Name: Wdrożenie AAV konstruktów ekspresyjnych opartych na wzmacniaczu in vivo w mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Poznaj metodę rAAV do wizualizacji aktywności wzmacniaczy w mózgu myszy. Protokół umożliwia szybką ocenę ekspresji genu reporterowego EGFP w określonych regionach kory mózgowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sekwencjonowanie zostało przeprowadzone w UC Davis DNA Technologies Core. Dziękujemy laboratorium Lin Tian na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis za szkolenie w zakresie pakowania rAAV i hojne podarowanie nam plazmidów pomocniczych AAV i rep/cap. Prace te były wspierane przez NIH/NIGMS R35GM119831.

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Protokół ten opisuje opartą na rAAV metodę wdrażania transgenów napędzanych wzmacniaczem w mózgu myszy po urodzeniu. W tym uogólnionym protokole kandydat na wzmacniacz, minimalny promotor, gen reporterowy i opcjonalna sekwencja kodu kreskowego są klonowane do szkieletu plazmidu AAV. Eksperymenty te można przeprowadzić z pojedynczą sekwencją wzmacniacza kandydującego lub z wieloma sekwencjami równolegle. Plazmid jest pakowany w rAAV i dostarczany do mózgu myszy po urodzeniu. Po pewnym czasie, aby umożliwić transdukcję wir...

