Name: W pełni autonomiczna charakterystyka i zbieranie danych z kryształów makrocząsteczek biologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Poznaj w pełni zautomatyzowaną charakterystykę i zbieranie danych z kryształów makrocząsteczek biologicznych przy użyciu linii synchrotronowej Massive one. Ta metoda umożliwia efektywne pozyskiwanie wysokiej jakości danych dyfrakcyjnych bez interwencji człowieka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują ESRF za czas spędzony na badaniu.

UWAGA: Produkcja, oczyszczanie i krystalizacja GCSH są opisane w Pliku Uzupełniającym 1.
1. Krótki opis przygotowania offline i montażu kryształów
<ol>
	<li>Umieść nylonową pętlę lub inny wspornik montażowy kryształu już przymocowany do kołka SPINE pod jednym lub kilkoma kryształami i wyjmij je z roztworu strącającego (20 μl 0,5 M mrówczanu sodu, pH 4,0 + 25 μl roztworu białkowego).
	<ol>
		<li>Usuń płyn luzem wokół kryształu (kryształów), dotykając uchwytu papierowym, aby odessać nadmiar płynu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanurz kryształ(y) w roztworze krioprotekcyjnym zawierającym roztwór strącający plus 30% glicerolu; następnie usuń zarówno podporę kryształu, jak i kryształ(y).
	<ol>
		<li>Usuń płyn luzem wokół kryształu (kryształów), dotykając uchwytu papierowym, aby odessać nadmiar płynu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanurz uchwyt w fiolce SPINE wypełnionej ciekłym azotem i przechowuj go, wraz z innymi podobnie przygotowanymi kryształami, w zmieniaczu próbek Europejskiego Laboratorium Biologii Molekularnej (EMBL)/ESRF puck9 w temperaturze ciekłego azotu. 
	UWAGA: Kryształ(y) są stabilne w tym stanie, dopóki czas wiązki nie będzie dostępny.</li>
</ol>
2. Prośba o czas probierczy na MASSIF-1
<ol>
	<li>Zapytaj o czas jak najwcześniej na stronie głównej ESRF (pod adresem http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying). 
	UWAGA: Istnieje kilka możliwych trybów dostępu do linii badawczych ESRF MX. Laboratoria mogą składać zbiorowe wnioski w ramach Grupy Alokacji Blokowej (BAG), aby mieć przydzielony czas badawczy na 2 lata. Jeśli grupy chcą złożyć wniosek indywidualnie, mogą ubiegać się o dostęp rolniczy, który umożliwia im szybki dostęp do linii badawczych po wzajemnej weryfikacji. Propozycja grupy zostanie rozpatrzona i zatwierdzona przez Grupę ds. Bezpieczeństwa ESRF, która może poprosić o dodatkowe szczegóły. Jeśli propozycja zostanie zaakceptowana, zostanie podany numer eksperymentu i hasło. Autorskie badania można przeprowadzić, kupując czas progeński.</li>
	<li>Ukończ wymagane szkolenie w zakresie bezpieczeństwa online (pod adresem http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining).</li>
	<li>Zarezerwuj czas na czas w kalendarzu MASSIF-1. 
	UWAGA: Możliwe jest zarezerwowanie maksymalnie 50 pojemników na próbki do analizy na zmianę.</li>
	<li>Wypełnij formularz A, aby zadeklarować eksperyment wysyłkowy (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form), wraz z wymaganymi informacjami dotyczącymi bezpieczeństwa, dla próbek, które mają być mierzone.</li>
</ol>
3. Tworzenie planu dyfrakcyjnego w ISPyB
UWAGA: Plan dyfrakcji zawiera wszystkie informacje potrzebne do próbki w ISPyB i może zawierać dodatkowe informacje do dostosowania eksperymentu przeprowadzanego dla każdej próbki.
<ol>
	<li>Otwórz ISPyB (w https://exi.esrf.fr/).</li>
	<li>Wybierz Eksperymenty MX.</li>
	<li>Zaloguj się za pomocą numeru eksperymentu i hasła.</li>
	<li>Kliknij na Wysyłka | Dodaj nowe i podaj niezbędne informacje. Kliknij Zapisz.</li>
	<li>Kliknij Dodaj paczkę i wypełnij wymagane informacje. Kliknij Zapisz.</li>
	<li>Następnie kliknij Dodaj kontener, nadaj kod kreskowy krążka jako nazwę i wybierz opcję SPINE puck. Kliknij Zapisz.</li>
	<li>Kliknij symbol pojemnika i Edytuj, a następnie wprowadź niezbędne informacje, takie jak nazwa białka, preferowany przepływ pracy, pozycja kryształu w krążku itp., dotyczące próbek.</li>
	<li>Wybierz białko (na przykład GCSH lub lizozym), które zostało zatwierdzone przez grupę bezpieczeństwa ESRF.</li>
	<li>Wprowadź unikatową nazwę próbki, aby zidentyfikować każdą pojedynczą próbkę. Opcjonalnie istnieje możliwość zeskanowania kodu kreskowego PIN. Pozostałe informacje poniżej są opcjonalne.</li>
	<li>Wprowadź informacje opcjonalne.
	<ol>
		<li>Dla każdej pojedynczej próbki wprowadź typ eksperymentu (tj. MXPressE_SAD, SCORE lub MXPressO itp., domyślnie MXPressE) w polu Exp. Type. Określa to, który automatyczny przepływ pracy będzie używany do przetwarzania każdego kryształu. Biorąc pod uwagę, że kryształy GCSH są igłami, wybierz MXPressP.</li>
		<li>Wprowadź grupę pomieszczeń (na przykład P1, C2 lub P2121 21), jeśli jest znana. Jeśli jest obecny, zostanie on wykorzystany do obliczeń strategii gromadzenia danych oraz przez dostępne potoki automatycznego przetwarzania danych.</li>
		<li>Wprowadź żądaną rozdzielczość (domyślnie: dmin = 2.0 A). Określa to odległość od kryształu do detektora dla początkowych skanów siatki, charakterystyki i domyślnego zbierania danych.</li>
		<li>Ustaw żądaną rozdzielczość progową (na przykład 1,5 A lub 2,3 A), aby zapobiec zbieraniu pełnych zestawów danych z kryształów, które nie ulegają dyfrakcji do tego limitu. Może to zaoszczędzić miejsce do przechowywania danych i czas analizy.</li>
		<li>Ustawia wymaganą kompletność (domyślnie: 0,99). Ustawia wymaganą krotność (domyślnie: 4). Jeśli na nośniku próbki znajduje się więcej niż jeden kryształ, należy ustawić maksymalną liczbę kryształów do analizy. Wartość domyślna to 1 lub 5 dla MXPressP.</li>
		<li>Wybierz odpowiedni rozmiar wiązki (domyślnie: 50 μm). Jeśli określona wartość nie zostanie wybrana, obliczenia strategii centrowania promieniowania rentgenowskiego i zbierania danych zostaną przeprowadzone przy rozmiarze wiązki 50 μm. 
		UWAGA: Podczas każdego kolejnego zbierania kompletnych zestawów danych, rozmiar wiązki zostanie automatycznie dostosowany.</li>
		<li>Umieść grupę przestrzeni, jeśli jest znana, w kolumnie grupa wymuszonej przestrzeni. Ustaw czułość kryształów na promieniowanie (0,5–2,0 dla niskiej lub wysokiej czułości, z domyślną wartością 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W razie potrzeby ustaw całkowity kąt obrotu, który ma być zbierany dla całej kolekcji zestawów danych (domyślnie: całkowity kąt obrotu określony przez eEDNA).</li>
	<li>Zapisz wartości. Kliknij Zwrot do przesyłek. Naciśnij przycisk Wyślij przesyłkę do ESRF.</li>
	<li>Wydrukuj etykietę wysyłkową i wyślij próbki. Użytkownicy powinni umówić się na odbiór z kurierem, korzystając z danych konta ESRF. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby wybrać opcję Dołącz etykietę zwrotną, aby umożliwić bezproblemowy zwrot próbek (patrz https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement).</li>
</ol>
4. Zbieranie, przeglądanie i pobieranie danych
UWAGA: W dniu eksperymentu, próbki są przenoszone do MASSIF-1 High Capacity Dewar (HCD). Następnie naukowcy zajmujący się linią badawczą uruchamiają zbieranie danych, które mogą być zdalnie śledzone przez użytkowników. Dla każdego typu próbki użytkownicy otrzymują wiadomość e-mail z informacją, że zbieranie danych zostało rozpoczęte. Jak wspomniano wcześniej, wykonanie wszystkich kroków we wszystkich przepływach pracy może być śledzone online i w czasie rzeczywistym przez użytkownika za pośrednictwem ISPyB, z którego można przeglądać i pobierać wyniki.
<ol>
	<li>Dla każdej analizowanej próbki należy sprawdzić wyniki automatycznego eksperymentu w ISPyB (https://exi.esrf.fr/).
	<ol>
		<li>Zaloguj się, używając numeru eksperymentu i hasła, a następnie kliknij żądaną sesję eksperymentalną pod adresem ID30A-1.</li>
		<li>Wybierz preferowany (najwyżej oceniany) potok automatycznego przetwarzania (na przykład Granaty lub XDS_APP) i pobierz dane zapisane w odpowiedniej grupie przestrzeni z najwyższą kompletnością i najwyższą rozdzielczością, klikając Ostatnie wyniki zbierania, a następnie Pobierz. 
		UWAGA: Wszystkie obrazy siatki, linii i charakterystyki znajdują się w podkatalogu dla każdej próbki o nazwie /MXPressE_01. ESRF automatycznie uruchamia pięć oddzielnych pakietów przetwarzających, a mianowicie EDNA_proc12, Grenades12, XDS_APP14, autoPROC15 i XIA216. Integracja danych jest oparta na XDS, z wyjątkiem XIA2, który jest oparty na DIALS. Wszystkie pakiety są również uruchamiane w trybach anomalnych i nienanomalnych, co pozwala na automatyczne wykrywanie nietypowego sygnału, jeśli jest obecny w danych, do wykorzystania w protokołach fazowych SAD. Każdy pakiet używa innych parametrów i drzew decyzyjnych, co oznacza, że niektóre pakiety działają lepiej z określonymi próbkami. Może to jednak prowadzić do uzyskania dużej liczby wyników, gdy weźmie się pod uwagę liczbę pakietów i możliwych grup przestrzeni. Wyniki są zatem uszeregowane w przybliżeniu na podstawie rozdzielczości i innych wskaźników jakości, takich jakscalanie R w powłoce o najniższej rozdzielczości, CC(1/2) i kompletność. Ma to na celu naprowadzenie użytkownika na najlepsze zestawy danych, ale wszystkie możliwe grupy przestrzeni i wyniki powinny być dokładnie sprawdzone.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpakuj pobrany folder, który będzie zawierał wszystkie pliki dziennika i niescalone XDS_ASCII. HKL oraz scalone i przeskalowane pliki .mtz. 
	UWAGA: W przypadku, gdy struktura (w formacie PDB) białka będącego przedmiotem zainteresowania lub bliski homolog został przesłany do ISPyB na początku eksperymentu, potok automatycznego przetwarzania w ESRF automatycznie przeprowadzi proces wymiany molekularnej (MR) przy użyciu tej struktury jako modelu wyszukiwania najlepszego rozwiązania punktacji. Wyniki potoku MR są wyświetlane w ISPyB i można je znaleźć w folderze przetworzonych danych (na przykład /data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_mrpipe_dir/). W tym przypadku ostateczny model będzie nosił nazwę coot1.pdb, a dane odbicia łańcuchy boczne.mtz. Należy pamiętać, że potok może zmniejszyć symetrię komórki (prymitywna redukcja komórki) w celu zwiększenia prawdopodobieństwa znalezienia rozwiązania. W tym przypadku potok MR zapisywał roztwór w komórce jednoskośnej (C2), a nie w komórce rombowej (C2221). Szczegółowe informacje na temat ręcznego wykonywania procesu wymiany molekularnej (przykład dla drugiego najlepiej ocenianego rozwiązania do automatycznego przetwarzania) znajdują się w plikach uzupełniających.</li>
</ol>

<ol><li>Hui, R., Edwards, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput protein crystallization.</a> Journal of Structural Biology. 142 (1), 154-161 (2003).</li>
<li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MASSIF-1%3A+a+beamline+dedicated+to+the+fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).</li>
<li>Svensson, O., Malbet-Monaco, S., Popov, A., Nurizzo, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (8), 1757-1767 (2015).</li>
<li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrystalDirect%3A+a+new+method+for+automated+crystal+harvesting+based+on+laser-induced+photoablation+of+thin+films%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68, 1393-1399 (2012).</li>
<li>Nurizzo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RoboDiff%3A+combining+a+sample+changer+and+goniometer+for+highly+automated+macromolecular+crystallography+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">RoboDiff: combining a sample changer and goniometer for highly automated macromolecular crystallography experiments.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (8), 966-975 (2016).</li>
<li>Bowler, M. W., Svensson, O., Nurizzo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automatic+macromolecular+crystallography%3A+the+impact+of+MASSIF-1+on+the+optimum+acquisition+and+quality+of+data%5BTitle%5D)+AND+%22Crystallography+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fully automatic macromolecular crystallography: the impact of MASSIF-1 on the optimum acquisition and quality of data.</a> Crystallography Reviews. 22 (4), 233-249 (2016).</li>
<li>Brockhauser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+workflows+in+the+design+and+implementation+of+complex+experiments+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).</li>
<li>Svensson, O., Gilski, M., Nurizzo, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-position+data+collection+and+dynamic+beam+sizing%3A+recent+improvements+to+the+automatic+data-collection+algorithms+on+MASSIF-1%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Multi-position data collection and dynamic beam sizing: recent improvements to the automatic data-collection algorithms on MASSIF-1.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74, 433-440 (2018).</li>
<li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li>
<li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISPyB%3A+an+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li>
<li>ESRF. Structural Biology samples: how to organise the transport of reimbursed dewars. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.esrf.fr/MXDewarReimbursement">http://www.esrf.fr/MXDewarReimbursement</a> (2018).</li>
<li>Monaco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+processing+of+macromolecular+crystallography+X-ray+diffraction+data+at+the+ESRF%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF.</a> Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).</li>
<li>Kikuchi, G., Motokawa, Y., Yoshida, T., Hiraga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycine+cleavage+system%3A+reaction+mechanism%2C+physiological+significance%2C+and+hyperglycinemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Japan+Academy.+Series+B%2C+Physical+and+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Glycine cleavage system: reaction mechanism, physiological significance, and hyperglycinemia.</a> Proceedings of the Japan Academy. Series B, Physical and Biological Sciences. 84 (7), 246-263 (2008).</li>
<li>Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDSAPP2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">XDSAPP2.0.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 1085-1092 (2016).</li>
<li>Vonrhein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+processing+and+analysis+with+the+autoPROC+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Data processing and analysis with the autoPROC toolbox.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).</li>
<li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((xia2%3A+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li>
<li>Higashiura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+X-ray+crystal+structure+of+bovine+H-protein+at+0.88+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">High-resolution X-ray crystal structure of bovine H-protein at 0.88 Å resolution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (6), 698-708 (2010).</li>
<li>Sanishvili, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+7+%C2%B5m+mini-beam+improves+diffraction+data+from+small+or+imperfect+crystals+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A 7 µm mini-beam improves diffraction data from small or imperfect crystals of macromolecules.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (4), 425-435 (2008).</li>
<li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffraction+cartography%3A+applying+microbeams+to+macromolecular+crystallography+sample+evaluation+and+data+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Diffraction cartography: applying microbeams to macromolecular crystallography sample evaluation and data collection.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (8), 855-864 (2010).</li>
<li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+and+Experience+of+Controlled+Crystal+Dehydration%3A+Results+from+the+European+Synchrotron+HC1+Collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22Crystal+Growth+%26+Design%22%5BJournal%5D)">Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration.</a> Crystal Growth & Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).</li>
<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+harvesting+and+processing+of+protein+crystals+through+laser+photoablation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W pełni automatyczne linie badawcze zapewniają zautomatyzowaną charakterystykę i gromadzenie danych z dużej liczby kryształów makromolekularnych bez konieczności obecności naukowca, zarówno na linii badawczej, jak i zdalnie. Korzystanie z całkowicie zautomatyzowanych linii badawczych ma wiele zalet w porównaniu z obsługą ręczną. Na przykład automatyczne centrowanie próbki, oparte na siatce rentgenowskiej i skanach liniowych, jest bardziej precyzyjne niż to wykonywane za pomocą ludzkiego oka, ponieważ nie ma na nie wpływu efekty termiczne ani optyczne. Rzeczywiście, te skany siatkowe i liniowe dostarczają dodatkowych danych (tj. szczegółowych wymiarów kryształu i najlepszego obszaru dyfrakcyjnego kryształu), które są ważne w określeniu prawidłowego rozmiaru wiązki do wykorzystania do zbierania danych - szczególnie w przypadku małych kryształów18 - i często skutkują poprawą jakości uzyskanych danych dyfrakcyjnych. Co więcej, wykorzystując parametry zdefiniowane przez użytkownika w konfiguracji eksperymentów automatycznych, kroki w określonych przepływach pracy można dostosować tak, aby jak najlepiej pasowały do badanego systemu, optymalizując w ten sposób wskaźnik powodzenia eksperymentu.
Biorąc pod uwagę niezawodność dostępnych przepływów pracy, prosty dostęp do linii badawczej (użytkownicy samodzielnie planują, korzystając z kalendarza [patrz wyżej]) oraz w pełni zautomatyzowane podejście MASSIF-1 zapewniają rygorystyczną, wysokowydajną i oszczędzającą czas alternatywę dla klasycznych praktycznych eksperymentów MX oraz potencjał do wdrażania bardziej zaawansowanych procedur i aplikacji do automatycznych przepływów pracy. W niedalekiej przyszłości kartografia krystaliczna w 3D19 zostanie wdrożona w celu poprawy dokładności centrowania rentgenowskiego, podczas gdy bardziej złożone protokoły, takie jak eksperymenty z odwadnianiem kryształów20, zostaną zautomatyzowane. Oczekuje się, że w pełni autonomiczne gromadzenie danych stanie się standardową metodą w MX, dostarczając wysokiej jakości danych do badań przesiewowych fragmentów małych cząsteczek, optymalizując badania przesiewowe dużej liczby słabo dyfrakcyjnych kryształów i automatycznie dostarczając informacji o fazie w celu rozwiązania struktur krystalicznych de novo. W połączeniu z postępem w dziedzinie zautomatyzowanego zbierania kryształów21, możliwość rozwiązania struktury krystalicznej białka jako zautomatyzowanej usługi może stać się rzeczywistością.

Określenie trójwymiarowej struktury określonych białek jest kluczowe w biologii. Uzyskane w ten sposób informacje rzucają światło na funkcję biologiczną oraz na kształt i specyficzność miejsc aktywnych i/lub wiążących zawartych w badanej cząsteczce. W wielu przypadkach pozwala to na określenie mechanizmów działania lub, w stosownych przypadkach, na opracowanie potencjalnych cząsteczek terapeutycznych. MX jest techniką najczęściej stosowaną do uzyskiwania informacji strukturalnych, ale wąskim gardłem jest określenie optymalnych warunków do uzyskania dobrze dyfrakcyjnych kryształów. Dlatego próby krystalizacji są przeprowadzane w wielu różnych warunkach, a następnie są przesiewane, aby znaleźć najlepsze kryształy do wykorzystania do zbierania danych dyfrakcyjnych. Automatyzacja konfiguracji prób krystalizacji 1 wyraźnie pomogła w tym względzie. Jednak kolejne etapy (tj. montaż kryształów, badanie dyfrakcyjne i zbieranie danych dyfrakcyjnych) są zwykle wykonywane ręcznie, co zajmuje dużo czasu, wysiłku i zasobów. Automatyzacja badań przesiewowych dyfrakcyjnych i gromadzenia danych oznaczałaby zatem ogromny przyrost czasu i efektywność.
Badania dyfrakcyjne i zbieranie danych w MX są najczęściej przeprowadzane na synchrotronowych liniach badawczych MX, na których automatyzacja znacznie ułatwiła ten proces. Jednak w większości przypadków konieczne jest, aby naukowiec był obecny na linii badawczej podczas eksperymentu lub obsługiwał ją zdalnie. Niedawno opracowano nową generację całkowicie zautomatyzowanych linii badawczych MX2. W tym przypadku użytkownicy nie muszą być obecni, ani fizycznie, ani zdalnie, podczas sesji eksperymentalnej. Dzięki temu naukowcy mogą spędzać więcej czasu na mniej rutynowych zadaniach, zamiast spędzać całe dni, a często noce, na badaniu kryształów i zbieraniu danych dyfrakcyjnych. Pierwszą na świecie w pełni zautomatyzowaną linią badawczą jest Massively Automated Sample Selection Integrated Facility (MASSIF-1, ID30A-1)2,3 w Europejskim Ośrodku Promieniowania Synchrotronowego (ESRF). Ma unikalne środowisko próbkowania, w którym dewar o dużej pojemności zawiera próbkę działa w tandemie z robotycznym zmieniaczem próbek, który działa również jako goniometr linii badawczej4,5. MASSIF-1 to falująca linia badawcza wyposażona w hybrydowy detektor pikseli zliczający pojedyncze fotony6, który działa na stałej długości fali 0,969 A (12,84 keV) z intensywną wiązką promieniowania rentgenowskiego (2 x 1012 fotonów/s). Wielkość wiązki w miejscu pobierania próbki można regulować w zakresie od minimum 10 μm (wiązka okrągła) do maksimum 100 μm x 65 μm (wielkość wiązki poziomej przez pionową). Średnio linia badawcza może przetworzyć, w sposób całkowicie automatyczny (patrz poniżej), 120 kryształów w ciągu 24 godzin. Działanie linii badawczej opiera się na serii przepływów pracy7, z których każdy podejmuje inteligentne decyzje w oparciu o wynik poprzednich kroków w przepływie pracy, aby zapewnić pomiar jak najlepszych danych z badanej próby. W szczególności ocena charakterystyki dyfrakcyjnej pojedynczej próbki uwzględnia objętość i strumień kryształów oraz zapewnia, w przypadku gdy kryształ jest większy niż wiązka promieniowania rentgenowskiego, do późniejszego gromadzenia danych wykorzystywany jest tylko najlepszy obszar kryształu. Zestawy danych dyfrakcyjnych są zatem zoptymalizowane pod kątem maksymalnej rozdzielczości przy zminimalizowanych uszkodzeniach spowodowanych promieniowaniem2,3. Dostępne są również wymagające protokoły zbierania danych, takie jak strategie zbierania danych pseudo-helikalnych (wielopozycyjnych) zarówno dla natywnego, jak i jednofalowego dyfrakcji anomalnej (SAD), są również dostępne8.
Całkowicie automatyczne eksperymenty w MASSIF-1 polegają na kriochłodzeniu i montażu kryształów na magnetycznym uchwycie próbki odpowiednim dla pożądanego wyposażenia linii badawczej standardowe piny SPINE9, wprowadzając pożądane parametry eksperymentalne do tabeli 'plan dyfrakcji' w Zintegrowanym Systemie Krystalografii Białek (ISPyB)10, internetowy system zarządzania informacjami dla eksperymentów MX i wysyłania próbek na linię badawczą. W ESRF wszystkie koszty transportu próbek do/z linii badawczej są pokrywane przez Biuro Użytkownika ESRF (szczegóły na stronie ESRF11). W MASSIF-1 nie ma żadnych ograniczeń co do rozmiaru pętli ani jakości kryształów. Wybierając plan dyfrakcji dla danego kryształu, użytkownik może skorzystać z ustawień domyślnych lub wybrać jeden z określonych przepływów pracy, które można dostosować do każdej próbki. Dostępnych jest kilka wstępnie zaprogramowanych przepływów pracy. W przepływie pracy MXPressE3 pętla zawierająca próbkę jest najpierw wyrównywana do pozycji próbki za pomocą centrowania optycznego. Następnie centrowanie oparte na promieniowaniu rentgenowskim zapewnia, że najlepszy obszar kryształu jest wyśrodkowany do wiązki promieniowania rentgenowskiego. Strategie gromadzenia danych są następnie obliczane przy użyciu eEDNA, platformy do tworzenia aplikacji opartych na wtyczkach, specjalnie do analizy danych online w dziedzinie eksperymentów rentgenowskich, biorąc pod uwagę objętość kryształów i strumień w czasie rzeczywistym na linii badawczej. Po zebraniu pełnego zestawu danych dyfrakcyjnych, jest on następnie przetwarzany za pomocą serii automatycznych potoków przetwarzania danych12, a wyniki są udostępniane do wglądu i pobierania w ISPyB. Przepływ pracy MXPressE SAD3 jest ukierunkowany na kryształy białka docelowego zawierające selenometioninę i wykorzystuje fakt, że energia robocza MASSIF-1 znajduje się tuż powyżej krawędzi Se K. W tym przypadku strategia zbierania danych MXPressE eEDNA jest zoptymalizowana pod kątem gromadzenia danych SAD (tj. wysoka redundancja i rozdzielczość ustawiona na miejsce, w którympołączenie R między parami Bijvoet wynosi poniżej 5%). Aby przebadać właściwości dyfrakcyjne serii kryształów bez późniejszego zbierania danych, można użyć przepływu pracy MXScore3 w celu uzyskania pełnej oceny jakości analizowanych kryształów. W przepływie pracy MXPressI3 dane obrotu 180° są zbierane przy użyciu oscylacji 0,2° i przy użyciu początkowego kąta phi oraz rozdzielczości określonej przez strategię eEDNA. MXPressO3 dołącza wstępnie zaobserwowaną rozdzielczość do przepływu pracy (domyślnie: dmin = 2 A). Aby dokonać wstępnej oceny kryształów powstałych w wyniku próby krystalizacji, oferowany jest przepływ pracy MXPressM3. Wykonuje to skanowanie siatki o wysokiej dawce w najszerszej orientacji nośnika próbki bez zbierania danych lub centrowania. Ostatnio zaimplementowano dwa nowe przepływy pracy eksperymentów, MXPressP i MXPressP_SAD, które wykonują zbieranie danych pseudohelikalnych8. Wykonanie wszystkich kroków we wszystkich przepływach pracy może być śledzone online i w czasie rzeczywistym przez użytkownika za pośrednictwem ISPyB.
Tutaj pokazujemy, jak przygotować w pełni zautomatyzowany eksperyment MX w MASSIF-1 oraz jak pobrać i przeanalizować dane wynikające z eksperymentu. Jako przykład używamy ludzkiego białka H (GCSH) systemu cięcia glicyny mitochondrialnej. To białko zawierające kwas liponowy jest częścią systemu rozkładu glicyny odpowiedzialnego za degradację glicyny. System ten obejmuje ponadto białko P, dekarboksylazę glicyny zależną od fosforanu pirydoksalu, białko T, enzym wymagający tetrahydrofolianu oraz białko L, dehydrogenazę lipoamidową. GCSH przenosi grupę metyloaminową glicyny z białka P do białka T. Defekty białka H są przyczyną hiperglikemii nieketotycznej (NKH) u ludzi13.

