Name: Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj metodę kontrolowanej ekspresji kanałów jonowych poprzez indukowalną transfekcję przejściową w komórkach TREX 293. Technika umożliwia szybkie badanie właściwości farmakologicznych z powtarzalnymi wynikami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Izraelską Fundację Naukową [Granty 1721/12, 1368/12 i 1444/16] (dla A.P.). A.P. jest stowarzyszona z Brettler Center i David R. Bloom Center, School of Pharmacy, The Hebrew University of Jerusalem.

1. Ligowanie interesującego genu w represyjnym miejscu wektora
<ol>
	<li>Uzyskaj wektor indukowalny, taki jak pcDNA5/FRT/TO lub pcDNA4/TO.</li>
	<li>Przeanalizuj interesujący nas gen pod kątem potencjalnie podatnych miejsc restrykcyjnych w środku genu, które są również zawarte w miejscu wielokrotnego klonowania wybranego wektora za pomocą oprogramowania do analizy DNA in silico4.</li>
	<li>Korzystając ze standardowych technik nakładania się PCR4, należy otoczyć interesujący gen dwoma wybranymi miejscami rozpoznawania enzymu restrykcyjnego (które nie występują w genie będącym przedmiotem zainteresowania), pierwszym wstawionym przed kodonem start, a drugim po kodonie stop.</li>
	<li>Trawić zarówno wektor, jak i wstawkę za pomocą enzymów restrykcyjnych (wybranych w kroku 1.2) w temperaturze roboczej enzymów przez jedną godzinę, a następnie dodać jedną jednostkę fosfatazy jelita cielęcego () do reakcji wektora tylko przez 30 minut, aby uniknąć samoligacji.</li>
	<li>Załaduj strawione DNA na 1% żel agarozowy i oddziel rozszczepione segmenty za pomocą elektroforezy9.</li>
	<li>Za pomocą światła UV odetnij ostrzem kawałki żelu zawierające pożądane segmenty wektora i włóż do podwiązania.</li>
	<li>Ekstrahować segmenty DNA z kawałków żelu agarozowego (przy użyciu dostępnych na rynku zestawów do ekstrakcji DNA) i zmierzyć ich końcowe stężenie za pomocą spektrofotometru przy długości fali 260 nm.</li>
	<li>Zliguj interesujący gen do indukowalnego wybranego wektora za pomocą enzymu ligazy T4 w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo podwiązania wkładki z wektorem, należy użyć stosunku molowego insert: wektora 3:1. Do kontroli przygotuj reakcję ligacji, która obejmuje tylko wektor.</li>
	<li>W celu transformacji bakteryjnej dodaj 10 ng samego wektora i genu wektor + do 50 μl kompetentnej E. coli. Inkubować probówkę na lodzie przez 30 minut, a następnie inkubować przez 45 sekund w temperaturze 42 °C. Natychmiast umieścić z powrotem na lodzie na dwie minuty i przenieść przekształcone bakterie na pożywkę o pojemności 500 μl LB. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 °C przy mieszaniu przy 220 obr./min.</li>
	<li>W celu selekcji pomyślnie przekształconych bakterii, należy umieścić 100 μl każdej reakcji (jak opisano w ppkt 1.9) na przygotowanej płytce agarowej LB zawierającej odpowiedni antybiotyk (np. 100 μg/ml ampicyliny w przypadku stosowania pCDNA4/TR).</li>
	<li>Pozostawić na noc do wyrośnięcia w temperaturze 37 °C. Płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni, szczelnie owijając je folią parafinową z tworzywa sztucznego.</li>
	<li>Podnieś poszczególne kolonie za pomocą końcówki o pojemności 10 μl i pozostaw na noc do wzrostu w pożywce z antybiotykiem o pojemności 3 ml LB + w temperaturze 37 °C pod mieszaniem przy 220 obr./min. Bakterie z DNA będącym przedmiotem zainteresowania można zamrozić (w temperaturze -20 °C) w celu krótkotrwałego przechowywania poprzez odwirowanie LB i bakterii w temperaturze 11 000 x g i odsysanie supernatantu. Długotrwałe przechowywanie wymaga zamrożenia bakterii w postaci glicerolu w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Ekstrahować DNA za pomocą mini-prepu i zmierzyć końcowe stężenie za pomocą spektrofotometru przy 260 nm5.</li>
	<li>Potwierdź pomyślną insercję interesującego genu, sekwencjonując oczyszczony konstrukt4. Alternatywnie, diagnostyczne trawienie konstruktu przez enzymy restrykcyjne przy użyciu elektroforezy do oddzielenia ciętych segmentów i oceny ich obecności i długości może być również wykorzystane do tego celu4.</li>
</ol>
2. Hodowla linii komórkowych wyrażających TetR
<ol>
	<li>Uzyskaj linię hodowli komórkowej zawierającą plazmid represorowy Tet włączony do ich genomowego DNA. W tym przypadku protokół zostanie napisany na przykładzie ludzkich embrionalnych komórek 293T nerki (HEK-293T) zawierających plazmid pcDNA6 / TR.</li>
	<li>Komórki nasienne na 100 mm płytce do hodowli tkankowej z modyfikowanym podłożem Eagles (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionym 10% FBS, 1% penicyliną-streptomycyną, 2 mM l-glutaminą i 25 mM HEPES, pH 7,3 (tutaj: Full DMEM) i inkubować O/N w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Cała praca z komórkami powinna być wykonywana w okapie biologicznym w sterylnych warunkach.</li>
	<li>W celu utrzymania ekspresji genu represora Tet należy odessać pożywkę i zastąpić ją Full DMEM uzupełnionym o 5 μg/ml blasticydyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 80 - 90% konflufluencji, należy odessać pożywkę i delikatnie przemyć komórki dwukrotnie DPBS (bez wapnia i magnezu) podgrzanym do 37 °C.</li>
	<li>W celu delikatnego uniesienia komórek bez powodowania uszkodzeń mechanicznych należy inkubować kulturę w DMEM zawierającym 0,05% trypsyny podgrzanej do 37 °C przez 1,5 min.</li>
	<li>Zablokuj działanie trypsyny równą objętością pełnego DMEM. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby podnieść komórki i przenieść je do sterylnej probówki.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać supernatant i zastąpić go 1 ml Full DMEM. Pipetować roztwór z komórkami w górę i w dół, aż nie będzie widać grudek komórek. Policz i oblicz liczbę komórek za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Nasiona 1 - 2 x 106 komórek w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm zawierającym 12 ml pełnego DMEM z 5 μg/ml blasticydyny. Dziel komórki dwa razy w tygodniu, gdy osiągną 90% zbieżności.</li>
</ol>
3. Transfekcja plazmidu będącego przedmiotem zainteresowania do komórek
<ol>
	<li>Stosując tę samą metodę dzielenia komórek, jak opisano powyżej, przenieś komórki do studzienek na 12-dołkowej płytce przygotowanej z 0,9 ml pełnego DMEM, wystarczającego do uzyskania 50% zlewania (~ 200 000 komórek) i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .</li>
