Izolacja chemiczna, kwantyfikacja i separacja lipidów skóry

Nasz protokół pozwala naukowcom wyizolować bioaktywne cząsteczki sygnałowe wykorzystywane przez w komunikacji chemicznej. A także separacja i oczyszczanie tych związków w celu dodatkowych testów, a nawet identyfikacji. Korzystając z tej metody, naukowcy mogą uzyskać źródło sygnałów chemicznych, a następnie wyodrębnić je w celu ich ilościowego określenia lub zastosowania w testach biologicznych.

Dzisiejszą procedurę zademonstruje Holly Rucker, doktorantka z mojego laboratorium. Zacznij od umieszczenia pięciu centymetrowych kwadratowych kawałków w zamykanym szklanym pojemniku z pokrywką kompatybilną z heksanem i dodania do pojemnika wystarczającej ilości heksanu, aby całkowicie zanurzyć zrzucone kawałki skóry przed zamknięciem pojemnika. Następnego dnia użyj czystych metalowych kleszczy, aby usunąć kawałki szopy, potrząsając kawałkami podczas chwytania, aby zachować pozostały heksan w pojemniku.

Aby określić wyekstrahowaną masę lipidową, przenieś ekstrakt do wstępnie zważonej kolby okrągłodennej i włącz źródło podciśnienia do wyparki obrotowej, upewniając się, że ciśnienie podciśnienia jest wystarczające do przytrzymania kolby przy szyjce skraplacza. Otwórz odpowietrznik na końcu skraplacza, wsuń kolbę na szyjkę skraplacza i zamknij odpowietrznik, aby uszczelnić system. Po upewnieniu się, że kolba nie może odłączyć się od skraplacza po zwolnieniu kolby.

Opuścić kolbę do momentu, gdy tylko 10% dolnej części kolby dotknie wody w kąpieli i rozpocząć obrót ze średnią prędkością. Jeśli próżnia, prędkość, przepływ skraplacza i temperatura kąpieli są optymalne, para rozpuszczalnika opuszczająca kolbę skrapla się na wężownicy i kapie do kolby odzysku. Odparować próbkę w próżni do momentu, gdy na dnie kolby pojawi się kropla cieczy o średnicy mniejszej niż jeden centymetr

Następnie wyłącz obroty i odkurzanie, a następnie wyjmij kolbę z kąpieli. Przytrzymaj szyjkę kolby, gdy uszczelka próżniowa zostanie zwolniona, i przekręć szyjkę na bok kolby od kondensatora. Kropla cieczy w ekstrakcie zestala się, gdy heksan odparowuje.

Po wyschnięciu kulki w temperaturze pokojowej przez około pięć minut, lipidy utworzą w kolbie półprzezroczysty wosk o barwie od białej do żółtej. Zważyć kolbę w celu uzyskania końcowej masy i rozpuścić lipidy w zarejestrowanej objętości heksanu, aby uzyskać jeden miligram lub więcej lipidów na jeden mililitr heksanu. Aby przygotować kolumnę chromatograficzną, użyj drewnianego pręta ustalającego, dłuższego niż kolumna, aby umieścić kwadrat o wymiarach cztery na cztery centymetry złożonego włókna szklanego na dnie szklanej kolumny chromatograficznej.

Przymocuj kolumnę w dygestorium do standardowego statywu pierścieniowego i otwórz kurek. Następnie wlej umyty i wysuszony piasek do kolumny, aż około trzy centymetry piasku spoczną nad włóknem szklanym. Następnie umieść ciemny papier pod kolumną i delikatnie w nią postukaj.

Teraz umieść 500-mililitrową zlewkę pod kolumną i powoli zwilż piasek około 25 mililitrami heksanu, zamykając kurek, gdy nad piaskiem znajduje się około 0,5 centymetra heksanu. Aby aktywować neutralną illuminę, pipetuj wodę dejonizowaną o objętości równej 6% masy illumina w kroplach w całym illumina. I przykryj kolbę aktywowanego illumina, energicznie obracając roztwór, aby równomiernie rozprowadzić ładunek.

Gdy nie pozostaną żadne widoczne grudki iluminacji, dodawaj heksan, aż iluminacja zostanie całkowicie pokryta około 0,5 centymetra heksanu. Zakręć kolbą, aby utworzyć zawiesinę, i umieść nową szklaną zlewkę o pojemności 500 mililitrów pod kolumną. Otwórz kurek, a następnie ponownie zakręć illumina, a następnie równomiernie wlej illumina do wentylowanego lejka umieszczonego w zbiorniku kolumny, uważając, aby illumina równomiernie osiadała w kolumnie i aby nie tworzyły się duże pęcherzyki ani pęknięcia.

Kolumna powstaje, gdy górna część illumina jest stabilna i znajduje się około czterech centymetrów poniżej szyjki kolumny u podstawy zbiornika. Następnie za pomocą pipety przepłucz wnętrze zbiornika heksanem w celu uzyskania resztek illumina i delikatnie dodaj drugą warstwę piasku na wierzch illuminy do około jednego centymetra poniżej zbiornika. Do frakcjonowania ekstraktu lipidowego użyj długiej szklanej pipety, aby przenieść próbkę lipidów do kolumny i powoli pipetować ekstrakt, aby uniknąć naruszenia warstwy piasku.

Przepłucz ekstrakt vile pięcioma mililitrami heksanu i przenieś płukanie do kolumny. Po dodaniu całego ekstraktu otworzyć zawór odcinający i pozwolić, aby próbka została załadowana do kolumny. Po dodaniu próbki kolumna musi pozostać nasycona rozpuszczalnikiem.

Jeśli kolumna wyschnie, próbka zostanie utracona. Umieść wstępnie zważoną i oznakowaną kolbę okrągłodenną pod kolumną, aby zebrać pierwszą frakcję. I użyj wentylowanego szklanego lejka, aby wlać 100% heksanu na bok zbiornika, aby uniknąć naruszenia warstwy piasku.

Następnie otwórz kran odcinający, aby rozpocząć elucję, zamykając kran, gdy około trzech mililitrów heksanu pozostanie nad piaskiem w górnej części kolumny. Ponieważ większe zwierzęta naturalnie wytwarzają więcej lipidów skóry ze względu na większą całkowitą powierzchnię skóry, ważne jest, aby ustandaryzować wyekstrahowaną masę lipidową do długości otworu wentylacyjnego pyska zwierzęcia. Po standaryzacji do całkowitej zrzuconej masy skóry, liniowa zależność wyekstrahowanej masy lipidowej skóry a masą wyekstrahowanej skóry jest całkowicie usunięta.

Po frakcjonowaniu można zastosować to samo podejście do standaryzacji w odniesieniu do mas poszczególnych frakcji. Na przykład tutaj każda frakcja nie przyczynia się w równym stopniu do całkowitej wyekstrahowanej masy lipidowej, ponieważ obojętne lipidy są dominującym zestawem związków pod względem proporcji masowej w porównaniu z każdym zestawem bardziej polarnych lipidów. Jeśli identyfikacja związków jest ostatecznym celem, należy używać czystych naczyń szklanych i unikać tworzyw sztucznych, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek.

W celu identyfikacji związków chemicznych po pobraniu próbek można przeprowadzić chromatografię cieczową lub gazową w połączeniu ze spektrometrią mas. Alternatywnie można przeprowadzić testy biologiczne w celu wyjaśnienia aktywności biologicznej próbki.