, przetworzenie 22 próbek zajęło 2,5 godziny w porównaniu do 7,5 godziny w przypadku ręcznego cPILOT. W naszym laboratorium prowadzone są eksperymenty mające na celu dalszą ocenę porównań ręcznych i zautomatyzowanych przepływów pracy cPILOT. Opierając się na wcześniejszych raportach z naszego laboratorium, CV% intensywności jonów reporterowych białka w ręcznym cPILOT wynosiły średnio 20%, przy czym niektóre wartości odstające przekraczały tę wartość12.
cPILOT to strategia derywatyzacji chemicznej na poziomie peptydów, którą można zastosować do dowolnego rodzaju próbki, takiej jak komórki, tkanki i płyny ustrojowe. cPILOT oferuje ulepszone multipleksowanie próbek, a dzięki zastosowaniu automatyzacji może ułatwić multipleksowanie próbek o wysokiej przepustowości w proteomice. Ta przepustowość jest niezbędna do dalszego pogłębiania wiedzy o chorobach i biologii oraz odkrywania biomarkerów.

Proteomika oparta na spektrometrii mas (MS) jest niezbędnym narzędziem badawczym w identyfikacji biomarkerów specyficznych dla choroby, zrozumieniu postępu choroby i tworzeniu wskazówek dla rozwoju terapii. Można to osiągnąć na podstawie szeregu próbek klinicznych związanych z chorobą, takich jak surowica/osocze krwi, płyny proksymalne i tkanki1,2. Odkrywanie i walidacja biomarkerów proteomicznych zyskały ostatnio duże zainteresowanie ze względu na moc strategii multipleksowania próbek3,4. Multipleksowanie próbek to technika, która umożliwia jednoczesne porównanie i kwantyfikację dwóch lub więcej warunków próbki w ramach jednego wstrzyk<nięcia MS sup class="xref">5,6. Multipleksowanie próbek uzyskuje się poprzez kodowanie kreskowe peptydów lub białek z wielu próbek ze znacznikami chemicznymi, enzymatycznymi lub metabolicznymi i uzyskiwanie informacji o MS ze wszystkich próbek w jednym eksperymencie MS lub MS/MS. Wśród dostępnych znaczników izobarycznych znajdują się odczynniki do znakowania izobarycznego (iTRAQ), komercyjne tandemowe znaczniki masowe (TMT) oraz syntetyzowane w domu odczynniki izobaryczne N,N-dimetyloleucyny (DiLeu) o możliwościach odpowiednio do 16-plex7 i 21-plex8.
Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ulepszona technologia multipleksowania próbek. cPILOT łączy znakowanie izotopowe N-końców peptydu z lekkimi [−(CH3)2] i ciężkimi [−(13C2H3)2] izotopami o niskim pH (∼2,5), co utrzymuje dostępność reszty lizyny do późniejszego znakowania izobarycznego o wysokim pH (8,5) za pomocą TMT, DiLeu, lub iTRAQ tagging3,9,10,11,12,13,14. Schemat podwójnego znakowania w ramach strategii cPILOT przedstawiono na rysunku uzupełniającym 1 z dwiema próbkami przy użyciu przykładowego peptydu. Dokładność i precyzja kwantyfikacji opartej na TMT na poziomie MS2 może być zagrożona ze względu na obecność zanieczyszczających jonów współizolowanych i współfragmentowanych, określanych jako efekt interferencji15. To ograniczenie w niedokładnych proporcjach jonów reporterowych można przezwyciężyć za pomocą tribrydowych spektrometrów masowych Orbitrap. Na przykład efekt interferencji można przezwyciężyć poprzez wyizolowanie piku w dimetylowanej parze na poziomie MS1 w spektrometrze masowym, poddanie lekkiego lub ciężkiego piku fragmentacji MS2 w liniowej pułapce jonowej, a następnie poddanie najbardziej intensywnego fragmentu MS2 HCD-MS3 w celu uzyskania informacji ilościowych. W celu zwiększenia szans na wybór peptydów bez amin lizynowych