Wzmacniacze to genomowe elementy cis-regulatorowe, które służą jako miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych i mogą sterować ekspresją docelowego genu w sposób specyficzny czasowo1,2. Są one różnie aktywne w różnych typach komórek, tkankach i stadiach rozwoju i mogą być substratami zmienności genomowej związanej z ryzykiem choroby3,4. W związku z tym potrzeba zrozumienia dynamiki funkcji wzmacniacza ma kluczowe znaczenie dla postępu zarówno w zastosowaniach translacyjnych, jak i podstawowych w genomice. Przewidywania in silico aktywności wzmacniacza mogą służyć jako doskonałe zasoby do generowania hipotez dotyczących zdolności wzmacniacza5,6. Taka przewidywana aktywność wzmacniacza może wymagać dodatkowej walidacji i przesłuchania w celu pełnego zrozumienia aktywności funkcjonalnej. Testy reporterowe Enhancer okazały się cenne w tym celu w różnych systemach, od komórek po zwierzęta7,8,9. W celu rozszerzenia tych badań na elastyczny i opłacalny kontekst przejściowy in vivo, protokół ten opisuje zastosowanie metod opartych na AAV in vivo do testowania przypuszczalnych sekwencji wzmacniających pod kątem ich zdolności do kierowania ekspresją ektopowego genu reporterowego w mózgu myszy po urodzeniu. Ta rodzina metod jest przydatna do badania pojedynczych sekwencji kandydujących lub równoległego przesiewu bibliotek i jest istotna dla badań podstawowych i translacyjnych.
Ta metoda łączy w pojedynczym plazmidzie przypuszczalną sekwencję DNA kandydata na wzmacniacz z genem reporterowym (tutaj EGFP), pod kontrolą minimalnego promotora, który sam w sobie nie napędza znaczącej ekspresji. Plazmid jest pakowany w rekombinowany AAV (rAAV) i wstrzykiwany do modelu zwierzęcego. Chociaż zastosowanie dotyczy to mózgu, różne serotypy rAAV umożliwiają infekcję w różnych typach tkanek, dzięki czemu podejście to można rozszerzyć na inne systemy10. Po pewnym czasie mózg może zostać pobrany i przetestowany pod kątem ekspresji genu reporterowego. Silna ekspresja w porównaniu z grupą kontrolną wskazuje, że testowana sekwencja kandydująca była w stanie "zwiększyć" ekspresję genu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). Ta prosta konstrukcja oferuje łatwe i przejrzyste podejście do testowania sekwencji pod kątem aktywności wzmacniacza in vivo w mózgu.
Oprócz testowania zdolności wzmacniania sekwencji, ta metoda może być połączona z technikami określania aktywności wzmacniacza typu komórkowego. W podejściach opartych na sekwencjach do określania zróżnicowanej aktywności wzmacniacza, sortowanie komórek według markerów specyficznych dla typu komórki przed sekwencjonowaniem DNA i RNA może pozwolić badaczom określić, czy różne typy komórek wykazują różnicową aktywność wzmacniającą, jak opisano w Gisselbrecht i wsp.11. W podejściach opartych na obrazowaniu, wspólne znakowanie obrazów markerami specyficznymi dla typu komórki pozwala na zbadanie, czy komórki wykazujące fluorescencję sterowaną wzmacniaczem wyświetlają również interesujące markery typu komórki12,13,14,15,16. Testy reporterowe wzmacniacza umożliwiają bezpośrednie testowanie związanych z ryzykiem zmienności alleli w wzmacniaczach pod kątem wpływu na zdolność wzmacniacza. Zdecydowana większość loci ryzyka zidentyfikowanych w badaniach asocjacyjnych całego genomu (GWAS) leży w niekodujących regionach genome17. Badania adnotacji funkcjonalnych tych loci ryzyka wskazują, że duża część z nich prawdopodobnie działa jako wzmacniacze18,19,20. Wdrożenie MPRA in vivo może umożliwić testowanie tych wariantów związanych z ryzykiem pod kątem aktywności wzmacniacza w brain12,21. Wreszcie, dostawa i odbiór w różnych punktach czasowych może zapewnić wgląd w etapy rozwoju, podczas których wzmacniacz jest aktywny.
Projekty plazmidów wzmacniająco-reporterowych są różnorodne i mogą być dostosowane do celów eksperymentalnych. Istnieje kilka opcji minimalnych promotorów, które zostały wykorzystane w badaniach nad wzmacniaczami, takich jak ludzki β-globinowy minimalny promotor22 i mysi Hsp68 minimalny promotor23. Wiadomo, że te promotory napędzają niski poziom ekspresji, chyba że w połączeniu z elementem wzmacniającym, który je aktywuje. W przeciwieństwie do tego, konstytutywne elementy promotorowe napędzają silną ekspresję transgenu, przydatną do kontroli pozytywnej lub do testowania funkcji wzmacniacza na tle silnej ekspresji. Typowe wybory dla konstytutywnych promotorów obejmują CAG, hybrydowy promotor pochodzący z promotora β-aktyny kurczaka i wirusa cytomegalii natychmiast-wczesnego wzmacniacza24, lub ludzki EF1α25. Ponieważ wiadomo, że wzmacniacze działają dwukierunkowo26, orientacja i położenie wzmacniacza względem minimalnego promotora są elastyczne (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Tradycyjne testy enhancer-reporter