	<li>Przygotować mieszaninę transfekcji z pcDNA4/TO zawierającą interesujący nas gen, obojętny plazmid, aby doprowadzić całkowitą ilość DNA do 1 μg (w razie potrzeby), 3 μl odczynnika do transfekcji lipidów i DMEM, aby uzyskać końcową objętość 100 μl. Optymalna ilość plazmidowego DNA, która ma być użyta, różni się znacznie, ponieważ różne białka wyrażają się z różną wydajnością. W przypadku eksperymentów elektrofizjologicznych należy uwzględnić EGFP w plazmidzie ekspresyjnym ssaków w koktajlu transfekcji, aby uwidocznić komórki, które pomyślnie przeszły transfekcję4.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę transfekcji w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Transfekcję komórek poprzez pipetowanie mieszaniny do transfekcji kroplami na posiane komórki na płytce 12-dołkowej i energiczne kołysanie płytki, aby zapewnić jednorodną dyspersję DNA i odczynnika do transfekcji. Komórki powinny być ~ 80% zlewające się w momencie transfekcji.</li>
	<li>Inkubować transfekowane komórki O/N w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Upewnij się, że komórki zostały pomyślnie transfekowane, obserwując sygnał fluorescencyjny EGFP pod lampą UV następnego ranka, jeśli wykonujesz elektrofizjologię.</li>
</ol>
4. Komórki posiewne na szkiełkach nakrywkowych/studzienkach z poli-D-lizyny (PDL)
<ol>
	<li>Wysterylizuj szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm, oblewając je 70% roztworem etanolu izopropylowego. Wysuszyć i umieścić pojedyncze szkiełko nakrywkowe w każdym dołku 24-dołkowej płytki w celu zapisu elektrofizjologicznego.</li>
	<li>Pobrać pipetą roztwór 0,1 - 0,2 mg/ml roztworu PDL na każde szkiełko nakrywkowe lub studzienkę komory obrazowania wapnia.</li>
	<li>Pozostawić na 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
	<li>Przemyć trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną (DDW) klasy hodowli komórkowej, zasysając między każdym praniem. Po ostatnim praniu dokładnie wysuszyć i pozostawić do odstawienia na suchą rękę.</li>
	<li>Do celów elektrofizjologii każdą studzienkę zawierającą szkiełko nakrywkowe pokryte PDL należy wypełnić 500 μl pełnego DMEM ogrzanego do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Wykonaj tę samą metodę podziału transfekowanych komórek, jak opisano powyżej. Po ponownym zawieszeniu komórek po leczeniu trypsyną i zablokowaniu, przenieś 80 μl komórek (lub około 30 000 komórek) do środka każdego szkiełka nakrywkowego pokrytego PDL w celu zapisu elektrofizjologicznego. Pozostawić komórki na co najmniej 1,5 godziny lub inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2</li>.
	<li>Do obrazowania wapnia przenieś i umieść 20 μl komórek (około 20 000 komórek) do środka każdej studni obrazowania wapnia pokrytego PDL. Pozostawić komórki na co najmniej 30 minut i dodać 180 μl pełnego DMEM do każdej studzienki.</li>
</ol>
5. Indukowanie ekspresji genów
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy doksycykliny o stężeniu 1 mg/ml w DDW zgodnie z instrukcjami producenta. Roztwór podstawowy należy chronić przed światłem w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni. W przypadku długotrwałego przechowywania roztwór podstawowy doksycykliny należy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować świeży roztwór doksycykliny o stężeniu 2 μg/ml (elektrofizjologia) lub 3 μg/ml (obrazowanie wapnia) w pełnym DMEM i ogrzać go do temperatury 37 °C.</li>
	<li>W przypadku zapisów elektrofizjologicznych należy odpipetować 500 μl roztworu doksycykliny o stężeniu 2 μg/ml do każdego dołka, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μg/ml doksycykliny. Do obrazowania wapnia dodać 100 μl 3 μg/ml roztworu doksycykliny do każdego dołka, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μg/ml doksycykliny. Zapisz godzinę indukcji.</li>
	<li>Inkubować przez żądany czas do indukcji w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
6. Kalibracja osi czasu ekspresji białek
<ol>
	<li>Kalibracja ekspresji białek za pomocą obrazowania wapnia5,10
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór Ringera (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 2 mMMgSO4, 20 mM HEPES, pH dostosowane do 7,4 z NaOH) i ogrzać go do 37 °C.</li>
		<li>Przygotować stężenia nasycające agonistę kanału w roztworze Ringera. Ponieważ ilość agonisty jest rozcieńczana po dodaniu do komór obrazowania wapnia zawierających komórki i roztwór zewnątrzkomórkowy, należy podwoić ilość pożądanego końcowego stężenia agonisty. To również sprawia, że ilość roztworu do kąpieli w każdej studzience ma kluczowe znaczenie dla kontroli.</li>
		<li>Przygotować roztwór niejonowego F-127 20% W/V w DMSO. Podgrzać roztwór do temperatury 40 °C aż do rozpuszczenia niejonowego F-127. Przechowywać niejonowy roztwór F-127 w temperaturze pokojowej i ogrzać go do 40 °C przed użyciem. Niejonowy F-127 jest stosowany do pomocy w dyspersji estrów acetoksymetylowych (AM) fluorescencyjnych wskaźników jonowych, takich jak Fura-2, w roztworach wodnych.</li>
		<li>Odessać pożywkę i zastąpić ją roztworem ładującym Fura-2AM (roztwór Ringera uzupełniony o 2 - 3 μM Fura-2AM, 0,02 mg/ml niejonowego F-127 i 10 mM D-glukozy).</li>
		<li>Inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Odessać roztwór Fura-2AM i przemyć komórki roztworem D-glukozy Ringera + 10 mM w celu usunięcia barwnika zewnątrzkomórkowego. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
		<li>Pozostawić 200 μl roztworu D-glukozy Ringera + 10 mM w każdym dołku i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Umieść komorę na stoliku nad końcówką nosową mikroskopu i zabezpiecz ją uchwytem.</li>
		<li>Włącz lampę, kamerę i mikroskop i wybierz filtr Fura-2, aby wykryć emisję o długości fali 510 nm.</li>
		<li>Dostosuj żądane powiększenie i ustaw ostrość komórek w wybranym polu.</li>
		<li>W ciemności odejmij światło tła i ustaw czas ekspozycji.</li>
		<li>Ustaw próbkowanie obrazu z żądaną szybkością i rejestruj odpowiedź fluorescencyjną komórek obciążonych Fura-2, wzbudzając je na długościach fal 340 i 380 nm. Stosunek sygnałów 340/380 jest wskaźnikiem wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+, a tym samym również aktywności TRPV1.</li>
		<li>Dodać 2 μM kapsaicynę do 200 μl roztworu Ringera przez pipetowanie, aby uzyskać końcowe stężenie nasycające 1 μM kapsaicyny w celu oceny poziomu ekspresji TRPV1.</li>
		<li>Przeanalizuj odpowiedź TRPV1 zgodnie z czasem indukcji i określ protokół dla interesującego Cię białka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Regulacja ekspresji białek w układach heterologicznych przy użyciu całej konfiguracji komórkowej techniki patch clamp4,11.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór kąpieli z (mM) 140 NaCl, 2,3 KCl, 2MgSO4, 5 HEPES i 5 kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES), dostosowany do pH 7,4 za pomocą NaOH.</li>
		<li>Przygotować stężenia nasycające agonistę kanału w roztworze zewnątrzkomórkowym.</li>
		<li>Wyciągnąć szklane elektrody o średnicy wewnętrznej (ID) 1,10 mm i wypolerować ogniowo do rezystancji 2 - 4 MΩ.</li>