<table><tbody><tr><td>Linia badawcza MASSIF-1</td><td>ESRF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL21DE3</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>chloramfenikol</td><td>Roth</td><td>3886.1</td><td></td></tr><tr><td>Koncentratory: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>Membrana dializacyjna</td><td>Spectrumlabs</td><td>132655</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitory proteazy wolne od EDTA</td><td>Roche</td><td>4,693,159,001</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>VWR Chemicals Prolabo</td><td>14388.29T</td><td></td></tr><tr><td>His-pułapka HP</td><td>GE healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56750-500G</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Euromedex</td><td>EU0008-B</td><td></td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>kwas liponowy</td><td>pętla Sigma-Aldrich</td><td>T5625</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hampton Research</td><td>HR8-124</td><td></td></tr><tr><td>lizozym</td><td>Roche</td><td>10 837 059 001</td><td></td></tr><tr><td>MonoQ 5/50 GL</td><td>GE healthcare</td><td>17-5166-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/3160/60</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator Vibra cell 75/15</td><td>SONICS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>krążki SPINE</td><td>MiTeGen</td><td>SKU: M-CSM003-0001A</td><td></td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td>Morczówczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1064430500</td><td></td></tr><tr><td>bufor oczyszczający GCSH</td><td>20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GCSH bufor krioochronny</td><td>0,25 M Mrówczan sodu pH 4, 30% glicerol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Programs:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MxCube</td><td></td><td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE : synchrotronowe środowisko sterowania linią badawczą dostosowane do eksperymentów krystalografii makromolekularnej. Dziennik Promieniowania Synchrotronowego. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010)</td><td>rozwój lokalny</td></tr><tr><td>ISPyB</td><td>ESRF</td><td>Solange Delageni&egrave; re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, St&eacute; phanie Veyrier, Jos&eacute; Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Se&aacute; n M. McSweeney, St&eacute; phanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: system zarządzania informacją dla synchrotronowej krystalografii makromolekularnej, Bioinformatyka, tom 27, wydanie 22, 15 listopada 2011 r., strony 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td><td>rozwoju lokalnego</td></tr><tr><td>MXCube2</td><td>ESRF</td><td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE : środowisko sterowania synchrotronową linią badawczą dostosowane do eksperymentów krystalografii makromolekularnej. Journal of Synchrotron Promieniowanie. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).</td><td>Rozwój lokalny</td></tr><tr>Serwer <td></td><td>przepływu pracy BES</td><td>Brockhauser, S. i wsp. Wykorzystanie przepływów pracy w projektowaniu i realizacji złożonych eksperymentów z krystalografii makromolekularnej. Acta Crystallographica Sekcja D Krystalografia biologiczna. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012).</td><td></td></tr><tr><td>DOZOR</td><td>ESRF</td><td>Bourenkov i Popov, niepublikowany</td><td>rozwój lokalny</td></tr><tr>Kontrola <td></td><td>linii badawczej BLISS</td><td>Guijarro, M. et al. BLISS - Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Hiszpania. DOI: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webPL05 (2018).</td><td>Rozwój lokalny</td></tr><tr><td>Automatyczne przetwarzanie obrazów</td><td></td><td>Monaco, S. i wsp. Automatyczne przetwarzanie danych dyfrakcji rentgenowskiej krystalografii makromolekularnej w ESRF. Dziennik Krystalografii Stosowanej. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013)</td><td>rozwój lokalny</td></tr><tr><td>BEST i EDNA</td><td></td><td>Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : framework dla aplikacji opartych na wtyczkach stosowanych do analizy danych online w eksperymencie rentgenowskim. Dziennik Promieniowania Synchrotronowego. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).</td><td>Rozwój lokalny</td></tr><tr><td>CCP4</td><td></td><td>Winn, M.D. et al. Przegląd pakietu CCP 4 i bieżących zmian. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011).</td><td></td></tr><tr><td>Phaser MR</td><td></td><td>McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser oprogramowanie krystalograficzne. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007).</td><td></td></tr><tr><td>Coot</td><td></td><td>Emsley, P., Cowtan, K. Coot: narzędzia do budowania modeli dla grafiki molekularnej. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004).</td><td></td></tr><tr><td>refmac5</td><td></td><td>Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Udoskonalanie struktur makromolekularnych metodą maksymalnego prawdopodobieństwa. Acta Crystallographica Sekcja D. 53, 240--255 (1997).</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Matthews <td>Matthews, BW Zawartość rozpuszczalnika w kryształach białka. Dziennik Biologii Molekularnej. 33 (2), 491-497 (1968).</td><td></td></tr></tbody></table>

w pełni autonomiczna charakterystyka i zbieranie danych z kryształów makrocząsteczek biologicznych

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Promienie rentgenowskie o wysokiej jasności w połączeniu z automatyzacją doprowadziły do wykorzystania linii badawczych makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej (MX) opartych na synchrotronie nawet do najbardziej wymagających projektów w biologii strukturalnej. Jednak większość obiektów nadal wymaga obecności naukowca na miejscu w celu przeprowadzenia eksperymentów. Niedawno opracowano nową generację zautomatyzowanych linii badawczych przeznaczonych do w pełni automatycznego charakteryzowania i zbierania danych z kryształów makrocząsteczek biologicznych. Te linie badawcze stanowią nowe narzędzie dla biologów strukturalnych do badania przesiewowego wyników wstępnych prób krystalizacji i/lub gromadzenia dużej liczby zestawów danych dyfrakcyjnych, bez konieczności samodzielnego kontrolowania linii badawczej przez użytkowników. Tutaj pokazujemy, jak skonfigurować eksperyment do automatycznego badania przesiewowego i zbierania danych, jak przeprowadza się eksperyment na linii badawczej, jak przetwarzane są wynikowe zestawy danych oraz jak, jeśli to możliwe, rozwiązuje się strukturę krystaliczną makrocząsteczki biologicznej.

Przepływ pracy MXPressP został wykorzystany na linii beamline MASSIF-1 w ESRF do w pełni automatycznego montowania, centrowania w wiązce promieni rentgenowskich, charakteryzacji oraz zbierania pełnych zestawów danych dyfrakcyjnych z serii kryształów ludzkiego GCSH. Próbki zostały zamontowane, a pętla przeanalizowana w celu wyznaczenia obszaru skanowania (Rysunek 1, po lewej). Po analizie dyfrakcyjnej wybrano cztery punkty wewnątrz kryształu do zbierania danych (Rysunek 1, prawa). Następcze przetwarzanie za pomocą zautomatyzowanych potoków analizy danych, w tym potoku MR, pozwoliło na uzyskanie wysokiej jakości zbiorów danych (Tabela 1) dla których znaleziono rozwiązanie MR. To ostatnie pozwala użytkownikom na szybką ocenę, czy uzyskany zbiór danych oraz zastosowany model poszukiwań nadają się do wyznaczania faz za pomocą wymiany molekularnej. Ponadto można ocenić obecność ligandów, co pozwala użytkownikowi skupić się wyłącznie na najbardziej obiecujących zbiorach danych w dalszej analizie. Ręczne wyznaczanie struktury metodą MR pozwoliło na uzyskanie wysokiej jakości mapy gęstości elektronowej po jednym automatycznym cyklu udoskonalania (Rycina 2a). W przypadku tego zbioru danych zautomatyzowany potok przetwarzania odciął dane przy rozdzielczości 1,32 Å; użytkownicy mogą jednak zdecydować o odcięciu danych przy niższej rozdzielczości, aby uzyskać inne statystyki jakości (CC1/2, &lt;I/σ(I)&gt;, Rpomiar) w powłoce o najwyższej rozdzielczości. Struktura krystaliczna ludzkiej GCSH jest podobna do struktury białka bydlęcego (3KlR)16.
Ciągła gęstość elektronowa jest widoczna dla całego łańcucha aminokwasowego, z wyjątkiem N-końcowego znacznika histydynowego. Z czterech substytucji różniących ludzkie i bydlęce GCSH, trzy są łatwo identyfikowalne w gęstości elektronowej (Ile/Val66, Asp/Glu98 oraz Leu/Phe149; Rysunek 2b-d). Jest to mniej oczywiste w przypadku substytucji Asp/Lys125, dla której gęstość elektronowa łańcucha bocznego jest jedynie częściowo rozdzielona ze względu na jego elastyczność (Rysunek 1e). Obecnie uzyskany model posiada wartości Rwork i Rfree wynoszące odpowiednio 20,4% i 23,8%, a może zostać dodatkowo zoptymalizowany poprzez kolejne cykle automatycznego i ręcznego budowania oraz udoskonalania modelu.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr>
			<td></td>
			<td>Potok GRENADES</td>
			<td>Potok XDS_APP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Gromadzenie i przetwarzanie danych</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Źródło promieniowania rentgenowskiego / Linia wiązki</td>
			<td colspan="2">ESRF / MASSIF-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Długość fali (Å)</td>
			<td colspan="2">0.966</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdzielczość (Å)</td>
			<td>41.88 – 1.48 (1.53 – 1.48)</td>
			<td>41.86 - 1.32 (1.39 – 1.32)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Całkowita liczba odbić/Odbicia unikalne</td>
			<td>127670 / 28644</td>
			<td>177332 / 40134</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(12178 / 2775)</td>
			<td>(23772 / 5714)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grupa przestrzenna do indeksowania, skalowania i łączenia</td>
			<td>C222</td>
			<td>C2221</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymiary komórki</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>       a, b, c (Å)</td>
			<td>42.20, 83.75, 95.85</td>
			<td>42.19, 83.72, 95,82</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mozaikowość</td>
			<td>0.05</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rmeas (%)</td>
			<td>10.0 (110.7)</td>
			<td>11.1 (198.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&lt;I/σ(I)&gt;</td>
			<td>9.6 (1.3)</td>
			<td>7.6 (0.7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC1/2 (%)</td>
			<td>99.7 (53.9)</td>
			<td>99.7 (19.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kompletność (%)</td>
			<td>99.6 (99.6)</td>
			<td>99.5 (98.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplikacja</td>
			<td>4.5 (4.4)</td>
			<td>4.4 (4.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Zamiana molekularna i wstępne udoskonalenie modelu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grupa przestrzenna do fazowania</td>
			<td>C2</td>
			<td>C2221</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymiary komórki</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>       a, b, c (Å)</td>
			<td>83.74, 42.18, 95.82</td>
			<td>42.19, 83.72, 95,82</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>       α, β, γ (°)</td>
			<td>90, 90.03, 90</td>
			<td>90, 90, 90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model poszukiwań dla MR (PDB)</td>
			<td>3KLR</td>
			<td>3KLR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cząsteczki białka / ASU</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pozostałości białkowe</td>
			<td>250</td>
			<td>125</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rwork/Rfree (%) po 1. udoskonaleniu</td>
			<td>24.3 / 26.5</td>
			<td>20.4 / 23.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RMSD długości wiązań (Å) po 1. udoskonaleniu</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RMSD kąta wiązania (°) po 1. udoskonaleniu</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odchylenia rotamerów (%) po 1. udoskonaleniu</td>
			<td>1.07</td>
			<td>4.29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wartości Ramachandrana: preferowane/dozwolone/niedozwolone (%) po 1. udoskonaleniu</td>
			<td>95.93 / 4.07 / 0</td>
			<td>95.12 / 4.88 / 0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Statystyki gromadzenia danych, udoskonalania i walidacji dyfrakcji rentgenowskiej. Wartości dla powłoki o najwyższej rozdzielczości podano w nawiasach.
<img alt="Dyfrakcja optyczna, obraz mikroskopowy (A), mapa ciepła sygnału dyfrakcyjnego (B), analiza fotoniczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59032/59032fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Analiza próbki przed gromadzeniem danych. (A) Obszar wybrany do skanowania zaznaczono czerwoną ramką. (B) Analiza obrazów dyfrakcyjnych przedstawiona jest w formie mapy ciepła. Do gromadzenia danych wybrano cztery pozycje w obrębie zlokalizowanego kryształu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59032/59032fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mapy gęstości elektronowej białka, dopasowanie modelu, analiza strukturalna; schemat pozycji atomowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59032/59032fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Wizualna walidacja map gęstości elektronowej uzyskanych po rafinacji. Mapy gęstości elektronowej z konturami na poziomie 2x r.m.s. wokół (a) Trp143, (b) Val66 (Ile w ludzkiej GCSH) oraz (c) Glu98 (Asp w ludzkiej GCSH) oraz mapy z konturami na poziomie 1x r.m.s. wokół (d) Phe149 (Leu w ludzkiej GCSH) i (e) Lys125 (Asp w ludzkiej GCSH). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59032/59032fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Tutaj opisujemy, jak korzystać z opcji automatycznego badania przesiewowego i zbierania danych dostępnych na niektórych liniach synchrotronowych. Naukowcy wysyłają próbki chłodzone kriogenicznie do synchrotronu, gdzie badane są właściwości dyfrakcyjne, zestawy danych są zbierane i przetwarzane, a tam, gdzie to możliwe, przeprowadzane jest rozwiązanie strukturalne – a wszystko to bez interwencji człowieka.

W pełni autonomiczna charakterystyka i zbieranie danych z kryształów makrocząsteczek biologicznych

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Krystalografia rentgenowska jest dominującą techniką określania informacji strukturalnych 3D z białek. Linie wiązki synchrotronowej są potrzebne do uzyskania danych z małych, słabo dyfrakcyjnych kryształów wytwarzanych przez białka. Massive One jest unikalną linią wiązki, ponieważ w pełni automatyzuje proces zbierania danych z makrocząsteczek biologicznych.Od montażu próbki, lokalizacji i końcowego zbierania danych. Pełna automatyzacja tego rodzaju jest bardzo ważna, ponieważ pozwala naukowcom spędzać czas w laboratorium, zamiast zbierać dane na linii wiązki. Linia wiązki jest również inteligentna i średnio może zbierać lepsze dane niż wtedy, gdy linia wiązki jest obsługiwana przez ludzi.Aby rozpocząć ten protokół, wykonaj montaż kryształu i zażądaj czasu wiązki na Massive one, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przejdź do systemu informacyjnego linii wiązki krystalografii białek lub strony internetowej ISPyB. Wybierz MX experiments, zaloguj się za pomocą numeru eksperymentu i hasła.Kliknij na przesyłkę, dodaj nową i podaj niezbędne informacje. Następnie kliknij Zapisz. Kliknij dodaj paczkę i wypełnij wymagane informacje.Kliknij przycisk Zapisz, a następnie kliknij przycisk Dodaj kontener. Podaj kod kreskowy krążka jako nazwę i wybierz krążek grzbietowy, ponownie kliknij zapisz. Kliknij na symbol pojemnika i edytuj, a następnie uzupełnij niezbędne informacje dotyczące próbek, takie jak nazwa białka, preferowany przepływ pracy i pozycja kryształu, w krążku.Wybierz białko, które zostało zatwierdzone przez grupę bezpieczeństwa ESRF. Wprowadź unikatową nazwę próbki, aby zidentyfikować każdą pojedynczą próbkę. Opcjonalnie zeskanuj kod kreskowy PIN.Pozostałe informacje, które należy uwzględnić, są również opcjonalne. Dla każdej próbki wprowadź typ eksperymentu. Określa to, który automatyczny przepływ pracy będzie używany do przetwarzania każdego kryształu.Biorąc pod uwagę, że kryształy GCSH są igłami, wybierz MX naciśnij P.Następnie wprowadź grupę spacji. Jeśli jest to możliwe, zostanie to wykorzystane do obliczeń strategii gromadzenia danych oraz przez dostępne rurociągi do automatycznego przetwarzania danych. Wprowadź żądaną rozdzielczość.Określa to odległość od kryształu do detektora od początkowych skanów siatki, charakterystyki i domyślnego zbierania danych. Teraz ustaw żądaną rozdzielczość progową, aby zapobiec zbieraniu pełnych zestawów danych z kryształów, które nie ulegają dyfrakcji do tego limitu. Może to zaoszczędzić miejsce na przechowywanie danych i czas analiz.Ustaw wymaganą kompletność. Następnie ustaw wymaganą krotność. Jeśli na nośniku próbki znajduje się więcej niż jeden kryształ, ustaw maksymalną liczbę kryształów do analizy.Wartość domyślna to jeden lub pięć dla MX press P. Można również wybrać odpowiedni rozmiar wiązki. Umieść grupę spacji, jeśli jest znana, w kolumnie grupy sił i przestrzeni. Następnie ustaw czułość kryształów na promieniowanie.W razie potrzeby ustaw całkowity kąt obrotu, który ma zostać zebrany dla pełnego zbioru danych. Po wprowadzeniu wszystkich informacji do systemu zapisz wartości. Kliknij, wróć do przesyłek i naciśnij wyślij przesyłkę do ESRF.Wydrukuj etykietę wysyłkową i wyślij próbki. Użytkownicy powinni umówić się na odbiór z kurierem, korzystając z danych konta ESRF. W dniu eksperymentu próbki są przenoszone do Massive one o dużej pojemności odrośniaka.Następnie naukowcy zajmujący się linią wiązki uruchamiają zbieranie danych, które mogą być zdalnie śledzone przez użytkowników. Dla każdego typu próbki użytkownicy otrzymują wiadomość e-mail z informacją, że zbieranie danych się rozpoczęło. Wykonanie wszystkich kroków we wszystkich przepływach pracy można śledzić online i w czasie rzeczywistym.Jest to dostępne dla użytkownika po zalogowaniu się do ISPyB. Wyniki można również przeglądać i pobierać. Dla każdej analizowanej próbki sprawdź wyniki automatycznego eksperymentu na ISPyB.Kliknij żądaną sesję eksperymentalną pod adresem ID30A1. Wybierz preferowany potok automatycznego przetwarzania. Pobierz dane zapisane w odpowiedniej grupie przestrzeni z najwyższą kompletnością i najwyższą rozdzielczością.Klikając na ostatnią, zbieraj wyniki, a następnie pobieraj. Przepływ pracy MX press P został wykorzystany przez linię wiązki ESRF Massive one do w pełni automatycznego montażu, wyśrodkowania w wiązce promieniowania rentgenowskiego, scharakteryzowania i zebrania pełnych zestawów danych dyfrakcyjnych z serii kryształów ludzkiego GCSH. Próbki zostały zamontowane, a pętla przeanalizowana pod kątem obszaru do skanowania.Po przeprowadzeniu analiz dyfrakcyjnych wybrano cztery punkty w krysztale do zebrania danych. Ręczne określanie struktury przez zastępowanie molekularne pozwoliło uzyskać wysokiej jakości mapę gęstości elektronów po pojedynczym zautomatyzowanym cyklu uszlachetniania. W przypadku tego zestawu danych zautomatyzowany potok przycinał dane z rozdzielczością jednego punktu i dwóch angstremów.Użytkownicy mogą jednak zdecydować się na przycięcie danych w niższej rozdzielczości. Ciągła gęstość elektronowa jest widoczna dla całego łańcucha aminokwasowego z wyjątkiem znacznika e-końcowej histydyny. Spośród czterech podstawień, które odróżniają GCSH człowieka i bydła, trzy są łatwo identyfikowalne w gęstości elektronów.Jest to mniej oczywiste w przypadku substytucji kwasu asparaginowego do lizyny 125. Dla których gęstość elektronowa łańcucha bocznego jest tylko częściowo rozwiązana ze względu na elastyczność. Aktualnie uzyskany model ma wartość pracy R wynoszącą 20 punktów cztery procent i wartość wolną R wynoszącą 23 punkty osiem procent i może być dodatkowo optymalizowany przez dodatkowe cykle automatycznego i ręcznego budowania i udoskonalania modelu.Ważne jest, aby dostosować wymagania do swojego systemu. Na przykład ustawienie już zaobserwowanej rozdzielczości na znaną wartość może zaoszczędzić czas i zapewnić lepsze zbieranie danych. W pełni automatyczne gromadzenie danych zdemokratyzowało krystalografię i teraz nawet małe laboratoria mogą rozpocząć słynny projekt, podczas gdy wcześniej było to wykonalne tylko przy użyciu ogromnej siły roboczej.

fully-autonomous-characterization-data-collection-from-crystals

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym opracowaniu opisano procedury wdrożone w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Membran Caffreya w celu zbioru i kriochłodzenia kryształów białek błonowych hodowanych w lipidowych fazach kubicznych i gąbczastych, przeznaczonych do wyznaczania struktur metodą makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej.

Pozyskiwanie i mrożenie kryształów białek błonowych hodowanych w mezofazach lipidowych w celu wyznaczenia struktury metodą krystalografii makromolekularnej

Zautomatyzowane systemy i protokoły do rutynowego przygotowania dużej liczby ekranów i nanolitrowych kropelek krystalizacji do eksperymentów dyfuzji par są opisane i omówione.

Zautomatyzowane protokoły krystalizacji makromolekularnej w Laboratorium Biologii Molekularnej MRC

Przedstawiono protokół krystalografii rentgenowskiej z wykorzystaniem mikrokryształów białkowych. Porównano dwa przykłady analizujące mikrokryształy hodowane in vivo po oczyszczeniu lub w celulo.

Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

Przedstawiono uproszczony protokół do przeprowadzenia obszernej charakterystyki biochemicznej i strukturalnej białka wiążącego substrat węglowodanowy ze Streptococcus pneumoniae.

Charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów SP0092

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak wytwarzać i obsługiwać urządzenia mikroprzepływowe do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej. Dodatkowo opisano, w jaki sposób monitorować krystalizację białek poprzez dynamiczne rozpraszanie światła oraz jak przetwarzać i analizować uzyskane dane dyfrakcyjne.

Chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej

Przedstawiono nowatorski uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej wraz z odpowiednim protokołem postępowania. System umożliwia wzrost kryształów, wygrzewanie kryształów i gromadzenie danych dyfrakcyjnych in situ zarówno w temperaturze otoczenia, jak i kriogenicznej, bez konieczności jakiejkolwiek manipulacji kryształami lub montażu.

Uniwersalny uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej z minimalnym rozpraszaniem tła

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół wytwarzania mikroprzepływowych chipów opracowanych do krystalizacji białek na chipie metodą dializy i eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Proces mikroprodukcji umożliwia zintegrowanie półprzepuszczalnej membrany do dializy z regenerowanej celulozy z dowolnym odcięciem masy cząsteczkowej między dwiema warstwami chipa.

Krystalizacja białek na chipie za pomocą mikrodializy do badań dyfrakcji rentgenowskiej in situ

Badanie przesiewowe fragmentów krystalograficznych w Helmholtz-Zentrum Berlin odbywa się za pomocą przepływu pracy z dedykowanymi bibliotekami związków, narzędziami do obsługi kryształów, szybkimi urządzeniami do zbierania danych i w dużej mierze zautomatyzowaną analizą danych. Przedstawiony protokół ma na celu maksymalizację wyników takich eksperymentów, aby zapewnić obiecujące punkty wyjścia do projektowania ligandów opartych na dalszej strukturze.

Przebieg pracy i narzędzia do badania przesiewowego fragmentów krystalograficznych w Helmholtz-Zentrum Berlin

Tutaj opisujemy, jak korzystać z automatycznych procesów krystalografii makromolekularnej do analizy białko-struktura, szybkiej analizy kompleksu ligand-białko i badań przesiewowych fragmentów na dużą skalę w oparciu o technologię CrystalDirect w laboratorium HTX w EMBL Grenoble.

Zautomatyzowane rurociągi krystalograficzne w zakładzie EMBL HTX w Grenoble

Ten wkład opisuje, jak skonfigurować krystalizację białek na urządzeniach typu kryształ na krysztale oraz jak przeprowadzić automatyczne szeregowe zbieranie danych w temperaturze pokojowej za pomocą platformy krystalizacji na chipie.

Krystalizacja na chipie i dyfrakcja szeregowa na dużą skalę w temperaturze pokojowej

Prezentujemy protokół krystalizacji białek za pomocą urządzenia do krystalizacji w Kompleksie Badawczym w Harwell i późniejsze zbieranie danych krystalograficznych in situ w promieniowaniu rentgenowskim in situ z kryształów wewnątrz płytek na linii badawczej Diamond's Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi). Opisujemy wymagania dotyczące próbek, protokoły krystalizacji i wytyczne dotyczące zbierania danych.

Gromadzenie danych o krystalizacji i temperaturze pokojowej in situ przy użyciu urządzenia do krystalizacji w Harwell i linii badawczej VMXi, diamentowego źródła światła

Poznaj w pełni zautomatyzowaną charakterystykę i zbieranie danych z kryształów makrocząsteczek biologicznych przy użyciu linii synchrotronowej Massive one. Ta metoda umożliwia efektywne pozyskiwanie wysokiej jakości danych dyfrakcyjnych bez interwencji człowieka.

W pełni autonomiczna charakterystyka i zbieranie danych z kryształów makrocząsteczek biologicznych

Przeglądaj więcej filmów