W pełni autonomiczna charakterystyka i zbieranie danych z kryształów makrocząsteczek biologicznych
March 22nd, 2019
Tutaj opisujemy, jak korzystać z opcji automatycznego badania przesiewowego i zbierania danych dostępnych na niektórych liniach synchrotronowych. Naukowcy wysyłają próbki chłodzone kriogenicznie do synchrotronu, gdzie badane są właściwości dyfrakcyjne, zestawy danych są zbierane i przetwarzane, a tam, gdzie to możliwe, przeprowadzane jest rozwiązanie strukturalne – a wszystko to bez interwencji człowieka.
Krystalografia rentgenowska jest dominującą techniką określania informacji strukturalnych 3D z białek. Linie wiązki synchrotronowej są potrzebne do uzyskania danych z małych, słabo dyfrakcyjnych kryształów wytwarzanych przez białka. Massive One jest unikalną linią wiązki, ponieważ w pełni automatyzuje proces zbierania danych z makrocząsteczek biologicznych.
Od montażu próbki, lokalizacji i końcowego zbierania danych. Pełna automatyzacja tego rodzaju jest bardzo ważna, ponieważ pozwala naukowcom spędzać czas w laboratorium, zamiast zbierać dane na linii wiązki. Linia wiązki jest również inteligentna i średnio może zbierać lepsze dane niż wtedy, gdy linia wiązki jest obsługiwana przez ludzi.
Aby rozpocząć ten protokół, wykonaj montaż kryształu i zażądaj czasu wiązki na Massive one, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przejdź do systemu informacyjnego linii wiązki krystalografii białek lub strony internetowej ISPyB. Wybierz MX experiments, zaloguj się za pomocą numeru eksperymentu i hasła.
Kliknij na przesyłkę, dodaj nową i podaj niezbędne informacje. Następnie kliknij Zapisz. Kliknij dodaj paczkę i wypełnij wymagane informacje.
Kliknij przycisk Zapisz, a następnie kliknij przycisk Dodaj kontener. Podaj kod kreskowy krążka jako nazwę i wybierz krążek grzbietowy, ponownie kliknij zapisz. Kliknij na symbol pojemnika i edytuj, a następnie uzupełnij niezbędne informacje dotyczące próbek, takie jak nazwa białka, preferowany przepływ pracy i pozycja kryształu, w krążku.
Wybierz białko, które zostało zatwierdzone przez grupę bezpieczeństwa ESRF. Wprowadź unikatową nazwę próbki, aby zidentyfikować każdą pojedynczą próbkę. Opcjonalnie zeskanuj kod kreskowy PIN.
Pozostałe informacje, które należy uwzględnić, są również opcjonalne. Dla każdej próbki wprowadź typ eksperymentu. Określa to, który automatyczny przepływ pracy będzie używany do przetwarzania każdego kryształu.
Biorąc pod uwagę, że kryształy GCSH są igłami, wybierz MX naciśnij P.Następnie wprowadź grupę spacji. Jeśli jest to możliwe, zostanie to wykorzystane do obliczeń strategii gromadzenia danych oraz przez dostępne rurociągi do automatycznego przetwarzania danych. Wprowadź żądaną rozdzielczość.
Określa to odległość od kryształu do detektora od początkowych skanów siatki, charakterystyki i domyślnego zbierania danych. Teraz ustaw żądaną rozdzielczość progową, aby zapobiec zbieraniu pełnych zestawów danych z kryształów, które nie ulegają dyfrakcji do tego limitu. Może to zaoszczędzić miejsce na przechowywanie danych i czas analiz.
Ustaw wymaganą kompletność. Następnie ustaw wymaganą krotność. Jeśli na nośniku próbki znajduje się więcej niż jeden kryształ, ustaw maksymalną liczbę kryształów do analizy.
Wartość domyślna to jeden lub pięć dla MX press P. Można również wybrać odpowiedni rozmiar wiązki. Umieść grupę spacji, jeśli jest znana, w kolumnie grupy sił i przestrzeni. Następnie ustaw czułość kryształów na promieniowanie.
W razie potrzeby ustaw całkowity kąt obrotu, który ma zostać zebrany dla pełnego zbioru danych. Po wprowadzeniu wszystkich informacji do systemu zapisz wartości. Kliknij, wróć do przesyłek i naciśnij wyślij przesyłkę do ESRF.
Wydrukuj etykietę wysyłkową i wyślij próbki. Użytkownicy powinni umówić się na odbiór z kurierem, korzystając z danych konta ESRF. W dniu eksperymentu próbki są przenoszone do Massive one o dużej pojemności odrośniaka.
Następnie naukowcy zajmujący się linią wiązki uruchamiają zbieranie danych, które mogą być zdalnie śledzone przez użytkowników. Dla każdego typu próbki użytkownicy otrzymują wiadomość e-mail z informacją, że zbieranie danych się rozpoczęło. Wykonanie wszystkich kroków we wszystkich przepływach pracy można śledzić online i w czasie rzeczywistym.
Jest to dostępne dla użytkownika po zalogowaniu się do ISPyB. Wyniki można również przeglądać i pobierać. Dla każdej analizowanej próbki sprawdź wyniki automatycznego eksperymentu na ISPyB.
Kliknij żądaną sesję eksperymentalną pod adresem ID30A1. Wybierz preferowany potok automatycznego przetwarzania. Pobierz dane zapisane w odpowiedniej grupie przestrzeni z najwyższą kompletnością i najwyższą rozdzielczością.
Klikając na ostatnią, zbieraj wyniki, a następnie pobieraj. Przepływ pracy MX press P został wykorzystany przez linię wiązki ESRF Massive one do w pełni automatycznego montażu, wyśrodkowania w wiązce promieniowania rentgenowskiego, scharakteryzowania i zebrania pełnych zestawów danych dyfrakcyjnych z serii kryształów ludzkiego GCSH. Próbki zostały zamontowane, a pętla przeanalizowana pod kątem obszaru do skanowania.
Po przeprowadzeniu analiz dyfrakcyjnych wybrano cztery punkty w krysztale do zebrania danych. Ręczne określanie struktury przez zastępowanie molekularne pozwoliło uzyskać wysokiej jakości mapę gęstości elektronów po pojedynczym zautomatyzowanym cyklu uszlachetniania. W przypadku tego zestawu danych zautomatyzowany potok przycinał dane z rozdzielczością jednego punktu i dwóch angstremów.
Użytkownicy mogą jednak zdecydować się na przycięcie danych w niższej rozdzielczości. Ciągła gęstość elektronowa jest widoczna dla całego łańcucha aminokwasowego z wyjątkiem znacznika e-końcowej histydyny. Spośród czterech podstawień, które odróżniają GCSH człowieka i bydła, trzy są łatwo identyfikowalne w gęstości elektronów.
Jest to mniej oczywiste w przypadku substytucji kwasu asparaginowego do lizyny 125. Dla których gęstość elektronowa łańcucha bocznego jest tylko częściowo rozwiązana ze względu na elastyczność. Aktualnie uzyskany model ma wartość pracy R wynoszącą 20 punktów cztery procent i wartość wolną R wynoszącą 23 punkty osiem procent i może być dodatkowo optymalizowany przez dodatkowe cykle automatycznego i ręcznego budowania i udoskonalania modelu.
Ważne jest, aby dostosować wymagania do swojego systemu. Na przykład ustawienie już zaobserwowanej rozdzielczości na znaną wartość może zaoszczędzić czas i zapewnić lepsze zbieranie danych. W pełni automatyczne gromadzenie danych zdemokratyzowało krystalografię i teraz nawet małe laboratoria mogą rozpocząć słynny projekt, podczas gdy wcześniej było to wykonalne tylko przy użyciu ogromnej siły roboczej.
Przegląd
Ten artykuł opisuje zautomatyzowany proces przesiewania i zbierania danych na synchrotronowych liniach wiązki dla krystalografii białek. W pełni zautomatyzowany system pozwala na efektywne zbieranie i przetwarzanie danych z krioochłodzonych próbek bez ludzkiej interwencji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Krystalografia białek
- Odbicie promieni X
- Automatyzacja w zbieraniu danych
Tło
- Krystalografia rentgenowska jest niezbędna do wyznaczania struktur białek.
- Synchrontronowe linie wiązki są kluczowe dla uzyskania danych z słabo rozpraszających kryształów.
- Automatyzacja poprawia efektywność i jakość zbierania danych.
- Massive one gwarantuje w pełni zautomatyzowany przepływ pracy dla biologicznych makrocząsteczek.
Cel badania
- Aby pokazać zautomatyzowany proces zbierania danych na synchrotronowych liniach wiązki.
- Aby podkreślić zalety automatyzacji w krystalografii białek.
- Aby dostarczyć szczegółowy protokół do naśladowania przez badaczy.
Zastosowane metody
- Montaż próbek i wysyłka do synchrotronu.
- Wykorzystanie systemu informacyjnego ISPyB do zarządzania eksperymentami.
- Zautomatyzowane procesy zbierania i przetwarzania danych.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym zbierania danych i analizy wyników.
Główne wyniki
- Skuteczne zbieranie wysokiej jakości danych dyfrakcji z ludzkich kryształów GCSH.
- Automatyczne przetwarzanie dało wysokiej rozdzielczości mapę gęstości elektronowej.
- Identyfikacja różnic strukturalnych między ludzkimi i bydlęcymi GCSH.
- Wykazanie efektywności zautomatyzowanych procesów w krystalografii.
Wnioski
- Automatyzacja w zbieraniu danych demokratyzuje dostęp do krystalografii.
- Mniejsze laboratoria mogą teraz podjąć się złożonych projektów, które wcześniej były ograniczone do większych obiektów.
- Dostosowanie parametrów eksperymentu może poprawić efektywność zbierania danych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Fully automated synchrotron beamlines reduce manual intervention in macromolecular crystallography, enabling high-throughput screening and data collection from weakly diffracting crystals. This automation enhances data quality and throughput, allowing biopharma R&D teams to allocate scientific effort toward target validation and lead optimization rather than beamline operations. The technology democratizes access to structural biology, supporting early-stage de-risking of therapeutic targets through reliable 3D structural insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing high-resolution structural data on biological macromolecules.
- Operational Value: Supports functional target validation through automated characterization and data collection from crystallization trials.
- Predictive Value: Increases confidence in target models by delivering consistent, high-quality electron density maps for structure-guided design.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated crystal systems for downstream workflows by automating mounting, centering, and diffraction analysis.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via predefined workflows and real-time monitoring through ISPyB.
- Scalability: Enables screening of large numbers of crystals and reuse of automated pipelines across projects.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage structural data to preclinical validation by providing reliable models for mechanistic studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by identifying structural differences between species variants, such as human and bovine GCSH.
- Mechanistic De-risking: Clarifies binding sites and flexibility, aiding in the interpretation of structure-activity relationships.
Pipeline & Workflow Integration
The automated beamline integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, supporting data generation for downstream analytics and modeling.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by solving crystal structures of proteins and complexes.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative outputs such as resolution, completeness, and multiplicity for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides measurable readouts including R-work and R-free values, resolution cutoffs, and electron density maps to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural insights to preclinical continuity by enabling species-specific model refinement, as demonstrated with GCSH.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for structural screening across multiple targets, reducing dependency on site-specific expertise.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target models, reduction of mechanistic ambiguity, and support for structure-based drug design.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of data collection across samples and projects.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency through reduced beamline staffing, and lowered biological risk in lead selection.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on structural confidence and data quality metrics.
Implementation Considerations
- Expertise in protein crystallography and sample preparation is required for successful crystal mounting and characterization.
- Access to synchrotron facilities and instrumentation such as the Massive one beamline is essential for automated data collection.
- Standardization across teams requires consistent use of ISPyB for experiment tracking, workflow selection, and result retrieval.
- Adaptation across model systems involves adjusting parameters such as resolution thresholds, space group, and radiation sensitivity based on crystal properties.
- Practical limitations include the need for cryocooled samples and dependency on crystal quality, which affects automated workflow success rates.
