Izolacja chemiczna, kwantyfikacja i separacja lipidów skóry
7 lutego 2019
U, lipidy skórne od przedstawicieli tego samego gatunku są kluczowe dla sygnalizacji seksualnej, z potencjalnym zastosowaniem w zarządzaniu gatunkami inwazyjnymi. W tym miejscu opisujemy protokoły ekstrakcji lipidów skóry ze zrzuconej skóry lub całych zwierząt, określania i analizowania całkowitej masy lipidów oraz oddzielania lipidów za pomocą frakcjonowania za pomocą chromatografii kolumnowej.
Nasz protokół pozwala naukowcom wyizolować bioaktywne cząsteczki sygnałowe wykorzystywane przez w komunikacji chemicznej. A także separacja i oczyszczanie tych związków w celu dodatkowych testów, a nawet identyfikacji. Korzystając z tej metody, naukowcy mogą uzyskać źródło sygnałów chemicznych, a następnie wyodrębnić je w celu ich ilościowego określenia lub zastosowania w testach biologicznych.
Dzisiejszą procedurę zademonstruje Holly Rucker, doktorantka z mojego laboratorium. Zacznij od umieszczenia pięciu centymetrowych kwadratowych kawałków w zamykanym szklanym pojemniku z pokrywką kompatybilną z heksanem i dodania do pojemnika wystarczającej ilości heksanu, aby całkowicie zanurzyć zrzucone kawałki skóry przed zamknięciem pojemnika. Następnego dnia użyj czystych metalowych kleszczy, aby usunąć kawałki szopy, potrząsając kawałkami podczas chwytania, aby zachować pozostały heksan w pojemniku.
Aby określić wyekstrahowaną masę lipidową, przenieś ekstrakt do wstępnie zważonej kolby okrągłodennej i włącz źródło podciśnienia do wyparki obrotowej, upewniając się, że ciśnienie podciśnienia jest wystarczające do przytrzymania kolby przy szyjce skraplacza. Otwórz odpowietrznik na końcu skraplacza, wsuń kolbę na szyjkę skraplacza i zamknij odpowietrznik, aby uszczelnić system. Po upewnieniu się, że kolba nie może odłączyć się od skraplacza po zwolnieniu kolby.
Opuścić kolbę do momentu, gdy tylko 10% dolnej części kolby dotknie wody w kąpieli i rozpocząć obrót ze średnią prędkością. Jeśli próżnia, prędkość, przepływ skraplacza i temperatura kąpieli są optymalne, para rozpuszczalnika opuszczająca kolbę skrapla się na wężownicy i kapie do kolby odzysku. Odparować próbkę w próżni do momentu, gdy na dnie kolby pojawi się kropla cieczy o średnicy mniejszej niż jeden centymetr
.Następnie wyłącz obroty i odkurzanie, a następnie wyjmij kolbę z kąpieli. Przytrzymaj szyjkę kolby, gdy uszczelka próżniowa zostanie zwolniona, i przekręć szyjkę na bok kolby od kondensatora. Kropla cieczy w ekstrakcie zestala się, gdy heksan odparowuje.
Po wyschnięciu kulki w temperaturze pokojowej przez około pięć minut, lipidy utworzą w kolbie półprzezroczysty wosk o barwie od białej do żółtej. Zważyć kolbę w celu uzyskania końcowej masy i rozpuścić lipidy w zarejestrowanej objętości heksanu, aby uzyskać jeden miligram lub więcej lipidów na jeden mililitr heksanu. Aby przygotować kolumnę chromatograficzną, użyj drewnianego pręta ustalającego, dłuższego niż kolumna, aby umieścić kwadrat o wymiarach cztery na cztery centymetry złożonego włókna szklanego na dnie szklanej kolumny chromatograficznej.
Przymocuj kolumnę w dygestorium do standardowego statywu pierścieniowego i otwórz kurek. Następnie wlej umyty i wysuszony piasek do kolumny, aż około trzy centymetry piasku spoczną nad włóknem szklanym. Następnie umieść ciemny papier pod kolumną i delikatnie w nią postukaj.
Teraz umieść 500-mililitrową zlewkę pod kolumną i powoli zwilż piasek około 25 mililitrami heksanu, zamykając kurek, gdy nad piaskiem znajduje się około 0,5 centymetra heksanu. Aby aktywować neutralną illuminę, pipetuj wodę dejonizowaną o objętości równej 6% masy illumina w kroplach w całym illumina. I przykryj kolbę aktywowanego illumina, energicznie obracając roztwór, aby równomiernie rozprowadzić ładunek.
Gdy nie pozostaną żadne widoczne grudki iluminacji, dodawaj heksan, aż iluminacja zostanie całkowicie pokryta około 0,5 centymetra heksanu. Zakręć kolbą, aby utworzyć zawiesinę, i umieść nową szklaną zlewkę o pojemności 500 mililitrów pod kolumną. Otwórz kurek, a następnie ponownie zakręć illumina, a następnie równomiernie wlej illumina do wentylowanego lejka umieszczonego w zbiorniku kolumny, uważając, aby illumina równomiernie osiadała w kolumnie i aby nie tworzyły się duże pęcherzyki ani pęknięcia.
Kolumna powstaje, gdy górna część illumina jest stabilna i znajduje się około czterech centymetrów poniżej szyjki kolumny u podstawy zbiornika. Następnie za pomocą pipety przepłucz wnętrze zbiornika heksanem w celu uzyskania resztek illumina i delikatnie dodaj drugą warstwę piasku na wierzch illuminy do około jednego centymetra poniżej zbiornika. Do frakcjonowania ekstraktu lipidowego użyj długiej szklanej pipety, aby przenieść próbkę lipidów do kolumny i powoli pipetować ekstrakt, aby uniknąć naruszenia warstwy piasku.
Przepłucz ekstrakt vile pięcioma mililitrami heksanu i przenieś płukanie do kolumny. Po dodaniu całego ekstraktu otworzyć zawór odcinający i pozwolić, aby próbka została załadowana do kolumny. Po dodaniu próbki kolumna musi pozostać nasycona rozpuszczalnikiem.
Jeśli kolumna wyschnie, próbka zostanie utracona. Umieść wstępnie zważoną i oznakowaną kolbę okrągłodenną pod kolumną, aby zebrać pierwszą frakcję. I użyj wentylowanego szklanego lejka, aby wlać 100% heksanu na bok zbiornika, aby uniknąć naruszenia warstwy piasku.
Następnie otwórz kran odcinający, aby rozpocząć elucję, zamykając kran, gdy około trzech mililitrów heksanu pozostanie nad piaskiem w górnej części kolumny. Ponieważ większe zwierzęta naturalnie wytwarzają więcej lipidów skóry ze względu na większą całkowitą powierzchnię skóry, ważne jest, aby ustandaryzować wyekstrahowaną masę lipidową do długości otworu wentylacyjnego pyska zwierzęcia. Po standaryzacji do całkowitej zrzuconej masy skóry, liniowa zależność wyekstrahowanej masy lipidowej skóry a masą wyekstrahowanej skóry jest całkowicie usunięta.
Po frakcjonowaniu można zastosować to samo podejście do standaryzacji w odniesieniu do mas poszczególnych frakcji. Na przykład tutaj każda frakcja nie przyczynia się w równym stopniu do całkowitej wyekstrahowanej masy lipidowej, ponieważ obojętne lipidy są dominującym zestawem związków pod względem proporcji masowej w porównaniu z każdym zestawem bardziej polarnych lipidów. Jeśli identyfikacja związków jest ostatecznym celem, należy używać czystych naczyń szklanych i unikać tworzyw sztucznych, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek.
W celu identyfikacji związków chemicznych po pobraniu próbek można przeprowadzić chromatografię cieczową lub gazową w połączeniu ze spektrometrią mas. Alternatywnie można przeprowadzić testy biologiczne w celu wyjaśnienia aktywności biologicznej próbki.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół ekstrakcji i analizy lipidów skóry gadów, które odgrywają kluczową rolę w sygnalizacji seksualnej. Opisane metody mogą pomóc w zrozumieniu komunikacji chemicznej i znaleźć zastosowanie w zarządzaniu gatunkami inwazyjnymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Ekologia
Wstęp
- Lipidy skóry są ważne dla komunikacji chemicznej u gadów.
- Zrozumienie tych związków może pomóc w zarządzaniu gatunkami inwazyjnymi.
- Ekstrakcja i analiza tych lipidów mogą dostarczyć informacji na temat ich roli w sygnalizacji.
- Protokoły ekstrakcji i analizy lipidów są niezbędne dla badaczy w tej dziedzinie.
Cel badania
- Wyizolowanie bioaktywnych cząsteczek sygnałowych ze skóry gadów.
- Przedstawienie szczegółowego protokołu ekstrakcji i analizy lipidów.
- Umożliwienie dalszych badań nad komunikacją chemiczną u gadów.
Zastosowane metody
- Ekstrakcja lipidów z zrzuconej skóry lub całych organizmów z użyciem heksanu.
- Oznaczanie całkowitej masy lipidów przy użyciu ewaporatora rotacyjnego.
- Frakcjonowanie lipidów za pomocą chromatografii kolumnowej.
- Standaryzacja masy lipidów w stosunku do wielkości zwierzęcia w celu zapewnienia dokładnej analizy.
Główne wyniki
- Skuteczna ekstrakcja lipidów, dająca woskowatą substancję do analizy.
- Opracowanie protokołów frakcjonowania i identyfikacji lipidów.
- Wykazanie zależności między masą lipidów a rozmiarem zwierzęcia.
- Potencjalne zastosowania w zrozumieniu mechanizmów sygnalizacji u gadów.
Wnioski
- Opracowane protokoły mogą usprawnić badania nad komunikacją chemiczną gadów.
- Zrozumienie składu lipidów skóry może pomóc w opracowaniu strategii zarządzania gatunkami inwazyjnymi.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych metodach w celu dalszej eksploracji związków sygnałowych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa izolacja i frakcjonowanie lipidów skóry gadów umożliwiają precyzyjną analizę bioaktywnych cząsteczek sygnałowych istotnych dla komunikacji chemicznej. Standaryzowana ekstrakcja i rozdział chromatograficzny wspierają powtarzalne schematy postępowania w zakresie identyfikacji związków oraz opracowywania późniejszych testów biologicznych. Możliwości te stanowią podstawę wiarygodności predykcyjnej w badaniach mechanistycznych i ułatwiają badania translacyjne nad szlakami sygnałowymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia izolację bioaktywnych frakcji lipidowych w celu minimalizacji ryzyka mechanistycznego w badaniach nad sygnalizacją.
- Wspiera walidację funkcjonalną sygnałów chemicznych w badaniach ewolucyjnych i behawioralnych.
- Zapewnia zestandaryzowane ekstrakty do bioanaliz opartych na hipotezach oraz wyjaśniania ścieżek sygnałowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia powtarzalne, mierzalne frakcje lipidowe w celu standaryzacji testów i przygotowania do screeningu.
- Umożliwia przygotowanie oczyszczonych eluatów do wiarygodnej oceny związków w testach bioaktywności.
- Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy do badań porównawczych między gatunkami lub w różnych warunkach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wspiera translacyjne odkrywanie biomarkerów, umożliwiając identyfikację cząsteczek sygnałowych o znaczeniu ekologicznym lub fizjologicznym.
- Zapewnia ciągłość procesu od odkrycia molekularnego do walidacji funkcjonalnej w modelach przedklinicznych.
- Umożliwia optymalizację ryzyka podczas dalszych etapów badań poprzez wyjaśnienie aktywności biologicznej wyizolowanych związków.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum procesów badawczych, od wczesnego testowania hipotez, poprzez identyfikację związków, aż po opracowanie przedklinicznych testów biologicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez zerowych oraz wyjaśnianie mechanizmów szlaków sygnałowych związków chemicznych.
- Screening: Zapewnia zestandaryzowane, mierzalne frakcje lipidowe dla odtwarzalnego rozwoju analiz.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar i porównanie statystyczne wydajności lipidów oraz ich bioaktywności w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Ułatwia powiązanie wyników molekularnych z efektami funkcjonalnymi w modelach ekologicznych lub fizjologicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku schemat ekstrakcji i frakcjonowania lipidów, który można zastosować w różnorodnych pytaniach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad sygnalizacją.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane, skalowalne i reprodukowalne przepływy pracy w zakresie ekstrakcji i separacji.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie rzetelnej walidacji związków.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój programów badawczych związanych z sygnalizacją.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy z zakresu ekstrakcji organicznej, chromatografii i ilościowego oznaczania analitycznego.
- Wymaga dostępu do odparowywacza obrotowego, kolumn chromatograficznych oraz spektrometrii mas w celu identyfikacji związków.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów ekstrakcji i frakcjonowania pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych źródeł tkanek (zrzucona skóra, żywa skóra, całe zwierzęta) przy zachowaniu dbałości o normalizację próbek.
- Krytyczne dla integralności analitycznej jest staranne unikanie zanieczyszczeń oraz zapewnienie kompatybilności rozpuszczalników.
