Name: Protokół przetwarzania obrazu do analizy wielkości dyfuzji i klastra receptorów błonowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Poznaj protokół przetwarzania obrazu do analizy dyfuzji i klastrów receptorów błonowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda umożliwia śledzenie pojedynczych cząsteczek i badanie dynamiki białek komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Carlo Manzo i Marii García Parajo za ich pomoc i kod źródłowy analizy współczynnika dyfuzji. Prace te były częściowo wspierane przez granty hiszpańskiego Ministerstwa Nauki, Innowacji i Uniwersytetów (SAF 2017-82940-R) oraz program RETICS Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 i RD16/0012/0006; RIER). LMM i JV są wspierane przez program COMFUTURO Fundación General CSIC.

<ol><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies in live cells.</a> Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).</li>
<li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).</li>
<li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).</li>
<li>Bakker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+mobility+of+individual+integrin+nanoclusters+orchestrates+the+onset+for+leukocyte+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).</li>
<li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+%28nanovid+microscopy%29.+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).</li>
<li>Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strongly+and+weakly+self-similar+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Physica+D%22%5BJournal%5D)">Strongly and weakly self-similar diffusion.</a> Physica D. 154, 111-137 (2001).</li>
<li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).</li>
<li>Ewers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking+of+murine+polyoma+virus-like+particles+on+live+cells+and+artificial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).</li>
<li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+progress+in+single+particle+tracking%3A+from+methods+to+biophysical+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Report+on+Progress+in+Physics%22%5BJournal%5D)">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601(2015).</li>
<li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).</li>
<li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Martinez-Munoz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+Actin-Dependent+Chemokine+Receptor+Nanoclustering+from+Dimerization+Indicates+a+Role+for+Clustering+in+CXCR4+Signaling+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function.</a> Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).</li>
<li>Destainville, N., Salome, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+correction+of+systematic+errors+due+to+detector+time-averaging+in+single-molecule+tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments.</a> Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana metoda jest łatwa do wykonania nawet bez wcześniejszego doświadczenia w pracy z programem Matlab. Należy jednak pamiętać, że procedury w Matlabie wymagają niezwykłej precyzji w nazewnictwie poszczególnych komend oraz w lokalizacji folderów wykorzystywanych przez program. W procedurze analizy śledzenia (krok 3) można zmodyfikować wiele parametrów. Okno „Setting Gaussian-Mixture Model Fitting” (krok 3.8) steruje tym, w jaki sposób U-track będzie wykrywać pojedyncze cząsteczki na filmie. Odbywa się to poprzez dopaso...

