Zastosowanie in vivo systemu REMOTE-control do manipulacji endogenną ekspresją genów

Znaczenie naszej metody polega na jej wszechstronności i sile działania. Pozwala to naukowcom na uzyskanie solidnej kontroli nad endogenną ekspresją genów w sposób, który był trudny do osiągnięcia przy użyciu istniejących metod. Pozwala naukowcom badać funkcję genu na różnych poziomach ekspresji i w sposób czasoprzestrzenny.

Tym samym pozwala na testowanie odwracalności fenotypu, co jest przydatne podczas badania genów związanych z chorobą. Aby osiągnąć represję, docelowy gen intron jest modyfikowany tak, aby zawierał repron R, który zawiera 12 symetrycznych operatorów Lac. Kiedy represor LacIGY ulega ekspresji z pożądanego promotora specyficznego dla tkanki, gen docelowy jest represjonowany.

Represję genu docelowego można odwrócić lub dostosować do pożądanego poziomu ekspresji poprzez podanie IPTG, antagonisty represora LacIGY. Aby osiągnąć regulację w górę, docelowy promotor genu jest modyfikowany tak, aby zawierał cztery lub więcej operatorów Tat, T, jako miejsca wiązania dla aktywatorów rtTA-M2. Gdy aktywator ulega ekspresji z pożądanego swoistego tkankowo promotora w obecności doksycykliny, indukowana jest regulacja w górę genu docelowego.

Regulacja w górę genu docelowego może być odwrócona lub dostosowana do pożądanego poziomu ekspresji poprzez wycofanie lub zmianę stężenia doksycykliny. Aby osiągnąć zarówno represję, jak i aktywację, można połączyć systemy represora Lac i aktywatora Tat. Aby zmodyfikować gen będący przedmiotem zainteresowania w celu represji, należy zidentyfikować obojętny transkrypcyjnie intron w kierunku pięciu głównych końców genu będącego przedmiotem zainteresowania w celu insercji sekwencji repronu.

Aby uzyskać sekwencję genomową dla interesującego nas genu, przejdź do przeglądarki genomu UCSC i wybierz najnowszą wersję roboczą genomu myszy na karcie genomy. Wprowadź nazwę lub symbol interesującego genu w pasku wyszukiwania, aby wyświetlić transkrypcje genu, a następnie kliknij przycisk Przejdź. Następnie wybierz żądany wariant transkryptu dla interesującego nas genu i kliknij symbol genu obok interesującego nas wariantu transkryptu.

Następnie, pod banerem sekwencji i linków do narzędzi i baz danych, kliknij link sekwencja genomowa. W przypadku opcji regionu pobierania sekwencji wybierz tylko eksony, introny i domyślny jeden rekord FASTA na gen. Aby uzyskać opcje formatowania sekwencyjnego, wybierz eksony wielkimi literami, wszystko inne małymi literami, a maska powtarza się do N. Następnie kliknij przycisk Prześlij.

Na koniec zapisz tę sekwencję, zachowując formatowanie wielkich i małych liter w dokumencie lub programie, do którego można dodawać adnotacje. Aby uniknąć przerywania wysp CpG, wybierz opcję pokaż dla ścieżki wysp CpG pod banerem wyrażania i regulacji przeglądarki genomu UCSC i kliknij przycisk odśwież. Powiększając pięć pierwszych intronów, kliknij na każdą wyspę CpG pokazaną na zielono i wybierz widok DNA dla tej funkcji.

Po wybraniu maski powtarza się do N, kliknij pobierz DNA, aby uzyskać sekwencję wysp CpG. Na koniec nałóż te sekwencje na oryginalny plik sekwencji i dodaj je jako regiony introniczne, których należy unikać. Aby uniknąć regionów intronicznych z sygnaturami wzmacniacza w tkankach będących przedmiotem zainteresowania, przejdź do bazy danych ENCODE i wybierz ikonę eksperymentów.

Jako typ testu wybierz ChiP-seq lub DNase-seq i wypełnij pozostałe kategorie zgodnie z komórkami, które mają zostać zaprojektowane. Po wybraniu funkcji wybierz piktogram po lewej stronie w kolorze niebieskim, dla którego wyświetl wyniki jako listę. Następnie wybierz zestawy danych dla celów monometylacji h3k4, acetylacji h3k27, DNazy 1 i CTCF, które najbardziej pasowały do komórek, które mają być zaprojektowane.

