Name: Niezawodna inżynieria i kontrola stabilnych optogenetycznych obwodów genowych w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj standaryzowany protokół optogenetyczny do kontroli ekspresji genów w komórkach ssaków za pomocą światła. Metoda umożliwia precyzyjną regulację przestrzennoczasową z minimalnym szumem ekspresji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować laboratorium Balázsi za komentarze i sugestie, dr Karlowi P. Gerhardtowi i dr Jeffreyowi J. Taborowi za pomoc w budowie pierwszego LPA, oraz dr Wilfriedowi Weberowi za udostępnienie plazmidów LOV2-degron. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health [R35 GM122561 i T32 GM008444]; Centrum Biologii Fizycznej i Ilościowej im. Laufera; oraz stypendium National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship. Finansowanie opłaty za otwarty dostęp: NIH [R35 GM122561].
Wkład autora: M.T.G. i G.B. byli pomysłodawcami projektu. M.T.G., D.C. i L.G. przeprowadzili eksperymenty. M.T.G., D.C., L.G. i G.B. przeanalizowali dane i przygotowali manuskrypt. Nadzór nad projektem sprawowali G.B. i M.T.G.

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Czytelnicy tego artykułu mogą uzyskać wgląd w kroki niezbędne do scharakteryzowania optogenetycznych obwodów genowych (a także innych systemów ekspresji genów), w tym: 1) projektowanie, budowę i walidację obwodów genów; 2) inżynieria komórkowa służąca do wprowadzania obwodów genowych do stabilnych linii komórkowych (np. rekombinacja Flp-FRT); 3) indukcja zmodyfikowanych ogniw za pomocą platformy opartej na świetle, takiej jak LPA; 4) wstępna charakterystyka testów indukcji światła za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej; ...

Podobnie jak inne dyscypliny inżynierskie, biologia syntetyczna ma na celu standaryzację protokołów, umożliwiając wykorzystanie narzędzi o wysoce powtarzalnych funkcjach do badania zagadnień związanych z systemami biologicznymi1,2. Jedną z dziedzin biologii syntetycznej, w której zbudowano wiele systemów kontroli, jest obszar regulacji ekspresji genów3,4. Kontrola ekspresji genów może być ukierunkowana zarówno na poziomy białek, jak i zmienność (szum lub współczynnik zmienności, CV = σ/μ, mierzony jako odchylenie standardowe od średniej), które są kluczowymi cechami komórkowymi ze względu na ich rolę w fizjologicznych i patologicznych stanach komórkowych5,6,7,8. Wiele syntetycznych systemów, które mogą kontrolować poziom białka i szum4,9,10,11,12 zostało zaprojektowanych, tworząc możliwości standaryzacji protokołów w różnych narzędziach.
Jednym z nowatorskich narzędzi do kontrolowania sieci genów, który pojawił się niedawno, jest optogenetyka, umożliwiająca wykorzystanie światła do kontrolowania ekspresji genów13,14,15,16,17. Podobnie jak ich chemiczni poprzednicy, optogenetyczne obwody genowe mogą być wprowadzane do dowolnego typu komórek, od bakterii po ssaki, umożliwiając ekspresję dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania18,19. Jednak ze względu na szybkie generowanie nowych narzędzi optogenetycznych, pojawiło się wiele systemów, które różnią się architekturą obwodów genetycznych, mechanizmem ekspresji (np. integracja oparta na plazmidzie vs. integracja wirusowa) oraz sprzętem kontrolującym dostarczającym światło11,16,20,21,22,23,24,25. W związku z tym pozostawia to miejsce na standaryzację cech optogenetycznych, takich jak budowa i optymalizacja obwodów genowych, metoda wykorzystania systemu (np. integracja vs. ekspresja przejściowa), narzędzia eksperymentalne wykorzystywane do indukcji i analiza wyników.
Aby poczynić postępy w standaryzacji protokołów optogenetycznych w komórkach ssaków, ten protokół opisuje eksperymentalny proces inżynierii systemów optogenetycznych w komórkach ssaków przy użyciu obwodu genu ujemnego sprzężenia zwrotnego (NF) zintegrowanego z komórkami HEK293 (ludzka embrionalna linia komórkowa nerki) jako przykład. NF jest idealnym systemem do demonstracji standaryzacji, ponieważ występuje w dużej obfitości26,27,28 w przyrodzie, co pozwala na dostrojenie poziomów białka i zminimalizowanie szumów. Krótko mówiąc, NF pozwala na precyzyjną kontrolę ekspresji genów przez represor, który wystarczająco szybko redukuje własną ekspresję, ograniczając w ten sposób wszelkie zmiany od stanu ustalonego. Stan ustalony może być zmieniony przez induktor, który dezaktywuje lub eliminuje represor, aby umożliwić większą produkcję białka, aż do osiągnięcia nowego stanu ustalonego dla każdego stężenia induktora. Niedawno stworzono zmodyfikowany system optogenetyczny NF, który może wytwarzać szeroką dynamiczną odpowiedź ekspresji genów, utrzymywać niski poziom szumów i reagować na bodźce świetlne, co pozwala na przestrzenną kontrolę ekspresji genów11. Narzędzia te, znane jako tunery indukowane światłem (LITers), zostały zainspirowane wcześniejszymi systemami, które umożliwiały kontrolę ekspresji genów w żywych komórkach4,10,29,30 i były stabilnie zintegrowane z ludzkimi liniami komórkowymi, aby zapewnić długoterminową kontrolę ekspresji genów.
Tutaj, na przykładzie LITera, przedstawiono protokół tworzenia obwodów genowych reagujących na światło, indukowania ekspresji genów za pomocą Aparatu Płytki Świetlnej (LPA, sprzętu do indukcji optogenetycznej)31, oraz analizy odpowiedzi zmodyfikowanych, optogenetycznie kontrolowanych linii komórkowych na niestandardowe bodźce świetlne. Protokół ten pozwala użytkownikom na wykorzystanie narzędzi LITer dla dowolnego funkcjonalnego genu, który chcą zbadać. Można go również dostosować do innych systemów optogenetycznych o różnych architekturach obwodów (np. dodatnie sprzężenie zwrotne, negatywna regulacja itp.) poprzez integrację metod i sprzętu optogenetycznego opisanych poniżej. Podobnie jak w przypadku innych protokołów biologii syntetycznej, przedstawione tutaj nagrania wideo i protokoły optogenetyczne mogą być stosowane w badaniach pojedynczych komórek w różnych obszarach, w tym między innymi w biologii raka, rozwoju embrionalnym i różnicowaniu tkanek.