umieszczają wzmacniacz przed promotorem, a w przypadku dostaw bibliotecznych zawierają sekwencję kodu kreskowego za genem reporterowym, aby skojarzyć odczyty sekwencjonowania z testowanym enhancer27. Jednak wzmacniacze mogą być również umieszczane w otwartej ramce odczytu genu reporterowego i służyć jako własna sekwencja kodu kreskowego, tak jak ma to miejsce w STARR-seq28. Opisany tutaj protokół wykorzystuje projekt testu STARR-seq, umieszczając kandydującą sekwencję wzmacniacza w 3' UTR genu reporterowego. Chociaż orientacja STARR-seq oferuje korzyści w postaci bardziej usprawnionego klonowania, jest ona mniej dobrze poznana niż podejście konwencjonalne i może indukować zmienną stabilność RNA między konstruktami. Opisane metody można łatwo dostosować zarówno do orientacji STARR-seq, jak i konwencjonalnej, z niewielkimi zmianami w procesie klonowania, które zostały opisane gdzie indziej27,29.
Różne metody dostarczania AAV mogą być stosowane w celu dalszego dostosowania tej techniki do celów eksperymentalnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Bezpośrednie wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowe, opisane w dalszej części tego protokołu, dostarczają wysokie stężenie wirusa bezpośrednio do mózgu30. Daje to wysoką wydajność transdukcji wyśrodkowaną w miejscu wstrzyknięcia, co czyni ją doskonałą techniką do eksperymentów mających na celu maksymalizację gęstości transdukowanych komórek na obszarze tkanki. Wstrzyknięcie stereotaktyczne może pomóc w standaryzacji miejsca wstrzyknięcia u zwierząt w celu uzyskania powtarzalnej transdukcji miejscowej. Wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowe są najprostsze u zwierząt we wczesnym okresie pourodzeniowym. Jako alternatywna technika, zastrzyki ogólnoustrojowe mogą dostarczać transgeny za pomocą AAV z serotypami zdolnymi do przekraczania bariery krew-mózg31. Wstrzyknięcia do żyły ogonowej pozwalają wirusowi krążyć po całym ciele, umożliwiając uogólnione dostarczanie do wielu tkanek10. Zastrzyki zaoczodołowe to kolejna technika iniekcji ogólnoustrojowych, która dostarcza wirusa za oko do zatoki zaoczodołowej32. Oferuje to bardziej bezpośrednią drogę dla AAV z układu żylnego do mózgu, co skutkuje wyższym stężeniem transdukowanych komórek w mózgu niż wstrzyknięcia do bardziej obwodowych naczyń krwionośnych33.
Innym elastycznym aspektem tej techniki jest metoda odczytu. Ogólnie rzecz biorąc, opcje można opisać jako oparte na raportowaniu lub sekwencjonowaniu (Rysunek 2C). Włączenie fluorescencyjnego reportera, takiego jak GFP, do otwartej ramy odczytu konstruktu, powoduje ekspresję białka fluorescencyjnego we wszystkich transdukowanych komórkach, w których kandydat na wzmacniacz sterował ekspresją. Techniki znakowania i obrazowania, takie jak immunohistochemia, umożliwiają wzmocnienie sygnału. Techniki odczytu oparte na sekwencjonowaniu polegają na identyfikacji sekwencji z dostarczonego konstruktu w RNA pobranym z tkanki. Określając ilościowo ilość wirusowego DNA, które zostało początkowo dostarczone, porównanie ekspresji RNA z dostarczonym DNA można wykorzystać do określenia stopnia, w jakim testowana sekwencja wzmacniacza była w stanie napędzać zwiększoną ekspresję transgenu, na przykład w kontekście masowo równoległego testu reporterowego (MPRA). MPRA oferują potężne rozszerzenie tych technik w celu jednoczesnego testowania do tysięcy potencjalnych wzmacniaczy aktywności i zostały obszernie opisane w badaniach genomicznych12,27,34,35,36. Wyższą przepustowość badań przesiewowych uzyskuje się poprzez wykonywanie etapów klonowania, pakowania, dostarczania i sekwencjonowania dla potencjalnych wzmacniaczy w partii, a nie pojedynczo.
Wybór kandydata na wzmacniacz daje kolejną możliwość elastyczności (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D). Na przykład test ten może być wykorzystany do identyfikacji wzmacniaczy określonego genu, do ustalenia funkcji niekodujących regionów DNA będących przedmiotem zainteresowania lub do określenia określonych typów komórek lub etapów rozwoju, podczas których wzmacniacz jest aktywny - wszystkie te cele służą celom zarówno w naukach podstawowych, jak i w badaniach nad chorobami. Ogólnie rzecz biorąc, wybór kandydata na wzmacniacz jest napędzany przez przewidywania in silico dotyczące aktywności wzmacniacza. Zazwyczaj przewidywania in silico obejmują ChIP-seq dla modyfikacji histonów, które wskazują na prawdopodobne wzmacniacze, takie jak H3K27ac37 i mapowanie dostępności chromatyny38. Wreszcie, rosnącym obszarem badań jest oparty na funkcjach przesiewowy syntetycznie zaprojektowanych elementów wzmacniających, umożliwiający badanie, w jaki sposób sekwencja wzmacniacza kieruje funkcją39 oraz projektowanie wzmacniaczy o określonych właściwościach40.

