Wdrożenie AAV konstruktów ekspresyjnych opartych na wzmacniaczu in vivo w mózgu myszy

Protokół ten jest istotny, ponieważ umożliwia wizualizację nie tylko tego, czy sekwencja wzmacniacza może sterować ekspresją, ale także tego, gdzie może kierować ekspresją w określonej części ciała. Jest szybki. Wstrzyknięcia trwają mniej niż 10 minut, a to, czy i gdzie gen reporterowy ulega ekspresji, można zobaczyć w ciągu zaledwie kilku dni od pobrania próbki.

Aby rozpocząć klonowanie, wybierz lub zaprojektuj konstrukcję reportera. Zastosowany tutaj konstrukt umieszcza kandydata na wzmacniacz w trzech głównych regionach nieulegających translacji genu reporterowego EGFP ulegającego ekspresji pod kontrolą minimalnego promotora hsp68. Aby zaprojektować startery PCR do amplifikacji interesującej sekwencji i klonowania do wektora, dodaj odpowiednie ramię homologiczne do klonowania Gibsona do pięciu pierwszych końców starterów.

Korzystając z zaprojektowanych starterów, wykonaj PCR z próbki DNA. Trawić od jednego do 10 mikrogramów DNA wektora przy użyciu Pac1 i Asc1, w zależności od pożądanej liczby wymaganych reakcji klonowania. Stosując elektroforezę żelową od 0,7 do 1% przez 30 do 60 minut przy napięciu 100 woltów, oddziel fragmenty trawienia restrykcyjnego.

Wyodrębnij pasmo dla zlinearyzowanego wektora i oczyść go za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu. Po zakończeniu klonowania i transformacji komórek Gibsona, umieść komórki na selektywnych pożywkach i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po sprawdzeniu, czy udało się sklonować konstrukt reporterowy, zaszczepić pięć mililitrów kultury starterowej przy użyciu zapasu glicerolu.

Hoduj kulturę przez osiem do 16 godzin w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 180 obrotach na minutę. Gdy bulion stanie się mętny, rozcieńczyć kulturę starterową 1 000 razy w 250 do 300 mililitrach świeżego selektywnego bulionu LB i inkubować ją przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 180 obrotach na minutę. Korzystając z komercyjnego zestawu maxi plazmidu, oczyść plazmid.

Aby przetestować rekombinację ITR, należy przeprowadzić mineralizację Xma1. Wizualizacja pasm. Upewnij się, że podsumowanie pokazuje oczekiwaną liczbę pasm.

Rekombinacja spowoduje powstanie mniejszej liczby pasm niż oczekiwano. Przygotuj rekombinowaną mieszaninę AAV do podawania. Porównując wzorce ekspresji wielu wirusów reporterowych wzmacniających, rozcieńczyć każdego wirusa, aby zrównać miana wirusa z najmniej skoncentrowanym wirusem.

Zmieszać wirusa reporterowego wzmacniacza i konstytutywnie wyrażonego wirusa reporterowego kontrolnego w stosunku dwa do jednego lub trzy do jednego. Dodaj niewielką ilość szybkiego zielonego barwnika o końcowym stężeniu 0,06%Rozbij końcówkę wyciągniętej szklanej pipety wykonanej z mikrolitrowej rurki kapilarnej, delikatnie przekłuwając ją w delikatną, niestrzępiącą się chusteczkę. Włóż pipetę do zespołu aspiratora z urządzeniem do wywierania ciśnienia połączonym z gumową uszczelką do przytrzymywania pipety mikrokapilarnej.

Wlej niewielką objętość około 0,2 do 0,5 mikrolitra oleju mineralnego do pipety, wywierając podciśnienie przez aspirator. Odłóż zespół aspiratora na bok i umieść wirusa na lodzie, aż będzie gotowy do wstrzyknięcia. Po krioznieczuleniu nowonarodzonych myszy należy zastosować podciśnienie za pomocą zespołu aspiratora i wciągnąć mieszaninę wirusów do wyciągniętej szklanej pipety, aż menisk przekroczy znacznik dwóch mikrolitrów.

Wyjmij mysz z zimnej komory i połóż ją na blacie stołu. Zlokalizuj obustronne miejsca wstrzyknięć w połowie drogi między lambdą a bregmą, a także szew strzałkowy i każde oko. Zdezynfekuj je chusteczką nasączoną alkoholem.

Przekłuj czaszkę nowonarodzonych myszy za pomocą wyciągniętej szklanej pipety. Gdy igła wejdzie do czaszki, zastosuj nadciśnienie przez zespół aspiratora. Dozować jeden mikrolitr wirusa do komory bocznej i wyjąć pipetę.

Umieść mysz na poduszce grzewczej lub komorze grzewczej, aby odzyskać sprawność. Po przebudzeniu zwierzę należy umieścić w klatce domowej. Rejestruj obrazy fluorescencyjne przecinające część mózgu za pomocą obiektywu subiektywnego o małym powiększeniu 5x.

Lokalizując miejsce wstrzyknięcia, oceń zakres transdukcji wirusa, w zależności od gęstości i intensywności czerwonych komórek fluorescencyjnych. Porównaj zwierzęta, które zostały transdukowane w podobny sposób. Rejestruj obrazy fluorescencyjne za pomocą obiektywu o większym powiększeniu niż 25x.

Następnie otwórz oprogramowanie analityczne i zastosuj filtr mediany trzy na trzy, aby zredukować szum. Kliknij menu Proces, a następnie kliknij Szum i wybierz opcję Usuń plamki. Następnie, aby odjąć fluorescencję tła od obrazów, zacznij od oddzielenia kanałów obrazu wielokanałowego.

Kliknij menu Obraz, a następnie kliknij Kolor i wybierz opcję Podziel kanały. Korzystając z narzędzia do zaznaczania prostokąta lub okręgu, narysuj mały kształt w obszarze obrazu bez komórek fluorescencyjnych. Zmierz średnią intensywność pikseli tła, klikając Analizuj, a następnie Zmierz i powtórz, aby pobrać próbkę wiele razy.

Uśrednij średnią wartość szarości z pięciu do ośmiu obszarów tła i upuść wartości dziesiętne. Odejmij wartości od każdego piksela obrazu, wybierając menu Proces, a następnie kliknij polecenie Matematyka i odejmij. Następnie wprowadź wartość tła do odjęcia, i kliknij przycisk OK. W razie potrzeby scal kanały z powrotem w obraz wielokanałowy, wybierając menu Obraz, a następnie kliknij Kolor i wybierz Scal kanały.

Aby policzyć liczbę zielonych komórek fluorescencyjnych, ukryj zielony kanał i narysuj kształt wokół obszaru mózgu wyrażającego czerwoną fluorescencję za pomocą narzędzia do zaznaczania dowolnego. Kliknij funkcję Zmierz, aby zmierzyć obszar, zintegrowaną gęstość i średnią wartość szarości kanału czerwonego w wybranej strefie. Policz liczbę zielonych komórek za pomocą narzędzia do zaznaczania wielopunktowego i znormalizuj liczbę zielonych komórek przez zintegrowaną intensywność kanału czerwonego.

Po transdukcji wzmacniacza, reporterowi, który mysz wstrzyknięto doczaszkowo w P0 z dodatnim konstruktem AAV, wykazał ekspresję EGFP napędzaną wzmacniaczem w środkowych dolnych warstwach kory 28 dni po wstrzyknięciu. Mysz, której wstrzyknięto kontyk kontroli ujemnej w P0, nie wykazuje żadnej ekspresji EGFP 28 dni po wstrzyknięciu, co pokazuje, że stwierdzono, że elementy wzmacniające napędzają transkrypcję EGFP w mózgu myszy. Aby zobrazować pomyślnie transdukowany obszar i kontrolować potencjalną zmienność, zbadano biblioteki reporterowe wzmacniaczy różnych mian dostarczane przez AAV.

Biblioteka o wysokim mianie potencjalnych wzmacniaczy napędza szeroką ekspresję EGFP, podczas gdy biblioteka o niższym mianie potencjalnych wzmacniaczy napędza rzadką ekspresję CGFP w mózgu myszy P7. Bardzo ważne jest, aby przy każdym wstrzyknięciu wymieszać wzmacniacz reporterowy AAV z kontrolą pozytywną, aby odróżnić wzmacniacze bez aktywności od nieudanych dostaw. Procedurę tę można połączyć z immunohistochemią, RNA FISH lub sekwencjonowaniem RNA pojedynczej komórki w celu określenia, w których typach komórek aktywny jest wzmacniacz.