<table><tbody><tr><td>0,2 ml probówki do PCR</td><td>Eppendorf</td><td>951010006</td><td>odczynnik do przeprowadzania PCR</td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna EDTA 1X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MT25053CI</td><td>odczynnik do rozszczepiania i pobierania komórek ssaków</td></tr><tr><td>0,5-10 &mu; L Pipeta o regulowanej objętości</td><td>Eppendorf</td><td>3123000020</td><td>narzędzie używane do reakcji pipetowania</td></tr><tr><td>100-1000 &mu; l Pipeta o regulowanej objętości</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td>narzędzie używane do reakcji pipetowania</td></tr><tr><td>20-200 &mu; L Pipeta o regulowanej objętości</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td>narzędzie służące do reakcji pipetowania</td></tr><tr><td>2-20 &mu; L Pipeta o regulowanej objętości</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td>narzędzie używane do reakcji pipetowania</td></tr><tr><td>5 ml polistyenowej probówki z okrągłym dnem z nasadką sitka komórkowego</td><td>Odczynnik Corning</td><td>352235</td><td>do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Wirówka 5702R, z 4 x 100 Rotor, adaptery 15 i 50 ml, 120 V</td><td>Eppendorf</td><td>22628113</td><td>sprzęt do pracy z hodowlą ssaków</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Denville Scientific</td><td>GR140-500</td><td>odczynnik do elektroforezy</td></tr><tr><td>żelowej Folie aluminiowe do płytek 96-dołkowych</td><td>VWR&reg;</td><td>60941-126</td><td>narzędzie używane do pokrywania płytek w eksperymentach z indukcją światła</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td>odczynnik do selekcji bakterii z prawidłowym plazmidem</td></tr><tr><td>Analogowy mieszalnik wirowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02215365PR</td><td>narzędzie do przeprowadzania reakcji PCR, transformacji lub ekstrakcji żelu</td></tr><tr><td>Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140010</td><td>odczynnik do hodowla bakterii</td></tr><tr><td>BD LSRAria</td><td>BD</td><td>656700</td><td>narzędzie do sortowania zmodyfikowanych linii komórkowych w populacje monoklonalne</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD</td><td>649225</td><td>narzędzie do charakteryzowania zmodyfikowanych linii komórkowych</td></tr><tr><td>BSA, Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Źródło naukowe Odczynnik</td><td>SIGA4919-1G</td><td>do buforu</td></tr> <tr><td>inkubacyjnego IFPłytka do hodowli komórkowych 12-dołkowa, przezroczysta, z płaskim dnem i pokrywką, polistyren, niepirogenna, standard-TC</td><td>Płytka 353043 Corning</td><td></td><td>służąca do hodowli komórek monoklonalnych</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>VWR</td><td>22628113</td><td>przyrząd do hodowli komórek ssaków</td></tr><tr><td>Chemiczny dygestorium</td><td>Nie</td><td></td> dotyczy <td>Przyrząd do przeprowadzania reakcji IF</td></tr><tr><td>Przezroczysta płytka do hodowli komórkowych 24-dołkowa płaska z pokrywką</td><td>BD</td><td>353047</td><td>płytka używana do hodowli komórek monoklonalnych</td></tr><tr><td>Nasadka filtra CytoOne T25 Kolba TC</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-4825</td><td>pojemnik do hodowli komórek ssaków</td></tr><tr>Odczynnik <td>Fischer Scientific</td><td>BP231-100</td><td>stosowany do zamrażania zmodyfikowanych komórek ssaków</td><td></td></tr> <tr><td>Bromek etydyny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-585-011</td><td>odczynnik do elektroforezy żelowej</td></tr><tr><td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom Mikropłytka hodowlana poddana działaniu TC, z pokrywką</td> Pojemnik <td>na 353072</td><td>Corning</td><td>do hodowli posortowanych komórek