Name: Izolacja chemiczna, kwantyfikacja i separacja lipidów skóry (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Naucz się izolacji lipidów skóry od gadów do badania sygnalizacji chemicznej. Ta metoda umożliwia ekstrakcję, kwantyfikację i frakcjonowanie związków bioaktywnych. Protokół wspiera badania nad komunikacją chemiczną i zarządzaniem gatunkami inwazyjnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Rozwój tych metod, zwłaszcza ekstrakcji lipidów w skórze, nastąpił podczas umów o współpracy (14-7412-1061-CA, 15-7412-1155-CA i 16-7412-1269-CA) pomiędzy Uniwersytetem Jamesa Madisona (JMU) a Służbą Inspekcji Zdrowia Zwierząt i Roślin Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (APHIS). M.R.P. docenia wkład następujących studentów w rozwój metod zrzucania skóry: S. Patel (Washington and Lee University [WLU]), J. Zachry (WLU), R. Flores (JMU), J. Noll (JMU) i S. Ashton (JMU).

<ol><li>Mason, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+pheromones+in+snakes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sex pheromones in snakes.</a> Science. 245 (4915), 290-292 (1989).</li>
<li>Mason, R. T., Parker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+behavior+and+pheromonal+communication+in+reptiles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+A%22%5BJournal%5D)">Social behavior and pheromonal communication in reptiles.</a> Journal of Comparative Physiology A. 196 (10), 729-749 (2010).</li>
<li>Martín, J., López, P. Pheromones and chemical communication in lizards. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMart%C3%ADn%2C+J+%22Reproductive+Biology+and+Phylogeny+of+Lizards+and+Tuatara%22">Reproductive Biology and Phylogeny of Lizards and Tuatara</a>. Rheubert, J. L., Siegel, D. S., Trauth, S. E. , CRC Press. Enfield, NJ. 43-77 (2014).</li>
<li>Mayerl, C., Baeckens, S., Van Damme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+role+of+the+follicular+epidermal+gland+system+in+non-ophidian+squamates%5BTitle%5D)+AND+%22Amphibia-Reptilia%22%5BJournal%5D)">Evolution and role of the follicular epidermal gland system in non-ophidian squamates.</a> Amphibia-Reptilia. 36 (3), 185-206 (2015).</li>
<li>Mathies, T., Levine, B., Engeman, R., Savidge, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromonal+control+of+the+invasive+brown+treesnake%3A+potency+of+female+sexual+attractiveness+pheromone+varies+with+ovarian+state%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pest+Management%22%5BJournal%5D)">Pheromonal control of the invasive brown treesnake: potency of female sexual attractiveness pheromone varies with ovarian state.</a> International Journal of Pest Management. 59 (2), 141-149 (2013).</li>
<li>Parker, M. R., Patel, S. M., Zachry, J. E., Kimball, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feminization+of+male+brown+treesnake+methyl+ketone+expression+via+steroid+hormone+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Feminization of male brown treesnake methyl ketone expression via steroid hormone manipulation.</a> Journal of Chemical Ecology. 44 (2), 189-197 (2018).</li>
<li>Parker, M. R., Mason, R. T. Pheromones in snakes: history, patterns, and future research directions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aParker%2C+MR+%22Reproductive+Biology+and+Phylogeny+of+Snakes%22">Reproductive Biology and Phylogeny of Snakes</a>. Sever, D., Aldridge, R. , CRC Press. Enfield, NJ. 551-572 (2011).</li>
<li>Parker, M. R., Mason, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+temperature+dormancy+affects+the+quantity+and+quality+of+the+female+sexual+attractiveness+pheromone+in+red-sided+garter+snakes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Low temperature dormancy affects the quantity and quality of the female sexual attractiveness pheromone in red-sided garter snakes.</a> Journal of Chemical Ecology. 35 (10), 1234-1241 (2009).</li>
<li>Parker, M. R., Mason, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+sexy+snake%3A+estrogen+activation+of+female+sex+pheromone+in+male+red-sided+garter+snakes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">How to make a sexy snake: estrogen activation of female sex pheromone in male red-sided garter snakes.</a> Journal of Experimental Biology. 215 (5), 723-730 (2012).</li>
<li>Alberts, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constraints+on+the+design+of+chemical+communication+systems+in+terrestrial+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22American+Naturalist%22%5BJournal%5D)">Constraints on the design of chemical communication systems in terrestrial vertebrates.</a> American Naturalist. 139, S62-S89 (1992).</li>
<li>Martín, J., Ortega, J., López, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpopulational+variations+in+sexual+chemical+signals+of+Iberian+wall+lizards+may+allow+maximizing+signal+efficiency+under+different+climatic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Interpopulational variations in sexual chemical signals of Iberian wall lizards may allow maximizing signal efficiency under different climatic conditions.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0131492(2015).</li>
<li>Baeckens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+conditions+shape+the+chemical+signal+design+of+lizards%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Ecology%22%5BJournal%5D)">Environmental conditions shape the chemical signal design of lizards.</a> Functional Ecology. 32 (2), 566-580 (2018).</li>
<li>Greene, M. J., Mason, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+mediated+sexual+behavior+of+the+brown+tree+snake%2C+Boiga+irregularis%5BTitle%5D)+AND+%22Ecoscience%22%5BJournal%5D)">Chemically mediated sexual behavior of the brown tree snake, Boiga irregularis.</a> Ecoscience. 5 (3), 405-409 (1998).</li>
<li>Mason, R. T. Integrated pest management: The case for pheromonal control of habu and brown tree snakes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMason%2C+RT+%22Snakes+and+Man%3A+Controlling+Pest+Species+for+Conservation+and+Human+Health%22">Snakes and Man: Controlling Pest Species for Conservation and Human Health</a>. Rodda, G., Chiszar, D., Sawai, Y., Tanaka, H. , Cornell University Press. Ithaca, NY. 196-205 (1998).</li>
<li>Pruett, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+interactions+between+visual+and+chemical+signals%3A+chemosignals+compensate+for+the+loss+of+a+visual+signal+in+male+Sceloporus+lizards%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary interactions between visual and chemical signals: chemosignals compensate for the loss of a visual signal in male Sceloporus lizards.</a> Journal of Chemical Ecology. 42 (11), 1164-1174 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ekstrakcja lipidów skórnych u może być stosowana do żywej lub martwej skóry, oprócz zrzucania skóry, co zapewnia wszechstronność w eksperymentalnym zastosowaniu tej techniki. Co więcej, ekstrakcje lipidów skóry mogą być wykonywane w terenie, aby umożliwić dynamiczne zastosowanie metody do szerokiego grona biologów 2,13. Ekstrakcja lipidów skóry jest prosta; W związku z tym łatwo jest zwiększyć skalę ekstrakcji w zależności od potrzeb dla eksperymentu lub projektu, a praktycy nie muszą mieć znaczącej wiedzy specjalistycznej, aby wykonać te metody. Jedynymi czynnikami ograniczającymi zwiększenie skali są dostępność miejsca pod wyciągiem, duża ilość czystych, zamykanych naczyń szklanych oraz miejsce do przechowywania rozpuszczalników.
Frakcjonowanie ekstraktu lipidowego ze skóry może być dostosowane do potrzeb badacza, a zatem ma podobną elastyczność do ekstrakcji lipidów. Na przykład neutralne lipidy można eluować, a następnie odrzucać, aby uzyskać frakcje docelowe, które mogą oczyścić interesujące związki lub uprościć testy biologiczne. Frakcjonowanie można przeprowadzać w wielu skalach w próbkach lipidów i między nimi. Na przykład wiele kolumn może być uruchamianych jednocześnie, aby proces był bardziej wydajny. Lub tylko część całkowitego ekstraktu lipidowego może być frakcjonowana na małej kolumnie, aby w ten sposób zaoszczędzić odczynniki i czas. Frakcjonowanie jest ograniczone przede wszystkim masą całkowitego ekstraktu lipidowego oraz precyzją sprzętu, jakim dysponuje badacz. Na przykład, jeśli badacz posiada wagę z dokładnością do 10,0 mg, określenie masy frakcji, a tym samym dokładność przygotowania próbki do analizy GC-MS, jest znacznie, jeśli nie całkowicie, utrudnione. To samo dotyczy wyrobów szklanych. Jeśli badacz ma kolumnę o dużej objętości do frakcjonowania, ale ma małą całkowitą masę lipidową do oddzielenia, elucja lub separacja związków będzie postępować, ale będzie wymagała znacznego marnotrawstwa rozpuszczalników, odczynników, czasu i potencjalnie samych związków docelowych.
Zaleca się przeprowadzenie kontroli jakości przed określeniem schematu elucji, jak pokazano w tabeli 2, i podjęcie decyzji, które frakcje można odrzucić. Aby potwierdzić elucję pożądanych lipidów, można uruchomić kolumnę, w której każda frakcja, 1 - 15, jest zbierana indywidualnie, a następnie analizowana za pomocą GC-MS. Na rysunku 3 reprezentatywne ślady chromatografu gazowego pokazują, że ketony metylowe z węży do pończoch wymywają się z kolumny tylko w określonej frakcji. Wykonując ten etap kontroli jakości, można opracować zmodyfikowany schemat elucji dla danego gatunku, aby zapewnić maksymalną wydajność interesujących związków. Zmiany w materiałach, takie jak dostawca lub partia tlenku glinu lub wiek eteru dietylowego, z pewnością spowodują różnice w elucji, które należy kontrolować poprzez przeprowadzenie testu kontroli jakości.
Opisane techniki są ograniczone głównie przez chemiczny charakter sygnałów, które można uzyskać. Przede wszystkim metody te pozwalają naukowcom jedynie na wyizolowanie i oddzielenie długołańcuchowych lipidów od skóry. Wiele gatunków wykorzystuje sygnały unoszące się w powietrzu i/lub białkowe jako sygnały chemiczne, a opisane metody są niekompatybilne z izolacją tych sygnałów. Co więcej, rozpuszczalniki niepolarne nie będą ekstrahować wodnych sygnałów z powierzchni lub źródeł osadzania się sygnałów (np. wody w klatce, kału, podłoża wodnego), które mogą rzeczywiście zawierać obfite sygnały chemiczne. Odpowiednie metody wychwytywania tego typu sygnałów są dostępne dla badaczy (np. mikroekstrakcja do fazy stałej [SPME] dla sygnałów lotnych i wysokosprawna chromatografia cieczowa [HPLC] dla wskazówek wodnych), chociaż, podobnie jak w przypadku metod opisanych powyżej, istnieje techniczna krzywa uczenia się.
Co najważniejsze, użyteczność końcowej mieszaniny chemicznej dla badacza powinna kierować stosowanymi metodami. Na przykład, jeśli badacz chce wiedzieć, czy samiec zwierzęcia ogniskowego może rozróżnić sygnały wytwarzane przez samce i samice współplemieńców w ukierunkowanym teście biologicznym, ekstrakcja jest jedyną potrzebną metodą 2,3. Jeśli jednak celem jest identyfikacja związków dymorficznych płciowo, ekstrakt powinien zostać oczyszczony, aby umożliwić większą pewność w przypisywaniu identyfikacji określonym cząsteczkom lub grupom cząsteczek za pomocą analizy chemicznej 1,6,9,11. Jednak, aby nawet przeprowadzić chromatografię ze źródłem lipidów, wymagana jest znaczna masa ekstraktu wyjściowego, aby można było uzyskać mierzalne masy frakcji; W przeciwnym razie można dążyć do łączenia próbek, ale nie jest to optymalne14.
Przyszły rozwój tego protokołu obejmuje środki mające na celu wykorzystanie i dostosowanie procedury do większej liczby gatunków. Opracowywane są również dodatkowe nieinwazyjne metody ekstrakcji lipidów skóry.

wytwarzają lipidy w naskórku, albo bezpośrednio z komórek skóry, albo z odrębnych gruczołów, które są wykorzystywane w komunikacji społecznej, takiej jak ocena i śledzenie partnerów, terytorialność oraz rozpoznawanie wewnątrz- i międzygatunkowe1,2,3,4. Izolacja tych lipidów skórnych ma zastosowanie w badaniach skoncentrowanych na wzorcach ewolucyjnych i mechanizmach komunikacji chemicznej, a także w zrozumieniu wodoodpornej roli lipidów w ewolucji życia lądowego2,3,4. Co więcej, wiele, zwłaszcza łuskokształtne (jaszczurki, węże), jest gatunkami inwazyjnymi budzącymi obawy we wrażliwych ekosystemach, a rozwój przynęt na bazie feromonów w celu poprawy pułapek i usuwania jest w toku5,6. Nieprzepuszczalność skóry ułatwia ekstrakcję obecnych lipidów w celu uzyskania stosunkowo czystej ekstrakcji potencjalnie solidnego źródła sygnałów chemicznych. Podstawowe kroki ilościowego oznaczania lipidów skóry w opisanym protokole obejmują ekstrakcję, całkowite oznaczenie lipidów i frakcjonowanie za pomocą chromatografii kolumnowej1,6,7. Metody te są stosowane rutynowo, ponieważ dają bioaktywne izolaty, które wyjaśniają wiele na temat wyboru partnera i selekcji, szczególnie u węży2.
Lipidy skóry mogą być ekstrahowane zarówno z żywej skóry, zrzuconej skóry, jak i martwych całych, przy użyciu niepolarnych lub polarnych rozpuszczalników organicznych1,7,8,9. Należy zauważyć, że okazy muzealne przechowywane w rozpuszczalnikach, takich jak etanol, nie są optymalne do ekstrakcji lipidów skóry, a jedynie świeże lub świeżo mrożone tusze powinny być brane pod uwagę jako możliwe źródła ekstrakcji. Lipidy skóry są obojętne, co sprawia, że są stabilne na powierzchni skóry i łatwe do ekstrakcji7. W swoich rolach sygnalizacyjnych w ekologii, sygnały lipidowe skóry są często odkładane w trudnych warunkach, ale ze względu na ich silne właściwości chemiczne, takie sygnały mogą zachować swoją wartość informacyjną przez długi czas10,11,12. W procesie ekstrakcji dochodzi do rozpuszczenia lipidów przy użyciu rozpuszczalnika niepolarnego (np. heksanu, benzenu, toluenu) przez wiele godzin, po którym następuje odparowanie rozpuszczalnika, aby pozostawić mierzalną masę ekstraktu lipidowego7,8. Lipidy skóry są wysoce mieszalne z rozpuszczalnikami niepolarnymi, a szeroka gama węglowodorów może być ekstrahowana z podobnie zróżnicowanej gamy źródeł.
Frakcjonowanie jest bardziej pracochłonne niż ekstrakcja, ale służy do rozdzielenia całkowitego ekstraktu lipidowego na określone frakcje za pomocą chromatografii kolumnowej, aby pomóc w oczyszczaniu i możliwej identyfikacji zawartych w nim związków1,6,7,8. Całkowity ekstrakt lipidowy jest wiązany z kolumną opartą na substracie, a następnie poszczególne eluaty ("frakcje") rozpuszczalnika o określonych objętościach są kolejno przepuszczane przez kolumnę w celu wymycia zestawów związków z mieszaniny lipidowej, które mają wspólną polarność6,7,8. W chromatografii lipidowej frakcje postępują w polarności w pewnej znormalizowanej kolejności poprzez zwiększenie względnej ilości rozpuszczalnika polarnego (np. eteru dietylowego) w rozpuszczalniku niepolarnym (zwykle wyrażonego w procentach: 0%, 2%, 4% eteru itp.)6,7,8. Chociaż metody takie jak chromatografia cienkowarstwowa (TLC) mogą być stosowane do rozdzielania lipidów w mieszaninie i są prostsze, preferowana jest chromatografia kolumnowa, ponieważ wykorzystuje system zamknięty, jest łatwa do kontrolowania, może oddzielać bardziej skoncentrowane mieszaniny i jest kompatybilna z multipleksowaniem w celu zwiększenia wydajności. W tym manuskrypcie opisujemy kilka metod ekstrakcji lipidów skóry, a następnie przedstawiamy standardowy protokół izolowania różnych zestawów związków w oparciu o polarność, przy użyciu tradycyjnej chromatografii kolumnowej. W wielu projektach badawczych obejmujących izolację sygnałów chemicznych ostatecznym celem jest wywołanie zmian w odbiornikach wystawionych na te sygnały. Całe ekstrakty lipidowe lub określone frakcje mogą być zatem używane w testach biologicznych w celu określenia dowolnej aktywności biologicznej wywołanej przez zawarte w nich związki1,2,6,7. Na przykład w podstawowych badaniach biologicznych testy biologiczne z wykorzystaniem określonych frakcji mogą ujawnić badaczom, że oczyszczone źródło feromonów zostało wyizolowane, a następnie można zastosować metody identyfikacji docelowych związków. Z punktu widzenia zarządzania dziką przyrodą identyfikacja może nie być celem, a zamiast tego aktywna frakcja może być wykorzystana w terenie do zwabienia przedstawicieli tego samego gatunku do pułapek lub zahamowania śledzenia partnerów w nierodzimym siedlisku13,14.

<table><tbody><tr><td>Bezpudrowe rękawice chloroprenowe</td><td>Microflex</td><td>NEC-288</td><td>Zobacz "1.1 Konfiguracja ekstrakcji szopy" (krok 1.1.2 "rękawice")</td></tr><tr><td>Ohaus Adventurer Precision Balance</td><td>Ohaus</td><td>AX622</td><td>Zobacz "1.1 Konfiguracja ekstrakcji szopy" (krok 1.1.3 "równowaga")</td></tr><tr><td>Freund Container Ball 16 uncji słoika Mason & Kulka pokrywy</td><td></td><td>NC9661590</td><td>Patrz "1.1 Konfiguracja ekstrakcji szopy" (krok 1.1.5 "słoik z masonem")</td></tr><tr><td>Heksan, mieszaniny izomerów</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650544</td><td>Zobacz "1.1 Konfiguracja ekstrakcji szopy" (krok 1.1.6 "heksan")</td></tr><tr><td>Taśma temperaturowa Hi/Lo Write-On</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>5029927</td><td>Zobacz "1.1 Konfiguracja ekstrakcji szopy" (krok 1.1.8 "taśma")</td></tr><tr><td>Kolba okrągłodenna z pojedynczą szyjką, pojemność 500 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z414514</td><td>Patrz "2. Ekstrakcja" (krok 2.1.2.4 "500 ml")</td></tr><tr><td>Kolba okrągłodenna z pojedynczą szyjką, pojemność 100 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z414492</td><td>Patrz "3.2 Frakcjonowanie" (krok 3.2.4 "100 ml")</td></tr><tr><td>Pierścień podtrzymujący kolbę korkową</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z512419</td><td>Patrz "2. Ekstrakcja" (krok 2.1.2.1 "korkowy pierścień podtrzymujący")</td></tr><tr><td>Kontroler pipet Accu-jet Pro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z671533</td><td>Patrz "2. Ekstrakcja" (krok 2.1.1.3 "elektryczny sterownik pipet")</td></tr><tr><td>Jednorazowe szklane pipety serologiczne pakowane pojedynczo, 10 ml</td><td>Pyrex</td><td>13-666-7E</td><td>Patrz "2. Ekstrakcja" (krok 2.1.1.3 "Pipeta 10 ml")</td></tr><tr><td>Rotavapor R II</td><td>Buchi</td><td>2422A0</td><td>Patrz "2. Ekstrakcja" (krok 2.1.2.1 "wyparka obrotowa")</td></tr><tr><td>Eliptyczna pułapka uderzeniowa</td><td>Chemglass Nauki przyrodnicze</td><td>501215241</td><td>Patrz "2. Ekstrakcja" (krok 2.1.2.1 "pułapka uderzeniowa")</td></tr><tr><td>Fiolki 7 ml, zakrętka, przezroczyste szkło</td><td>Supelco</td><td>27151</td><td>Patrz "1.1 Konfiguracja ekstrakcji szopowej" (krok 1.1.11 "Fiolka 7 ml")</td></tr><tr><td>Zakrętka fiolki 7 mL, solidna góra z wkładką PTFE</td><td>Supelco</td><td>27152</td><td>Patrz "1.1 Konfiguracja ekstrakcji szopy" (krok 1.1.11 "nakrętka")</td></tr><tr><td>Fiolki 22 ml, Zakrętka, przezroczyste szkło</td><td>Supelco</td><td>27173</td><td>Patrz "1.1 Konfiguracja ekstrakcji szopy" (krok 1.1.11 "Fiolka 22 ml")</td></tr><tr><td>Zakrętka fiolki 22 mL, solidna nakrętka z wkładką PTFE</td><td>Supelco</td><td>27174-U</td><td>Patrz "1.1 Konfiguracja ekstrakcji szopy" (krok 1.1.11 "nasadka")</td></tr><tr><td>Waga analityczna Excellence XS</td><td>Mettler-Toledo</td><td>XS205DU</td><td>Patrz "2. Ekstrakcja" (krok 2.1.2.1 "równowaga")</td></tr><tr><td>5 3/4" Jednorazowa szklana pipeta</td><td>Fisherbrand</td><td>NC0418555</td><td>Patrz "1.1 Konfiguracja ekstrakcji szopy" (krok 1.1.11 "pipeta")</td></tr><tr><td>Kolumna chromatograficzna z zespołem krana PTFE</td><td>Kimble-Chase</td><td>17810-19300</td><td>Patrz "3.1 Przygotowanie kolumny" (krok 3.1.1 "mała szklana kolumna")</td></tr><tr><td>Żeliwna podstawa w kształcie litery L Stojaki</td><td>Fischerbrand</td><td>11474207</td><td>Patrz "3.1 Przygotowanie kolumny" (krok 3.1.1 "Podstawa podporowa")</td></tr><tr><td>3-bolcowy podwójnie regulowany niklowany Clamp</td><td>Troemner</td><td>2300203</td><td>Patrz "3.1 Przygotowanie kolumny" (krok 3.1.1 "zaciski")</td></tr><tr><td>Clamp Regular Holder</td><td>Fischerbrand</td><td>05754Q</td><td>Patrz "3.1 Przygotowanie kolumny" (krok 3.1.1 "clamp holder")</td></tr><tr><td>Piasek, umyty i wysuszony</td><td>Macron Fine Chemical</td><td>MK-7062-212</td><td>Patrz "3.1 Przygotowanie kolumny" (krok 3.1.5 "piasek")</td></tr><tr><td>Tlenek glinu, neutralny</td><td>Sorbtech</td><td>15740-5</td><td>Patrz "3.1 Przygotowanie kolumny" (krok 3.1.7 "tlenek glinu"); jedyny znany producent w USA</td></tr><tr><td>Szklana kolba Erlenmeyera o wąskiej szyjce, 1000 ml</td><td>Pyrex</td><td>4980-1L</td><td>Patrz "3.1 Przygotowanie kolumny" (krok 3.1.6 "Kolba Erlenmeyera")</td></tr><tr><td>Kolba okrągłodenna z pojedynczą szyjką, pojemność 250 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z100684</td><td>Patrz "3.1 Przygotowanie kolumny" (krok 3.2.4 "Kolba okrągłodenna 250 ml")</td></tr><tr><td>Skalibrowana kolumna chromatograficzna ze zbiornikiem rozpuszczalnika</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z560553</td><td>Patrz "3.2 Przygotowanie kolumny" (Krok 3.2.1 "duża szklana kolumna" )</td></tr> <tr><td>Eter etylowy bezwodny</td><td>Fisher Chemical</td><td>E138500</td><td>Patrz "3.2 Frakcjonowanie" (krok 3.2.5 "Eter")</td></tr><tr><td>Alconox Detergnet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242985</td><td>Patrz "4. Czyszczenie" (krok 4.2 "Alconox")</td></tr><tr><td>Aceton (certyfikowany ACS)</td><td>Fisher Chemical</td><td>A18P-4</td><td>Patrz "4. Czyszczenie" (krok 4.4 "aceton")</td></tr></tbody></table>

izolacja chemiczna, kwantyfikacja i separacja lipidów skóry

Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles

sygnalizują swoim przedstawicielom za pomocą lipidów w ich skórze, przede wszystkim w celu umożliwienia śledzenia i oceny partnerów. Izolacja tych lipidów ma zastosowanie w badaniach skoncentrowanych na wzorcach ewolucyjnych i mechanizmach komunikacji chemicznej, a także w zrozumieniu wodoodpornej roli lipidów w ewolucji życia ziemskiego. W podejściu stosowanym, takie wskazówki oparte na skórze mogą być przydatne dla osób zarządzających dziką przyrodą zajmujących się gatunkami inwazyjnymi. Główne etapy ilościowego oznaczania lipidów skóry w przedstawionym tutaj protokole obejmują ekstrakcję, całkowite oznaczenie lipidów i frakcjonowanie za pomocą chromatografii kolumnowej, przy czym ten ostatni proces prowadzi do oczyszczenia eluatów związków, które mogą być następnie analizowane w celu przypisania identyfikacji związków (np. chromatografia gazowa ze spektrometrią mas [GC-MS]) i / lub stosowane bezpośrednio w bardziej wyrafinowanych testach biologicznych. Lipidy skóry można ekstrahować z żywej skóry, zrzuconej skóry lub martwych całych zwierząt przy użyciu niepolarnych rozpuszczalników organicznych (np. heksanu, benzenu, toluenu). Ekstrakcja rozpuszcza lipidy, a następnie rozpuszczalnik można odparować, aby uzyskać mierzalny ekstrakt zawierający tylko lipidy. Frakcjonowanie polega na rozdzieleniu całkowitego ekstraktu lipidowego na określone eluaty za pomocą tradycyjnej chromatografii kolumnowej. Całkowity ekstrakt lipidowy jest najpierw wiązany z kolumną opartą na substracie (np. tlenku glinu), a następnie poszczególne eluaty ("frakcje") rozpuszczalnika o określonych objętościach są kolejno przepuszczane przez kolumnę w celu wymycia zestawów związków z mieszaniny lipidowej w oparciu o wspólną polarność. Frakcje postępują w polarności w znormalizowanej kolejności poprzez zwiększenie względnej ilości rozpuszczalnika polarnego (np. eteru dietylowego) w rozpuszczalniku niepolarnym. W tym manuskrypcie opisujemy kilka metod ekstrakcji lipidów skóry, a następnie przedstawiamy standardowy protokół izolowania różnych zestawów związków w oparciu o polarność, przy użyciu tradycyjnej chromatografii kolumnowej. Całe ekstrakty lipidowe lub określone frakcje mogą być następnie wykorzystane w testach biologicznych w celu określenia jakiejkolwiek aktywności biologicznej wywołanej przez zawarte w nich związki.

Po ekstrakcji całkowita masa lipidów jest pierwszym rodzajem danych, jakie można uzyskać dzięki przedstawionemu tutaj protokołowi. Jednak wartości całkowitej masy lipidów nigdy nie powinny być analizowane bez próby standaryzacji uzyskanych wyników. Można zastosować kilka podejść, ale zalecamy standaryzację wyekstrahowanej masy lipidów względem SVL zwierzęcia (w centymetrach) lub względem masy wyekstrahowanej zrzuconej skóry. Pierwsza metoda pozwala uzyskać wartość masy lipidów na jednostkę długości, a druga określa proporcję względem masy materiału źródłowego. Powodem standaryzacji jest fakt, że większe zwierzęta naturalnie produkują więcej lipidów skórnych ze względu na większą całkowitą powierzchnię skóry. Rysunek 1A obrazuje tę zależność, w której wyekstrahowana masa lipidów skórnych skaluje się liniowo z masą wyekstrahowanej zrzuconej skóry. Po standaryzacji względem całkowitej masy zrzuconej skóry ta liniowa zależność zostaje całkowicie zniesiona (Rysunek 1B).
Po frakcjonowaniu można zastosować tę samą metodę standaryzacji w odniesieniu do mas poszczególnych frakcji (Rysunek 2). W tym zestawie danych próbkowych każda frakcja nie wnosi równych proporcji do całkowitej masy ekstrahowanych lipidów: lipidy neutralne (frakcje 1 - 3) stanowią dominującą grupę związków pod względem proporcji masy w porównaniu do każdego zestawu lipidów bardziej polarnych (frakcje 4 - 6, 7 - 9 oraz 10 - 12).
<img alt="Wykresy rozrzutu masy wyekstrahowanych lipidów skóry w stosunku do masy zrzuconej skóry, przedstawiające wyniki analizy korelacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59018/59018fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zależności między masą wyekstrahowanych lipidów a materiałem wejściowym. (A) U gadów występuje dodatnia korelacja między całkowitą masą zrzuconej skóry a masą wyekstrahowanych lipidów skórnych (P &lt; 0.001). (B) Gdy masa wyekstrahowanych lipidów skóry zostanie znormalizowana do całkowitej masy złuszczonego naskórka (masa lipidów podzielona przez masę złuszczonego naskórka), zależność ta przestaje występować (P = 0.46). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59018/59018fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.</a>
<img alt="Wykres słupkowy analizy frakcji lipidowych; proporcje ekstraktu lipidowego skóry w podziale na frakcje; wizualizacja danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59018/59018fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Standaryzowane masy frakcji po elucji. Za pomocą chromatografii kolumnowej można eluować ekstrakty z lipidów skóry do frakcji, w zależności od polarności związków. Masa frakcji jest następnie wyrażana jako proporcja całkowitego ekstraktu lipidowego (masa frakcji [w miligramach] podzielona przez masę całkowitego ekstraktu lipidowego [w miligramach]), aby określić różnice między frakcjami lub grupami eksperymentalnymi.8Słupki przedstawiają średnie. Górny słupek błędu to SEM; dolny słupek błędu to 95% CI. Dla przejrzystości naniesiono poszczególne punkty danych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59018/59018fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wyniki chromatografii; wykresy czasu retencji w funkcji obfitości dla analizy związków, porównanie podwójnych wykresów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59018/59018fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne chromatogramy gazowe frakcji metyloketonów. (APrzy odpowiedniej elucji związki najliczniej występujące w frakcji 7 to metyloketony z Tabela 2 i mogą być postrzegane jako pary pików (czas retencji = 24–34 min). (B) Frakcja 6 z Tabela 2jednakże pozwala jedynie na uzyskanie związków niecelowych. Taki sam wynik może wystąpić, gdy polarny rozpuszczalnik użyty w fazie ruchomej jest przeterminowany lub gdy praca kolumny została zatrzymana na dłuższy czas (&gt;1 h) pomiędzy frakcjami. Zwróć uwagę na różnicę w obfitości cząsteczek między dwoma śladami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59018/59018fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Frakcja</td>
			<td>Heksan (ml)</td>
			<td>Eter dietylowy (ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2,3</td>
			<td>100 [30]</td>
			<td>0 [0]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,5,6</td>
			<td>98 [29.4]</td>
			<td>2 [0.6]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7,8,9</td>
			<td>96 [28.8]</td>
			<td>4 [1.2]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10,11,12</td>
			<td>92 [27.6]</td>
			<td>8 [2.4]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13,14,15</td>
			<td>84 [25.2]</td>
			<td>16 [4.8]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Standardowe objętości elucji dla frakcjonowania lipidów skóry. Podano objętości i procenty rozpuszczalników zarówno dla kolumn chromatograficznych o dużej objętości (np. 250 mL), jak i [małej objętości] (np. 10 mL) z zastosowaniem tlenku glinu (aktywność III). Rozpuszczalnikiem nośnym jest heksan, a fazą ruchomą eter dietylowy.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr>
			<td>Frakcja</td>
			<td>Heksan (mL)</td>
			<td>Eter dietylowy (mL)</td>
			<td>Uwagi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1, 2, 3</td>
			<td>30</td>
			<td>0</td>
			<td>eluować; nie zbierać</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4, 5</td>
			<td>28.8</td>
			<td>1.2</td>
			<td>eluować; nie zbierać</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6, 7, 8</td>
			<td>28.8</td>
			<td>1.2</td>
			<td>zbierać oddzielnie; większość masy metyloketonu znajdzie się we frakcji 7; należy przeprowadzić kontrolę jakości GC-MS dla frakcji 6 i 8, aby upewnić się co do prawidłowej elucji ketonów</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Zmodyfikowany schemat elucji dla metyloketonów węża królewskiego. Objętości te są przeznaczone do stosowania z kolumną chromatograficzną o małej pojemności oraz z aktualnie dostępną marką tlenku glinu. Eluowana frakcja wykazująca obecność ketonów metylowych posiada silną bioaktywność w testach polowych przeprowadzanych z dzikimi, tokującymi samcami zaskrońców.1,7Aby potwierdzić obecność ketonów metylowych w docelowych frakcjach, próbki można rozcieńczyć do stężenia 1 mg/ml i poddać analizie poprzez GC-MS. Rysunek 3 przedstawiono reprezentatywne chromatogramy dla wyników dodatnich i ujemnych po elucji.

U, lipidy skórne od przedstawicieli tego samego gatunku są kluczowe dla sygnalizacji seksualnej, z potencjalnym zastosowaniem w zarządzaniu gatunkami inwazyjnymi. W tym miejscu opisujemy protokoły ekstrakcji lipidów skóry ze zrzuconej skóry lub całych zwierząt, określania i analizowania całkowitej masy lipidów oraz oddzielania lipidów za pomocą frakcjonowania za pomocą chromatografii kolumnowej.

Izolacja chemiczna, kwantyfikacja i separacja lipidów skóry

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in ...

Nasz protokół pozwala naukowcom wyizolować bioaktywne cząsteczki sygnałowe wykorzystywane przez w komunikacji chemicznej. A także separacja i oczyszczanie tych związków w celu dodatkowych testów, a nawet identyfikacji. Korzystając z tej metody, naukowcy mogą uzyskać źródło sygnałów chemicznych, a następnie wyodrębnić je w celu ich ilościowego określenia lub zastosowania w testach biologicznych.Dzisiejszą procedurę zademonstruje Holly Rucker, doktorantka z mojego laboratorium. Zacznij od umieszczenia pięciu centymetrowych kwadratowych kawałków w zamykanym szklanym pojemniku z pokrywką kompatybilną z heksanem i dodania do pojemnika wystarczającej ilości heksanu, aby całkowicie zanurzyć zrzucone kawałki skóry przed zamknięciem pojemnika. Następnego dnia użyj czystych metalowych kleszczy, aby usunąć kawałki szopy, potrząsając kawałkami podczas chwytania, aby zachować pozostały heksan w pojemniku.Aby określić wyekstrahowaną masę lipidową, przenieś ekstrakt do wstępnie zważonej kolby okrągłodennej i włącz źródło podciśnienia do wyparki obrotowej, upewniając się, że ciśnienie podciśnienia jest wystarczające do przytrzymania kolby przy szyjce skraplacza. Otwórz odpowietrznik na końcu skraplacza, wsuń kolbę na szyjkę skraplacza i zamknij odpowietrznik, aby uszczelnić system. Po upewnieniu się, że kolba nie może odłączyć się od skraplacza po zwolnieniu kolby.Opuścić kolbę do momentu, gdy tylko 10% dolnej części kolby dotknie wody w kąpieli i rozpocząć obrót ze średnią prędkością. Jeśli próżnia, prędkość, przepływ skraplacza i temperatura kąpieli są optymalne, para rozpuszczalnika opuszczająca kolbę skrapla się na wężownicy i kapie do kolby odzysku. Odparować próbkę w próżni do momentu, gdy na dnie kolby pojawi się kropla cieczy o średnicy mniejszej niż jeden centymetr.Następnie wyłącz obroty i odkurzanie, a następnie wyjmij kolbę z kąpieli. Przytrzymaj szyjkę kolby, gdy uszczelka próżniowa zostanie zwolniona, i przekręć szyjkę na bok kolby od kondensatora. Kropla cieczy w ekstrakcie zestala się, gdy heksan odparowuje.Po wyschnięciu kulki w temperaturze pokojowej przez około pięć minut, lipidy utworzą w kolbie półprzezroczysty wosk o barwie od białej do żółtej. Zważyć kolbę w celu uzyskania końcowej masy i rozpuścić lipidy w zarejestrowanej objętości heksanu, aby uzyskać jeden miligram lub więcej lipidów na jeden mililitr heksanu. Aby przygotować kolumnę chromatograficzną, użyj drewnianego pręta ustalającego, dłuższego niż kolumna, aby umieścić kwadrat o wymiarach cztery na cztery centymetry złożonego włókna szklanego na dnie szklanej kolumny chromatograficznej.Przymocuj kolumnę w dygestorium do standardowego statywu pierścieniowego i otwórz kurek. Następnie wlej umyty i wysuszony piasek do kolumny, aż około trzy centymetry piasku spoczną nad włóknem szklanym. Następnie umieść ciemny papier pod kolumną i delikatnie w nią postukaj.Teraz umieść 500-mililitrową zlewkę pod kolumną i powoli zwilż piasek około 25 mililitrami heksanu, zamykając kurek, gdy nad piaskiem znajduje się około 0,5 centymetra heksanu. Aby aktywować neutralną illuminę, pipetuj wodę dejonizowaną o objętości równej 6% masy illumina w kroplach w całym illumina. I przykryj kolbę aktywowanego illumina, energicznie obracając roztwór, aby równomiernie rozprowadzić ładunek.Gdy nie pozostaną żadne widoczne grudki iluminacji, dodawaj heksan, aż iluminacja zostanie całkowicie pokryta około 0,5 centymetra heksanu. Zakręć kolbą, aby utworzyć zawiesinę, i umieść nową szklaną zlewkę o pojemności 500 mililitrów pod kolumną. Otwórz kurek, a następnie ponownie zakręć illumina, a następnie równomiernie wlej illumina do wentylowanego lejka umieszczonego w zbiorniku kolumny, uważając, aby illumina równomiernie osiadała w kolumnie i aby nie tworzyły się duże pęcherzyki ani pęknięcia.Kolumna powstaje, gdy górna część illumina jest stabilna i znajduje się około czterech centymetrów poniżej szyjki kolumny u podstawy zbiornika. Następnie za pomocą pipety przepłucz wnętrze zbiornika heksanem w celu uzyskania resztek illumina i delikatnie dodaj drugą warstwę piasku na wierzch illuminy do około jednego centymetra poniżej zbiornika. Do frakcjonowania ekstraktu lipidowego użyj długiej szklanej pipety, aby przenieść próbkę lipidów do kolumny i powoli pipetować ekstrakt, aby uniknąć naruszenia warstwy piasku.Przepłucz ekstrakt vile pięcioma mililitrami heksanu i przenieś płukanie do kolumny. Po dodaniu całego ekstraktu otworzyć zawór odcinający i pozwolić, aby próbka została załadowana do kolumny. Po dodaniu próbki kolumna musi pozostać nasycona rozpuszczalnikiem.Jeśli kolumna wyschnie, próbka zostanie utracona. Umieść wstępnie zważoną i oznakowaną kolbę okrągłodenną pod kolumną, aby zebrać pierwszą frakcję. I użyj wentylowanego szklanego lejka, aby wlać 100% heksanu na bok zbiornika, aby uniknąć naruszenia warstwy piasku.Następnie otwórz kran odcinający, aby rozpocząć elucję, zamykając kran, gdy około trzech mililitrów heksanu pozostanie nad piaskiem w górnej części kolumny. Ponieważ większe zwierzęta naturalnie wytwarzają więcej lipidów skóry ze względu na większą całkowitą powierzchnię skóry, ważne jest, aby ustandaryzować wyekstrahowaną masę lipidową do długości otworu wentylacyjnego pyska zwierzęcia. Po standaryzacji do całkowitej zrzuconej masy skóry, liniowa zależność wyekstrahowanej masy lipidowej skóry a masą wyekstrahowanej skóry jest całkowicie usunięta.Po frakcjonowaniu można zastosować to samo podejście do standaryzacji w odniesieniu do mas poszczególnych frakcji. Na przykład tutaj każda frakcja nie przyczynia się w równym stopniu do całkowitej wyekstrahowanej masy lipidowej, ponieważ obojętne lipidy są dominującym zestawem związków pod względem proporcji masowej w porównaniu z każdym zestawem bardziej polarnych lipidów. Jeśli identyfikacja związków jest ostatecznym celem, należy używać czystych naczyń szklanych i unikać tworzyw sztucznych, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek.W celu identyfikacji związków chemicznych po pobraniu próbek można przeprowadzić chromatografię cieczową lub gazową w połączeniu ze spektrometrią mas. Alternatywnie można przeprowadzić testy biologiczne w celu wyjaśnienia aktywności biologicznej próbki.

chemical-isolation-quantification-separation-skin-lipids-from

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Ten protokół pokaże ekstrakcję i analizę wolnych i estryfikowanych bioaktywnych kwasów tłuszczowych z komórek. Kwasy tłuszczowe są dokładnie oznaczane ilościowo za pomocą rozcieńczania stabilnych izotopów, chiralnej chromatografii cieczowej, wychwytywania elektronów, atmosferycznej jonizacji chemicznej, wielokrotnego monitorowania spektrometrii mas (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas

Ten film demonstruje izolację lipidów od ludzkich neutrofili za pomocą dwufazowego systemu rozpuszczalnikowego z użyciem metanolu i chloroformu.

Izolacja lipidów z neutrofili pochodzenia ludzkiego przez separację dwufazową

Izolacja i charakterystyka domeny lipidów A lipopolisacharydu (LPS) od bakterii Gram-ujemnych dostarcza wglądu w oparte na powierzchni komórek mechanizmy oporności na antybiotyki, przeżywalność i sprawność bakterii, oraz jak chemicznie zróżnicowane gatunki molekularne lipidów A różnie modulują wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Izolacja i charakterystyka chemiczna lipidu A z bakterii Gram-ujemnych

Powłoka ssaków zawiera lipidy ekstrahowane rozpuszczalnikiem, które mogą dostarczyć składu chemicznego charakterystycznego dla poszczególnych gatunków.  W pracy przedstawiono rutynową metodę rozdzielania szerokich klas lipidów izolowanych z tkanek powłokowych za pomocą chromatografii cienkowarstwowej i oznaczania profilu triacyloglicerydów za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą.

Profilowanie zawartości triacyloglicerydów w lipidach powłokowych nietoperzy za pomocą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej i spektrometrii mas MALDI-TOF

Opisujemy protokół skutecznego izolowania limfocytów T rezydujących w skórze z biopsji ludzkiej skóry. Protokół ten zapewnia wystarczającą liczbę żywotnych limfocytów rezydentnych w ludzkiej skórze do analizy cytometrii przepływowej i hodowli ex vivo.

Izolacja limfocytów z ludzkiej skóry w celu analizy fenotypowej i hodowli komórkowej ex vivo

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Podejście markerów troficznych kwasów tłuszczowych, tj. asymilacja kwasów tłuszczowych jako całej cząsteczki i transfer do tkanki konsumenckiej bez lub z niewielkimi modyfikacjami, jest utrudnione przez luki w wiedzy na temat metabolizmu kwasów tłuszczowych u małych bezkręgowców glebowych. Profilowanie izotopologiczne jest cennym narzędziem do rozplątywania oddziaływań troficznych.

Profilowanie izotopologu kwasów tłuszczowych 13C zapewnia wgląd w troficzny transfer węgla i metabolizm lipidów u konsumentów bezkręgowców

Ten protokół ustanawia nowatorską metodę izolacji i oczyszczania kropelek lipidów z wątroby myszy, przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji retikulum endoplazmatycznego.

Protokół szybkiej izolacji kropelek lipidów przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji organelli

Ten protokół służy do oznaczania lipidów w wodzie morskiej i próbkach biologicznych. Lipidy w filtratach ekstrahuje się chloroformem lub mieszaninami chloroformu i metanolu w przypadku ciał stałych. Klasy lipidów mierzy się za pomocą pręcikowej chromatografii cienkowarstwowej z detekcją płomieniowo-jonizacyjną, a ich suma daje całkowitą zawartość lipidów.

Oznaczanie całkowitej zawartości lipidów i klas lipidów w próbkach morskich

Protokół ten opisuje unikalny protokół kliniczny pobierania próbek ludzkiego płynu łezowego za pomocą czerwonych nici fenolowych oraz workflow oparty na chromatografii cieczowej i spektrometrii mas tandemowej (LC-MS/MS) w celu odkrycia profilu lipidomicznego łz. Prosta metoda bifazowej separacji metyloter-butyloeteru (MTBE)/metanolu umożliwia szybką ekstrakcję lipidów łzowych z wysoką odbudową i odkryciem biomarkerów łz.

Procedura pobierania próbek oparta na niciach fenolowych czerwonych dla lipidomiki nieukierunkowanego płynu łzowego w odkrywaniu biomarkerów

Naucz się izolacji lipidów skóry od gadów do badania sygnalizacji chemicznej. Ta metoda umożliwia ekstrakcję, kwantyfikację i frakcjonowanie związków bioaktywnych. Protokół wspiera badania nad komunikacją chemiczną i zarządzaniem gatunkami inwazyjnymi.

Izolacja chemiczna, kwantyfikacja i separacja lipidów skóry

Przeglądaj więcej filmów