W każdym odpowiednim zestawie danych przewiń do sekcji pliku, sprawdź, czy wybrano mm10 i UCSC, a następnie kliknij przycisk wizualizacji. Teraz w przeglądarce genomu UCSC powiększ pięć pierwszych intronów i kliknij każdy pik na oznaczonych ścieżkach pików. Uzyskaj sekwencję DNA dla każdego regionu piku, klikając współrzędne chromosomalne dla każdego piku.

W menu rozwijanym widoku wybierz DNA i kliknij maskę powtarza się na N.Na koniec nałóż te sekwencje na oryginalny plik sekwencji i dodaj je jako regiony introniczne, których należy unikać. Aby zidentyfikować sgRNA w pozostałych regionach intronowych o wysokiej swoistości i przewidywanych wynikach wydajności, przejdź do wybranego narzędzia do projektowania sgRNA online, takiego jak CRISPOR. Wprowadź sekwencję interesującego nas regionu intronowego, określ odpowiedni genom referencyjny i wybierz żądany motyw sąsiadujący z protospacerem.

Następnie kliknij przycisk Prześlij. Następnie posortuj przewidywane sgRNA według wyniku swoistości i wybierz jeden lub więcej sgRNA, które również mają wysoki przewidywany wynik wydajności. Na koniec zaprojektuj matrycę DNA zawierającą sekwencję lądowiska PITT, otoczoną z obu stron ramionami homologii 60 zasad, które odpowiadają miejscu cięcia sgRNA.

W celu odwrócenia represji genu docelowego, należy podać IPTG w wodzie pitnej myszy wyhodowanych w homozygocie ze zmodyfikowanym allelem będącym przedmiotem zainteresowania, całkowicie rozpuszczając pożądaną ilość IPTG w sterylnej wodzie destylowanej w dniu podania. Owiń butelkę folią i podawaj wodę IPTG w butelce zabezpieczonej przed światłem myszom o odpowiednim genotypie i grupie kontrolnej przez co najmniej tydzień. Przejdź do analizy ekspresji interesującego genu w tkance docelowej.

Aby indukować regulację genu w górę, podawaj doksycyklinę w diecie przez tydzień i przystąp do analizy ekspresji interesującego genu w tkance docelowej. Analiza qRT PCR wykazała, że ekspresja DNMT1 została stłumiona do 15% nieregulowanych poziomów przy użyciu podejścia opartego na promotorze. Represja została odwrócona w sposób zależny od dawki poprzez leczenie myszy różnymi ilościami IPTG.

Zaobserwowana represja DNMT1 i odwrócenie represji DNMT1 przez leczenie IPTG została zwalidowana na poziomie białka przez barwienie immunologiczne. Analiza qRT PCR ekspresji mKate2 wykazała, że podejście oparte na intronie osiągnęło ponad 90% represję od operatorów znajdujących się kilka kilozasad poniżej miejsca rozpoczęcia transkrypcji poprzez osłabienie wydłużenia transkrypcji. Konfokalne obrazy ekspresji mKate2 w małej intensywności myszy z represorem LacIGY lub bez niego potwierdziły podejście oparte na intronie.

Silną regulację w górę i w dół ekspresji DNMT1 osiągnięto w embrionalnych komórkach macierzystych zawierających zmodyfikowany endogenny allel DNMT1 z sekwencjami operatora Tat i Lac. Obie regulacje były w pełni odwracalne i indukowane przez leczenie IPTG i Dox. Silną regulację w górę DNMT1 zaobserwowano z wątroby, śledziony i nerek.

Nie zaobserwowano jednak wykrywalnej regulacji w górę w sercu, co sugeruje, że zależny od cyklu komórkowego wzorzec ekspresji DMNT1 i niedobór komórek proliferacyjnych w sercu mogą leżeć u podstaw tej obserwacji. Badanie funkcji in vivo krytycznego genu poprzez manipulowanie jego ekspresją często było trudne ze względu na śmiertelność. Nasza metoda pozwoliła nam przezwyciężyć fenotyp letalny dla interesującego nas genu i umożliwiła nam zbadanie jego roli w nowotworach in vivo.

Technologia ta umożliwi również badanie innych istotnych genów, które były trudne do zbadania.