monoklonalnych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie FCS</td><td>Express De Novo:</td> Nie <td>dotyczy</td><td>oprogramowania do charakteryzowania danych cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu, zwykła, USDA 500 ml</td><td>Odczynnik Corning</td><td>35-010-CV</td><td>do hodowli komórek</td></tr> <tr><td>ssakówFisherbrand Szalki Petriego z przezroczystą pokrywką - podniesiony grzbiet; 100 x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>sprzęt do hodowli bakterii</td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; DMEM, Odczynnik High Glucose</td><td>Thermo Scientific</td><td>11-965-092</td><td>do hodowli komórek ssaków</td></tr><tr><td>Hs00932330_m1 izoforma KRAS A Test ekspresji genów Taqman</td> Life <td>Technologies</td><td>4331182</td><td>qPCR Probe</td></tr><tr><td>Hygromycyna B (50 mg/mL), 20 mL</td><td>Life Technologies</td><td>10687-010</td><td>odczynnik do selekcji komórek z prawidłową integracją obwodów genowych</td></tr><tr><td>iScript Odwrotna transkrypcja Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708890</td><td>odczynnik do konwersji RNA do cDNA</td></tr><tr><td>Zamrażarka Laboratoryjna -20 &deg; C</td><td>VWR</td><td>76210-392</td><td>sprzęt do przechowywania odczynników eksperymentalnych</td></tr><tr><td>Zamrażarka laboratoryjna -80 &deg; C</td><td>Sprzęt Panasonic</td><td>MDF-U74VC</td><td>do przechowywania odczynników eksperymentalnych</td></tr><tr><td>Lodówka laboratoryjna +4 &deg; C</td><td>VWR</td><td>76359-220</td><td>sprzęt do przechowywania odczynników eksperymentalnych</td></tr><tr><td>LB Broth (Lennox), 1 kg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022-250G</td><td>odczynnik do hodowli bakterii</td></tr><tr><td>LIPOFECTAMINE 3000</td><td>Life Technologies</td><td>L3000008</td><td>reagemt do transfekcji obwodów genowych do komórek ssaków</td></tr><tr><td>MATLAB 2019</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>oprogramowanie do analizy danych</td></tr> <tr><td>eksperymentalnychMetanol</td><td>Acros Organics</td><td>413775000</td><td>odczynnik do reakcji immunofluorescencyjnej</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, polipropylen 1,7 ml</td><td>Pojemnik z tworzywa sztucznego</td><td>VWR</td><td>20170-333</td></tr><tr><td>Mr04097229_mr EGFP/YFP Test ekspresji genów Taqman</td><td>Technologie 4331182</td><td></td><td>qPCR Sonda MultiTherm</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000-HC</td><td>do badań bakteryjnych transformacja</td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop Lite</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Sprzęt ND-NDL-US-CAN</td><td>do pomiaru stężenia DNA/RNA</td></tr><tr><td>NEB Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wierności 2x Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>odczynnik do PCR fragmentów obwodu genu</td></tr><tr><td>NEB10-beta Kompetentny E. coli (wysoka wydajność)</td><td>New England Biolabs (NEB)</td>Komórki bakteryjne <td>C3019H</td><td>do amplifikacji obwodu genowego Interesujące</td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>E2621L</td><td>odczynnik do łączenia frakcji obwodów genowych</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Nikon Eclipse Ti-E z kamerą DS-Qi2</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Instrument N/A</td><td>do ilościowego oznaczania ekspresji genów</td></tr><tr><td>NIS-Elements</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Oprogramowanie N/A</td><td>do charakteryzowania danych z mikroskopii fluorescencyjnej</td></tr><tr><td>oligonukleotydy</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>odczynnik używany do PCR składników obwodu genowego</td></tr><tr><td>Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Inkubator z UV i H2O2 Sterowanie</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUVHL-PA</td><td>Instrument do hodowli komórek</td></tr> <tr><td>ssakówParaformaldehyd, 16% mikroskopia elektronowa klasy</td> mikroskopii <td>elektronowej Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (D-PBS) (1x) Odczynnik</td><td></td> <td>14190144 do</td><td>hodowli komórek ssaków, odczynnik do buforu inkubacyjnego IF</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL), 100x</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>odczynnik do hodowli komórek</td></tr> <tr><td>ssakówpierwotne przeciwciało ERK</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>4370S</td><td>podstawowe przeciwciało ERK do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>pierwotne przeciwciało KRAS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WH0003845M1</td><td>podstawowe przeciwciało KRAS do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>Zestaw odczynników <td>Qiagen</td><td>27106</td><td>do oczyszczania plazmidów obwodu genowego</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick (50)</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>zestaw odczynników do oczyszczania fragmentów obwodu genowego</td></tr><tr><td>QuantStudio 3 Real-Time PCR System</td><td>Eppendorf</td><td>A28137</td> sprzęt do aplikacji do względnej kwantyfikacji <td>qRT-PCR</td></tr><tr><td></td><td>Oprogramowanie Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>do ilościowego oznaczania amplificaitonu RNA/cDNA</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>zestaw do ekstrakcji RNA z komórek zmodyfikowanych ssaków</td></tr><tr><td>Wtórne przeciwciało</td> <td>ERKTechnologia sygnalizacji komórkowej</td><td>8889S</td><td>wtórne przeciwciało ERK do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>wtórne przeciwciało KRAS</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td>wtórne przeciwciało KRAS do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 5,0 ml</td><td>Odczynniki Olympus Plastics</td><td>12-102</td><td>używane do wywoływania różnych reakcji chemicznych</td></tr><tr><td>System obrazowania SmartView Pro</td><td>Główna nauka</td><td>UVCI-1200</td><td>narzędzie do obrazowania prawidłowych prążków PCR</td></tr><tr><td>SnapGene Viewer (darmowy) lub SnapGene</td><td>Oprogramowanie SnapGene</td><td>N/A</td><td>Projektowanie i analiza sekwencji DNA</td></tr><tr><td>Inkubator Top</td><td>Stage Tokai Hit</td><td>INU-TIZ</td><td>narzędzie do przeprowadzania reakcji PCR, transformacji lub ekstrakcji żelu</td></tr><tr><td>Odczynnik TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444557</td><td>do PCR fragmentów</td></tr> <tr><td>obwodów genowychTaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (sonda VIC/MGB), starter limited, 2500 rxn</td><td>Life Technologies</td><td>4326317E</td><td>qPCR Probe</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td>narzędzie do przeprowadzania reakcji PCR, transformacji lub ekstrakcji żelu</td></tr><tr><td>VisiPlate-24, 24-dołkowa mikropłytka z przezroczystym dnem, sterylna i poddana hodowli tkankowej</td><td>Płytka PerkinElmer</td><td>1450-605</td><td>używana do indukcji światła </td></tr><tr><td>eksperymenty Jednorazowe pipety Pasteura VWR, szkło, szkło borokrzemianowe Pipet, krótka końcówka, pojemność=2 mL, długość całkowita=14,6 cm</td> Odczynnik <td>VWR</td><td>14673-010</td><td>do hodowli komórek ssaków</td></tr><tr><td>VWR Mini poziome systemy elektroforetyczne, system żelowy Mini10</td> Sprzęt <td>VWR</td><td>89032-290</td><td>do elektroforezy żelowej DNA</td></tr><tr><td>Flp-In 293</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R75007</td><td>Inżynierska linia komórkowa z FRT miejsce</td></tr></tbody></table>

niezawodna inżynieria i kontrola stabilnych optogenetycznych obwodów genowych w komórkach ssaków

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Niezawodna kontrola ekspresji genów w komórkach ssaków wymaga narzędzi o dużej zmianie fałdowania, niskim poziomie szumu i określonych funkcjach transferu między wejściami a wyjściami, niezależnie od użytej metody. W tym celu w ciągu ostatniej dekady wiele uwagi poświęcono optogenetycznym systemom ekspresji genów w celu czasoprzestrzennej kontroli poziomów białek w komórkach ssaków. Jednak większość istniejących obwodów kontrolujących ekspresję genów indukowaną światłem różni się architekturą, jest wyrażana przez plazmidy i wykorzystuje zmienny sprzęt optogenetyczny, co stwarza potrzebę zbadania charakterystyki i standaryzacji składników optogenetycznych w stabilnych liniach komórkowych. W tym przypadku badanie dostarcza eksperymentalnego toku niezawodnej konstrukcji, integracji i charakterystyki obwodów genowych w celu kontrolowania indukowanej światłem ekspresji genów w komórkach ssaków, wykorzystując jako przykład obwodu optogenetycznego z ujemnym sprzężeniem zwrotnym. Protokoły ilustrują również, w jaki sposób standaryzacja sprzętu optogenetycznego i reżimów świetlnych może niezawodnie ujawnić cechy obwodu genowego, takie jak szum ekspresji genów i wielkość ekspresji białek. Wreszcie, artykuł ten może być przydatny dla laboratoriów niezaznajomionych z optogenetyką, które chcą zastosować taką technologię. Opisany tutaj rurociąg powinien mieć zastosowanie do innych obwodów optogenetycznych w komórkach ssaków, co pozwoli na bardziej wiarygodną, szczegółową charakterystykę i kontrolę ekspresji genów na poziomie transkrypcyjnym, proteomicznym i ostatecznie fenotypowym w komórkach ssaków.

Montaż obwodów genowych i generowanie stabilnych linii komórkowych opisane w tym artykule oparto na komercyjnych, zmodyfikowanych komórkach HEK-293 zawierających transkrypcyjnie aktywny, pojedynczy stabilny punkt FRT (Rysunek 1). Obwody genowe skonstruowano w wektorach zawierających miejsca FRT w plazmidzie, umożliwiając integrację Flp-FRT do genomu komórek HEK-293. Takie podejście nie ogranicza się wyłącznie do komórek Flp-In, ponieważ miejsca FRT można wprowadzić do dowolnej linii komórkow...

Niezawodna kontrola komórek ssaków reagujących na światło wymaga standaryzacji metod optogenetycznych. Aby osiągnąć ten cel, badanie to nakreśla linię budowy obwodów genowych, inżynierii komórkowej, obsługi sprzętu optogenetycznego i testów weryfikacyjnych w celu standaryzacji badania ekspresji genów indukowanej światłem przy użyciu optogenetycznego obwodu genowego o ujemnym sprzężeniu zwrotnym jako studium przypadku.

Niezawodna inżynieria i kontrola stabilnych optogenetycznych obwodów genowych w komórkach ssaków

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Standaryzowany protokół optogenetyczny jest przeznaczony dla laboratoriów zainteresowanych wykorzystaniem światła jako bodźca do kontrolowania właściwości komórkowych w zmodyfikowanych systemach komórkowych ssaków. Protokół ten jest łatwy do wdrożenia w laboratoriach, które w przeciwnym razie nie są zaznajomione z optogenetyką i zapewnia metody precyzyjnej przestrzennej kontroli czasowej zaprojektowanych systemów biologicznych. Metoda ta ma szeroki zakres zastosowań w określonych obszarach badawczych, w których informacje czasoprzestrzenne mogą być ważne, w tym w biologii nowotworów, biologii systemowej i różnicowaniu tkanek.Na początek wybierz składniki genetyczne, które mają zostać połączone, powiązać się w pojedynczy obwód genu lub plazmid. Na przykład miejsca integracji DNA ssaków, elementy reagujące na światło lub funkcjonalne geny. Po zebraniu i zbadaniu wszystkich niezbędnych cech, takich jak kodony start, sekwencje regulatorowe lub translowane, użyj dowolnego oprogramowania do inżynierii genetycznej i klonowania molekularnego, opisz i przechowuj sekwencje DNA do późniejszego wykorzystania i jako odniesienie.Weryfikuj obliczeniowo startery pod kątem budowy plazmidu za pomocą wbudowanych funkcji oprogramowania do klonowania molekularnego, na przykład wyrównania sekwencji. Aby wygenerować stabilną linię komórkową, należy przeprowadzić transfekcję obwodów genów projektowych i pożądanych komórek za pomocą liposomu mieszaniny DNA obwodu genu z odpowiednią rekombinazą. Po tym, jak komórki zlewają się w 80 do 100%, zamroź komórki w mieszance 45% starych pożywek, 45% świeżych pożywek i 10% DMSO.Przenieś pozostałe komórki do sterylnej probówki i przeprowadź sortowanie pojedynczych komórek w celu wyizolowania komórek monoklonalnych na 96-dołkowej płytce. Około dwa do trzech tygodni po sortowaniu monoklonalnym studzienki w 96-dołkowej płytce powinny mieć ogniska. Po osiągnięciu 50 do 60% konfluencji podziel komórki na 12-dołkową płytkę.Dodaj oprogramowanie układowe do zmontowanego obwodu LPA za pomocą programatora mikrokontrolera. Następnie połącz wydrukowane w 3D części w zmontowanej płytce drukowanej za pomocą płyty montażowej, płytki drukowanej, przekładki LED, adaptera płytki, płytki 24-dołkowej, pokrywy płyty, mocujących, nakrętek motylkowych i elementów do układania w stosy. Aby rozpocząć eksperyment optogenetyczny, należy skorzystać z oprogramowania Iris dostępnego na stronie Tabor Lab, aby zaprogramować kartę SD dla LPA i zbadać odpowiednie warunki oświetleniowe.Następnie wprowadź wartości intensywności za pomocą powtórzeń technicznych dla żądanego konspektu eksperymentu. Dodaj około 75 000 komórek na studzienkę na 24-dołkową czarną płytkę o łącznej objętości 500 mikrolitrów, a następnie umieść komórki w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla, aby mogły osiąść przez dwie do sześciu godzin. Po przeniesieniu komórek do okapu do hodowli tkankowej pod koniec inkubacji, zdejmij plastikową pokrywkę i dodaj samoprzylepny pasek folii do górnej części płytki, aby zminimalizować przenoszenie światła między studzienkami, tak aby światło mogło przedostać się tylko przez diodę LED znajdującą się na dnie studzienki.Umieść płytkę w dopasowanych częściach 3D LPA, a następnie przykryj płytkę wydrukowaną w 3D pokrywą LPA, która pasuje do urządzenia w każdym rogu. Podłącz urządzenie do źródła zasilania i naciśnij przycisk resetowania na urządzeniu LPA, aby upewnić się, że zaktualizowane ustawienia eksperymentu LPA zostały zastosowane i inkubuj komórki. Po inkubacji, wewnątrz kaptura do hodowli tkankowej, usuń pasek folii z płytki i pozostaw płytkę na jedną do dwóch minut, aby zapobiec tworzeniu się kondensatu na plastikowej pokrywie.Następnie umieść oryginalną plastikową pokrywkę z powrotem na płytce i zobrazuj komórki za pomocą odpowiedniego mikroskopu kontrastowego lub fluorescencyjnego. Po 24 do 72 godzinach od indukcji, po której następuje trypsynizacja, przenieś całą zawartość każdej studzienki o objętości około 500 mikrolitrów do oznakowanych probówek wyposażonych w sitko do komórek. Następnie, używając odpowiedniego oprogramowania przyrządu do cytometrii przepływowej, utwórz bramkę rozpraszania do przodu i z boku, aby uchwycić pojedyncze komórki o odpowiednim rozmiarze i ziarnistości, aby wykluczyć zanieczyszczenia i grudki komórkowe.Po ustawieniu bramki przechwyć około 10 000 komórek za pomocą odpowiedniej bramki i dostosuj liczbę komórek w zależności od wymaganej ilości danych komórkowych i powtórz przechwytywanie komórek eksperymentalnych w każdej probówce. Po indukcji i trypsynizacji przenieś całą zawartość każdej studzienki o pojemności około 500 mikrolitrów do oznaczonych probówek. Odwirowywać komórki przez pięć minut w temperaturze 400 razy G. Po odrzuceniu supernatantu przenieść próbki do dygestorium chemicznego.Ponownie zawiesić komórki w 750 do 1 000 mikrolitrów 4% PFA rozcieńczonego w PBS i kilkakrotnie pipetować w górę iw dół, aby rozbić grudki komórek. Po 15 minutach inkubacji dodać 750 do 1 000 mikrolitrów PBS i ponownie kilkakrotnie pipetować w górę iw dół, a następnie granulować komórki przez pięć minut w temperaturze 400 razy G w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu przenieść próbki do dygestorium chemicznego i ponownie zawiesić komórki w 750 do 1 000 mikrolitrów lodowatego metanolu, jak pokazano, i pozostawić komórki na 30 minut w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Po inkubacji dodać 750 do 1 000 mikrolitrów PBS, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół. Następnie, po odwirowaniu komórek przez pięć minut w temperaturze 400 razy G, wyrzucić supernatant i przenieść próbki do dygestorium chemicznego. Zawiesić komórki w 100 mikrolitrach lub innym odpowiednim rozcieńczeniu znakowanego przeciwciała pierwszorzędowego i pipetować w górę iw dół sześć do ośmiu razy, a następnie inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej.Następnie kilkakrotnie dodaj 750 do 1 000 mikrolitrów buforu inkubacyjnego i roztworu pipetowanego w górę iw dół, a następnie odwiruj komórki przez pięć minut przy 400 razy G. Następnie ponownie zawieś komórki w 500 mikrolitrach PBS i rozbij grudki, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół. Przenieść całą zawartość każdej probówki do oznakowanych probówek z sitkami do komórek. Przynieś komórki do odpowiednich przyrządów cytometrii przepływowej z laserami o odpowiednich długościach fal.Dla urządzeń została przeprowadzona kalibracja optyczna. Na podstawie uzyskanego obrazu obliczono wartości kompensacji dla diody LED, odjęto sygnał tła i wydedukowano intensywność pikseli. Współczynnik zmienności był minimalny między 96 odwiertami.Oprogramowanie kalibracyjne zademonstrowało zmienność diody LED w zależności od lokalizacji i utworzyło regulację skali szarości, dzięki czemu każda dioda LED jest znormalizowana do tej samej intensywności. Ekspresję genów indukowano w zmodyfikowanych lżejszych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy różnych czasach trwania impulsów świetlnych na LPA, a komórki zobrazowano pod kątem ekspresji Brightfield i GFP. Za pomocą cytometrii przepływowej komórki zostały indukowane przy różnych wartościach długości impulsów i wykazały odpowiedź na dawkę ekspresji genów określoną ilościowo na poziomie populacji ponad czterokrotną zmianę w stosunku do stanów nieindukowanych.Ujemne sprzężenie zwrotne osiągnięto przy pięciokrotnej redukcji szumów ekspresji genów, co wykazano, porównując różne wartości natężenia światła dla systemu zapalniczki w porównaniu z jaskrawym lub włączonym światłem. Analiza qPCR wykazała, że zmodyfikowane lżejsze komórki wyrażały poziomy RNA w sposób zależny od dawki z ponad dziesięciokrotną indukcją ze stanów nieindukowanych, co odpowiada kwantyfikacji cytometrii przepływowej. Zmodyfikowany obwód genu zapalniczki wykazywał coraz większe ilości niebieskiego światła, co skutkowało zwiększonym poziomem białka KRAS i fosforylowanym poziomem ERK.Można wykonać kilka testów funkcjonalnych, w tym wzrost, ruchliwość komórek, gojenie się ran, proliferację lub testy inwazji. Metody te mogą dostarczyć szczegółowych informacji na temat mechanizmów biologii nowotworów, różnicowania tkanek lub oporności na leki.

reliably-engineering-controlling-stable-optogenetic-gene-circuits

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niedawny rozwój narzędzi neuronauki, które łączą genetykę i optykę, określany jako "optogenetyka", umożliwia kontrolę nad aktywnością obwodów neuronowych z niespotykanym dotąd poziomem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół integracji zapisu in vivo z manipulacją optogenetyczną genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów przedczołowych korowych i podkostnych neuronów piramidowych.

Metoda wysokiej wierności optogenetycznej kontroli pojedynczych neuronów piramidowych in vivo

Opisujemy metodę charakteryzowania funkcjonalnej topografii i właściwości synaptycznych obwodów przodomózgowia za pomocą podejścia optogenetycznego do fotostymulacji populacji neuronów in vitro.

Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym

Optogenetyka stała się potężnym narzędziem do wykorzystania w eksperymentach neuronauki behawioralnej. Protokół ten oferuje przewodnik krok po kroku po projektowaniu i konfiguracji systemów laserowych oraz zapewnia pełny protokół przeprowadzania wielokrotnych i jednoczesnych stymulacji optogenetycznych in vivo zgodnych z większością paradygmatów testów behawioralnych gryzoni.

In vivo (in vivo) Stymulacja optogenetyczna ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Ten protokół opisuje kroki i analizę danych wymaganych do pomyślnego przeprowadzenia optogenetycznego funkcjonalnego rezonansu magnetycznego (ofMRI). ofMRI to nowatorska technika, która łączy odczyt fMRI w wysokim polu ze stymulacją optogenetyczną, pozwalając na specyficzne dla typu komórki mapowanie funkcjonalnych obwodów nerwowych i ich dynamiki w całym żywym mózgu.

Optogenetyczny funkcjonalny rezonans magnetyczny

Ten protokół opisuje strategię optogenetyczną do modulowania aktywności kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus. Metoda ta pozwala na odwracalną aktywację szlaku sygnałowego MAPK w hodowli komórek ssaków oraz w wielokomórkowych organizmach żywych, takich jak zarodki Xendopus, z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus

Tutaj prezentujemy protokół do analizy transferu informacji oscylacyjnych między komórkami za pomocą kontroli optogenetycznej i monitorowania ekspresji genów na żywo. Podejście to stanowi unikalną platformę do testowania funkcjonalnego znaczenia programów dynamicznej ekspresji genów w systemach wielokomórkowych.

Metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych

Tutaj prezentujemy dwa łatwe do naśladowania protokoły krok po kroku dla paradygmatów preferencji miejsca z wykorzystaniem optogenetyki u myszy. Korzystając z tych dwóch różnych konfiguracji, zachowania związane z preferencjami i unikaniem mogą być solidnie oceniane w ramach tego samego aparatu z wysoką selektywnością przestrzenną i czasową oraz w prosty sposób.

Dwa różne paradygmaty preferencji miejsca w czasie rzeczywistym wykorzystujące optogenetykę w brzusznym obszarze nakrywki myszy

Dzięki optogenetycznej manipulacji określonych populacji neuronów lub obszarów mózgu, zachowanie może być modyfikowane z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u swobodnie poruszających się zwierząt. Stosując różne narzędzia optogenetyczne w połączeniu z przewlekle wszczepionymi światłowodami, można przeprowadzić różnorodne modulacje neuronalne i testy behawioralne.

Optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy

Optogenetyczna kontrola metabolizmu mikrobiologicznego oferuje elastyczną dynamiczną kontrolę nad procesami fermentacji. Niniejszy protokół pokazuje, jak skonfigurować fermentację regulowaną niebieskim światłem do produkcji chemicznej i białkowej w różnych skalach objętościowych.

Fermentacja kontrolowana światłem do produkcji mikrobiologicznej, chemicznej i białkowej

Ten protokół opisuje zastosowanie zaprojektowanej domeny przełącznika allosterycznego aktywowanego niebieskim światłem (LightR) do odwracalnej czasoprzestrzennej kontroli aktywności białek. Wykorzystując kinazę tyrozynową Src jako model, badanie to oferuje skomplikowany protokół do opracowania i scharakteryzowania regulowanego światłem Src (LightR-Src). Pokazuje to wszechstronność tego podejścia w różnych klasach enzymów.

Czasoprzestrzenna kontrola aktywności białek poprzez optogenetyczną regulację allosteryczną

Badanie opisuje metodę eksperymentów o wysokiej przepustowości z wykorzystą matrycę LED drukowaną w 3D, aby zoptymalizować ekspresję genów indukowanych światłem w HEK293T komórkach.

Szybka optymalizacja systemu indukowalnego światłem do kontroli ekspresji genów ssaków

Poznaj standaryzowany protokół optogenetyczny do kontroli ekspresji genów w komórkach ssaków za pomocą światła. Metoda umożliwia precyzyjną regulację przestrzennoczasową z minimalnym szumem ekspresji.

Niezawodna inżynieria i kontrola stabilnych optogenetycznych obwodów genowych w komórkach ssaków

Przeglądaj więcej filmów