Białka błonowe osadzone w dwuwarstwie lipidowej są w ciągłym ruchu z powodu dyfuzji termicznej. Ich dynamika jest niezbędna do regulacji odpowiedzi komórek, ponieważ interakcje międzycząsteczkowe umożliwiają tworzenie kompleksów różniących się wielkością od monomerów do oligomerów i wpływają na stabilność kompleksów sygnałowych. Wyjaśnienie mechanizmów kontrolujących dynamikę białek jest zatem nowym wyzwaniem w biologii komórki, niezbędnym do zrozumienia szlaków transdukcji sygnału i zidentyfikowania nieprzewidzianych funkcji komórki.
Niektóre metody optyczne zostały opracowane do badania tych interakcji w żywych komórkach1. Wśród nich mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), opracowana na początku lat 80., pozwala na badanie interakcji molekularnych na błonie komórkowej lub bardzo blisko niej2. Do badania parametrów dynamicznych trajektorii białek błonowych uzyskanych z danych TIRF w żywych komórkach wymagana jest metoda śledzenia pojedynczych cząstek (SPT). Chociaż dostępnych jest kilka algorytmów w tym zakresie, obecnie używamy algorytmów opublikowanych przez Jaqamana i in.3, które rozwiązują problem niejednorodności ruchu cząstek w gęstym polu cząstek, łącząc cząstki między kolejnymi ramkami w celu połączenia powstałych segmentów toru w pełne trajektorie (tymczasowe zanikanie cząstek). Oprogramowanie rejestruje łączenie się i rozdzielanie cząstek, które wynikają ze zdarzeń agregacji i dysocjacji3. Jedną z danych wyjściowych tego oprogramowania jest wykrywanie cząstek wzdłuż całej trajektorii poprzez zdefiniowanie ich pozycji X i Y w każdej klatce.
Po wykryciu cząstek, stosujemy różne algorytmy do określenia współczynnika dyfuzji krótkiego opóźnienia (D1-4)4,5. Stosując analizę Spektrum Skalowania Momentów (MSS)6,7,8 lub dopasowując wartość "alfa" poprzez dostosowanie średniego przemieszczenia kwadratowego (MSD) do krzywej9, klasyfikujemy również cząstki według typu trajektorii.
Analiza intensywności plamki na obrazach fluorescencyjnych jest wspólnym celem naukowców w tej dziedzinie10,11. Najczęściej stosowanym algorytmem jest tak zwany liczba i jasność. Metoda ta nie pozwala jednak na prawidłowe wykrywanie intensywności klatka po klatce cząstek we frakcji ruchomej. W związku z tym opracowaliśmy nowy algorytm do oceny intensywności tych cząstek klatka po klatce i określenia ich stanu agregacji. Po wykryciu współrzędnych każdej cząstki za pomocą oprogramowania U-Track2 3, definiujemy jej intensywność w każdej klatce na całej trajektorii, biorąc również pod uwagę tło komórki w każdej klatce. Oprogramowanie to oferuje różne możliwości określania intensywności plamki i tła komórkowego oraz, wykorzystując znane białka monomeryczne i dimeryczne jako odniesienia, oblicza przybliżoną liczbę białek w wykrytej cząsteczce (wielkość klastra).
W tym artykule opisujemy dokładny przewodnik do wykonania tych trzech kroków: 1) wykrywanie i śledzenie pojedynczych cząstek wzdłuż filmu z mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą ścieżki U; 2) analiza chwilowego współczynnika dyfuzji (D1-4) tych cząstek oraz rodzaju ruchu (ograniczony, swobodny lub skierowany) cząstek o długich trajektoriach za pomocą MSS; 3) pomiar intensywności plamki wzdłuż filmu skorygowanej o szacowaną fluorescencję tła dla każdego punktu. Pozwala to na oszacowanie wielkości klastra i identyfikację etapów fotowybielania.
Korzystanie z tego protokołu nie wymaga specjalistycznych umiejętności i może być wykonane w każdym laboratorium z hodowlą komórkową, cytometrią przepływową i mikroskopią. Protokół korzysta z ImageJ lub Fiji (dystrybucja ImageJ12), U-track3 i niektórych procedur tworzonych ad hoc (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). Procedury U-track i ad hoc są uruchamiane w Matlabie, który można zainstalować na dowolnym kompatybilnym komputerze.

<table><tbody><tr><td>Ludzkie komórki Jurkata</td><td>ATCC</td><td>CRL-10915</td><td>Ludzka linia komórek T. Za pomocą tego oprogramowania można analizować każdy inny typ komórek</td></tr><tr><td>pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP</td><td>Clontech</td><td>632469</td><td>Za pomocą tego rutynowego elektroporatora Gene Pulse X Cell można śledzić i analizować różne białka fluorescencyjne</td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>BioRad&nbsp;</td><td></td><td>Do ogniw Jurkat używamy napięcia 280 V, 975 mF.&nbsp; Użyj metody transfekcji, która najlepiej sprawdza się w Twoich rękach.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Cytomics FC 500&nbsp;</td><td>Sortownik komórkowy Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Astrios&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>W zależności od poziomu transfekcji, sortowanie komórek może nie być wymagane.&nbsp; Można również zastosować komórki o stabilnej ekspresji odpowiedniego poziomu receptora będącego przedmiotem zainteresowania.</td></tr><tr><td>Dako Qifikit</td><td>DakoCytomation</td><td>K0078</td><td>Służy do ilościowego określania liczby receptorów na powierzchni komórki.</td></tr><tr><td>Naczynia mikrostudzienkowe ze szklanym dnem</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka fibronektyna z plazmy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka CXCL12</td><td>PeproTech</td><td>300928A</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócona Leica AM TIRF</td><td>Kamera Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD</td><td>Andor&nbsp;</td><td>DU 885-CSO-#10-VP</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Oprogramowanie MathWorks, Natick, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-Track2</td><td>Oprogramowanie Danuser Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>FiJi</td><td>FiJI</td><td></td><td>https://imagej.net/Fiji)</td></tr><tr><td>u-Track2</td><td></td><td></td><td>Narzędzie Matlab.&nbsp; Aby zainstalować, pobierz .zip plik ze strony internetowej (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) i rozpakuj plik w wybranym katalogu</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td> GraphPad</tr></tbody></table>