<table><tbody><tr><td>10x Bufor cytrynianowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9999-1000ML</td><td></td></tr><tr><td>5'-gatcactctcggcatggac-3'Integrated</td> <td>DNA Technologies</td><td>N/A: Specjalnie zaprojektowany</td><td>starter Forward do weryfikacji klonów po transformacji. Te startery są specyficzne dla użytego wektora i zostały zaprojektowane dla konkretnego wektora użytego w naszych eksperymentach.</td></tr><tr><td>5'-gatggctggcaactagaagg-3'Integrated</td> <td>DNA Technologies</td><td>N/A: Specjalnie zaprojektowany</td><td>odwrócony starter do weryfikacji klonów po transformacji. Te startery są specyficzne dla użytego wektora i zostały zaprojektowane dla konkretnego wektora użytego w naszych eksperymentach.</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>VWR</td><td>VWRVN605-500G</td><td></td></tr><tr><td>Zespoły rurek aspiratora</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td>do doustnego dostarczania rAAV</td></tr><tr><td>Bakteriologiczne szalki Petriego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Karbenicylina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1389-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kurczak IgY anty-GFP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10262</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>LSM900</td><td>Zdjęcia zostały wykonane modelem LSM800, ale Zeiss wprowadził na rynek model LSM900 w ostatnich latach, aby zastąpić LSM800.</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-565-269</td><td></td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9806558</td><td>Te formy są odpowiednie dla mózgu myszy P28. Inne rozmiary mogą być bardziej odpowiednie dla większych lub mniejszych tkanek.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne, 4,5"</td> <td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Oślica przeciw kurczakom AlexaFlour-488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS 1x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MT21031CV</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Eppendorf 2,0 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>22431048</tr><tr><td>Falcon probówki okrągłodenne 14 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green dye</td><td>Grainger</td><td>F0099-1G</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw pędzli do drobnych detali</td><td>Artbrush Tower</td><td>B014GWCLFO</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611S Szklane</td><td></td></tr><tr><td>rurki kapilarne</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>5-000-2005</td><td></td></tr><tr><td>HiSpeed Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12663</td><td>Komercyjny zestaw do przygotowania plazmidu maxi</td></tr><tr><td>HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water</td><td>VWR</td><td>SH30538.03</td><td></td></tr><tr><td>IV zestaw do infuzji motyli z rurką 12" i igłą 25G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26708</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td>Niestrzępiąca się chusteczka</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td>LB premiks agarowy do pożywek selektywnych</td></tr><tr><td>Nożyczki do irysu McPherson Vannas</td><td>Integra LifeSciences</td><td>360-215</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma Life Science</td><td>69794-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NEB Stabilny kompetentny E. coli</td><td>NEB</td><td>C3040I</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Żel i PCR Clean-Up</td><td>Takara</td><td>740609.5</td><td>Zestaw do reakcji enzymatycznej oczyszczanie i ekstrakcja żelu</td></tr><tr><td>Pożywka OCT</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Cole Parmer</td><td>60-100</td><td></td></tr><tr><td>Probówki paraformaldehydowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>do PCR 0,2 ml</td><td>VWR</td><td>490003-692</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Gilson</td><td>F155005</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 10x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start II Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F549L</td><td></td></tr><tr><td>Mleko w proszku</td><td>Sunny Select</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmart Bufor</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td>Bufor do trawienia restrykcyjnego z PacI, AscI i XmaI</td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny: AscI</td><td>NEB</td><td>R0558L</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny: PacI</td><td>NEB</td><td>R0547L</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny: XmaI</td><td>NEB</td><td>R0180L</td><td></td></tr><tr><td>SOC pożywka przeciwwzrostowa</td><td>NEB</td><td>B0920S</td><td>Pożywka regeneracyjna po przemianie</td></tr><tr><td>Sacharoza ( Bez RNaz / DNaz)</td><td>Millipore Sigma</td><td>033522.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TAE</td><td>Apex</td><td>20-194</td><td></td></tr><tr><td>Rurka transferowa</td><td>Gilson</td><td>F1179941</td><td>Do pompy perystaltycznej</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps System oczyszczania DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1460</td><td>Mini zestaw przygotowawczy do plazmidu</td></tr></tbody></table>

wdrożenie aav konstruktów ekspresyjnych opartych na wzmacniaczu in vivo w mózgu myszy

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Wzmacniacze są platformami wiążącymi dla różnorodnego wachlarza czynników transkrypcyjnych, które napędzają określone wzorce ekspresji genów specyficznych dla typów tkanek i komórek. Wiele sposobów oceny niekodującego DNA i różnych stanów chromatyny okazało się przydatne w przewidywaniu obecności sekwencji wzmacniających w genomie, ale walidacja aktywności tych sekwencji i znalezienie narządów i etapów rozwoju, w których są aktywne, jest pracochłonnym procesem. Niedawne postępy w dziedzinie wektorów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) umożliwiły powszechne dostarczanie transgenów do tkanek myszy, umożliwiając testowanie wzmacniaczy in vivo bez konieczności stosowania transgenicznego zwierzęcia. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób konstrukt reporterowy, który wyraża EGFP pod kontrolą minimalnego promotora, który sam w sobie nie napędza znaczącej ekspresji, może być wykorzystany do badania wzorców aktywności potencjalnych sekwencji wzmacniacza w mózgu myszy. Konstrukt reporterowy w opakowaniu AAV jest dostarczany do mózgu myszy i inkubowany przez 1-4 tygodnie, po czym zwierzę jest uśmiercane, a skrawki mózgu są obserwowane pod mikroskopem. EGFP pojawia się w komórkach, w których testowany wzmacniacz jest wystarczający do zainicjowania ekspresji genów, wskazując lokalizację i etap rozwoju, w którym wzmacniacz jest aktywny w mózgu. Standardowe metody klonowania, tanie pakowanie AAV i rozszerzanie serotypów AAV oraz metody dostarczania in vivo i standardowego odczytu obrazowania sprawiają, że jest to przystępne podejście do badania, w jaki sposób ekspresja genów jest regulowana w mózgu.

Zastosowanie tych metod pozwoliło na przetestowanie aktywności enhansera sekwencji o długości 915 bp, zlokalizowanej w trzecim intronie genu CACNA1C19,49,50 powiązanym z ryzykiem zaburzeń psychiatrycznych, w postnatalnym mózgu myszy. Sekwencja ta została odkryta podczas MPRA 345 kandydackich sekwencji enhanserów skupionych wokół SNP związanych z ryzykiem psychiatrycznym i neurologicznym12, a eksp...

Ten protokół opisuje nowatorski test przejściowy oparty na rAAV z funkcją wzmacniania i opisywania. Ten test może być wykorzystany do wywołania ekspresji in vivo w mózgu myszy.

Wdrożenie AAV konstruktów ekspresyjnych opartych na wzmacniaczu in vivo w mózgu myszy

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ umożliwia wizualizację nie tylko tego, czy sekwencja wzmacniacza może sterować ekspresją, ale także tego, gdzie może kierować ekspresją w określonej części ciała. Jest szybki. Wstrzyknięcia trwają mniej niż 10 minut, a to, czy i gdzie gen reporterowy ulega ekspresji, można zobaczyć w ciągu zaledwie kilku dni od pobrania próbki.Aby rozpocząć klonowanie, wybierz lub zaprojektuj konstrukcję reportera. Zastosowany tutaj konstrukt umieszcza kandydata na wzmacniacz w trzech głównych regionach nieulegających translacji genu reporterowego EGFP ulegającego ekspresji pod kontrolą minimalnego promotora hsp68. Aby zaprojektować startery PCR do amplifikacji interesującej sekwencji i klonowania do wektora, dodaj odpowiednie ramię homologiczne do klonowania Gibsona do pięciu pierwszych końców starterów.Korzystając z zaprojektowanych starterów, wykonaj PCR z próbki DNA. Trawić od jednego do 10 mikrogramów DNA wektora przy użyciu Pac1 i Asc1, w zależności od pożądanej liczby wymaganych reakcji klonowania. Stosując elektroforezę żelową od 0,7 do 1% przez 30 do 60 minut przy napięciu 100 woltów, oddziel fragmenty trawienia restrykcyjnego.Wyodrębnij pasmo dla zlinearyzowanego wektora i oczyść go za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu. Po zakończeniu klonowania i transformacji komórek Gibsona, umieść komórki na selektywnych pożywkach i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po sprawdzeniu, czy udało się sklonować konstrukt reporterowy, zaszczepić pięć mililitrów kultury starterowej przy użyciu zapasu glicerolu.Hoduj kulturę przez osiem do 16 godzin w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 180 obrotach na minutę. Gdy bulion stanie się mętny, rozcieńczyć kulturę starterową 1 000 razy w 250 do 300 mililitrach świeżego selektywnego bulionu LB i inkubować ją przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 180 obrotach na minutę. Korzystając z komercyjnego zestawu maxi plazmidu, oczyść plazmid.Aby przetestować rekombinację ITR, należy przeprowadzić mineralizację Xma1. Wizualizacja pasm. Upewnij się, że podsumowanie pokazuje oczekiwaną liczbę pasm.Rekombinacja spowoduje powstanie mniejszej liczby pasm niż oczekiwano. Przygotuj rekombinowaną mieszaninę AAV do podawania. Porównując wzorce ekspresji wielu wirusów reporterowych wzmacniających, rozcieńczyć każdego wirusa, aby zrównać miana wirusa z najmniej skoncentrowanym wirusem.Zmieszać wirusa reporterowego wzmacniacza i konstytutywnie wyrażonego wirusa reporterowego kontrolnego w stosunku dwa do jednego lub trzy do jednego. Dodaj niewielką ilość szybkiego zielonego barwnika o końcowym stężeniu 0,06%Rozbij końcówkę wyciągniętej szklanej pipety wykonanej z mikrolitrowej rurki kapilarnej, delikatnie przekłuwając ją w delikatną, niestrzępiącą się chusteczkę. Włóż pipetę do zespołu aspiratora z urządzeniem do wywierania ciśnienia połączonym z gumową uszczelką do przytrzymywania pipety mikrokapilarnej.Wlej niewielką objętość około 0,2 do 0,5 mikrolitra oleju mineralnego do pipety, wywierając podciśnienie przez aspirator. Odłóż zespół aspiratora na bok i umieść wirusa na lodzie, aż będzie gotowy do wstrzyknięcia. Po krioznieczuleniu nowonarodzonych myszy należy zastosować podciśnienie za pomocą zespołu aspiratora i wciągnąć mieszaninę wirusów do wyciągniętej szklanej pipety, aż menisk przekroczy znacznik dwóch mikrolitrów.Wyjmij mysz z zimnej komory i połóż ją na blacie stołu. Zlokalizuj obustronne miejsca wstrzyknięć w połowie drogi między lambdą a bregmą, a także szew strzałkowy i każde oko. Zdezynfekuj je chusteczką nasączoną alkoholem.Przekłuj czaszkę nowonarodzonych myszy za pomocą wyciągniętej szklanej pipety. Gdy igła wejdzie do czaszki, zastosuj nadciśnienie przez zespół aspiratora. Dozować jeden mikrolitr wirusa do komory bocznej i wyjąć pipetę.Umieść mysz na poduszce grzewczej lub komorze grzewczej, aby odzyskać sprawność. Po przebudzeniu zwierzę należy umieścić w klatce domowej. Rejestruj obrazy fluorescencyjne przecinające część mózgu za pomocą obiektywu subiektywnego o małym powiększeniu 5x.Lokalizując miejsce wstrzyknięcia, oceń zakres transdukcji wirusa, w zależności od gęstości i intensywności czerwonych komórek fluorescencyjnych. Porównaj zwierzęta, które zostały transdukowane w podobny sposób. Rejestruj obrazy fluorescencyjne za pomocą obiektywu o większym powiększeniu niż 25x.Następnie otwórz oprogramowanie analityczne i zastosuj filtr mediany trzy na trzy, aby zredukować szum. Kliknij menu Proces, a następnie kliknij Szum i wybierz opcję Usuń plamki. Następnie, aby odjąć fluorescencję tła od obrazów, zacznij od oddzielenia kanałów obrazu wielokanałowego.Kliknij menu Obraz, a następnie kliknij Kolor i wybierz opcję Podziel kanały. Korzystając z narzędzia do zaznaczania prostokąta lub okręgu, narysuj mały kształt w obszarze obrazu bez komórek fluorescencyjnych. Zmierz średnią intensywność pikseli tła, klikając Analizuj, a następnie Zmierz i powtórz, aby pobrać próbkę wiele razy.Uśrednij średnią wartość szarości z pięciu do ośmiu obszarów tła i upuść wartości dziesiętne. Odejmij wartości od każdego piksela obrazu, wybierając menu Proces, a następnie kliknij polecenie Matematyka i odejmij. Następnie wprowadź wartość tła do odjęcia, i kliknij przycisk OK. W razie potrzeby scal kanały z powrotem w obraz wielokanałowy, wybierając menu Obraz, a następnie kliknij Kolor i wybierz Scal kanały.Aby policzyć liczbę zielonych komórek fluorescencyjnych, ukryj zielony kanał i narysuj kształt wokół obszaru mózgu wyrażającego czerwoną fluorescencję za pomocą narzędzia do zaznaczania dowolnego. Kliknij funkcję Zmierz, aby zmierzyć obszar, zintegrowaną gęstość i średnią wartość szarości kanału czerwonego w wybranej strefie. Policz liczbę zielonych komórek za pomocą narzędzia do zaznaczania wielopunktowego i znormalizuj liczbę zielonych komórek przez zintegrowaną intensywność kanału czerwonego.Po transdukcji wzmacniacza, reporterowi, który mysz wstrzyknięto doczaszkowo w P0 z dodatnim konstruktem AAV, wykazał ekspresję EGFP napędzaną wzmacniaczem w środkowych dolnych warstwach kory 28 dni po wstrzyknięciu. Mysz, której wstrzyknięto kontyk kontroli ujemnej w P0, nie wykazuje żadnej ekspresji EGFP 28 dni po wstrzyknięciu, co pokazuje, że stwierdzono, że elementy wzmacniające napędzają transkrypcję EGFP w mózgu myszy. Aby zobrazować pomyślnie transdukowany obszar i kontrolować potencjalną zmienność, zbadano biblioteki reporterowe wzmacniaczy różnych mian dostarczane przez AAV.Biblioteka o wysokim mianie potencjalnych wzmacniaczy napędza szeroką ekspresję EGFP, podczas gdy biblioteka o niższym mianie potencjalnych wzmacniaczy napędza rzadką ekspresję CGFP w mózgu myszy P7. Bardzo ważne jest, aby przy każdym wstrzyknięciu wymieszać wzmacniacz reporterowy AAV z kontrolą pozytywną, aby odróżnić wzmacniacze bez aktywności od nieudanych dostaw. Procedurę tę można połączyć z immunohistochemią, RNA FISH lub sekwencjonowaniem RNA pojedynczej komórki w celu określenia, w których typach komórek aktywny jest wzmacniacz.