dostępnych do generowania jonów reporterowych, można również zastosować selektywną akwizycję MS3 na podstawie fragmentu y-1 i jest to podejście, które może skutkować wyższym procentem peptydów kwantyfikowalnych za pomocą cPILOT9. Połączenie lekkiego i ciężkiego znakowania zwiększa możliwości multipleksowania próbek 2-krotnie w porównaniu z indywidualnymi znacznikami izobarycznymi. Ostatnio użyliśmy cPILOT do połączenia do 24 próbek w jednym eksperymencie za pomocą odczynników DiLeu16. Dodatkowo cPILOT został wykorzystany do badania oksydacyjnych modyfikacji potranslacyjnych14, w tym nitrowania białek17, innych globalnych proteomów9, i zademonstrował zastosowania w wielu próbkach tkanek w mysim modelu choroby Alzheimera11.
Solidne przygotowanie próbki jest kluczowym krokiem w eksperymencie cPILOT i może być czasochłonne, pracochłonne i rozległe. Ulepszone multipleksowanie próbek wymaga intensywnego pipetowania i wysoko wykwalifikowanego personelu laboratoryjnego, a ponadto istnieje kilka czynników, które mogą mieć duży wpływ na odtwarzalność eksperymentu. Na przykład konieczne jest ostrożne obchodzenie się z próbkami, aby zapewnić podobny czas reakcji dla wszystkich próbek i utrzymać odpowiednie pH buforu dla lekkich i ciężkich próbek dimetylowanych. Co więcej, ręczne przygotowanie dziesiątek do setek próbek może wprowadzić wysoki błąd eksperymentalny. W związku z tym, aby zmniejszyć zmienność przygotowania próbek, poprawić dokładność ilościową i zwiększyć przepustowość eksperymentów, opracowaliśmy zautomatyzowany przepływ pracy cPILOT. Automatyzację osiąga się za pomocą zrobotyzowanego urządzenia do obsługi cieczy, które może wykonywać wiele aspektów przepływu pracy (ilustracja 1). Przygotowanie próbki, od kwantyfikacji białka do znakowania peptydów, przeprowadzono na zautomatyzowanym urządzeniu do obsługi cieczy. Zautomatyzowana maszyna do obsługi cieczy jest zintegrowana z aparatem nadciśnieniowym (PPA) do wymiany między płytkami do ekstrakcji do fazy stałej (SPE), wytrząsarką orbitalną i urządzeniem grzewczym/chłodzącym. Platforma robotyczna zawiera 28 miejsc na pokładzie, w których można umieścić płyty i zderzaki. Znajdują się tam dwie saszetki z chwytakiem do przenoszenia płytek w miejscach pokładu: 96-kanałowa głowica pipetująca o stałej objętości (5-1100 μl) i 8-kanałowa sonda o zmiennej objętości (1-1000 μl). Sterowanie platformą robotyczną odbywa się za pomocą oprogramowania. Użytkownik musi zostać profesjonalnie przeszkolony przed rozpoczęciem korzystania ze zrobotyzowanej ładowarki do cieczy. Niniejsze badanie koncentruje się na automatyzacji ręcznego przepływu pracy cPILOT, który może być pracochłonny w przypadku przetwarzania więcej niż 12 próbek w jednej partii. Aby zwiększyć wydajność podejścia cPILOT11, przenieśliśmy protokół cPILOT do zrobotyzowanego urządzenia do obsługi cieczy, aby przetwarzać ponad 10 próbek równolegle. Automatyzacja pozwala również na podobne reakcje dla każdej próbki równolegle na różnych etapach procesu przygotowania próbki, co wymagało wysoko przeszkolonych użytkowników podczas ręcznego cPILOT. Protokół ten koncentruje się na wdrożeniu zautomatyzowanego urządzenia do obsługi cieczy w celu przeprowadzenia cPILOT. Niniejsze badanie opisuje protokół korzystania z tego zautomatyzowanego systemu i demonstruje jego działanie za pomocą 22-pleksowej analizy "proof-of-concept" homogenatów wątroby myszy.

<table><tbody><tr><td>Probówki eppendorf 0,6 ml, 500 szt</td>. <td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td>Probówki eppendorfa 0,6 ml są dowolna marki 0,6 ml</td></tr><tr><td>0,65 &mikro; m Ultrafree MC DV filtry odśrodkowe</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30DV00</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówki eppendorfa, 500 szt</td>. <td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>Wystarczą probówki eppendorf dowolnej marki</td></tr> 2 <tr><td>ml płytka głębinowa</td><td>Analytical Sales and Services, Inc.</td><td>59623-23BKGC</td><td>Wystarczy dowolna marka czarnej płytki 96-dołkowej</td></tr><tr><td>2 ml przezroczystej płytki głębinowej</td><td>VWR</td><td>75870-796</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>J.T. Baker</td><td>9508-01</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl - MS Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td>Ilość 4 L nie jest konieczna</td></tr><tr><td>Agilent 500&micro; Płytka L</td><td>Agilent</td><td>203942-100</td><td>Płytka odczynnikowa do dodawania</td></tr><tr><td>Mrówczan amonu</td><td>Acros Organics</td><td>208-753-9</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku amonu (28 - 30%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320145-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td> Zestaw do oznaczania białek <td>BCA Mettler Toledo</td><td>AL54</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pierce Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Biomek i7 hybrid</td><td>Beckmann</td><td></td><td>Dowolne urządzenie do obsługi cieczy z możliwością stosowania nadciśnienia, ogrzewania/chłodzenia i wirowania próbek.</td></tr><tr><td>Materiał opakowaniowy C18 (2,5 i mikro; m, 100 & Aring ;)</td><td>Bruker</td><td></td><td>Ten przedmiot nie jest już dostępny w firmie Bruker. Alternatywny materiał opakowaniowy o podanych specyfikacjach będzie wystarczający</td></tr><tr><td>Wirówka z wirnikiem płytowym</td><td>Thermo Scientific</td><td>69720</td><td></td></tr><tr><td>Micro 21R Wirówka</td><td>Sorval</td><td>5437</td><td></td></tr><tr><td>Dionex 3000 UHPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Ten model nie jest już dostępny. Wystarczy dowolny nano LC z automatycznym samplerem.</td></tr><tr><td>Dithiothreiotol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu (13CD2O); 20 % wag. w D2O, 98 atomów % D, 99 atomów % 13C</td><td>Sigma Aldrich, Chemia</td><td>596388-1G</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu (CH2O); 36,5 - 38% w H2O</td><td>Sigma Aldrich, Life Science</td><td>F8775-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Fluka Analityczny</td><td>94318-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Fusion Lumos Mass Spektrometr</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Ten model nie jest już dostępny. Można używać innych instrumentów o wysokiej rozdzielczości (np. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion lub Orbitrap Fusion Lumos).</td></tr><tr><td>Chlorowodorek hydroksyloaminy</td><td>Sigma Aldrich, Chemia</td><td>255580-100G</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid (IAM)</td><td>Acros Organics</td><td>144-48-9</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania izobarycznego (TMT 11-plex)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna z trzustki bydlęcej traktowana L-1-tozyloamido-2 fenyloetyloketonem cholormetylowym (TPCK)</td><td>Sigma Aldrich, Life Science</td><td>T1426-100MG</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma Aldrich, Chemia</td><td>168149-25G</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator mechaniczny (tj. FastPrep-24 5G)</td><td>MP Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>bufor pH 10</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-664-261</td><td>Wystarczy bufor pH 10 dowolnej marki</td></tr><tr><td>Bufor pH 7</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-664-260</td><td>Wystarczy</td></tr><tr><td>pH-metr dowolnej marki 7 (Tris kompatybilny)</td><td>Fisher Scientific (Accumet)</td><td>13-620-183</td><td>Wystarczy pH-metr dowolnej marki</td></tr><tr><td>Oprogramowanie białkowe (np. Proteome Discoverer)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytka rezerwowa 200ml</td><td>Agilent</td><td>204017-100</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanoborodeuterek sodu; 96 atomów % D, 98% CP</td><td>Sigma Aldrich, Chemia</td><td>190020-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanoborowodorek sodu; odczynnik gatunek, 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>156159-10G</td><td></td></tr><tr><td>Speed-vac</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD1010</td><td>wystarczy każda marka szybkostrzelnego odkurzacza, która może pomieścić płytkę z głęboką studnią Płytka</td></tr><tr><td>mieszająca</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td>Wystarczy każda marka płytek mieszających</td></tr><tr><td>20 mg SPE</td><td>Nest Group, Inc.</td><td>HNS S18V</td><td>Są to wkłady C18</td></tr><tr><td>Bufor wodorowęglanu trietyloamoniowego (TEAB)</td><td>Sigma Aldrich, Life Science</td><td>T7408-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biorad</td><td>161-0716</td><td></td></tr><tr><td>Biomek 24-miejscowy uchwyt na probówki</td><td>Beckmann</td><td>373661</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Biorad</td><td>161-0731</td><td></td></tr><tr><td>Woda - MS Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td>Ilość 4 L nie jest konieczna</td></tr></tbody></table>

automatyczne multipleksowanie próbek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cpilot)

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Wprowadziliśmy wysokoprzepustowy ilościowy przepływ pracy proteomiki, połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) zdolne do multipleksowania do 22 lub 24 próbek z tandemowymi znacznikami masowymi lub izobarycznymi znacznikami N,N-dimetyloleucyny izobarycznej, odpowiednio, w jednym eksperymencie. To ulepszone multipleksowanie próbek znacznie skraca czas akwizycji spektrometrii mas i zwiększa użyteczność drogich komercyjnych odczynników izobarycznych. Jednak ręczny proces obsługi próbek i etapów pipetowania w ramach strategii może być pracochłonny, czasochłonny i powodować utratę próbki oraz błąd ilościowy. Ograniczenia te można przezwyciężyć poprzez włączenie automatyzacji. W tym przypadku przenieśliśmy ręczny protokół cPILOT do zautomatyzowanego urządzenia do obsługi cieczy, które może równolegle przygotowywać duże liczby próbek (tj. 96 próbek). Ogólnie rzecz biorąc, automatyzacja zwiększa wykonalność i powtarzalność cPILOT oraz pozwala na szerokie zastosowanie przez innych badaczy z porównywalnymi urządzeniami do automatyzacji.

Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne dane MS dla peptydu zidentyfikowanego we wszystkich 2 kanałach jonów reporterowych z eksperymentu cPILOT 2-plex, w tym powtórzeń procesu. Rysunek 2 (góra) przedstawia parę pików dwukrotnie ładowanych, oddzielonych o 4 Da m/z, co wskazuje na wbudowanie jednej grupy dimetylowej do peptydu. Lekkie i ciężkie pary pików dimetylowanych zostały wyizolowane i pofragmentowane niezależnie w celu uzyskania sekwencji peptydu. Sekwencja peptydu to G(dimethyl)AAELMQQK(TMT-1plex) i odpowiada białku betaino-homocysteinowej S-metylotransferazie. Najintensywniejsze jony fragmentów dla obu pików dimetylowanych, lekkiego i ciężkiego (nie pokazano), zostały dalej wyizolowane do fragmentacji MS3, a jony reporterowe (m/z 126-131) przedstawiono na Rysunku 2 (dół). Intensywności jonów reporterowych są bezpośrednio proporcjonalne do zawartości peptydu w próbce. Zawartość peptydu w próbkach sugeruje, że zdolność pipetowania platformy robotycznej jest dość jednolita we wszystkich 2 próbkach. Ogólnie rzecz biorąc, ten eksperyment cPILOT 2-plex doprowadził do identyfikacji 1326 (1209-lekkich/181-ciężkich) białek na podstawie 3098 (6137-lekkich/5872-ciężkich) peptydów (Tabela 4). Rysunek 3 przedstawia wykres pudełkowy log10 zawartości w stosunku do całkowitych intensywności jonów reporterowych we wszystkich 2 kanałach, wykazujący mniejszą zmienność między studzienkami/próbkami. Ocena pełnej automatyzacji została przeprowadzona poprzez analizę błędu w zawartości jonów reporterowych dla każdego białka w 2 próbkach. Rysunek 4 pokazuje, że przetwarzanie próbek za pomocą platformy robotycznej zaowocowało bardzo niskimi wartościami CV. Konkretnie, spośród 3098 zidentyfikowanych peptydów średnie CV zawartości jonów reporterowych wyniosło odpowiednio 12,36 % dla peptydów lekko dimetylowanych i 15,03 % dla peptydów ciężko dimetylowanych. spośród tych peptydów 2032 posiadało sygnał jonów reporterowych powyżej minimalnego progu i uznano je za mierzalne.
<img alt="Przebieg analizy proteomicznej wątroby myszy; oznaczanie ilościowe metodą BCA, redukcja, dimetylacja, analiza LC-MS³." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat eksperymentalny równoległego przetwarzania 22 próbek z wykorzystaniem zautomatyzowanego protokołu cPILOT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat spektrometrii mas przedstawiający analizę danych MS i MS/MS w celu kwantyfikacji peptydów, wartości m/z." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Ilościowe oznaczenie peptydów w 2 próbkach. Przykład MS (góra) i MS3 (dół) widma peptydu G(dimetyl)AAELMQQK(TMT-1plex) przeanalizowane ilościowo w zautomatyzowanym eksperymencie cPILOT 2-plex dla pików lekkich dimetylowanych (lewy dół) i ciężkich dimetylowanych (prawy dół). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Równowaga statyczna, schemat ΣFx=0, wykresy pudełkowe log10 obfitości dla analizy rozkładu izotopowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3. Wykres pudełkowy całkowitej intensywności jonów reporterowych w funkcji log10 obfitości dla 2 próbek, sporządzony przy użyciu oprogramowania Proteome Discoverer 2.3. Plik RAW przeszukano dwukrotnie w celu zidentyfikowania peptydów lekkich i ciężkich oraz osobno identyfikatorów białek, przyjmując TMT jako modyfikację dynamiczną: lekką (+28,031 Da) i ciężką (+36,076 Da). &amp; +35,069 Da) dimetylacja N-końców peptydów jako modyfikacja statyczna. Przeszukiwanie łączone z uwzględnieniem wszystkich powyższych modyfikacji przeprowadzono w programie Proteome Discover 2.3, aby uzyskać wartość Log 10 Abundance intensywności peptydów dla wszystkich kanałów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres skrzypcowy przedstawia wartości CV% dla analiz proteomicznych z wykorzystaniem testów cPILOT Light oraz Heavy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4. Wykresy skrzypcowe współczynnika zmienności zawartości peptydów obliczonego na podstawie sumarycznych intensywności jonów reporterowych w kanałach 126-131 m/z. Ilość peptydu określono, uzyskując średnią wartość CV wynoszącą 12,36 dla lekkich (2373) oraz 15,03 dla ciężkich (253) peptydów mierzalnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rycina dodatkowa 1. Ilustracja metody cPILOT z pojedynczym peptydem. Przedstawiono znakowanie izotopowe dwóch różnych próbek oraz znakowanie izobaryczne przy użyciu TMT126; otrzymaną mieszaninę wstrzyknięto do spektrometru mas w celu przeprowadzenia analizy LC-MS3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342supfig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa zmiennej</td>
			<td>Wartość</td>
			<td>Opis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OdsalaniePróbki1</td>
			<td>1065</td>
			<td>Objętość do wykorzystania w pierwszym etapie odsolania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DesaltSamp2</td>
			<td>392</td>
			<td>Objętość do wykorzystania w drugim etapie odsolania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DesaltSamp3</td>
			<td>100</td>
			<td>Objętość do wykorzystania w kroku 3 odsolania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryb dewelopera</td>
			<td>BŁĄD</td>
			<td>Wartość False skróci czas inkubacji do 30 s; wartość True spowoduje zastosowanie czasu inkubacji zgodnie z protokołem.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obj.DTT</td>
			<td>3</td>
			<td>Objętość DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Płyta filtrująca</td>
			<td>Targa</td>
			<td>Płyta użyta do odsalania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ObjętośćPłytyFiltrującej</td>
			<td>600</td>
			<td>Objętość do odsolania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przemycia wodą HA</td>
			<td>FAŁSZ</td>
			<td>Liczba płukań wodnych na płytce SPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAMVol</td>
			<td>2</td>
			<td>Objętość jodoacetamidu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PeptideTMTVol</td>
			<td>12.5</td>
			<td>Objętość peptydów do znakowania TMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ciśnienie</td>
			<td>100</td>
			<td>ciśnienie w mbar w PPA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Korekta Temperatury</td>
			<td>1</td>
			<td>Zmiana temperatury</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMTVol</td>
			<td>10</td>
			<td>Objętość do dodania znaczników izobarycznych</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisVol</td>
			<td>800</td>
			<td>Objętość do rozcieńczenia próbki przed mineralizacją</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość trypsyny</td>
			<td>2</td>
			<td>Objętość trypsyny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Użycie licznika czasu dla populacji</td>
			<td>PRAWDA</td>
			<td>Wartość True wyświetla opcje przyłożenia nacisku do płytki, jeśli jest to wymagane</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Lista zmiennych użytych w zautomatyzowanym protokole cPILOT.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ŹródłoRozcieńczalnika</td>
			<td>StudzienkaRozcieńczalnika</td>
			<td>MiejsceDocelowe</td>
			<td>StudzienkaDocelowa</td>
			<td>ObjętośćRozcieńczalnika</td>
			<td>ŹródłoZasobu</td>
			<td>StudzienkaZasobu</td>
			<td>ObjętośćPróbki</td>
			<td>IDPróbki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>24</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Objętość homogenatu wątroby mysiej i mocznika 8 M.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SourceWell</td>
			<td>SourceWell2</td>
			<td>Jon reporterowy</td>
			<td>DestWell1</td>
			<td>DestWell2</td>
			<td>Objętość</td>
			<td>Identyfikator próbki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1</td>
			<td>C1</td>
			<td>126</td>
			<td>A1</td>
			<td>E1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A3</td>
			<td>C3</td>
			<td>127N</td>
			<td>A2</td>
			<td>E2</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A5</td>
			<td>C5</td>
			<td>127C</td>
			<td>A3</td>
			<td>E3</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A7</td>
			<td>C7</td>
			<td>128N</td>
			<td>A4</td>
			<td>E4</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A9</td>
			<td>C9</td>
			<td>128C</td>
			<td>A5</td>
			<td>E5</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1</td>
			<td>C1</td>
			<td>129N</td>
			<td>A6</td>
			<td>E6</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B2</td>
			<td>D2</td>
			<td>129C</td>
			<td>A7</td>
			<td>E7</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B4</td>
			<td>D4</td>
			<td>130N</td>
			<td>A8</td>
			<td>E8</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6</td>
			<td>D6</td>
			<td>130°C</td>
			<td>A9</td>
			<td>E9</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B8</td>
			<td>D8</td>
			<td>131N</td>
			<td>A10</td>
			<td>E10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B10</td>
			<td>D10</td>
			<td>131C</td>
			<td>A1</td>
			<td>E1</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3. Całkowita liczba peptydów, białek i dopasowań widm peptydowych (PSMs).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">Zautomatyzowany system cPILOT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Światło</td>
			<td>Ciężki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Białka</td>
			<td>1209</td>
			<td>1181</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptydy</td>
			<td>6137</td>
			<td>5872</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSM (spektra peptydowe)</td>
			<td>14948</td>
			<td>16762</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4. Kodowanie kreskowe znaczników izobarycznych przy użyciu próbek znakowanych lekko i ciężko.