protokół przetwarzania obrazu do analizy wielkości dyfuzji i klastra receptorów błonowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Śledzenie cząsteczek w sekwencji wideo i późniejsza analiza ich trajektorii jest obecnie powszechną operacją w wielu badaniach biologicznych. Wykorzystując analizę klastrów receptorów błony komórkowej jako model, przedstawiamy szczegółowy protokół dla tego zadania analizy obrazu przy użyciu procedur Fiji (ImageJ) i Matlab w celu: 1) zdefiniowania obszarów zainteresowania i zaprojektowania masek dostosowanych do tych regionów; 2) śledzić cząstki w filmach z mikroskopii fluorescencyjnej; 3) Przeanalizuj charakterystyki dyfuzji i natężenia wybranych utworów. Ilościowa analiza współczynników dyfuzji, rodzajów ruchu i wielkości klastrów uzyskana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i przetwarzania obrazu stanowi cenne narzędzie do obiektywnego określenia dynamiki cząstek i konsekwencji modyfikacji warunków środowiskowych. W tym artykule przedstawiamy szczegółowe protokoły analizy tych cech. Opisana tutaj metoda nie tylko pozwala na wykrywanie śledzenia pojedynczych cząsteczek, ale także automatyzuje szacowanie parametrów dyfuzji bocznej na błonie komórkowej, klasyfikuje rodzaj trajektorii i umożliwia pełną analizę, pokonując w ten sposób trudności w ilościowym określeniu wielkości plamki na całej jej trajektorii na błonie komórkowej.

Zastosowanie niniejszego protokołu umożliwia zautomatyzowane śledzenie cząsteczek wykrytych w filmach z mikroskopii fluorescencyjnej oraz analizę ich charakterystyki dynamicznej. W pierwszej kolejności komórki są transfekowane białkiem sprzężonym z fluoroforem, które ma być śledzone. Odpowiedni poziom receptorów obecnych na powierzchni komórki, umożliwiający przeprowadzenie SPT, uzyskuje się poprzez sortowanie komórek (Rycina 1). Wybrane komórki są analizowan...

Tutaj prezentujemy protokół do analizy obrazu śledzenia pojedynczych cząstek, który umożliwia ilościową ocenę współczynników dyfuzji, typów ruchu i rozmiarów klastrów pojedynczych cząstek wykrywanych przez mikroskopię fluorescencyjną.

Protokół przetwarzania obrazu do analizy wielkości dyfuzji i klastra receptorów błonowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

Nowe techniki mikroskopowe wymagają opracowania odpowiednich narzędzi do prawidłowego zrozumienia badanych procesów biologicznych. Protokół ten opisuje etapy przetwarzania obrazu wymagane do śledzenia pojedynczej cząsteczki, w tym oszacowanie parametrów dyfuzji bocznej i kwantyfikacja wielkości plamki na całej jej trajektorii na błonie komórkowej. Protokół ten łączy w sobie użycie kilku elementów oprogramowania, w tym ImageJ, MATLAB i uTrack, a także niektórych białek, które zostały opracowane specjalnie dla tego protokołu.Metoda ta jest zilustrowana śledzeniem receptorów błonowych pod mikroskopem świetlnym, ale można ją zastosować do dowolnej struktury podobnej do cząstek, której trajektorie można śledzić w czasie w sekwencji wideo. Technika ta odnosi się do badań podstawowych i nie ma bezpośredniego zastosowania w warunkach klinicznych. Można go jednak wykorzystać do pomocy w charakterystyce zdarzeń biologicznych zarówno w różnych chorobach, jak i w identyfikacji nowych celów terapeutycznych.Protokół ten jest istotny dla śledzenia cząstek w błonach komórkowych, jak pokazano w tym filmie, ale może być również stosowany do śledzenia pełnych komórek, bakterii, nanocząstek w płynie lub dowolnym innym obiekcie, którego środek można dobrze określić. Protokół ten jest przyjazny dla użytkownika i wymaga jedynie wiedzy z zakresu hodowli komórkowych i technik mikroskopowych. Różne techniki i narzędzia informatyczne zastosowane w tym protokole mogą zastraszyć nowego użytkownika.Demonstracja wizualna pomaga z pewnością korzystać z tej techniki. Na początek wyhoduj komórki Jurkata, przetransfekuj je monomerycznym wektorem receptora chemokiny znakowanym GFP i wybierz komórki o niskim poziomie ekspresji znakowanego wektora, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Dodaj pożywkę zawierającą ligand CXCL12 lub pożywkę kontrolną do każdej pokrytej fibronektyną 35-milimetrowej płytki mikrostudzienkowej ze szklanym dnem, które zostały pokryte fibronektyną, i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie dodaj posortowane komórki do każdej potrawy i inkubuj przez 20 minut przed obrazowaniem komórek. Po inkubacji przenieś pierwszą szalkę z komórkami do stolika mikroskopowego TIRF i obróć się do obiektywu 100-krotnego zanurzenia w olejku. Zlokalizuj i skup się na komórkach za pomocą jasnego pola, aby zminimalizować efekty fotowybielania.Następnie przełącz się w tryb TIRF i wykonaj precyzyjną regulację ostrości przy niskiej intensywności lasera. Nagrywaj filmy o długości około 50 sekund, minimalizując odstęp czasu między klatkami. Dla każdego pliku wideo z warunkiem eksperymentalnym utwórz nowy folder, postępując zgodnie ze wskazówkami dotyczącymi struktury pliku opisanymi w protokole tekstowym tego filmu.Otwórz wideo za pomocą Fiji lub ImageJ, przeciągając i upuszczając plik na pasku menu Fidżi, a następnie kliknij OK, aby zaimportować plik LIF przy użyciu bioformatów. Aby zaprojektować maskę, zaimportuj również odpowiedni obraz wielokanałowy. Następnie utwórz maskę, tworząc najpierw pojedynczy obraz z kanałami przydatnymi do zaprojektowania maski.Wybierz Obraz w menu paska i kliknij Kolor, a następnie Podziel kanały, aby wyświetlić różne kanały jako osobne obrazy. Ponownie scal trzy kanały na jednym obrazie, wybierając pozycję Obraz w menu paska, przechodząc do pozycji Kolor i wybierając pozycję Scal kanały. Upewnij się, że wybrałeś odpowiednie kanały, a następnie naciśnij OK, aby wygenerować nowy obraz bez stosu.Zsynchronizuj dwa okna, przechodząc do menu paska, wybierając pozycję Analizuj, a następnie przechodząc do pozycji Narzędzia i wybierając pozycję Synchronizuj okna. Zostanie wyświetlone nowe okno z możliwościami synchronizacji obrazu. Teraz, po zsynchronizowaniu dwóch okien, ten sam region w obu oknach może zostać przycięty.Przejdź do Obraz w menu paska i wybierz Przytnij. Za pomocą narzędzia do zaznaczania prostokątnego narysuj interesujący Cię obszar. Dwa przycięte obrazy będą wyświetlane pojedynczo.Następnie rozsynchronizuj oba okna. Jeśli maska nie została utworzona, narysuj obszar zainteresowania za pomocą narzędzia do zaznaczania i przytnij. Następnie zapisz wideo jako sekwencję obrazów w katalogu Videosec.Następnie wybierz obraz wielokanałowy, przejdź do Wtyczki w menu i wybierz Edytor segmentacji, aby otworzyć wtyczkę edytora segmentacji. Wybierz narzędzie do zaznaczania odręcznego i użyj go, aby wybrać zieloną etykietę i zaprojektować najbardziej zewnętrzną maskę. Po zaprojektowaniu naciśnij przycisk Plus w opcji wyboru okna kompozytowego, a wybrana maska zostanie wyświetlona w przeglądarce.Powtórz ten krok dla wszystkich etykiet. Po zaprojektowaniu wszystkich masek zapisz maskę o tej samej nazwie pliku, co wideo, wraz z name:mask.tif. Otwórz program MATLAB i dodaj katalog uTrack do ścieżki, przechodząc do pozycji Ustaw ścieżkę i wybierając pozycję Dodaj z.Następnie zmień katalog roboczy na katalog zawierający serię, która ma być analizowana. Wywołaj uTrack, wpisując GUI Movie Selector w konsoli i naciskając Enter. Spowoduje to otwarcie okna wyboru filmu.Naciśnij przycisk Nowy film i poczekaj, aż pojawi się okno Dodawanie filmu. Naciśnij Dodaj kanał, aby wybrać katalog z filmem i wypełnić parametry informacji o filmie. Ustaw katalog wyjściowy dla wyników uTrack na Wyniki, a następnie naciśnij Zaawansowane ustawienia kanałów, wypełnij parametry związane z akwizycją i zapisz.Po utworzeniu filmu naciśnij Kontynuuj w oknie wyboru filmu. W tym miejscu uTrack zapyta o rodzaj obiektu, który ma być analizowany. Wybierz Pojedyncze cząstki, a następnie pojawi się okno panelu sterowania.Następnie wybierz pierwszy krok, Krok 1:Wykrywanie i kliknij Ustawienia. Pojawi się okno Setting Gaussian Mixture Model Fitting (Ustawianie dopasowania modelu mieszaniny Gaussa). Wprowadź ustawienia, jak pokazano tutaj, a następnie naciśnij przycisk Zastosuj.W panelu sterowania kliknij Uruchom, aby uruchomić krok wykrywania. Po kilku minutach sprawdź wyniki, naciskając przycisk Wynik. Film pokazuje czerwone kółka na wykrytych cząstkach.Jeśli nie jest pokazane żadne czerwone kółko, oznacza to, że ten krok nie zadziałał poprawnie i powinieneś spróbować ponownie. Teraz połącz cząstki, które zostały właśnie wykryte, w ścieżki obejmujące wiele klatek, najpierw ustawiając parametry, jak pokazano tutaj. Następnie naciśnij Uruchom w panelu sterowania.Następnie wykonaj analizę ścieżek. Zdefiniuj ustawienia, jak pokazano poniżej, a następnie naciśnij Zastosuj i Uruchom. Sprawdź wyniki, najpierw naciskając przycisk Wynik, a następnie kliknij Pokaż numer ścieżki w oknie opcji filmu i sprawdź klatka po klatce, czy każda ścieżka została poprawnie zidentyfikowana, ręcznie zaznaczając cząstki, które nie są prawdziwymi cząstkami.W programie MATLAB wprowadź polecenie, jak pokazano poniżej. To polecenie spowoduje, że program odczyta wszystkie trajektorie i obliczy współczynniki dyfuzji. Następnie wyklucz trajektorie odpowiadające nieprawidłowo zidentyfikowanym punktom lub trajektoriom, podając listę miejsc do wykluczenia.Oblicz chwilowe współczynniki dyfuzji dla każdej ze ścieżek tej komórki, postępując zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym. W takim przypadku oblicz współczynnik dyfuzji dla opóźnienia czasowego równego 4 zwanego D1 do 4. Po zakończeniu rozłóż trajektorie na krótkie i długie.Aby przeanalizować długie trajektorie, wpisz polecenie, jak pokazano poniżej, aby sklasyfikować typ ruchu na podstawie ich widma skalowania momentów. Przeanalizuj intensywność każdej cząstki wzdłuż jej trajektorii. Skonfiguruj to podstawowe zachowanie na wiele różnych sposobów, postępując zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym.Następnie zbierz informacje o dyfuzji i intensywności dla wszystkich trajektorii. Zbierz tylko informacje o dyfuzji i intensywności dla krótkich trajektorii. Na koniec zbierz skalowanie widma momentów i informacje o intensywności, wpisując następujące polecenie, gdzie long to sufiks używany wcześniej.Zastosowanie technik opisanych w tym protokole pozwala na zautomatyzowane śledzenie cząstek wykrytych w filmach z mikroskopii fluorescencyjnej oraz analizę ich charakterystyk dynamicznych. Z tej analizy można uzyskać różne cechy w oparciu o różnice w bodźcach. Obejmuje to odsetek nieruchomych miejsc opartych na czterech różnych bodźcach, odsetek długich trajektorii dłuższych niż 50 klatek oraz rodzaje ruchu wzdłuż trajektorii podzielone na ruchy ukierunkowane, swobodne lub ograniczone.Ponadto można określić współczynnik dyfuzji, średnie intensywności plamki i liczbę receptorów na cząstkę. Pokazuje to rozkład wartości współczynnika krótkiej dyfuzji dla każdej plamki w odpowiedzi na różne bodźce. Czerwona linia reprezentuje wartość mediany, ten podobny wykres pokazuje średnią intensywność punktu dla każdego punktu wzdłuż jego pierwszych 20 klatek w odpowiedzi na te same bodźce.Ponownie czerwona linia reprezentuje średnią wartość intensywności. Ponieważ średnia skorygowana intensywność plamki jest związana z liczbą białek fluorescencyjnych obecnych w tym punkcie, można bezpośrednio obliczyć liczbę receptorów na cząsteczkę, jak pokazano tutaj. MATLAB to język programowania, w którym rozróżniana jest wielkość liter.Możesz zmieniać nazwy zmiennych w stosunku do tych opisanych w tym protokole, ale pamiętaj, aby zachować spójność w nazewnictwie. Nazw funkcji nie można zmieniać, a przecinki, dwukropki i średniki są ważne dla poprawnej składni. Mikroskopia jednocząsteczkowa pozwala na wizualizację pojedynczych białek błonowych z niespotykaną dotąd rozdzielczością czasoprzestrzenną i daje unikalne możliwości ujawnienia nieprzewidzianych aspektów biologii komórki.Protokoły te otwierają nowe drzwi do ilościowej analizy filmów mikroskopowych w komórkach i biologii molekularnej.

image-processing-protocol-for-analysis-diffusion-cluster-size

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Multiple-Target Tracing to autorski algorytm opracowany do śledzenia pojedynczo znakowanych cząsteczek w błonie plazmatycznej żywych komórek. Efektywne wykrywanie, szacowanie i śledzenie cząsteczek w czasie przy wysokiej gęstości znakowania zapewnia przyjazne dla użytkownika, kompleksowe narzędzie do badania dynamiki błon w skali nanometrycznej.

Mapowanie dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej za pomocą Multiple-Target Tracing (MTT)

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Endocytoza za pośrednictwem klatryny, szybki i bardzo dynamiczny proces internalizuje wiele białek, w tym receptory sygnałowe. Opisany tutaj protokół bezpośrednio wizualizuje kinetykę poszczególnych zdarzeń endocytarnych. Ma to zasadnicze znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób rdzeniowi członkowie maszynerii endocytarnej koordynują się ze sobą i jak ładunek białka wpływa na ten proces.

Wizualizacja endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G za pośrednictwem klatryny w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia za pomocą mikroskopii TIRF

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Prezentujemy nową technikę pomiaru bocznej dyfuzji gatunków powierzchniowo czynnych na granicy płyn-płyn poprzez połączenie monowarstwy kropelki z płaską monowarstwą.

Odzyskiwanie fluorescencji po połączeniu kropli w celu zmierzenia dwuwymiarowej dyfuzji monowarstwy fosfolipidowej

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania pojedynczych, zapośredniczonych przez SNARE zdarzeń fuzji między liposomami a wspieranymi dwuwarstwami w kanałach mikroprzepływowych za pomocą spolaryzowanego TIRFM, z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością czasową ~15 ms. Uwalnianie lipidów i rozpuszczalnego ładunku może być wykrywane jednocześnie. Mierzy się wielkość liposomów, dyfuzyjność lipidów i właściwości porów fuzyjnych.

Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Opisujemy metodę obrazowania w celu określenia średniego stanu oligomerów receptora znakowanego mEGFP, indukowanego przez wiązanie ligandów w błonie komórkowej żywych komórek. Protokół opiera się na mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) połączonej z analizą liczby i jasności (N&amp;B).

Dynamika oligomeryzacji receptorów powierzchniowych komórek w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego w połączeniu z analizą liczby i jasności

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Poznaj protokół przetwarzania obrazu do analizy dyfuzji i klastrów receptorów błonowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda umożliwia śledzenie pojedynczych cząsteczek i badanie dynamiki białek komórkowych.

Protokół przetwarzania obrazu do analizy wielkości dyfuzji i klastra receptorów błonowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal

Protokół przetwarzania obrazu do analizy wielkości dyfuzji i klastra receptorów błonowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów