Wdrożenie AAV konstruktów ekspresyjnych opartych na wzmacniaczu in vivo w mózgu myszy
31 marca 2022
Ten protokół opisuje nowatorski test przejściowy oparty na rAAV z funkcją wzmacniania i opisywania. Ten test może być wykorzystany do wywołania ekspresji in vivo w mózgu myszy.
Protokół ten jest istotny, ponieważ umożliwia wizualizację nie tylko tego, czy sekwencja wzmacniacza może sterować ekspresją, ale także tego, gdzie może kierować ekspresją w określonej części ciała. Jest szybki. Wstrzyknięcia trwają mniej niż 10 minut, a to, czy i gdzie gen reporterowy ulega ekspresji, można zobaczyć w ciągu zaledwie kilku dni od pobrania próbki.
Aby rozpocząć klonowanie, wybierz lub zaprojektuj konstrukcję reportera. Zastosowany tutaj konstrukt umieszcza kandydata na wzmacniacz w trzech głównych regionach nieulegających translacji genu reporterowego EGFP ulegającego ekspresji pod kontrolą minimalnego promotora hsp68. Aby zaprojektować startery PCR do amplifikacji interesującej sekwencji i klonowania do wektora, dodaj odpowiednie ramię homologiczne do klonowania Gibsona do pięciu pierwszych końców starterów.
Korzystając z zaprojektowanych starterów, wykonaj PCR z próbki DNA. Trawić od jednego do 10 mikrogramów DNA wektora przy użyciu Pac1 i Asc1, w zależności od pożądanej liczby wymaganych reakcji klonowania. Stosując elektroforezę żelową od 0,7 do 1% przez 30 do 60 minut przy napięciu 100 woltów, oddziel fragmenty trawienia restrykcyjnego.
Wyodrębnij pasmo dla zlinearyzowanego wektora i oczyść go za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu. Po zakończeniu klonowania i transformacji komórek Gibsona, umieść komórki na selektywnych pożywkach i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po sprawdzeniu, czy udało się sklonować konstrukt reporterowy, zaszczepić pięć mililitrów kultury starterowej przy użyciu zapasu glicerolu.
Hoduj kulturę przez osiem do 16 godzin w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 180 obrotach na minutę. Gdy bulion stanie się mętny, rozcieńczyć kulturę starterową 1 000 razy w 250 do 300 mililitrach świeżego selektywnego bulionu LB i inkubować ją przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 180 obrotach na minutę. Korzystając z komercyjnego zestawu maxi plazmidu, oczyść plazmid.
Aby przetestować rekombinację ITR, należy przeprowadzić mineralizację Xma1. Wizualizacja pasm. Upewnij się, że podsumowanie pokazuje oczekiwaną liczbę pasm.
Rekombinacja spowoduje powstanie mniejszej liczby pasm niż oczekiwano. Przygotuj rekombinowaną mieszaninę AAV do podawania. Porównując wzorce ekspresji wielu wirusów reporterowych wzmacniających, rozcieńczyć każdego wirusa, aby zrównać miana wirusa z najmniej skoncentrowanym wirusem.
Zmieszać wirusa reporterowego wzmacniacza i konstytutywnie wyrażonego wirusa reporterowego kontrolnego w stosunku dwa do jednego lub trzy do jednego. Dodaj niewielką ilość szybkiego zielonego barwnika o końcowym stężeniu 0,06%Rozbij końcówkę wyciągniętej szklanej pipety wykonanej z mikrolitrowej rurki kapilarnej, delikatnie przekłuwając ją w delikatną, niestrzępiącą się chusteczkę. Włóż pipetę do zespołu aspiratora z urządzeniem do wywierania ciśnienia połączonym z gumową uszczelką do przytrzymywania pipety mikrokapilarnej.
Wlej niewielką objętość około 0,2 do 0,5 mikrolitra oleju mineralnego do pipety, wywierając podciśnienie przez aspirator. Odłóż zespół aspiratora na bok i umieść wirusa na lodzie, aż będzie gotowy do wstrzyknięcia. Po krioznieczuleniu nowonarodzonych myszy należy zastosować podciśnienie za pomocą zespołu aspiratora i wciągnąć mieszaninę wirusów do wyciągniętej szklanej pipety, aż menisk przekroczy znacznik dwóch mikrolitrów.
Wyjmij mysz z zimnej komory i połóż ją na blacie stołu. Zlokalizuj obustronne miejsca wstrzyknięć w połowie drogi między lambdą a bregmą, a także szew strzałkowy i każde oko. Zdezynfekuj je chusteczką nasączoną alkoholem.
Przekłuj czaszkę nowonarodzonych myszy za pomocą wyciągniętej szklanej pipety. Gdy igła wejdzie do czaszki, zastosuj nadciśnienie przez zespół aspiratora. Dozować jeden mikrolitr wirusa do komory bocznej i wyjąć pipetę.
Umieść mysz na poduszce grzewczej lub komorze grzewczej, aby odzyskać sprawność. Po przebudzeniu zwierzę należy umieścić w klatce domowej. Rejestruj obrazy fluorescencyjne przecinające część mózgu za pomocą obiektywu subiektywnego o małym powiększeniu 5x.
Lokalizując miejsce wstrzyknięcia, oceń zakres transdukcji wirusa, w zależności od gęstości i intensywności czerwonych komórek fluorescencyjnych. Porównaj zwierzęta, które zostały transdukowane w podobny sposób. Rejestruj obrazy fluorescencyjne za pomocą obiektywu o większym powiększeniu niż 25x.
Następnie otwórz oprogramowanie analityczne i zastosuj filtr mediany trzy na trzy, aby zredukować szum. Kliknij menu Proces, a następnie kliknij Szum i wybierz opcję Usuń plamki. Następnie, aby odjąć fluorescencję tła od obrazów, zacznij od oddzielenia kanałów obrazu wielokanałowego.
Kliknij menu Obraz, a następnie kliknij Kolor i wybierz opcję Podziel kanały. Korzystając z narzędzia do zaznaczania prostokąta lub okręgu, narysuj mały kształt w obszarze obrazu bez komórek fluorescencyjnych. Zmierz średnią intensywność pikseli tła, klikając Analizuj, a następnie Zmierz i powtórz, aby pobrać próbkę wiele razy.
Uśrednij średnią wartość szarości z pięciu do ośmiu obszarów tła i upuść wartości dziesiętne. Odejmij wartości od każdego piksela obrazu, wybierając menu Proces, a następnie kliknij polecenie Matematyka i odejmij. Następnie wprowadź wartość tła do odjęcia, i kliknij przycisk OK. W razie potrzeby scal kanały z powrotem w obraz wielokanałowy, wybierając menu Obraz, a następnie kliknij Kolor i wybierz Scal kanały.
Aby policzyć liczbę zielonych komórek fluorescencyjnych, ukryj zielony kanał i narysuj kształt wokół obszaru mózgu wyrażającego czerwoną fluorescencję za pomocą narzędzia do zaznaczania dowolnego. Kliknij funkcję Zmierz, aby zmierzyć obszar, zintegrowaną gęstość i średnią wartość szarości kanału czerwonego w wybranej strefie. Policz liczbę zielonych komórek za pomocą narzędzia do zaznaczania wielopunktowego i znormalizuj liczbę zielonych komórek przez zintegrowaną intensywność kanału czerwonego.
Po transdukcji wzmacniacza, reporterowi, który mysz wstrzyknięto doczaszkowo w P0 z dodatnim konstruktem AAV, wykazał ekspresję EGFP napędzaną wzmacniaczem w środkowych dolnych warstwach kory 28 dni po wstrzyknięciu. Mysz, której wstrzyknięto kontyk kontroli ujemnej w P0, nie wykazuje żadnej ekspresji EGFP 28 dni po wstrzyknięciu, co pokazuje, że stwierdzono, że elementy wzmacniające napędzają transkrypcję EGFP w mózgu myszy. Aby zobrazować pomyślnie transdukowany obszar i kontrolować potencjalną zmienność, zbadano biblioteki reporterowe wzmacniaczy różnych mian dostarczane przez AAV.
Biblioteka o wysokim mianie potencjalnych wzmacniaczy napędza szeroką ekspresję EGFP, podczas gdy biblioteka o niższym mianie potencjalnych wzmacniaczy napędza rzadką ekspresję CGFP w mózgu myszy P7. Bardzo ważne jest, aby przy każdym wstrzyknięciu wymieszać wzmacniacz reporterowy AAV z kontrolą pozytywną, aby odróżnić wzmacniacze bez aktywności od nieudanych dostaw. Procedurę tę można połączyć z immunohistochemią, RNA FISH lub sekwencjonowaniem RNA pojedynczej komórki w celu określenia, w których typach komórek aktywny jest wzmacniacz.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia nową metodę opartą na rAAV do przeprowadzania przejściowych testów enhancer-reporter do użytku in vivo w mózgu myszy w celu wizualizowania ekspresji genów sterowanych przez enhancery. Protokół umożliwia badaczom szybkie ocenę nie tylko tego, czy enhancer może sterować ekspresją, ale także gdzie może to robić w określonych regionach mózgu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Ekspresja genów
- Biologia molekularna
Tło
- Zrozumienie sekwencji enhancerów jest kluczowe dla rozszyfrowania regulacji genów.
- Modele in vivo zapewniają wgląd w wzorce ekspresji w określonych tkankach.
- Ta metoda umożliwia szybką ocenę aktywności genów w porównaniu z tradycyjnymi podejściami.
Cel badania
- Stworzenie efektywnego testu do wizualizowania aktywności enhancerów w żywym organizmie.
- Ułatwienie szybkiej oceny ekspresji genów reporterowych w mózgu myszy.
- Możliwość precyzyjnej lokalizacji ekspresji sterowanej przez enhancer.
Stosowane metody
- Protokół wykorzystuje podejście oparte na transdukcji rAAV.
- Modele mózgu myszy są używane do oceny wzorców ekspresji po dostarczeniu wirusa.
- Kluczowe kroki obejmują klonowanie konstrukcji reporterowych i przeprowadzanie iniekcji in vivo.
- Analiza wzorców ekspresji genów następuje zaledwie kilka dni po iniekcji.
Główne wyniki
- Udana wizualizacja ekspresji EGFP sterowanej przez enhancer w określonych warstwach kory.
- Wyraźne rozróżnienie efektów konstrukcji kontrolnych dodatnich i ujemnych.
- Walidacja wzorców ekspresji wskazuje na efektywną ocenę aktywności enhancerów.
Wnioski
- Ten protokół demonstruje nową metodę oceny funkcji enhancerów in vivo.
- Umożliwia szybką i zlokalizowanych ocenę ekspresji genów, poprawiając nasze zrozumienie mechanizmów regulacyjnych.
- Podejście to jest wartościowe dla przyszłych badań dotyczących regulacji genów w kontekstach neuronowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid, in vivo assessment of enhancer activity in the mouse brain, providing spatial and temporal resolution of gene regulation without requiring transgenic models. It supports target validation by linking non-coding DNA elements to functional expression patterns in disease-relevant neural circuits. The approach accelerates mechanistic de-risking in early discovery by delivering quantitative, imaging-based readouts of enhancer function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether candidate enhancer sequences can drive gene expression in specific brain regions.
- Operational Value: Uses standard cloning and AAV packaging to generate enhancer-reporter libraries for high-throughput screening of regulatory elements.
- Predictive Value: Enables biological de-risking by linking enhancer activity to cell-type-specific expression patterns in the cortex and other neural structures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative fluorescence readouts (EGFP intensity) that correlate with enhancer strength and activity patterns across developmental stages.
- Operational Value: Leverages expanding AAV serotypes and standardized imaging workflows for reproducible, scalable enhancer testing across multiple constructs.
- Assay Readiness: Generates validated biological systems (transduced mouse brain) suitable for downstream applications like immunohistochemistry or single-cell RNA sequencing to define enhancer-active cell types.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by mapping enhancer activity to specific cortical layers and developmental timepoints (P0 to P7).
- Translational Continuity: Enables cross-functional collaboration by providing standardized, spatially resolved expression data that can inform biomarker alignment and target selection.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions by distinguishing active enhancers from negative controls through normalized green-to-red fluorescence ratios.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling hypothesis testing of non-coding regulatory elements prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing where enhancers drive expression in the mouse brain, linking genotype to phenotype in neural tissue.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized virus production, equitized titers, and co-injection with control reporters to distinguish true enhancer activity from delivery failure.
- Analytics: Enables quantitative comparison of enhancer activity via integrated density measurements and background-subtracted fluorescence imaging.
- Translational Research: Connects to preclinical work by allowing follow-up with RNA FISH or immunohistochemistry to determine cell-type specificity of enhancer-driven expression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for enhancer library screening, leveraging low-cost AAV production and standard microscopy for repeated campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in enhancer function through direct in vivo visualization.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via controlled virus titers, background subtraction protocols, and normalized cell counting.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid screening of enhancer candidates without generating and maintaining transgenic lines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing clear, imaging-based evidence of enhancer activity in disease-relevant brain regions.
Implementation Considerations
- Requires molecular cloning expertise for Gibson assembly and viral vector preparation.
- Depends on AAV purification and titration infrastructure for consistent enhancer-reporter delivery.
- Necessitates stereotaxic injection skills and neonatal mouse handling for accurate intracranial delivery.
- Relies on fluorescence microscopy and image analysis tools (e.g., background subtraction, channel splitting) for reliable readout.
- Limited by enhancer context-dependency; activity may vary across developmental stages, brain regions, or disease models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:39
Enhancer Candidate Sequence Cloning into the AAV Vector Plasmid
3:09
Intracranially Inject rAAV-Packaged Plasmid into Neonatal Mice
5:32
Image and Analyze Brain Tissue Sections for Enhancer Activity
8:10
Results: AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs in Mouse Brain
9:21
Conclusion
