Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie wygodnego sposobu kontrolowania ekspresji kanałów jonowych w układach heterologicznych przy jednoczesnym uniknięciu długotrwałych komplikacji związanych z hodowlą komórkową. W ten sposób zapewnia się sposób kontrolowania warunków między eksperymentami i generowania bardziej powtarzalnych wyników. Metoda ta może ułatwić badania w dziedzinie kanałów jonowych.

Takich jak charakterystyka właściwości kanałów w farmakologii. Ponieważ obecne metody są albo złożone, albo wykazują niespójną ekspresję białka. Główną zaletą tej techniki jest to, że w stosunkowo krótkim czasie możemy osiągnąć kontrolowane poziomy ekspresji szerokiej gamy białek dostosowanych do indywidualnych eksperymentów.

Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś komórki TREX 293 na 12-dołkową płytkę przygotowaną z 0,9 mililitra pełnego DMEM na studzienkę, aby wygenerować 50-procentową konfluencję. I inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze CO2. Następnie przygotuj mieszaninę transfekcji składającą się z DMEM, genu będącego przedmiotem zainteresowania, pokazanego tutaj, TRPV1, obojętnego plazmidu i odczynnika do transfekcji lipidów.

W przypadku eksperymentów elektrofizjologicznych należy uwzględnić EGFP w plazmidzie ekspresyjnym ssaków w koktajlu transfekcji, aby uwidocznić komórki, które pomyślnie przechodzą transfekcję. Inkubować mieszaninę transfekcji w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie należy przeprowadzić transfekcję komórek, pipetując mieszaninę transfekcji kroplami na posiane komórki na płytce 12-dołkowej.

Energicznie kołysz płytką, aby zapewnić jednorodną dyspersję DNA i odczynnika do transfekcji. Następnie inkubuj transfekowane komórki przez noc w temperaturze 27 stopni Celsjusza. Następnego ranka, jeśli wykonujesz elektrofizjologię, upewnij się, że komórki zostały pomyślnie transfekowane, obserwując sygnał fluorescencyjny EGFP pod lampą UV.

W przypadku wykonywania elektrofizjologii należy przenieść komórki z płytki 12-dołkowej na szkiełka nakrywkowe pokryte PDL w 500 mikrolitrach pełnego DMEM. Jeśli wykonujesz obrazowanie wapnia, umieść około 20 000 komórek w komorach obrazowania wapnia pokrytych PDL. W tej procedurze należy przygotować roztwór podstawowy doksycykliny w stężeniu jeden miligram na mililitr w wodzie podwójnie destylowanej.

Roztwór podstawowy należy chronić przed światłem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do trzech tygodni. W przypadku długotrwałego przechowywania roztwór podstawowy doksycykliny należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie przygotuj świeży roztwór doksycykliny w pełnym DMEM.

I podgrzej go do 37 stopni Celsjusza. W przypadku zapisów elektrofizjologicznych należy odpipetować 500 mikrolitrów roztworu doksycykliny w ilości dwóch mikrogramów na mililitr do każdego dołka, aby uzyskać końcowe stężenie doksycykliny na poziomie jednego mikrograma na mililitr. Do obrazowania wapnia dodaj 100 mikrolitrów roztworu doksycykliny w stężeniu trzech mikrogramów na mililitr do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie doksycykliny na poziomie jednego mikrograma na mililitr.

Inkubuj próbkę przez żądany czas do indukcji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach CO2. Aby skalibrować ekspresję białka za pomocą obrazowania wapnia, przygotuj roztwór Ringera i podgrzej go do 37 stopni Celsjusza. Aby pomóc w dyspersji estrów AM, wskaźniki jonów fluroescencyjnych, takie jak Fura-2 w roztworach wodonośnych, przygotuj roztwór niejonowego F-127 w DMSO.

Podgrzej roztwór do 27 stopni Celsjusza, aż niejonowy F-127 się rozpuści. Następnie przechowuj niejonowy roztwór F-127 w temperaturze pokojowej i ponownie podgrzej go do 37 stopni Celsjusza przed użyciem. Następnie przygotuj roztwór ładujący Fura-2 AM z roztworu Ringera, uzupełniony dwoma do trzech mikromolowych Fura-2 AM, 02 miligramami na mililitr niejonowego F-127 i 10 milimolowymi D-glukozami.

Następnie należy odessać pożywkę z komórek w komorach i zastąpić ją roztworem ładującym Fura-2 AM. Inkubować komórki przez 60 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie odessać roztwór Fura-2 AM.

I umyj komórki roztworem Ringera i 10-milimolowym roztworem D-glukozy, aby usunąć dodatkowy barwnik komórkowy. Pozostaw w każdym 200 mikrolitrów roztworu Ringera i 10 milimolowych roztworów D-glukozy. I inkubuj go przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.

Po 30 minutach umieść komorę na stoliku nad końcówką mikroskopu i zabezpiecz ją uchwytem. Następnie należy obliczyć i przygotować stężenie robocze kapsaizyny specyficznego dla swoistego agonisty TRPV1 zgodnie z końcowym pożądanym stężeniem. Następnie włącz lampę, kamerę i mikroskop i wybierz filtr Fura-2, aby wykryć emisję o długości fali 510 nanometrów.

Dostosuj żądane powiększenie i ustaw ostrość komórek w wybranym polu, manipulując tymi parametrami za pomocą pokręteł mikroskopu. W ciemności odejmij światło tła i ustaw czas ekspozycji. Ustaw próbkowanie obrazu z żądaną szybkością.

Następnie zacznij od zarejestrowania odpowiedzi fluorescencyjnej komórek obciążonych Fura-2, wzbudzając je na falach o długości fali 340 nanometrów i 380 nanometrów. Stosunek sygnałów 340 do 380 jest wskaźnikiem wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia, a tym samym również aktywności TRPV1. Następnie dodaj dwie mikromolowe kapsaicynę do 200 mikrolitrów roztworu Ringera, aby uzyskać końcowe stężenie nasycające jednej mikromolowej kapsaicyny w celu oceny poziomu ekspresji TRPV1 i analizy odpowiedzi TRPV1.

Aby określić idealny czas indukcji dla zapisu jednokanałowego, należy najpierw przygotować roztwory kąpieli i pipet. Następnie przygotuj kilka szklanych pipet, wypolerowanych ogniowo do rezystancji od 10 do 12 megaomów. Wykonaj zacisk łaty na całe komórki, tworząc uszczelnienie na błonie docelowej komórki.

Następnie ustaw potencjał utrzymywania na minus 40 miliwoltów. I rozerwij membranę, stosując podciśnienie. Następnie, za pomocą mikromanipulatora, podnieś pipetę z plastrem mebrane z dala od komórki.

Następnie umieść system profusion bezpośrednio obok pipety zawierającej plaster membranowy. Obniż filtr Bessela i wzmocnienie wyjściowe odpowiednio do dwóch do pięciu killahurtz i 10 amperów. Następnie wylej nasycone stężenia agonisty na plaster błony.

Następnie przeanalizuj liczbę pomyślnie zarejestrowanych jednokanałowych łatek w stosunku do czasu indukcji zastosowanego do komórek i dostosuj czas indukcji zgodnie z pożądanymi wynikami. Pokazano tutaj pseudo kolorowe obrazy komórek TREX 293 przejściowo eksprymujących RTRPV1, przed i po zastosowaniu kapsaicyny. A oto odpowiednie zmiany wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia w czasie w leczonych, transfekowanych komórkach TREX 293.

Każdy wykres reprezentuje średnio 50 komórek. Skuteczność patcha jednokanałowego w nagraniach TRPV1 zależy od czasu indukcji. Oto aktualne ślady plastrów z komórek TREX 293 przejściowo eksprymujących RTRPV1 po dwóch godzinach i czterech godzinach indukcji.

A ten wykres opisuje liczbę kanałów w łacie po wskazanym czasie indukcji. Ta technika może dać nam analizę białka o kontrolowanej ekspresji w ciągu 12 godzin od transfekcji, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o standaryzacji stężeń transfekcji i czasu indukcji dla różnych białek.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytworzyć kontrolowany system odciągania pokarmu w sposób efektywny czasowo dla wybranego przez Ciebie jonu.