aav-deployment-enhancer-based-expression-constructs-vivo-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano metodę in vivo służącą do badania funkcji genów w mózgu po urodzeniu. Rekombinowane AAV wykazujące ekspresję Cre i/lub białka fluorescencyjnego są wstrzykiwane do mózgu noworodka myszy. Uzyskano mozaikową inaktywację genów oraz rzadkie znakowanie neuronów, co umożliwia szybką analizę funkcji genów w procesach kluczowych dla rozwoju obwodów neuronalnych.

Mozaikowa analiza funkcji genów w postnatalnym rozwoju mózgu myszy z wykorzystaniem rekombinacji Cre opartej na wirusach

Migracja neuroblastów jest fundamentalnym wydarzeniem w neurogenezie poporodowej. Opisujemy protokół skutecznego znakowania neuroblastów za pomocą elektroporacji poporodowej in vivo i późniejszej wizualizacji ich migracji za pomocą obrazowania poklatkowego ostrych wycinków mózgu. Dołączamy opis do ilościowej analizy dynamiki neuroblastów za pomocą śledzenia wideo.

In vivo (in vivo) Poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy

Opisujemy protokół chirurgii stereotaktycznej za pomocą domowego urządzenia do mikrowstrzykiwania odczynników do prążkowia mózgów noworodków myszy. Technika ta pozwala na manipulację genetyczną w komórkach neuronalnych określonych regionów mózgów noworodków myszy.

Chirurgia stereotaktyczna w manipulacji genetycznej w komórkach prążkowia mózgów noworodków myszy

Obecny protokół demonstruje prostą metodę śledzenia projekcji glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki (VTA) do hipokampa. Fotostymulację neuronów glutaminianu VTA połączono z zapisem CA1, aby zademonstrować, w jaki sposób zakończenia glutaminianu VTA modulują przypuszczalną szybkość wypalania CA1 w piramidzie in vivo.

Połączone anatomiczne i funkcjonalne śledzenie in vivo zakończeń glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki w hipokampie

Tutaj prezentujemy metodę badania morfogenezy neurytów w pourodzeniowych eksplantatach siatkówki myszy za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Opisujemy podejście do rzadkiego znakowania i pozyskiwania typów komórek siatkówki i ich drobnych procesów przy użyciu rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adeno, które wyrażają białka fluorescencyjne ukierunkowane na błonę w sposób zależny od Cre.

Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Tutaj opisujemy metodę selektywnej zmiany ekspresji genów w splocie naczyniówkowym, unikając jednocześnie jakiegokolwiek wpływu na inne obszary mózgu.

Celowy knockdown genów w splocie naczyniówkowym

Tutaj prezentowany jest protokół produkcji zawiesiny HEK293 oparty na komórkach AAV, co skutkuje zmniejszeniem czasu i pracy potrzebnej do produkcji wektorów przy użyciu komponentów, które są dostępne do celów badawczych od komercyjnych dostawców.

Produkcja wysokowydajnych partii wektorów związanych z adeno przy użyciu komórek zawiesinowych HEK293

Ten protokół opisuje ektopową ekspresję Neurod1 za pośrednictwem wirusa po korowym udarze niedokrwiennym. Neurod1 jest dostarczany (1) za pomocą systemu Cre-Flex AAV u myszy typu dzikiego w fazie podostrej po udarze (7 dni) oraz (2) przy użyciu pojedynczego wektora AAV u myszy z warunkowym reporterem w fazie przewlekłej po udarze (21 dni).

Systemy AAV i modele mysie do badania ektopowej ekspresji Neurod1 w transdukowanych komórkach w czasie podostrym i przewlekłym po udarze niedokrwiennym

Ten protokół ma na celu przedstawienie metody produkcji i oczyszczania biomimetyków pochodzących od mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) dla terapii genowej. Nanowezykul jest ograniczony MSC-pochodnymi dwuwarstwowami lipidowymi i zawiera rekombinowane AAV przenoszące gen interesujący się w świetle. Ta nanowezykul oferuje ulepszony wektor dla in vivo dostarczania genów.

Opracowanie nanowezykuł otoczonych błoną komórek macierzystych mezenchymalnych w celu zwiększenia wydajności dostarczania genów

Poznaj metodę rAAV do wizualizacji aktywności wzmacniaczy w mózgu myszy. Protokół umożliwia szybką ocenę ekspresji genu reporterowego EGFP w określonych regionach kory mózgowej.

Wdrożenie AAV konstruktów ekspresyjnych opartych na wzmacniaczu in vivo w mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów