Niezawodna inżynieria i kontrola stabilnych optogenetycznych obwodów genowych w komórkach ssaków

Standaryzowany protokół optogenetyczny jest przeznaczony dla laboratoriów zainteresowanych wykorzystaniem światła jako bodźca do kontrolowania właściwości komórkowych w zmodyfikowanych systemach komórkowych ssaków. Protokół ten jest łatwy do wdrożenia w laboratoriach, które w przeciwnym razie nie są zaznajomione z optogenetyką i zapewnia metody precyzyjnej przestrzennej kontroli czasowej zaprojektowanych systemów biologicznych. Metoda ta ma szeroki zakres zastosowań w określonych obszarach badawczych, w których informacje czasoprzestrzenne mogą być ważne, w tym w biologii nowotworów, biologii systemowej i różnicowaniu tkanek.

Na początek wybierz składniki genetyczne, które mają zostać połączone, powiązać się w pojedynczy obwód genu lub plazmid. Na przykład miejsca integracji DNA ssaków, elementy reagujące na światło lub funkcjonalne geny. Po zebraniu i zbadaniu wszystkich niezbędnych cech, takich jak kodony start, sekwencje regulatorowe lub translowane, użyj dowolnego oprogramowania do inżynierii genetycznej i klonowania molekularnego, opisz i przechowuj sekwencje DNA do późniejszego wykorzystania i jako odniesienie.

Weryfikuj obliczeniowo startery pod kątem budowy plazmidu za pomocą wbudowanych funkcji oprogramowania do klonowania molekularnego, na przykład wyrównania sekwencji. Aby wygenerować stabilną linię komórkową, należy przeprowadzić transfekcję obwodów genów projektowych i pożądanych komórek za pomocą liposomu mieszaniny DNA obwodu genu z odpowiednią rekombinazą. Po tym, jak komórki zlewają się w 80 do 100%, zamroź komórki w mieszance 45% starych pożywek, 45% świeżych pożywek i 10% DMSO.

Przenieś pozostałe komórki do sterylnej probówki i przeprowadź sortowanie pojedynczych komórek w celu wyizolowania komórek monoklonalnych na 96-dołkowej płytce. Około dwa do trzech tygodni po sortowaniu monoklonalnym studzienki w 96-dołkowej płytce powinny mieć ogniska. Po osiągnięciu 50 do 60% konfluencji podziel komórki na 12-dołkową płytkę.

Dodaj oprogramowanie układowe do zmontowanego obwodu LPA za pomocą programatora mikrokontrolera. Następnie połącz wydrukowane w 3D części w zmontowanej płytce drukowanej za pomocą płyty montażowej, płytki drukowanej, przekładki LED, adaptera płytki, płytki 24-dołkowej, pokrywy płyty, mocujących, nakrętek motylkowych i elementów do układania w stosy. Aby rozpocząć eksperyment optogenetyczny, należy skorzystać z oprogramowania Iris dostępnego na stronie Tabor Lab, aby zaprogramować kartę SD dla LPA i zbadać odpowiednie warunki oświetleniowe.

Następnie wprowadź wartości intensywności za pomocą powtórzeń technicznych dla żądanego konspektu eksperymentu. Dodaj około 75 000 komórek na studzienkę na 24-dołkową czarną płytkę o łącznej objętości 500 mikrolitrów, a następnie umieść komórki w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla, aby mogły osiąść przez dwie do sześciu godzin. Po przeniesieniu komórek do okapu do hodowli tkankowej pod koniec inkubacji, zdejmij plastikową pokrywkę i dodaj samoprzylepny pasek folii do górnej części płytki, aby zminimalizować przenoszenie światła między studzienkami, tak aby światło mogło przedostać się tylko przez diodę LED znajdującą się na dnie studzienki.

Umieść płytkę w dopasowanych częściach 3D LPA, a następnie przykryj płytkę wydrukowaną w 3D pokrywą LPA, która pasuje do urządzenia w każdym rogu. Podłącz urządzenie do źródła zasilania i naciśnij przycisk resetowania na urządzeniu LPA, aby upewnić się, że zaktualizowane ustawienia eksperymentu LPA zostały zastosowane i inkubuj komórki. Po inkubacji, wewnątrz kaptura do hodowli tkankowej, usuń pasek folii z płytki i pozostaw płytkę na jedną do dwóch minut, aby zapobiec tworzeniu się kondensatu na plastikowej pokrywie.

Następnie umieść oryginalną plastikową pokrywkę z powrotem na płytce i zobrazuj komórki za pomocą odpowiedniego mikroskopu kontrastowego lub fluorescencyjnego. Po 24 do 72 godzinach od indukcji, po której następuje trypsynizacja, przenieś całą zawartość każdej studzienki o objętości około 500 mikrolitrów do oznakowanych probówek wyposażonych w sitko do komórek. Następnie, używając odpowiedniego oprogramowania przyrządu do cytometrii przepływowej, utwórz bramkę rozpraszania do przodu i z boku, aby uchwycić pojedyncze komórki o odpowiednim rozmiarze i ziarnistości, aby wykluczyć zanieczyszczenia i grudki komórkowe.

Po ustawieniu bramki przechwyć około 10 000 komórek za pomocą odpowiedniej bramki i dostosuj liczbę komórek w zależności od wymaganej ilości danych komórkowych i powtórz przechwytywanie komórek eksperymentalnych w każdej probówce. Po indukcji i trypsynizacji przenieś całą zawartość każdej studzienki o pojemności około 500 mikrolitrów do oznaczonych probówek. Odwirowywać komórki przez pięć minut w temperaturze 400 razy G. Po odrzuceniu supernatantu przenieść próbki do dygestorium chemicznego.

Ponownie zawiesić komórki w 750 do 1 000 mikrolitrów 4% PFA rozcieńczonego w PBS i kilkakrotnie pipetować w górę iw dół, aby rozbić grudki komórek. Po 15 minutach inkubacji dodać 750 do 1 000 mikrolitrów PBS i ponownie kilkakrotnie pipetować w górę iw dół, a następnie granulować komórki przez pięć minut w temperaturze 400 razy G w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu przenieść próbki do dygestorium chemicznego i ponownie zawiesić komórki w 750 do 1 000 mikrolitrów lodowatego metanolu, jak pokazano, i pozostawić komórki na 30 minut w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Po inkubacji dodać 750 do 1 000 mikrolitrów PBS, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół. Następnie, po odwirowaniu komórek przez pięć minut w temperaturze 400 razy G, wyrzucić supernatant i przenieść próbki do dygestorium chemicznego. Zawiesić komórki w 100 mikrolitrach lub innym odpowiednim rozcieńczeniu znakowanego przeciwciała pierwszorzędowego i pipetować w górę iw dół sześć do ośmiu razy, a następnie inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Następnie kilkakrotnie dodaj 750 do 1 000 mikrolitrów buforu inkubacyjnego i roztworu pipetowanego w górę iw dół, a następnie odwiruj komórki przez pięć minut przy 400 razy G. Następnie ponownie zawieś komórki w 500 mikrolitrach PBS i rozbij grudki, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół. Przenieść całą zawartość każdej probówki do oznakowanych probówek z sitkami do komórek. Przynieś komórki do odpowiednich przyrządów cytometrii przepływowej z laserami o odpowiednich długościach fal.

Dla urządzeń została przeprowadzona kalibracja optyczna. Na podstawie uzyskanego obrazu obliczono wartości kompensacji dla diody LED, odjęto sygnał tła i wydedukowano intensywność pikseli. Współczynnik zmienności był minimalny między 96 odwiertami.

Oprogramowanie kalibracyjne zademonstrowało zmienność diody LED w zależności od lokalizacji i utworzyło regulację skali szarości, dzięki czemu każda dioda LED jest znormalizowana do tej samej intensywności. Ekspresję genów indukowano w zmodyfikowanych lżejszych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy różnych czasach trwania impulsów świetlnych na LPA, a komórki zobrazowano pod kątem ekspresji Brightfield i GFP. Za pomocą cytometrii przepływowej komórki zostały indukowane przy różnych wartościach długości impulsów i wykazały odpowiedź na dawkę ekspresji genów określoną ilościowo na poziomie populacji ponad czterokrotną zmianę w stosunku do stanów nieindukowanych.

Ujemne sprzężenie zwrotne osiągnięto przy pięciokrotnej redukcji szumów ekspresji genów, co wykazano, porównując różne wartości natężenia światła dla systemu zapalniczki w porównaniu z jaskrawym lub włączonym światłem. Analiza qPCR wykazała, że zmodyfikowane lżejsze komórki wyrażały poziomy RNA w sposób zależny od dawki z ponad dziesięciokrotną indukcją ze stanów nieindukowanych, co odpowiada kwantyfikacji cytometrii przepływowej. Zmodyfikowany obwód genu zapalniczki wykazywał coraz większe ilości niebieskiego światła, co skutkowało zwiększonym poziomem białka KRAS i fosforylowanym poziomem ERK.

Można wykonać kilka testów funkcjonalnych, w tym wzrost, ruchliwość komórek, gojenie się ran, proliferację lub testy inwazji. Metody te mogą dostarczyć szczegółowych informacji na temat mechanizmów biologii nowotworów, różnicowania tkanek lub oporności na leki.