Protokół przetwarzania obrazu do analizy wielkości dyfuzji i klastra receptorów błonowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Nowe techniki mikroskopowe wymagają opracowania odpowiednich narzędzi do prawidłowego zrozumienia badanych procesów biologicznych. Protokół ten opisuje etapy przetwarzania obrazu wymagane do śledzenia pojedynczej cząsteczki, w tym oszacowanie parametrów dyfuzji bocznej i kwantyfikacja wielkości plamki na całej jej trajektorii na błonie komórkowej. Protokół ten łączy w sobie użycie kilku elementów oprogramowania, w tym ImageJ, MATLAB i uTrack, a także niektórych białek, które zostały opracowane specjalnie dla tego protokołu.

Metoda ta jest zilustrowana śledzeniem receptorów błonowych pod mikroskopem świetlnym, ale można ją zastosować do dowolnej struktury podobnej do cząstek, której trajektorie można śledzić w czasie w sekwencji wideo. Technika ta odnosi się do badań podstawowych i nie ma bezpośredniego zastosowania w warunkach klinicznych. Można go jednak wykorzystać do pomocy w charakterystyce zdarzeń biologicznych zarówno w różnych chorobach, jak i w identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

Protokół ten jest istotny dla śledzenia cząstek w błonach komórkowych, jak pokazano w tym filmie, ale może być również stosowany do śledzenia pełnych komórek, bakterii, nanocząstek w płynie lub dowolnym innym obiekcie, którego środek można dobrze określić. Protokół ten jest przyjazny dla użytkownika i wymaga jedynie wiedzy z zakresu hodowli komórkowych i technik mikroskopowych. Różne techniki i narzędzia informatyczne zastosowane w tym protokole mogą zastraszyć nowego użytkownika.

Demonstracja wizualna pomaga z pewnością korzystać z tej techniki. Na początek wyhoduj komórki Jurkata, przetransfekuj je monomerycznym wektorem receptora chemokiny znakowanym GFP i wybierz komórki o niskim poziomie ekspresji znakowanego wektora, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Dodaj pożywkę zawierającą ligand CXCL12 lub pożywkę kontrolną do każdej pokrytej fibronektyną 35-milimetrowej płytki mikrostudzienkowej ze szklanym dnem, które zostały pokryte fibronektyną, i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie dodaj posortowane komórki do każdej potrawy i inkubuj przez 20 minut przed obrazowaniem komórek. Po inkubacji przenieś pierwszą szalkę z komórkami do stolika mikroskopowego TIRF i obróć się do obiektywu 100-krotnego zanurzenia w olejku. Zlokalizuj i skup się na komórkach za pomocą jasnego pola, aby zminimalizować efekty fotowybielania.

Następnie przełącz się w tryb TIRF i wykonaj precyzyjną regulację ostrości przy niskiej intensywności lasera. Nagrywaj filmy o długości około 50 sekund, minimalizując odstęp czasu między klatkami. Dla każdego pliku wideo z warunkiem eksperymentalnym utwórz nowy folder, postępując zgodnie ze wskazówkami dotyczącymi struktury pliku opisanymi w protokole tekstowym tego filmu.

Otwórz wideo za pomocą Fiji lub ImageJ, przeciągając i upuszczając plik na pasku menu Fidżi, a następnie kliknij OK, aby zaimportować plik LIF przy użyciu bioformatów. Aby zaprojektować maskę, zaimportuj również odpowiedni obraz wielokanałowy. Następnie utwórz maskę, tworząc najpierw pojedynczy obraz z kanałami przydatnymi do zaprojektowania maski.

Wybierz Obraz w menu paska i kliknij Kolor, a następnie Podziel kanały, aby wyświetlić różne kanały jako osobne obrazy. Ponownie scal trzy kanały na jednym obrazie, wybierając pozycję Obraz w menu paska, przechodząc do pozycji Kolor i wybierając pozycję Scal kanały. Upewnij się, że wybrałeś odpowiednie kanały, a następnie naciśnij OK, aby wygenerować nowy obraz bez stosu.

Zsynchronizuj dwa okna, przechodząc do menu paska, wybierając pozycję Analizuj, a następnie przechodząc do pozycji Narzędzia i wybierając pozycję Synchronizuj okna. Zostanie wyświetlone nowe okno z możliwościami synchronizacji obrazu. Teraz, po zsynchronizowaniu dwóch okien, ten sam region w obu oknach może zostać przycięty.

Przejdź do Obraz w menu paska i wybierz Przytnij. Za pomocą narzędzia do zaznaczania prostokątnego narysuj interesujący Cię obszar. Dwa przycięte obrazy będą wyświetlane pojedynczo.

Następnie rozsynchronizuj oba okna. Jeśli maska nie została utworzona, narysuj obszar zainteresowania za pomocą narzędzia do zaznaczania i przytnij. Następnie zapisz wideo jako sekwencję obrazów w katalogu Videosec.

Następnie wybierz obraz wielokanałowy, przejdź do Wtyczki w menu i wybierz Edytor segmentacji, aby otworzyć wtyczkę edytora segmentacji. Wybierz narzędzie do zaznaczania odręcznego i użyj go, aby wybrać zieloną etykietę i zaprojektować najbardziej zewnętrzną maskę. Po zaprojektowaniu naciśnij przycisk Plus w opcji wyboru okna kompozytowego, a wybrana maska zostanie wyświetlona w przeglądarce.

Powtórz ten krok dla wszystkich etykiet. Po zaprojektowaniu wszystkich masek zapisz maskę o tej samej nazwie pliku, co wideo, wraz z name:mask.tif. Otwórz program MATLAB i dodaj katalog uTrack do ścieżki, przechodząc do pozycji Ustaw ścieżkę i wybierając pozycję Dodaj z.

Następnie zmień katalog roboczy na katalog zawierający serię, która ma być analizowana. Wywołaj uTrack, wpisując GUI Movie Selector w konsoli i naciskając Enter. Spowoduje to otwarcie okna wyboru filmu.

Naciśnij przycisk Nowy film i poczekaj, aż pojawi się okno Dodawanie filmu. Naciśnij Dodaj kanał, aby wybrać katalog z filmem i wypełnić parametry informacji o filmie. Ustaw katalog wyjściowy dla wyników uTrack na Wyniki, a następnie naciśnij Zaawansowane ustawienia kanałów, wypełnij parametry związane z akwizycją i zapisz.

Po utworzeniu filmu naciśnij Kontynuuj w oknie wyboru filmu. W tym miejscu uTrack zapyta o rodzaj obiektu, który ma być analizowany. Wybierz Pojedyncze cząstki, a następnie pojawi się okno panelu sterowania.

Następnie wybierz pierwszy krok, Krok 1:Wykrywanie i kliknij Ustawienia. Pojawi się okno Setting Gaussian Mixture Model Fitting (Ustawianie dopasowania modelu mieszaniny Gaussa). Wprowadź ustawienia, jak pokazano tutaj, a następnie naciśnij przycisk Zastosuj.

W panelu sterowania kliknij Uruchom, aby uruchomić krok wykrywania. Po kilku minutach sprawdź wyniki, naciskając przycisk Wynik. Film pokazuje czerwone kółka na wykrytych cząstkach.

Jeśli nie jest pokazane żadne czerwone kółko, oznacza to, że ten krok nie zadziałał poprawnie i powinieneś spróbować ponownie. Teraz połącz cząstki, które zostały właśnie wykryte, w ścieżki obejmujące wiele klatek, najpierw ustawiając parametry, jak pokazano tutaj. Następnie naciśnij Uruchom w panelu sterowania.

Następnie wykonaj analizę ścieżek. Zdefiniuj ustawienia, jak pokazano poniżej, a następnie naciśnij Zastosuj i Uruchom. Sprawdź wyniki, najpierw naciskając przycisk Wynik, a następnie kliknij Pokaż numer ścieżki w oknie opcji filmu i sprawdź klatka po klatce, czy każda ścieżka została poprawnie zidentyfikowana, ręcznie zaznaczając cząstki, które nie są prawdziwymi cząstkami.

W programie MATLAB wprowadź polecenie, jak pokazano poniżej. To polecenie spowoduje, że program odczyta wszystkie trajektorie i obliczy współczynniki dyfuzji. Następnie wyklucz trajektorie odpowiadające nieprawidłowo zidentyfikowanym punktom lub trajektoriom, podając listę miejsc do wykluczenia.

Oblicz chwilowe współczynniki dyfuzji dla każdej ze ścieżek tej komórki, postępując zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym. W takim przypadku oblicz współczynnik dyfuzji dla opóźnienia czasowego równego 4 zwanego D1 do 4. Po zakończeniu rozłóż trajektorie na krótkie i długie.

Aby przeanalizować długie trajektorie, wpisz polecenie, jak pokazano poniżej, aby sklasyfikować typ ruchu na podstawie ich widma skalowania momentów. Przeanalizuj intensywność każdej cząstki wzdłuż jej trajektorii. Skonfiguruj to podstawowe zachowanie na wiele różnych sposobów, postępując zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym.

Następnie zbierz informacje o dyfuzji i intensywności dla wszystkich trajektorii. Zbierz tylko informacje o dyfuzji i intensywności dla krótkich trajektorii. Na koniec zbierz skalowanie widma momentów i informacje o intensywności, wpisując następujące polecenie, gdzie long to sufiks używany wcześniej.

Zastosowanie technik opisanych w tym protokole pozwala na zautomatyzowane śledzenie cząstek wykrytych w filmach z mikroskopii fluorescencyjnej oraz analizę ich charakterystyk dynamicznych. Z tej analizy można uzyskać różne cechy w oparciu o różnice w bodźcach. Obejmuje to odsetek nieruchomych miejsc opartych na czterech różnych bodźcach, odsetek długich trajektorii dłuższych niż 50 klatek oraz rodzaje ruchu wzdłuż trajektorii podzielone na ruchy ukierunkowane, swobodne lub ograniczone.

Ponadto można określić współczynnik dyfuzji, średnie intensywności plamki i liczbę receptorów na cząstkę. Pokazuje to rozkład wartości współczynnika krótkiej dyfuzji dla każdej plamki w odpowiedzi na różne bodźce. Czerwona linia reprezentuje wartość mediany, ten podobny wykres pokazuje średnią intensywność punktu dla każdego punktu wzdłuż jego pierwszych 20 klatek w odpowiedzi na te same bodźce.

Ponownie czerwona linia reprezentuje średnią wartość intensywności. Ponieważ średnia skorygowana intensywność plamki jest związana z liczbą białek fluorescencyjnych obecnych w tym punkcie, można bezpośrednio obliczyć liczbę receptorów na cząsteczkę, jak pokazano tutaj. MATLAB to język programowania, w którym rozróżniana jest wielkość liter.

Możesz zmieniać nazwy zmiennych w stosunku do tych opisanych w tym protokole, ale pamiętaj, aby zachować spójność w nazewnictwie. Nazw funkcji nie można zmieniać, a przecinki, dwukropki i średniki są ważne dla poprawnej składni. Mikroskopia jednocząsteczkowa pozwala na wizualizację pojedynczych białek błonowych z niespotykaną dotąd rozdzielczością czasoprzestrzenną i daje unikalne możliwości ujawnienia nieprzewidzianych aspektów biologii komórki.

Protokoły te otwierają nowe drzwi do ilościowej analizy filmów mikroskopowych w komórkach i biologii molekularnej.