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ulepszona strategia multipleksowania próbek, która jest w stanie zwiększyć liczbę próbek, które mogą być analizowane jednocześnie z dostępnymi znacznikami izobarycznymi. Zastosowanie platformy robotycznej znacznie zwiększyło przepustowość eksperymentalną, powtarzalność i dokładność ilościową.

Automatyczne multipleksowanie próbek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of ...

Nasz zautomatyzowany protokół cPILOT ułatwia badaczom analizę próbek w sposób wysoce przepustowy. Jest to istotne, ponieważ pozwala nam znacznie szybciej dotrzeć do informacji biologicznych o chorobach lub różnych stanach. Główną zaletą tej techniki jest to, że pomaga ona w równoległym przetwarzaniu wielu próbek, zmniejszając w ten sposób liczbę błędów, które można wykonać, przy użyciu próbek o wysokiej przepustowości.Nasze laboratorium jest zainteresowane zastosowaniami związanymi ze starzeniem się i chorobą Alzheimera. Jednak technika ta może być również wykorzystana do badania dowolnej choroby lub wyzwania, w którym zaangażowane są tkanki biologiczne. Zacznij od włączenia aparatu nadciśnieniowego, urządzenia grzewczego i chłodzącego oraz pomp próżniowych.Podłącz wszystkie akcesoria do urządzenia do obsługi cieczy, które będzie świecić niebieskim światłem, gdy zostanie podłączone do komputera i będzie gotowe do pracy. Porcję 300 mikrolitrów wątroby homogenate do probówki o pojemności 500 mikrolitrów i umieszczenie na dwumililitrowej płytce o głębokości studzienki. Próbkę należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu rozpoczęcia protokołu.Otwórz metodę w oprogramowaniu i umieść wymagane końcówki i sprzęt laboratoryjny w swoich miejscach. Następnie sprawdź ostateczny układ talii i kliknij Dalej, aby kontynuować protokół. Załaduj końcówki o pojemności 230 mikrolitrów i odessaj 90 mikrolitrów ośmiomolowego mocznika ze zbiornika.Następnie dozuj go do wyłożenia jednej z czarnych płytek o głębokości dwóch mililitrów. Rozładuj końcówki TL1 i powtarzaj ten krok, aż mocznik zostanie dodany do wszystkich studzienek. Po dodaniu buforu denaturacyjnego użyj końcówek o pojemności 90 mikrolitrów, aby przenieść 10 mikrolitrów homogenatu wątroby myszy na płytkę z głęboką studzienką.Rozładuj końcówki, a następnie załaduj jeden rząd końcówek o pojemności 90 mikrolitrów i zastrzyj trzy mikrolitry DTT z pierwszej płytki odczynnika. Dozuj naziemną telewizję cyfrową do rzędów pierwszego i drugiego płytki głębokiej studzienki. Uszczelnić płytkę z próbką folią aluminiową i inkubować ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 600 sekund, obracając z prędkością 300 obr./min.Po inkubacji załaduj jeden rząd końcówek o pojemności 90 mikrolitrów, zassaj sześć mikrolitrów IAM z płytki odczynnika pierwszej w rzędzie trzecim i dozuj ją do pierwszego rzędu płytki próbki. Uszczelnić płytkę do pobierania próbek i inkubować ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut, obracając się z prędkością 300 obr./min na urządzeniu chłodzącym. Następnie rozszczelnić płytkę próbki i załadować jeden rząd końcówek o pojemności 90 mikrolitrów.Odessać pięć mikrolitrów cystyny z płytki odczynnika numer jeden w drugim rzędzie i dozować ją do pierwszego i drugiego rzędu płytki z próbką. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po inkubacji wykonuj wstrząs z prędkością 1800 obr./min przez 30 minut.Następnie dodaj 800 mikrolitrów 20-milimolowego buforu Tris z 10 milimolowym chlorkiem wapnia do każdego dołka na płytce z próbką, aby rozcieńczyć stężenie mocznika do dwóch molowców. Dodaj 20 mikrolitrów trypsyny do pierwszego rzędu płytki 96-dołkowej i umieść płytkę w określonym miejscu na pokładzie. Po dodaniu trypsyny do płytki z próbką zamknij ją i inkubuj przez 15 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 600 obr./min na urządzeniu do ogrzewania i chłodzenia.Zatrzymaj trawienie, zasysając 150 mikrolitrów 5% kwasu mrówkowego z trzeciego rzędu płytki z kwasem mrówkowym i dozując go do płytki próbki w rzędzie pierwszym i drugim. Przystąp do odsolenia peptydów. Użyj końcówek o pojemności 1070 mikrolitrów, aby zassać 600 mikrolitrów acetonitrylu.Następnie dozuj go w pierwszym i drugim rzędzie ekstrakcji do fazy stałej lub płytki SPE, aby aktywować C-18. Następnie załadować strawioną próbkę na płytkę SPE w dwóch przejściach. Załaduj dwa rzędy końcówek, odessaj 534 mikrolitry strawionych próbek i dozuj je do pierwszego i drugiego rzędu płytki SPE.Docisnąć płytkę i powtarzać ten krok, aż wszystkie próbki zostaną załadowane. Oczyść peptydy, przemywając je wodą i rozcieńcz peptydy 60 do 40 acetonitrylu w 0,1% kwasie mrówkowym. Następnie umieść płytkę na wierzchu płytki zbiorczej, aby wymyć peptydy za pomocą aparatu nadciśnieniowego.Narysuj przepływ i skonfiguruj wymagane wskazówki i sprzęt laboratoryjny w oprogramowaniu, sprawdź krzyżowo z układem pokładu i kliknij Dalej, aby kontynuować protokół dimetylacji. Rozpuść peptydy w 1% kwasie octowym. Aby wykonać znakowanie dimetylu, załaduj 90 mikrolitrowych końcówek i odessaj 16 mikrolitrów 60-milimolowego lekkiego formaldehydu z drugiego rzędu płytki odczynnika.Dozuj go, aby ułożyć jedną z płytek próbnych, a następnie rozładuj końcówki. Załaduj jeden rząd końcówek o pojemności 90 mikrolitrów i zastrzyj 16 mikrolitrów 60-milimolowego ciężkiego formaldehydu z trzeciego rzędu drugiej płytki odczynnika. Dozuj go w drugim rzędzie płytki próbki i rozładuj końcówki.Załaduj dwa rzędy końcówek o pojemności 90 mikrolitrów i odessaj 16 mikrolitrów 24-milimolowego cyjanoborowodorku sodu i 24-milimolowego cyjanoborodeuterku sodu z pierwszego i drugiego rzędu trzeciej płytki odczynnika, a następnie dozuj odczynniki do pierwszego i drugiego rzędu płytki próbki, aby rozpocząć reakcję dimetylacji. Rozładuj końcówki i użyj wytrząsarki orbitalnej, aby wykonać czasowe wstrząsy przez 15 minut przy 1800 obr./min. Następnie załaduj dwa rzędy końcówek o pojemności 90 mikrolitrów i zastrzyj 32 mikrolitry 1% amoniaku z rzędów trzeciego i czwartego płytki odczynnika.Dozować go do pierwszego i drugiego rzędu drugiej płytki próbki, aby zatrzymać reakcję. Połącz równe objętości lekkich i ciężkich peptydów dimetylowanych w nowej dwumililitrowej płytce głębinowej do odsalania. Po odsoleniu połączonych lekkich i ciężkich peptydów należy je wysuszyć i przeprowadzić znakowanie izobaryczne.Rozpuść peptydy w 100 mikrolitrach 100-milimolowego buforu wodorowęglanu trietyloniowego na wytrząsarce orbitalnej. Następnie użyj końcówek o pojemności 90 mikrolitrów, aby zassać 25 mikrolitrów połączonych dimetylozowanych peptydów i dozować je do pierwszego rzędu płytki przetwarzającej TMT. Załaduj jeden rząd końcówek o pojemności 90 mikrolitrów i zastrzyj 10 mikrolitrów TMT.Dozuj go w pierwszym rzędzie płytki obróbczej TMT, rozładuj końcówki, a następnie wykonuj wstrząs z czasem przez godzinę z prędkością 1800 obr./min. Odessać osiem mikrolitrów hydroksyloaminy z drugiego rzędu płytki TEAB i dozować ją do pierwszego rzędu płytki do przetwarzania TMT. Po 15-minutowym wstrząsaniu przy 1800 obr./min przenieś 30,5 mikrolitra peptydów znakowanych TMT do 1,5 mililitrowej probówki.Następnie przystąp do zbierania i analizy danych zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Reprezentatywne dane MS peptydu zidentyfikowanego we wszystkich 22 kanałach jonów reporterowych z połączonego eksperymentu znakowania izotopowego prekursora i znakowania izobarycznego 22 Plex przedstawiono tutaj. Sekwencja peptydu odpowiada S-metylotransferazie betainy-homocysteiny.Najintensywniejsze jony fragmentacyjne zarówno dla lekkich, jak i ciężkich pików dimetylowanych zostały dodatkowo wyizolowane pod kątem fragmentacji MS3. Intensywność jonów reporterowych jest wprost proporcjonalna do obfitości peptydów w próbce. Ogólnie rzecz biorąc, ten połączony eksperyment znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego skrócił czas przetwarzania próbki i umożliwił wizualizację ekspresji białka w wielu kanałach lub warunkach.Wykres pudełkowy obfitości logarytmu 10 w funkcji całkowitej intensywności jonów reporterowych we wszystkich 22 kanałach wykazuje mniejszą zmienność między dołkami lub między próbkami. Ocenę całkowitej automatyzacji przeprowadzono poprzez zbadanie błędu w obfitości jonów reporterowych w każdym białku w 22 próbkach. Przetwarzanie próbek za pomocą platformy robotycznej skutkowało bardzo niskimi współczynnikami zmienności.W 3098 peptydach średni współczynnik zmienności obfitości jonów reporterowych wynosił 12,36 i 15,03% odpowiednio dla lekkich i ciężkich peptydów dimetylowanych. Próbując zastosować ten protokół, należy pamiętać, że poziomy izotopowe i izobaryczne są używane w jednym eksperymencie. W związku z tym należy przeprowadzić staranne planowanie, aby oznaczyć każdą próbkę znacznikami przeznaczonymi do użycia w eksperymencie.Metodę tę można łatwo zintegrować z innymi systemami robotycznymi i można ją zastosować do różnych tkanek, takich jak lizaty tkankowe lub komórkowe oraz inne płyny biologiczne.

automated-sample-multiplexing-using-combined-precursor-isotopic

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu.  W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ilościowa strategia proteomiczna, która zwiększa możliwości multipleksowania próbek znaczników izobarycznych. Protokół ten opisuje zastosowanie cPILOT do tkanek z mysiego modelu choroby Alzheimera i kontroli typu dzikiego.

Ulepszone multipleksowanie próbek tkanek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę ilościowego i kompleksowego badania metabolizmu wielu źródeł składników odżywczych. Ten przepływ pracy, oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi i procedury analitycznej, pozwala na określenie losu spożywanych składników odżywczych i pochodzenia metabolicznego cząsteczek syntetyzowanych przez mikroorganizmy.

Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Ten przepływ pracy opisuje wydajność efektywnego czasowo i kosztowo wzbogacania wielu modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM) jednocześnie dla ilościowej globalnej analizy proteomicznej. Protokół wykorzystuje wzbogacanie PTM na poziomie peptydów wieloma sprzężonymi przeciwciałami, a następnie niezależną od danych analizę spektrometrii mas w celu uzyskania biologicznego wglądu w przesłuchy PTM.

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Utlenianie tiolu białka ma znaczące implikacje w normalnych warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Opisujemy szczegóły ilościowej metody proteomiki redoks, która wykorzystuje wychwytywanie wspomagane żywicą, znakowanie izobaryczne i spektrometrię mas, umożliwiając specyficzną dla miejsca identyfikację i kwantyfikację odwracalnie utlenionych reszt cysteiny białek.

Wychwytywanie wspomagane żywicą w połączeniu z izobarycznym tandemowym etykietowaniem masy w celu multipleksowanej kwantyfikacji utleniania tiolu białek

W tym protokole opisujemy, jak przygotować komórki ssaków do analizy proteomicznej pojedynczej komórki za pomocą spektrometrii mas przy użyciu dostępnych na rynku odczynników i sprzętu, z opcjami zarówno ręcznego, jak i automatycznego pipetowania.

Przygotowanie proteomiki jednokomórkowej do analizy spektrometrii mas z wykorzystaniem lizy cieplno-zamrażalniczej i nośnika izobarycznego

Przedstawiona tutaj jest metoda badania struktur lipidowych poprzez znakowanie stabilnych izotopów przy użyciu czasu ich retencji, mobilności i fragmentacji.

Śledzenie lipidów de novo przy użyciu znakowania stabilnych izotopów LC-TIMS-TOF MS/MS

Przedstawiamy tutaj protokół automatyzacji analizy posttranslacyjnej modyfikacji histonów pojedynczych komórek, wykorzystując strategię znakowania izotopowego dwu-plexowego oraz trawienie ArgC. Ten workflow umożliwia ilościowe, powtarzalne i wysokoczułe profilowanie heterogeniczności chromatyny oraz odpowiedzi epigenetycznych w rozdzielczości pojedynczych komórek.

Automatyczne przygotowanie próbki do multipleksowanej analizy pojedynczokomórkowych modyfikacji histonów po translacji (sc-hPTM2)

Poznaj zautomatyzowaną metodę cPILOT do multipleksowania próbek w badaniach proteomicznych. Technika ta umożliwia równoległą analizę wielu próbek, zwiększając przepustowość i dokładność w badaniach nad chorobami takimi jak Alzheimer.

Automatyczne multipleksowanie próbek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT) (Wideo) | JoVE Journal

Automatyczne multipleksowanie próbek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Przeglądaj więcej filmów