		<li>Przygotować roztwór pipet o stężeniu (mM) 130 KCl, 4 NaCl, 2MgSO4, 0,5 CaCl2, 1 EGTA i 10 HEPES o pH 7,2 z KOH. Przefiltruj roztwór pipety przed użyciem. Przed każdym eksperymentem pojedyncza, wypolerowana ogniowo szklana pipeta jest ponownie napełniana, zanurzając końcówkę w roztworze pipety na co najmniej minutę, a następnie napełniana za pomocą stopionej i rozciągniętej końcówki za pomocą strzykawki wypełnionej tym samym roztworem pipety.</li>
		<li>Delikatnie podnieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe pokryte PDL z platerowanymi komórkami z dołka na plastikową szalkę Petriego o średnicy 35 mm wypełnioną około 2 ml roztworu do kąpieli w temperaturze pokojowej. Obserwuj pod mikroskopem epifluorescencyjnym.</li>
		<li>Zlokalizuj dodatnią komórkę EGFP, jak pokazano za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, na przygotowanym szkiełku nakrywkowym i przejdź do środka wizualizowanego pola.</li>
		<li>Podłącz napełnioną pipetę do uchwytu pipety mikromanipulatora i wstrzyknij niewielką ilość dodatniego ciśnienia do systemu, aby uniknąć zanieczyszczenia wewnątrzkomórkowego roztworu pipety. Obniż go do poziomu tuż nad GFP - ogniwem dodatnim, sprawdzając prawidłową rezystancję.</li>
		<li>Gdy pipeta dotknie ogniwa, zastosuj niewielką ilość podciśnienia, aby utworzyć uszczelnienie GΩ między szklaną pipetą a membraną komórkową.</li>
		<li>Krótkim, ostrym impulsem ssania przerwij błonę komórkową, umożliwiając pipecie kontakt z wewnątrzkomórkową zawartością komórki.</li>
		<li>Przełącz tryb wzmacniacza na całe ogniwo i obniż filtr Bessela i wzmocnienie wyjściowe odpowiednio do 1 - 5 kHz i 0.5α.</li>
		<li>Rejestruj aktualną odpowiedź na stężenia nasycenia agonisty kanału za pomocą ramp napięcia lub protokołu bez przerw.</li>
		<li>Ponieważ wydajność ekspresji zmienia się między różnymi białkami, powtórz zapisy, używając różnych czasów trwania indukcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określanie idealnego czasu indukcji dla nagrań jednokanałowych4.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór (mM) 150 Na-glukonianu, 15 NaCl, 5 EGTA i 10 HEPES, dostosowany do pH 7,4 za pomocą NaOH, jako roztwór pipetowany. Do roztworu do kąpieli należy użyć roztworu z kroku 6.2.1.</li>
		<li>Powtórz procedurę z całą komórką przy użyciu szklanych pipet o średnicy wewnętrznej 0,86 mm, wypolerowanych ogniowo do rezystancji 10 - 12 MΩ i ustaw potencjał utrzymywania na -40 mV.</li>
		<li>Utwórz uszczelnienie na membranie, jak opisano wcześniej, i rozerwij membranę.</li>
		<li>Za pomocą mikromanipulatora podnieść pipetę z plastrem membranowym z dala od komórki.</li>
		<li>Umieścić system perfuzyjny bezpośrednio obok pipety zawierającej plaster membranowy.</li>
		<li>Zmniejsz filtr Bessela i wzmocnienie wyjściowe odpowiednio do 2 - 5 kHz i 10α.</li>
		<li>Perfuzja nasyca stężenia agonisty na łatkę błony, oceniając, czy plaster zawiera jeden lub więcej kanałów zgodnie z odpowiedzią.</li>
		<li>Przeanalizuj liczbę pomyślnie zarejestrowanych łat jednokanałowych w stosunku do czasu indukcji zastosowanego do komórek. Dostosuj czas indukcji zgodnie z pożądanymi wynikami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ooi, A., Wong, A., Esau, L., Lemtiri-Chlieh, F., Gehring, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Guide+to+Transient+Expression+of+Membrane+Proteins+in+HEK-293+Cells+for+Functional+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Guide to Transient Expression of Membrane Proteins in HEK-293 Cells for Functional Characterization.</a> Frontiers in Physiology. 7, 300(2016).</li>
<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).</li>
<li>Xu, X., Nagarajan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+sequence+of+the+Chinese+hamster+ovary+%28CHO%29-K1+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).</li>
<li>Hazan, A., Kumar, R., Matzner, H., Priel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pain+receptor+TRPV1+displays+agonist-dependent+activation+stoichiometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">The pain receptor TRPV1 displays agonist-dependent activation stoichiometry.</a> Scientific reports. 5, 12278(2015).</li>
<li>Kumar, R., Hazan, A., Basu, A., Zalcman, N., Matzner, H., Priel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+Residue+in+the+TRPV1+Vanilloid+Binding+Pocket+Regulates+Deactivation+Kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tyrosine Residue in the TRPV1 Vanilloid Binding Pocket Regulates Deactivation Kinetics.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (26), 13855-13863 (2016).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Preuss, A. K., Connor, J. A., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transfection+induces+different+intracellular+calcium+signaling+in+CHO+K1+versus+HEK+293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Transient transfection induces different intracellular calcium signaling in CHO K1 versus HEK 293 cells.</a> Cytotechnology. 33 (1-3), 139-145 (2000).</li>
<li>Dalton, A. C., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+secreted+proteins+from+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines.</a> Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Bohlen, C. J., Priel, A., Zhou, S., King, D., Siemens, J., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bivalent+tarantula+toxin+activates+the+capsaicin+receptor%2C+TRPV1%2C+by+targeting+the+outer+pore+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A bivalent tarantula toxin activates the capsaicin receptor, TRPV1, by targeting the outer pore domain.</a> Cell. 141 (5), 834-845 (2010).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6270629">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflügers Archiv European journal of physiology. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Jones, J., Nivitchanyong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+tetracycline-responsive+recombinant+protein+production+and+effect+on+cell+growth+and+ER+stress+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Optimization of tetracycline-responsive recombinant protein production and effect on cell growth and ER stress in mammalian cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 91 (6), 722-732 (2005).</li>
<li>Raphemot, R., Weaver, C. D., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels.</a> J Vis Exp. (71), e4209(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Transfekcja jest szeroko stosowanym protokołem do ekspresji białek i badań, z wieloma różnymi wariantami w celu poprawy spójności i stabilności ekspresji. Odczynniki do transfekcji przejściowej oferują prosty, łatwy w użyciu protokół, w którym komórka i białko będące przedmiotem zainteresowania mogą być analizowane w ciągu kilku godzin do nocy od momentu transfekcji. Niestety, takie podejście może być nieprzewidywalne, gdy tryb analizy wymaga stałego poziomu ekspresji białek, takich jak zapisy jednokanałowe w elektrofizj...

Heterologiczne systemy ekspresji to jedna z najczęściej używanych technik do badania wielu funkcji komórkowych1. Ich niski endogenny profil białkowy, minimalne wymagania dotyczące konserwacji, niezawodny wzrost oraz zdolność do pobierania i ekspresji obcego DNA sprawiły, że linie komórkowe, takie jak ludzka nerka embrionalna (HEK293) i jajnik chomika chińskiego (CHO) są prawie niezbędne do badań biologicznych2,3. Obszary badań z wykorzystaniem systemów heterologicznych obejmują białka błonowe, sygnalizację wewnątrzkomórkową i aktywność enzymatyczną. Po transfekcji obcego DNA do komórki można przeprowadzić wiele różnych form analizy, w tym elektrofizjologię, ratiometryczne obrazowanie wapnia, western blot itp.4,5.
Ze względu na szeroki wachlarz potencjalnych zastosowań dla heterologicznych systemów ekspresji, opracowano wiele różnych odczynników i produktów do wykorzystania tych komórek i ich właściwości6. Systemy dostarczania DNA, które przejściowo lub na stałe integrują obce DNA z komórkami w celu badania białka egzogennego, stały się jednym z najpopularniejszych i najbardziej użytecznych narzędzi do badań biologicznych. Mówiąc dokładniej, przejściowa transfekcja DNA do komórki jest szeroko stosowana jako prosty, nieskomplikowany proces, który wymaga stosunkowo niewiele czasu i materiałów. Co więcej, wskaźnik powodzenia komórek, które przechodzą transfekcję, jest wysoki7. Technika ta jest bardzo niezawodna w połączeniu z genem markerowym, takim jak białko zielonej fluorescencji (GFP), i może być stosowana w wielu różnych technikach, takich jak obrazowanie wapnia i elektrofizjologia5. Niestety, przejściowa ekspresja DNA w komórkach gospodarza wiąże się z pewnymi poważnymi pułapkami, między innymi z tym, że poziom ekspresji na komórkę jest niewiarygodny. Liczba kopii plazmidowego DNA pobranych na komórkę jest niekontrolowana, dlatego ekspresja między poszczególnymi eksperymentami może się znacznie różnić2. Problem ten staje się istotny, gdy próbuje się odtworzyć warunki fizjologiczne lub stosuje się precyzyjne techniki zbierania danych.
Jako rozwiązanie wyżej wymienionych komplikacji, zaprojektowano stabilne protokoły transfekcji, w których interesujący gen może być wstawiony do genomu komórki pod ścisłą kontrolą indukowalnego promotora, takiego jak system ekspresji represora tetracykliny, zapewniając, że pojedyncza kopia plazmidu integruje się z genomem każdej komórki i ulega ekspresji dopiero po indukcji mechanizmu transkrypcji, Na przykład w obecności doksycykliny. Chociaż rozwiązuje to przeszkody związane z niespójnymi poziomami ekspresji białek, metoda ta traci wygodę szybkiego i stosunkowo prostego protokołu przejściowych transfekcji. Ustanowienie stabilnej linii komórkowej zajmuje co najmniej kilka tygodni, w ciągu których należy skalibrować krzywą zabijania wyznaczoną przez określone antybiotyki, aby utrzymać ekspresję białka i zapewnić integrację wektora oraz umiejętnie selekcjonować i hodować kolonie komórkowe. Ogólnie rzecz biorąc, zajmuje to znacznie więcej czasu i wysiłku przy niższym wskaźniku sukcesu8.
Tutaj wprowadzamy protokół pośredni, który wykorzystuje mocne strony obu popularnych opcji transfekcji, aby zapewnić prosty i skuteczny sposób kontrolowania poziomów ekspresji w dowolnej indukowalnej linii komórkowej. Utrzymując komórki z indukowalnym układem tet, przejściowo transfekujemy nasz interesujący nas gen, podrodzinę kanałów kationowych przejściowego potencjału receptora V członka 1 (TRPV1), zligowany w wektor, który może homologicznie łączyć się z układem represorowym. W ten sposób gen może zostać wprowadzony do komórek bez rozpoczynania ekspresji. Dopiero po dodaniu doksycykliny gen zaczyna ulegać ekspresji, co pozwala nam skalibrować poziomy ekspresji białka zgodnie z techniką lub poziomami obserwowanymi w warunkach fizjologicznych. Nasz protokół pozwala również uniknąć długotrwałych komplikacji związanych z generowaniem linii komórkowej o stabilnej ekspresji. Zaczynamy od pokazania zmieniających się poziomów aktywacji TRPV1 w obrazowaniu wapnia od nieindukowanego przez cztery godziny indukcji i jak koreluje ze wzrostem wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia. Następnie powielamy protokół w całej konfiguracji ogniwa techniki patch clamp, pokazując rosnący prąd wraz ze wzrostem czasu indukcji. Na koniec przedstawiamy przykłady jednokanałowych zapisów elektrofizjologii i pokazujemy, że technika ta jest szczególnie przydatna do kontrolowanej ekspresji, gdy szuka się precyzyjnego zbierania danych na podstawie poszczególnych jednostek białka. Dzięki naszemu protokołowi oferujemy wygodny sposób kontrolowania ekspresji białek w systemach heterologicznych przy jednoczesnym unikaniu długotrwałych komplikacji związanych z hodowlą komórkową, zapewniając w ten sposób sposób kontrolę warunków między eksperymentami i zapewniając bardziej powtarzalne wyniki.

<table><tbody><tr><td>pcDNA&handel; 4/TO Wektor ekspresji ssaków</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V102020</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA&handel; 5/TO Wektor ekspresji ssaków</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V103320</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Zestaw do szybkiego oczyszczania PCR</td><td>Invitrogen</td><td>K310001</td><td></td></tr><tr><td>Swift&trade; &nbsp; Termocykler MaxPro</td><td>Esco&nbsp;</td><td>n.d</td><td></td>.</tr><tr><td>Enzymy restrykcyjne</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>ER0501</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Szybki zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Invitrogen</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>One Shot&reg; TOP10 Chemicznie kompetentnych E. coli</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>C404006&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina (sód), złoto klasy USP</td><td>Bio</td><td>A-301-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypton do mikrobiologii</td><td>Merck</td><td>6.19305E+13</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>BD na całym świecie</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>SIF6000R Inkubowany shaker</td><td>LAB COMPANION</td><td>45H118</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin&reg; plazmid</td><td>Macherey Nagel</td><td>740588.25</td><td></td></tr><tr><td>MS 300V Zasilacz</td><td>Major Science</td><td>MP-300V</td><td></td></tr><tr><td>Owl&trade; EasyCast&handel; B1A Mini żelowy system elektroforezy</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>T-REx&trade;-293 linia komórkowa</td><td>Invitrogen</td><td>R710-07</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x), płynny (o wysokiej zawartości glukozy)</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF&reg;</td><td>NEB</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>ApaI</td><td>NEB</td><td>R0114S</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart&reg; Bufor</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA&handel; 6/TR&nbsp; Wektor ekspresji ssaków</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V102520</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS), kwalifikowana, zatwierdzona przez UE, pochodząca z Ameryki Południowej</td> Roztwór buforowy <td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-alanylo-L-glutamina (stabilna Glutamina) (200 mM)</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>03-022-1B</td><td></td></tr><tr><td>Heracell&trade; 150i Inkubator CO2</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>51026406</td><td></td></tr><tr><td>MSC-Advantage&trade; Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>51025411</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek blastycydyny S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15205-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) Modyfikowana, bez chlorku wapnia i chlorku magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr metalizowany w kratkę Neubauera</td><td>Hausser Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowana surowica Medium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TransIT&reg;- Odczynnik do transfekcji LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>szklane szkiełka nakrywkowe, grubość #1, średnica 12 mm okrągłe</td><td>szkło Knittel Glass</td><td>GG-12</td><td></td></tr><tr><td>BioCoat&trade; Poli-D-lizyna (PDL)</td><td>Corning</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>Woda, klasa kultury komórkowej</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>03-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>Hyklalat doksycykliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2, AM ester</td><td>Biotium</td><td>BTM-50034</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic&reg; F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide 8 Well</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>(E)-Kapsaicyna</td><td>Tocris</td><td>462</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX70 Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>b.a</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG-4 Przełącznik długości fali</td><td>Sutter Instruments</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>EXi Kamera do mikroskopii fluorescencyjnej niebieskiej</td><td>QImaging</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania współczynnika fluorescencji MetaFluor</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenne rurki borokrzemianowe</td><td>Instrumenty Sutter</td><td>B150-110-7,5HP</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe rurki borokrzemianowe</td><td>Instrumenty Sutter</td><td>B150-86-7,5HP</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>P1000 ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>MF-900 Microforge</td><td>NARISHIGE</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>System perfuzji ValveBank</td><td>AutoMate Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata&reg; 1440A Niskoszumowy system akwizycji danych</td><td>Molecular Devices</td><td>b.a</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B Wzmacniacz</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10.6 Oprogramowanie</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>b.a</td><td></td></tr><tr><td>mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td></td></tr></tbody></table>

kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfekcja, czyli dostarczanie obcych kwasów nukleinowych do komórki, jest potężnym narzędziem w badaniach nad białkami. Dzięki tej metodzie kanały jonowe mogą być badane poprzez analizę elektrofizjologiczną, charakterystykę biochemiczną, badania mutacji i ich wpływ na procesy komórkowe. Transfekcje przejściowe oferują prosty protokół, w którym białko staje się dostępne do analizy w ciągu kilku godzin do kilku dni. Chociaż metoda ta przedstawia stosunkowo prosty i efektywny czasowo protokół, jednym z krytycznych elementów jest kalibracja ekspresji interesującego genu do fizjologicznie odpowiednich poziomów lub poziomów, które są odpowiednie do analizy. W tym celu pojawiło się wiele różnych podejść, które oferują możliwość kontrolowania ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania. Kilka stabilnych protokołów transfekcji komórek zapewnia sposób na trwałe wprowadzenie interesującego genu do genomu komórkowego pod kontrolą aktywacji transkrypcji kontrolowanej przez tetracyklinę. Chociaż technika ta zapewnia wiarygodne poziomy ekspresji, każdy gen będący przedmiotem zainteresowania wymaga kilku tygodni wykwalifikowanej pracy, w tym kalibracji krzywej zabijania, selekcji kolonii komórkowych i ogólnie większej ilości zasobów. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który wykorzystuje transfekcję przejściowego genu TRPV1 (Transient Receptor Potential kation channel subfamily V member 1) w systemie indukowalnym jako skuteczny sposób ekspresji białka w kontrolowany sposób, co jest niezbędne w analizie kanałów jonowych. Pokazujemy, że za pomocą tej techniki jesteśmy w stanie przeprowadzić obrazowanie wapnia, analizę całych komórek i pojedynczych kanałów z kontrolowanymi poziomami kanałów wymaganymi dla każdego rodzaju zbierania danych za pomocą jednej transfekcji. Ogólnie rzecz biorąc, zapewnia to powtarzalną technikę, którą można wykorzystać do badania struktury i funkcji kanałów jonowych.

Aby szybko stworzyć indukowalny model ekspresji, wykorzystaliśmy komórki HEK293 wykazujące ekspresję białka represora tetracykliny (TR) (np. T-REx-293) oraz wektory zawierające sekwencje operatora tetracykliny (TetO) pomiędzy promotorem CMV a wielokrotny miejscem klonowania (np. pcDNA4/TO). Po transfekcji do komórek TREx-293 ekspresja genu zainteresowania w pcDNA4/TO jest represowana, ponieważ TR wiąże się z TetO. Dodanie doksycykliny do medium zapobiega oddziaływaniu TR...

Badanie kanałów jonowych za pomocą heterologicznie wyrażającego systemu stało się podstawową techniką w badaniach biomedycznych. W tym manuskrypcie przedstawiamy efektywną czasowo metodę osiągania ściśle kontrolowanej ekspresji kanału jonowego poprzez przeprowadzanie transfekcji przejściowej pod kontrolą indukowalnego promotora.

Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zapewnienie wygodnego sposobu kontroli ekspresji kanałów jonowych w systemach heterologicznych, przy jednoczesnym uniknięciu komplikacji związanych z długotrwałą hodowlą komórkową. Umożliwia to kontrolę warunków pomiędzy eksperymentami i pozwala na uzyskanie bardziej powtarzalnych wyników. Metoda ta może ułatwić prowadzenie badań w dziedzinie kanałów jonowych.Przykładem jest charakteryzowanie właściwości kanałów w farmakologii. Obecne metody są albo zbyt złożone, albo wykazują niespójną ekspresję białek. Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania kontrolowanych poziomów ekspresji szerokiego spektrum białek, dostosowanych do poszczególnych eksperymentów, w stosunkowo krótkim czasie.Aby rozpocząć tę procedurę, przenieść komórki TREX 293 do płytki 12-dołkowej przygotowanej z 0,9 ml pełnej pożywki DMEM na dołek, aby uzyskać 50% konfluencję. Następnie inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2. W kolejnym kroku przygotować mieszaninę do transfekcji składającą się z DMEM, genu zainteresowania, pokazanego tutaj jako TRPV1, inertnego plazmidu oraz lipidowego odczynnika do transfekcji.W przypadku eksperymentów elektrofizjologicznych, do koktajlu transfekcyjnego należy dodać plazmid ekspresyjny ssaków zawierający EGFP w celu wizualizacji komórek, które zostały pomyślnie poddane transfekcji. Mieszaninę do transfekcji inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie przeprowadzić transfekcję komórek, n nanosząc mieszaninę transfekcyjną kroplowo na komórki wysiane w płytce 12-dołkowej.Energicznie potrząśnij płytką, aby zapewnić jednorodne rozprzestrzenienie DNA i odczynnika do transfekcji. Następnie inkubuj transfektowane komórki przez noc w temperaturze 27 °C. Następnego dnia rano, w przypadku przeprowadzania elektrofizjologii, potwierdź pomyślną transfekcję komórek, obserwując sygnał fluorescencyjny EGFP pod lampą UV.W przypadku prowadzenia badań elektrofizjologicznych należy przenieść komórki z płytki 12-dołkowej na szkiełka nakrywki powlekane PDL w 500 µL pełnej pożywki DMEM. W przypadku obrazowania wapnia należy nanieść około 20 000 komórek do komór do obrazowania wapnia powlekanych PDL. W ramach tej procedury należy przygotować roztwór zapasu doksycykliny o stężeniu 1 mg/mL w wodzie dwukrotnie destylowanej.Przechowywać roztwór zapasowy w ciemności w temperaturze 4°C przez maksymalnie trzy tygodnie. W celu długoterminowego przechowywania roztwór zapasowy doksycykliny należy trzymać w temperaturze -20°C. Następnie przygotować świeży roztwór doksycykliny w pełnej pożywce DMEM.Następnie ogrzać do 37 °C. W przypadku pomiarów elektrofizjologicznych, do każdej studzienki nalać pipetą 500 µL roztworu doksycykliny o stężeniu 2 µg/mL, aby uzyskać końcowe stężenie doksycykliny wynoszące 1 µg/mL. W przypadku obrazowania wapnia, do każdej studzienki dodać 100 µL roztworu doksycykliny o stężeniu 3 µg/mL, aby uzyskać końcowe stężenie doksycykliny wynoszące 1 µg/mL.Inkubuj próbkę przez pożądany czas indukcji w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Aby skalibrować ekspresję białka za pomocą obrazowania wapnia, przygotuj roztwór Ringera i ogrzej go do 37 °C. Aby pomóc w dyspersji estrów AM, które są fluorescencyjnymi wskaźnikami jonów, takich jak Fura-2 w roztworach wodnych, przygotuj roztwór niejonowego F-127 w DMSO.Podgrzej roztwór do 27 °C, aż niejonowy F-127 się rozpuści. Następnie przechowuj roztwór niejonowego F-127 w temperaturze pokojowej i przed użyciem ponownie podgrzej go do 37 °C. Po tym przygotuj roztwór ładujący Fura-2 AM z roztworu Ringera, uzupełnionego o 2–3 µM Fura-2 AM, 0,2 mg/mL niejonowego F-127 oraz 10 mM D-glukozy.Następnie odessaj pożywkę z komórek w komorach i zastąp ją roztworem ładującym Fura-2 AM. Inkubuj komórki przez 60 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Po tym czasie odessaj roztwór Fura-2 AM.Następnie należy opłukać komórki roztworem Ringera z 10 mM D-glukozy, aby usunąć barwnik pozakomórkowy. W każdej próbce należy pozostawić 200 µL roztworu Ringera z 10 mM D-glukozy. Następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.Po 30 minutach umieść komorę na stoliku nad obiektywami mikroskopu i zabezpiecz ją uchwytem. Następnie oblicz i przygotuj stężenie robocze specyficznego agonisty TRPV1, kapsaicyny, zgodnie z pożądanym stężeniem końcowym. Następnie włącz lampę, kamerę oraz mikroskop i wybierz filtr Fura-2, aby wykryć emisję o długości fali 510 nanometrów.Ustaw pożądane powiększenie i wyostrz obraz komórek w wybranym polu widzenia, manipulując tymi parametrami za pomocą pokręteł mikroskopu. W ciemności odejmij światło tła i ustaw czas ekspozycji. Ustaw częstotliwość próbkowania obrazu zgodnie z potrzebami.Następnie należy rozpocząć od rejestracji odpowiedzi fluorescencyjnej komórek obciążonych barwnikiem Fura-2 poprzez ich wzbudzanie przy długościach fal 340 nm i 380 nm. Stosunek sygnałów 340 do 380 jest wskaźnikiem wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia, a tym samym również aktywności TRPV1. Następnie należy dodać 2 µM kapsaicyny w 200 µL roztworu Ringera, aby uzyskać końcowe nasycające stężenie 1 µM kapsaicyny w celu oceny poziomu ekspresji TRPV1 i analizy odpowiedzi TRPV1.Aby określić optymalny czas indukcji dla rejestracji pojedynczego kanału, należy najpierw przygotować roztwory do kąpieli i do pipety. Następnie należy przygotować szklane pipety, wypolerowane ogniowo do rezystancji od 10 do 12 megaohmów. Przeprowadź rejestrację metodą patch clamp w konfiguracji whole cell, tworząc uszczelnienie na błonie wybranej komórki.Następnie ustaw potencjał holdingowy na -40 mV. Przerwij błonę, przykładając podciśnienie. Po tym wykonaj ruch mikromanipulatorem, aby odsunąć pipetę z fragmentem błony od komórki.Następnie umieść system perfuzji bezpośrednio obok pipety zawierającej patch błonowy. Obniż częstotliwość filtra Bessela oraz wzmocnienie wyjściowe odpowiednio do 2–5 kHz i 10 A. Następnie przeprowadź perfuzję nasycających stężeń agonisty na patch błonowy.Następnie należy przeanalizować liczbę poprawnie zarejestrowanych patchy pojedynczego kanału w stosunku do czasu indukcji zastosowanego do komórek i dostosować czas indukcji zgodnie z pożądanymi wynikami. Przedstawione tutaj obrazy w pseudokolorach ukazują komórki TREX 293 przejściowo ekspresyjne dla RTRPV1, przed i po zastosowaniu kapsaicyny. Tutaj natomiast znajdują się odpowiadające im zmiany wewnątrzkomórkowych poziomów wapnia w czasie w traktowanych, transfektowanych komórkach TREX 293.Każdy wykres przedstawia średnią z 50 komórek. Odsetek sukcesu w wykonaniu patch-clampu jednokanałowego w rejestracjach TRPV1 zależy od czasu indukcji. Przedstawiono tutaj przebiegi prądowe patchy z komórek TREX 293 przejściowo ekspresujących RTRPV1 po dwóch i czterech godzinach indukcji.Wykres ten przedstawia liczbę kanałów w płacie po wskazanym czasie indukcji. Technika ta, przy prawidłowym wykonaniu, umożliwia analizę białka o kontrolowanej ekspresji w ciągu 12 godzin od transfekcji. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o ustandaryzowaniu stężeń transfekcyjnych oraz czasu indukcji dla różnych białek.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak w sposób wydajny czasowo stworzyć kontrolowany system ekspresji dla wybranego przez siebie jonu.

controllable-ion-channel-expression-through-inducible-transient

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Przedstawimy sposób badania wpływu pojedynczej mutacji punktowej na funkcję kanału jonowego.

Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

Niezawodna metoda wysokowydajnej ekspresji in vitro i następującego po niej zapisu elektrofizjologicznego rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowlach ludzkich komórek embrionalnej nerki (HEK-293T).

Zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach HEK-293T

Źródło: Berens, C. i in. Zastosowanie systemu indukowalnej ekspresji do badania interferencji czynników zjadliwości bakteryjnej z sygnalizacją wewnątrzkomórkową. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do identyfikacji, gdzie bakteryjne białko efektorowe CaeB zakłóca apoptotyczną kaskadę gospodarza. Opisuje ona kroki transfekujące komórki ekspresujące CaeB za pomocą systemu reagującego na tetracyklinę, aby indukować ekspresję genów pro-apoptotycznej w...

Transfekcja indukowalnego systemu ekspresji genów do komórek ekspresujących bakteryjne białko efektorowe

Ten film opisuje metodę regulacji ekspresji genów w hodowanych komórkach poprzez transfekcję plazmidem zawierającym interesujący nas gen i plazmid regulatorowy. Ekspresja tego plazmidu może być kontrolowana przez tetracyklinę lub jej syntetyczne analogi, co czyni ten system użytecznym modelem do badania regulowanej ekspresji genów.

Indukowalny system regulowany Tet-Off: metoda in vitro do modulacji ekspresji genów w hodowanych komórkach przy użyciu systemu Tetracyklina-Off

Opisana tutaj metoda jest używana do indukowania kaskady sygnalizacji apoptotycznej na określonych etapach w celu zbadania aktywności antyapoptotycznego bakteryjnego białka efektorowego. Metoda ta może być również stosowana do indukowalnej ekspresji białek proapoptotycznych lub toksycznych lub do analizowania interferencji z innymi szlakami sygnałowymi.

Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową

Dziedziczne zaburzenia rytmu serca są często spowodowane mutacjami, które zmieniają powierzchniowe dostarczanie jednego lub więcej kanałów jonowych. Tutaj dostosowujemy testy cytometrii przepływowej, aby zapewnić ilościowe określenie względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji białek w rekombinowanych kanałach jonowych ulegających ekspresji w komórkach tsA-201.

Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej

Nielityczne systemy ekspresji komórek owadów są niedostatecznie wykorzystywane do produkcji, transportu/lokalizacji komórkowej i analizy funkcjonalnej białek rekombinowanych. W tym miejscu opisujemy metody generowania wektorów ekspresyjnych i późniejszej przejściowej ekspresji białek w dostępnych na rynku liniach komórkowych lepidoptera. Przedstawiono również kolokalizację akwaporyn Bemisia tabaci z subkomórkowymi białkami markerowymi fluorescencyjnymi.

Przejściowa ekspresja i lokalizacja komórkowa rekombinowanych białek w hodowanych komórkach owadów

Tutaj prezentujemy protokół modulacji ekspresji transgenu za pomocą przełącznika pojedynczego genu pEUI(+) przez leczenie tebufenozydem.

Przełącznik pojedynczego genu oparty na receptorze ekdyzonu do celowej ekspresji transgenu z solidnością, odwracalnością i znikomą nieszczelnością

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju dominująco-ujemnego systemu indukcyjnego, w którym każde białko może być warunkowo dezaktywowane przez odwracalną nadekspresję jego dominująco-ujemnej wersji zmutowanej.

Indukowalne i odwracalne hamowanie białka dominująco-ujemnego (DN)

Badanie opisuje metodę eksperymentów o wysokiej przepustowości z wykorzystą matrycę LED drukowaną w 3D, aby zoptymalizować ekspresję genów indukowanych światłem w HEK293T komórkach.

Szybka optymalizacja systemu indukowalnego światłem do kontroli ekspresji genów ssaków

Poznaj metodę kontrolowanej ekspresji kanałów jonowych poprzez indukowalną transfekcję przejściową w komórkach TREX 293. Technika umożliwia szybkie badanie właściwości farmakologicznych z powtarzalnymi wynikami.

Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Przeglądaj więcej filmów