Name: Zastosowanie in vivo systemu REMOTE-control do manipulacji endogenną ekspresją genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Poznaj metodę REMOTE-control do warunkowej regulacji ekspresji endogennych genów in vivo przy użyciu systemów lac i tet. Technika umożliwia odwracalną represję i aktywację genów w tkankach zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy zmarłej dr Heidi Scrable za jej hojny dar w postaci konstruktu genu lacI u ssaków (Mayo Clinic, Rochester, MN), dr Danielowi Louvardowi (Institut Curie, Paryż, Francja) za dostarczenie promotora Villin oraz dr Laurie Jackson-Grusby (Szpital Dziecięcy, Boston, MA) za jej wkład we wczesne etapy rozwoju tej technologii. Jesteśmy wdzięczni dr Nancy Wu i dr Robertowi Maxsonowi za ich pomoc w wyhodowaniu myszy transgenicznych i nokautujących. Dziękujemy członkom laboratorium Laird za pomocne dyskusje i wsparcie. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health [R01 CA75090, R01 DA030325, R01 CA157918 i R01 CA212374 do P.W.L. i 1F31CA213897-01A1 do N.A.V.S.].

PWL zasiada w Naukowych Radach Doradczych AnchorDx i Progenity, Inc.

Kluczowym etapem i potencjalnym ograniczeniem systemu REMOTE-control jest wyzwanie związane z insercją miejsc wiązania represora i/lub aktywatora bez wpływu na ekspresję genów docelowych. Nasze pierwotne podejście do represji, zastosowane do genu Dnmt1 , obejmowało insercję miejsc wiązania represorów lac w krytycznych transkrypcyjnie regionach promotora. W celu zmniejszenia ryzyka wpływu na funkcję promotora, a tym samym poprawy ogólnej możliwości zastosowania systemu REMOTE-control, opracowaliśmy podejście oparte na represjach opartych na intronach. Siła działania naszego ulepszonego systemu lac pozwoliła nam na ścisłe stłumienie transkrypcji wszystkich silnych promotorów, które testowaliśmy u operatorów znajdujących się od setek do kilku kilozasad poniżej miejsc rozpoczęcia transkrypcji (Figura 3A-C)10. Co ważne, poziomy represji były niezależne od siły transkrypcji promotorów (Figura 3A-C)10. Sugeruje to, że zdolność represyjna naszego systemu represji opartego na intronie przekracza siłę transkrypcyjną badanych promotorów. W tym podejściu opartym na intronie jest prawdopodobne, że represja jest pośredniczona przez fizyczną interferencję między dwoma składnikami, maszynerią wydłużania transkrypcji i represorami lac57. Ten prosty mechanizm represji i wykazana solidność metody opartej na intronach mogą sprawić, że podejście to będzie ogólnie stosowane do różnych genów, tkanek i organizmów.
Regulacja w górę przez system REMOTE-control wymaga, aby sekwencje wiążące transaktywator znajdowały się blisko promotora genu docelowego, co wiąże się z ryzykiem wpływu na funkcję promotora. Odkryliśmy jednak, że pozycja sekwencji wiążących może znajdować się poza regionem krytycznym transkrypcyjnie. Zarówno promotory Dnmt1 , jak i EF1α były silnie regulowane w górę od operatorów tet zlokalizowanych kilkaset zasad powyżej miejsc rozpoczęcia transkrypcji10. To złagodzone ograniczenie znacznie zmniejsza ryzyko wpływu na funkcję promotora genu docelowego w przypadku braku transaktywatora. Zwiększenie liczby sekwencji wiążących i/lub zastosowanie silniejszych transaktywatorów może pomóc w dalszym zmniejszeniu ryzyka poprzez umożliwienie regulacji w górę z miejsc bardziej oddalonych od miejsca rozpoczęcia transkrypcji.
Nasz system zdalnego sterowania zapewnia elegancką kontrolę poziomu, czasu i lokalizacji endogennej ekspresji genów, umożliwiając testowanie odwracalności fenotypu i konsekwencji różnych poziomów ekspresji, które nie są łatwo osiągalne przy użyciu obecnych technologii kontroli ekspresji genów in vivo. Należy zauważyć, że w większości analiz ekspresji genów, w tym w naszej, wartości ekspresji reprezentują średnią populacji komórek, wśród których można znaleźć znaczne różnice. Ta heterogeniczność może wpływać na komórkowe procesy decyzyjne, takie jak różnicowanie lub apoptoza58. Chociaż precyzja kontroli ekspresji genów mogłaby być prawdopodobnie jeszcze bardziej poprawiona przez dodatkową inżynierię obwodów genetycznych59, obserwowana moc naszego obecnego systemu pozwoli na użyteczne badanie funkcji genów w wielu kontekstach biologicznych. Ponadto oczekuje się wysokiego stopnia swoistości docelowej ze względu na złożoność sekwencji operatorów, a także dużą odległość ewolucyjną między ssakami a gatunkami pochodzącymi ze składników regulacyjnych60. Co więcej, transgeniczne mysie linie represorów i aktywatorów mogą być opracowywane i stosowane dla dowolnego genu endogennego. Na przykład, istniejące modele myszy z transaktywatorem tet można dostosować do regulacji w górę docelowego genu w pożądanych tkankach myszy. Niedawno opracowaliśmy linię transgeniczną, która może napędzać silną, specyficzną tkankowo ekspresję naszego ulepszonego represora lac w wielu typach tkanek w połączeniu z istniejącymi liniami Cre poprzez wprowadzenie genu lacIGY do locus48 Hipp11 pod kontrolą elementu Lox-STOP-Lox (niepublikowanego). Linia ta znacznie ułatwiłaby specyficzne tkankowo zastosowanie systemu REMOTE-control.
Regulacja w górę genów za pomocą systemu REMOTE-control ma kilka zalet w porównaniu z obecnymi indukowalnymi metodami transgenicznymi. Nie wymaga generowania wielu linii transgenicznych w celu przetestowania efektów położenia insercji, ponieważ wykorzystuje endogenne locus. Ponadto podejście to dobrze nadaje się do regulacji w górę genów o silnej ekspresji wyjściowej, ponieważ zwiększa ekspresję z już silnego promotora, podczas gdy konwencjonalne modele transgeniczne opierają się na minimalnych promotorach wirusa. Wreszcie, specyficzność tkankowa, kontrola cyklu komórkowego i warianty splicingu docelowego genu mogą zostać zachowane po regulacji w górę przez nasze podejście, ponieważ zachowuje ono elementy naturalnej regulacji, takie jak wrodzone elementy cis-regulatorowe. Pojawienie się technologii celowania genowego za pośrednictwem CRISPR/Cas znacznie ułatwi zastosowanie tej technologii w różnych systemach modelowych.

Podejścia polegające na wyłączeniu genów (knockout) lub metody transgeniczne zostały&#160;skuteczne środki do badania funkcji genów w modelach zwierzęcych. Jednakże regulacja ekspresji za pomocą tych podejść jest dychotomiczna (włączona/wyłączona), nieczasowa i w związku z tym nie jest w stanie ujawnić pełnego spektrum funkcjonalnego genu. Warunkowy układ Cre/LoxP technologie te umożliwiły czasoprzestrzenną inaktywację lub aktywację funkcji genów, jednak ich dychotomiczny charakter nadal stanowi ograniczenie, przejawiające się m.in. w letalności komórkowej i nieodwracalności tych procesów1,2,3Aby wypełnić tę lukę, opracowano metody warunkowego wyciszania ekspresji genów z wykorzystaniem tetregulowane shRNA lub miRNA4Jednak efekty poza celowe wciąż stanowią problem w przypadku RNAi5 i stanowią wyzwanie w kontekście kontroli in vivo. W ostatnim czasie technologie kontroli transkrypcyjnej za pomocą systemu CRISPR/Cas wprowadziły bardziej wszechstronne podejście do osiągania zarówno zwiększenia, jak i zmniejszenia ekspresji endogennych genów, wykazując swoją użyteczność.6,7Jednakże skuteczność kontroli transkrypcyjnej za pośrednictwem systemu CRISPR/Cas in vivo nie jest jeszcze jasna, a odwracalność represji opartej na KRAB pozostaje kwestią otwartą, ponieważ wykazano, że silna represja wywołana przez KRAB oraz jego białko oddziałujące KAP1 może prowadzić do trwałego wyciszenia genów8,9.
Aby wyeliminować te ograniczenia, opracowaliśmy nowy system regulacji transkrypcyjnej zdolny do warunkowego kontrolowania ekspresji genów endogennych w sposób odwracalny i regulowalny u myszy, wykorzystując zmodyfikowane prokariotyczne binarne systemy regulacji transkrypcyjnej10. Prokariotyczne binarne systemy regulacji transkrypcyjnej z ligandami regulacyjnymi, takimi jak lac i tet, umożliwiły taką odwracalną i regulowalną kontrolę ekspresji11,12,13,14. Jednakże niewystarczająca siła represji obecnych systemów binarnych utrudniała ich powszechne zastosowanie do kontroli ekspresji genów endogennych u ssaków. Opracowaliśmy ulepszony system represji lac, wystarczająco silny do represji genów endogennych, oraz zastosowaliśmy nową strategię kierowania aktywatorów transkrypcyjnych tet bezpośrednio do pokrewnego promotora genu endogennego, aby osiągnąć silną upregulację (Rycina 1)10. Dzięki tej technologii osiągnęliśmy kontrolę ekspresji endogennego genu Dnmt1 w zakresie prawie dwóch rzędów wielkości w sposób regulowalny, indukowalny i odwracalny10. W niniejszym materiale przedstawiamy instrukcje krok po kroku dotyczące jego zastosowania in vivo w odniesieniu do innych genów i organizmów, wykorzystując myszy jako gatunek modelowy.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Przegląd systemu REMOTE-control. Transkrypcja endogennego genu docelowego może być regulowana przy użyciu zmodyfikowanych systemów represora lac i aktywatora tet. Promotor lub intron genu docelowego jest modyfikowany tak, aby zawierać operatory dla silnie wiążącego represora LacIGY i/lub aktywatora rtTA-M2. R oznacza Repron (Repression intron), który zawiera 12 symetrycznych operatorów lac (S) oraz częściowy intron beta-globiny królika. T oznacza operator tet. Represor i/lub aktywator są ekspresowane z promotora specyficznego dla danej tkanki. Ekspresja genu docelowego może być następnie odwracalnie dostrajana do pożądanego poziomu poprzez podanie IPTG (izopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranozydu, antagonisty represora LacIGY) lub doksycykliny (Dox). Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Lee i wsp.10 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Przed rozpoczęciem procedury należy zapoznać się z Tabelą 1, aby zidentyfikować kroki odpowiednie dla pożądanego sposobu kontroli ekspresji genów. Na przykład, aby stworzyć mysz umożliwiającą odwracalną regulację w dół „Gen X”, należy wykonać sekcje 1, 3 i 4 poniższego protokołu. Tabela 1 zawiera również podsumowanie niezbędnych komponentów systemu REMOTE-control.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pożądana zmiana ekspresji</td>
			<td>Wyłącznie represja</td>
			<td>Wyłącznie aktywacja</td>
			<td>Zarówno represja, jak i aktywacja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Istotne sekcje protokołu</td>
			<td>1, 3-4</td>
			<td>2-4</td>
			<td>1-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Konieczność występowania sekwencji sterującej zdalnie w genie docelowym</td>
			<td>Repron (&#34;Intron represyjny&#34;; 12 symetrycznych operatorów lac oraz fragment intronu beta-globiny królika)</td>
			<td>operator(y) Tet</td>
			<td>Repron i operator(y) Tet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lokalizacja sekwencji sterowania zdalnego</td>
			<td>Intron</td>
			<td>Promotor</td>
			<td>Intron &amp;#38; Promotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymagany aktywator/represor dla pożądanego sterowania</td>
			<td>Represor LacIGY</td>
			<td>Aktywator rtTA-M2</td>
			<td>Represor LacIGY i aktywator rtTA-M2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligandy regulacyjne</td>
			<td>IPTG</td>
			<td>Doksycyklina</td>
			<td>IPTG i/lub doksycyklina</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przegląd komponentów REMOTE-control.

<table><tbody><tr><td>B6C3F1/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>100010</td><td>https://www.jax.org/strain/100010</td></tr><tr><td>Cas9 Białko</td><td>PNA Bio</td><td>CP04</td><td>http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE</td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td>Haeussler i in. 2016</td><td></td><td>http://crispor.tefor.net/</td></tr> <tr><td>Dieta myszy zawierająca doksycyklinę</td><td>Envigo</td><td>Różni się w zależności od stężenia</td><td>https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/</td></tr> <tr><td>ENCODE Baza danych</td><td>Uniwersytetu</td><td></td> Stanforda <td>https://www.encodeproject.org/</td></tr> <tr><td>iCre synteza mRNA plazmid (pBBI)</td><td>Addgene</td><td>65795</td><td>https://www.addgene.org/65795/</td></tr> <tr><td>IPTG</td><td>GoldBio</td><td>I2481C</td><td>https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg</td></tr><tr><td>pGL3-Basic</td><td>Promega</td><td>E1751</td><td>https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751</td></tr><tr><td>SVM-BPfinder</td><td>Genomika regulacyjna, Uniwersytet</td><td></td> Pompeu Fabra <td>http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/</td></tr> <tr><td>TiProD: Tkanka promotor specjalny Baza danych Katedra</td><td>Bioinformatyki, UMG,&nbsp; Uniwersytet G&ouml; Ttingen&nbsp;</td><td></td><td>http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de</td></tr><tr><td>UCSC Przeglądarka Genomu Uniwersytet</td><td>Kalifornijski w Santa Cruz</td><td></td><td>https://genome.ucsc.edu/</td></tr></tbody></table>

zastosowanie in vivo systemu remote-control do manipulacji endogenną ekspresją genów

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Tutaj opisujemy protokół implementacji systemu REMOTE-control (Reversible Manipulation off Transcription at Endogenous loci), który pozwala na odwracalną i przestrajalną kontrolę ekspresji endogennego genu będącego przedmiotem zainteresowania w żywych systemach modelowych. System REMOTE-control wykorzystuje wzmocnione systemy tłumienia lac i aktywacji tet w celu obniżenia lub zwiększenia regulacji docelowego genu w ramach jednego systemu biologicznego. Ścisłą represję można osiągnąć dzięki miejscom wiązania represorów elastycznie zlokalizowanym daleko za miejscem rozpoczęcia transkrypcji poprzez hamowanie wydłużania transkrypcji. Solidną regulację w górę można osiągnąć poprzez wzmocnienie transkrypcji endogennego genu poprzez skierowanie aktywatorów transkrypcji tet na pokrewny promotor. Ta odwracalna i dostrajalna kontrola ekspresji może być wielokrotnie stosowana i wycofywana w organizmach. Siła działania i wszechstronność systemu, jak wykazano w przypadku endogennego Dnmt1, pozwoli na bardziej precyzyjne analizy funkcjonalne in vivo, umożliwiając badanie funkcji genów na różnych poziomach ekspresji oraz testując odwracalność fenotypu.

Zdolność supresyjna systemu REMOTE-control została dotychczas zademonstrowana w dwóch różnych podejściach. W pierwszym podejściu miejsca wiązania represora lac wstawiono w endogenny promotor genu Dnmt1. W drugim podejściu, rekomendowanym w niniejszym protokole, miejsca wiązania represora wstawiono do intronu położonego w regionie downstream, aby uniknąć potencjalnego ryzyka wpływu insercji na funkcję promotora, a tym samym uprościć zastosowanie systemu REMOTE-control. Oba podejścia doprowadziły do skutecznej supresji (Rysunek 2A,B oraz Rysunek 3A-C)10. Ekspresja Dnmt1 została zredukowana do 15% poziomu nieuregulowanego przy zastosowaniu podejścia opartego na promotorze (Rysunek 2A). Ta silna supresja została odwrócona w sposób zależny od dawki poprzez podawanie myszom różnych ilości IPTG (Rysunek 2A). Obserwowana supresja Dnmt1 została potwierdzona na poziomie białka za pomocą immunobarwienia (Rysunek 2B). Nie zaobserwowano żadnej zauważalnej różnicy w ekspresji Dnmt1 pomiędzy myszami Dnmt1+/+ a Dnmt1LO/LO, co potwierdza, że insercja operatora lac&#160;nie zaburzyła prawidłowej funkcji promotora10. Podejście oparte na intronie pozwoliło osiągnąć ponad 90% supresji dzięki operatorom zlokalizowanym kilka kilobaz downstream od miejsca rozpoczęcia transkrypcji, poprzez osłabienie elongacji transkrypcji (Rysunek 3A, B)10. Podejście oparte na intronie zostało następnie zwalidowane na siedmiu dodatkowych silnych promotorach (Rysunek 3C). W każdym przypadku uzyskano silną supresję dla wszystkich badanych promotorów. Nie zaobserwowano korelacji pomiędzy resztkowymi poziomami ekspresji a siłą promotorów, co sugeruje, że zdolność supresyjna naszego systemu opartego na intronie przewyższa potencjał transkrypcyjny wszystkich przetestowanych silnych promotorów (Rysunek 3C).
Zdolność systemu REMOTE-control do aktywacji in vivo została wykazana również na przykładzie genu Dnmt1. Do promotora Dnmt1 wprowadziliśmy dwie kopie operatora tet wraz z sekwencjami operatora lac, aby umożliwić zarówno nadróbkowanie (upregulację), jak i wyciszenie (downregulację) w zależności od obecności konkretnego białka efektorowego>. Silna aktywacja i wyciszenie ekspresji Dnmt1, obejmujące prawie dwa rzędy wielkości (od 10% do 650%), zostały osiągnięte w komórkach ESC zawierających zmodyfikowany endogenny allel Dnmt1 (Dnmt1LGT) (Rycyna 4A)10. Obie formy regulacji były w pełni odwracalne i indukowalne odpowiednio przez traktowanie IPTG i Dox (Rycyna 4A). Następnie wprowadziliśmy modyfikację Dnmt1LGT do linii zarodkowej myszy, aby przetestować zdolność systemu REMOTE-control do aktywacji in vivo. Silna upregulacja Dnmt1 została zaobserwowana w wątrobie, śledzionie i nerkach, podczas gdy w sercu nie stwierdzono wykrywalnej aktywacji (Rycyna 4B)7. Podłożem tej obserwacji może być zależny od cyklu komórkowego wzorzec ekspresji Dnmt1 oraz niewielka liczba komórek proliferujących w sercu10,56. Pozostaje kwestią otwartą, czy ograniczenie to można pokonać poprzez zwiększenie poziomu ekspresji aktywatora lub liczby jego miejsc wiązania.
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Represja Dnmt1 in vivo przez represor LacIGY. (A) Myszy z operatorami lac (LO) wstawionymi w promotor Dnmt1 , z ekspresją lub bez ekspresji LacIGY, poddano działaniu różnych dawek IPTG. Analiza qRT-PCR ekspresji Dnmt1 wykazuje zależne od dawki odwrócenie represji Dnmt1 in vivo po zastosowaniu IPTG. Każdy słupek reprezentuje dane z innej myszy. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM (n = 3). (B) Immunobarwienie białka Dnmt1 w kryptach jelita grubego myszy, którym przez 3 tygodnie podawano wodę pitną z 160 mM IPTG lub bez IPTG. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Lee i wsp.10 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Represja różnych promotorów in vivo i in vitro za pomocą systemu REMOTE-control. (A) Wczesna wersja sekwencji Repron (R*) została wprowadzona do intronu poniżej promotora Villin u myszy transgenicznej Villin-mKate2 (VilmKate2). Przedstawiono analizę qRT-PCR ekspresji mKate2 w jelicie cienkim myszy z represorem LacIGY lub bez niego. Każdy słupek reprezentuje dane z innej myszy. (B) Konfokalne obrazy mKate2 jelita cienkiego z ekspresją LacIGY i bez niej. (C) Sześć symetrycznych operatorów lac (S) wprowadzono pomiędzy różne promotory a reporter lukyferazy. Reportery (50 ng/dołek w płytce 96-dołkowej) oraz plazmidy represora wprowadzono przejściowo do komórek NIH/3T3 w stosunku molowym 1:1. Wartości lukyferazy oceniono 24 h po transfekcji. Te dane in vitro reprezentują procent ekspresji lukyferazy w komórkach wykazujących ekspresję LacIGY w stosunku do tych wykazujących ekspresję niefunkcjonalnego LacI (NFlacI). Do określenia istotności statystycznej zastosowano testy T. Dane reprezentują średnią ± SEM (n = 3). *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Lee et al.10 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig4.jpg" /> 
Rycina 4: Hamowanie i/lub zwiększanie ekspresji Dnmt1 in vitro i in vivo. (A) Kompletny system REMOTE-control został zaprojektowany w hodowlanych ESC za pomocą metod targetowania genów i elektroporacji. Maksymalna represja ekspresji Dnmt1 została osiągnięta bez podawania czynników, natomiast maksymalna aktywacja nastąpiła po zastosowaniu zarówno IPTG, jak i Dox. Dane przedstawiają średnią ± SEM (n = 3). *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 (testy t Welcha). (B) Aktywacja Dnmt1 in vivo za pomocą systemu REMOTE-control, wykazana poprzez immunobarwienie białka Dnmt1 w różnych tkankach myszy REMOTE-control. Allel LGT reprezentuje modyfikację promotora Dnmt1 w celu wprowadzenia operatora lac oraz miejsc wiązania aktywatora tet. Myszy otrzymywały standardową dietę lub dietę zawierającą Dox (5000 mg/kg hydrochlorчку doksycykliny) przez jeden miesiąc. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Lee et al.10 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina uzupełniająca 1" src="/files/ftp_upload/59235/59235supfig1.jpg" /> 
Rycina uzupełniająca 1: Przykład insercji landing pad do intronu 1 genu Dnmt1 u myszy. (A) Schemat matrycy DNA dla insercji landing pad, zaadaptowany z Quadros et al. (2015)31. Heterotypowe miejsca loxP, JT15 i Lox2272, są oddzielone krótką sekwencją łącznikową (sp) i flankowane po obu stronach przez 60-bp DNA homologicznego do docelowego regionu genomowego. (B) Przykładowa matryca DNA do insercji landing pad do intronu Dnmt1 z wykorzystaniem następującego sgRNA: CTAGTACCACTCCTGTACCG (celującego w nić odwrotną). Wybrany region intronowy został wyznaczony bioinformatycznie w kroku 1.1, a sgRNA zidentyfikowano za pomocą CRISPOR29. (C) Przykład projektu starterów PCR do oceny insercji landing pad. Startery PCR zaprojektowano poza ramionami homologii matrycy, aby potwierdzić integrację z endogennym genem Dnmt1. Amplikon PCR typu dzikiego ma długość 213 bp; po insercji jego długość wzrasta do 291 bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235supfig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół przedstawia kroki potrzebne do wygenerowania modelowego systemu, w którym transkrypcja interesującego nas endogennego genu może być warunkowo kontrolowana u żywych zwierząt lub komórek za pomocą ulepszonych systemów represora lac i/lub aktywatora tet.

Zastosowanie in vivo systemu REMOTE-control do manipulacji endogenną ekspresją genów

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Znaczenie naszej metody polega na jej wszechstronności i sile działania. Pozwala to naukowcom na uzyskanie solidnej kontroli nad endogenną ekspresją genów w sposób, który był trudny do osiągnięcia przy użyciu istniejących metod. Pozwala naukowcom badać funkcję genu na różnych poziomach ekspresji i w sposób czasoprzestrzenny.Tym samym pozwala na testowanie odwracalności fenotypu, co jest przydatne podczas badania genów związanych z chorobą. Aby osiągnąć represję, docelowy gen intron jest modyfikowany tak, aby zawierał repron R, który zawiera 12 symetrycznych operatorów Lac. Kiedy represor LacIGY ulega ekspresji z pożądanego promotora specyficznego dla tkanki, gen docelowy jest represjonowany.Represję genu docelowego można odwrócić lub dostosować do pożądanego poziomu ekspresji poprzez podanie IPTG, antagonisty represora LacIGY. Aby osiągnąć regulację w górę, docelowy promotor genu jest modyfikowany tak, aby zawierał cztery lub więcej operatorów Tat, T, jako miejsca wiązania dla aktywatorów rtTA-M2. Gdy aktywator ulega ekspresji z pożądanego swoistego tkankowo promotora w obecności doksycykliny, indukowana jest regulacja w górę genu docelowego.Regulacja w górę genu docelowego może być odwrócona lub dostosowana do pożądanego poziomu ekspresji poprzez wycofanie lub zmianę stężenia doksycykliny. Aby osiągnąć zarówno represję, jak i aktywację, można połączyć systemy represora Lac i aktywatora Tat. Aby zmodyfikować gen będący przedmiotem zainteresowania w celu represji, należy zidentyfikować obojętny transkrypcyjnie intron w kierunku pięciu głównych końców genu będącego przedmiotem zainteresowania w celu insercji sekwencji repronu.Aby uzyskać sekwencję genomową dla interesującego nas genu, przejdź do przeglądarki genomu UCSC i wybierz najnowszą wersję roboczą genomu myszy na karcie genomy. Wprowadź nazwę lub symbol interesującego genu w pasku wyszukiwania, aby wyświetlić transkrypcje genu, a następnie kliknij przycisk Przejdź. Następnie wybierz żądany wariant transkryptu dla interesującego nas genu i kliknij symbol genu obok interesującego nas wariantu transkryptu.Następnie, pod banerem sekwencji i linków do narzędzi i baz danych, kliknij link sekwencja genomowa. W przypadku opcji regionu pobierania sekwencji wybierz tylko eksony, introny i domyślny jeden rekord FASTA na gen. Aby uzyskać opcje formatowania sekwencyjnego, wybierz eksony wielkimi literami, wszystko inne małymi literami, a maska powtarza się do N. Następnie kliknij przycisk Prześlij.Na koniec zapisz tę sekwencję, zachowując formatowanie wielkich i małych liter w dokumencie lub programie, do którego można dodawać adnotacje. Aby uniknąć przerywania wysp CpG, wybierz opcję pokaż dla ścieżki wysp CpG pod banerem wyrażania i regulacji przeglądarki genomu UCSC i kliknij przycisk odśwież. Powiększając pięć pierwszych intronów, kliknij na każdą wyspę CpG pokazaną na zielono i wybierz widok DNA dla tej funkcji.Po wybraniu maski powtarza się do N, kliknij pobierz DNA, aby uzyskać sekwencję wysp CpG. Na koniec nałóż te sekwencje na oryginalny plik sekwencji i dodaj je jako regiony introniczne, których należy unikać. Aby uniknąć regionów intronicznych z sygnaturami wzmacniacza w tkankach będących przedmiotem zainteresowania, przejdź do bazy danych ENCODE i wybierz ikonę eksperymentów.Jako typ testu wybierz ChiP-seq lub DNase-seq i wypełnij pozostałe kategorie zgodnie z komórkami, które mają zostać zaprojektowane. Po wybraniu funkcji wybierz piktogram po lewej stronie w kolorze niebieskim, dla którego wyświetl wyniki jako listę. Następnie wybierz zestawy danych dla celów monometylacji h3k4, acetylacji h3k27, DNazy 1 i CTCF, które najbardziej pasowały do komórek, które mają być zaprojektowane.W każdym odpowiednim zestawie danych przewiń do sekcji pliku, sprawdź, czy wybrano mm10 i UCSC, a następnie kliknij przycisk wizualizacji. Teraz w przeglądarce genomu UCSC powiększ pięć pierwszych intronów i kliknij każdy pik na oznaczonych ścieżkach pików. Uzyskaj sekwencję DNA dla każdego regionu piku, klikając współrzędne chromosomalne dla każdego piku.W menu rozwijanym widoku wybierz DNA i kliknij maskę powtarza się na N.Na koniec nałóż te sekwencje na oryginalny plik sekwencji i dodaj je jako regiony introniczne, których należy unikać. Aby zidentyfikować sgRNA w pozostałych regionach intronowych o wysokiej swoistości i przewidywanych wynikach wydajności, przejdź do wybranego narzędzia do projektowania sgRNA online, takiego jak CRISPOR. Wprowadź sekwencję interesującego nas regionu intronowego, określ odpowiedni genom referencyjny i wybierz żądany motyw sąsiadujący z protospacerem.Następnie kliknij przycisk Prześlij. Następnie posortuj przewidywane sgRNA według wyniku swoistości i wybierz jeden lub więcej sgRNA, które również mają wysoki przewidywany wynik wydajności. Na koniec zaprojektuj matrycę DNA zawierającą sekwencję lądowiska PITT, otoczoną z obu stron ramionami homologii 60 zasad, które odpowiadają miejscu cięcia sgRNA.W celu odwrócenia represji genu docelowego, należy podać IPTG w wodzie pitnej myszy wyhodowanych w homozygocie ze zmodyfikowanym allelem będącym przedmiotem zainteresowania, całkowicie rozpuszczając pożądaną ilość IPTG w sterylnej wodzie destylowanej w dniu podania. Owiń butelkę folią i podawaj wodę IPTG w butelce zabezpieczonej przed światłem myszom o odpowiednim genotypie i grupie kontrolnej przez co najmniej tydzień. Przejdź do analizy ekspresji interesującego genu w tkance docelowej.Aby indukować regulację genu w górę, podawaj doksycyklinę w diecie przez tydzień i przystąp do analizy ekspresji interesującego genu w tkance docelowej. Analiza qRT PCR wykazała, że ekspresja DNMT1 została stłumiona do 15% nieregulowanych poziomów przy użyciu podejścia opartego na promotorze. Represja została odwrócona w sposób zależny od dawki poprzez leczenie myszy różnymi ilościami IPTG.Zaobserwowana represja DNMT1 i odwrócenie represji DNMT1 przez leczenie IPTG została zwalidowana na poziomie białka przez barwienie immunologiczne. Analiza qRT PCR ekspresji mKate2 wykazała, że podejście oparte na intronie osiągnęło ponad 90% represję od operatorów znajdujących się kilka kilozasad poniżej miejsca rozpoczęcia transkrypcji poprzez osłabienie wydłużenia transkrypcji. Konfokalne obrazy ekspresji mKate2 w małej intensywności myszy z represorem LacIGY lub bez niego potwierdziły podejście oparte na intronie.Silną regulację w górę i w dół ekspresji DNMT1 osiągnięto w embrionalnych komórkach macierzystych zawierających zmodyfikowany endogenny allel DNMT1 z sekwencjami operatora Tat i Lac. Obie regulacje były w pełni odwracalne i indukowane przez leczenie IPTG i Dox. Silną regulację w górę DNMT1 zaobserwowano z wątroby, śledziony i nerek.Nie zaobserwowano jednak wykrywalnej regulacji w górę w sercu, co sugeruje, że zależny od cyklu komórkowego wzorzec ekspresji DMNT1 i niedobór komórek proliferacyjnych w sercu mogą leżeć u podstaw tej obserwacji. Badanie funkcji in vivo krytycznego genu poprzez manipulowanie jego ekspresją często było trudne ze względu na śmiertelność. Nasza metoda pozwoliła nam przezwyciężyć fenotyp letalny dla interesującego nas genu i umożliwiła nam zbadanie jego roli w nowotworach in vivo.Technologia ta umożliwi również badanie innych istotnych genów, które były trudne do zbadania.

in-vivo-application-remote-control-system-for-manipulation-endogenous

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film demonstruje system ekspresji genów tetracykliny lub Tet-On w modelu mysim. W obecności doksycykliny, pochodnej tetracykliny, system Tet-On składający się z białka transaktywatora kontrolowanego przez odwróconą tetracyklinę ulega aktywacji i ulega ekspresji interesującego genu.

Indukowalna regulacyjna ekspresja genów oparta na systemie Tet-On in vivo: indukowany tetracykliną system ekspresji genów do aktywacji transkrypcji genu docelowego w modelu mysim

Ekspresja ektopowa to jedna z technik wyjaśniających rolę mikroRNA w rozwoju mózgu. Jednak celowanie w określone obszary za pomocą elektroporacji in ovo jest trudne. Tutaj pokazujemy skuteczny sposób selektywnego elektroportowania brzusznych i grzbietowych obszarów śródmózgowia.

In ovo Ekspresja mikroRNA w brzusznym śródmózgowiu piskląt

To badanie pokazuje przeprogramowanie komórek somatycznych w kierunku pluripotencji in vivo bez generowania potworniaków. Zastosowaliśmy hydrodynamiczne wstrzyknięcie do żyły ogonowej plazmidowego DNA kodującego czynniki Yamanka, aby indukować przeprogramowanie in vivo dorosłych hepatocytów na komórki o zwiększonej pluripotencji.

In vivo (in vivo) Przeprogramowanie dorosłych komórek somatycznych na pluripotencję przez nadekspresję czynników Yamanaka

System CRISPR/Cas9 oferuje potencjał, aby uczynić ukierunkowaną edycję genomu dostępną i przystępną cenowo dla społeczności naukowej. Protokół ten ma na celu zademonstrowanie, jak tworzyć wirusy, które znokautują interesujący nas gen za pomocą systemu CRISPR/Cas9, a następnie wstrzykną je stereotaktycznie do mózgu dorosłej myszy.

Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

W tym manuskrypcie opisana jest metoda przygotowania rekombinowanych wektorów wirusa 9 (rAAV9) do manipulowania ekspresją genów w sercu myszy.

Przygotowanie rAAV9 do nadekspresji lub knockdown genów w sercach myszy

Badanie kanałów jonowych za pomocą heterologicznie wyrażającego systemu stało się podstawową techniką w badaniach biomedycznych. W tym manuskrypcie przedstawiamy efektywną czasowo metodę osiągania ściśle kontrolowanej ekspresji kanału jonowego poprzez przeprowadzanie transfekcji przejściowej pod kontrolą indukowalnego promotora.

Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Hydrodynamiczne wstrzykiwanie wektorów integracji opartych na transpozonach do żyły ogonowej umożliwia stabilną transfekcję mysich hepatocytów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy praktyczny protokół dla systemów transfekcji, który umożliwia długotrwałą konstytutywną ekspresję pojedynczego transgenu lub połączoną konstytutywną i indukowaną doksycykliną ekspresję transgenu lub miR-shRNA w wątrobie.

Konstytutywne i indukowalne systemy do genetycznej modyfikacji in vivo mysich hepatocytów za pomocą hydrodynamicznej iniekcji żyły ogonowej

Tutaj prezentujemy protokół manipulacji genami specyficznymi dla serca u myszy. W znieczuleniu serca myszy zostały uzewnętrznione przez czwartą przestrzeń międzyżebrową. Następnie adenowirusy kodujące określone geny wstrzyknięto za pomocą strzykawki do mięśnia sercowego, a następnie dokonano pomiaru ekspresji białka za pomocą obrazowania in vivo i analizy Western blot.

Prosta i skuteczna metoda manipulacji genami in vivo specyficznymi dla serca poprzez wstrzyknięcie do mięśnia sercowego u myszy

Niezawodna kontrola komórek ssaków reagujących na światło wymaga standaryzacji metod optogenetycznych. Aby osiągnąć ten cel, badanie to nakreśla linię budowy obwodów genowych, inżynierii komórkowej, obsługi sprzętu optogenetycznego i testów weryfikacyjnych w celu standaryzacji badania ekspresji genów indukowanej światłem przy użyciu optogenetycznego obwodu genowego o ujemnym sprzężeniu zwrotnym jako studium przypadku.

Niezawodna inżynieria i kontrola stabilnych optogenetycznych obwodów genowych w komórkach ssaków

Ten protokół opisuje nowatorski test przejściowy oparty na rAAV z funkcją wzmacniania i opisywania. Ten test może być wykorzystany do wywołania ekspresji in vivo w mózgu myszy.

Wdrożenie AAV konstruktów ekspresyjnych opartych na wzmacniaczu in vivo w mózgu myszy

Badanie opisuje metodę eksperymentów o wysokiej przepustowości z wykorzystą matrycę LED drukowaną w 3D, aby zoptymalizować ekspresję genów indukowanych światłem w HEK293T komórkach.

Szybka optymalizacja systemu indukowalnego światłem do kontroli ekspresji genów ssaków

Poznaj metodę REMOTE-control do warunkowej regulacji ekspresji endogennych genów in vivo przy użyciu systemów lac i tet. Technika umożliwia odwracalną represję i aktywację genów w tkankach zwierząt.

Zastosowanie in vivo systemu REMOTE-control do manipulacji endogenną ekspresją genów

Przeglądaj więcej filmów