Wizualizacja i kwantyfikacja endogennych interakcji białek wewnątrz organelli w miejscach kontaktu ER-mitochondria za pomocą testów ligacji zbliżeniowej

Nasz protokół PLA pozwala na identyfikację i ilościowe określenie endogennych interakcji między białkami w miejscach kontaktu z błoną. Użyliśmy go do zbadania interakcji między dwoma białkami retikulum endoplazmatycznego w miejscach kontaktu mitochondriów retikulum endoplazmatycznego. Technika ta łączy PLA z barwieniem organelli i analizą odległości organelli.

Pozwala na lokalizację i ilościowe określenie interakcji między białkami w miejscach kontaktu błony między organellami. Po wykonaniu testu ligacji zbliżeniowej lub PLA i akwizycji obrazu, skonfiguruj oprogramowanie do analizy komórek, aby uruchomić MATLAB i uruchomić rozszerzenie, klikając opcję Imaris w systemie operacyjnym Mac lub menu edycji w systemie Windows. Wybierz preferencje, przejdź do niestandardowego panelu narzędzi i ustaw ścieżkę.

Aby zaimportować obrazy do oprogramowania, przekonwertuj obrazy stosu konfokalnego na plik IMS, bezpośrednio przez sekcję areny lub za pomocą samodzielnego konwertera plików, który umożliwia konwersję wsadową. Po zaimportowaniu kliknij edytuj, przejdź do właściwości obrazu i wybierz geometrię obrazu, aby sprawdzić kalibrację obrazu. Sprawdź, czy rozmiar woksela odpowiada rozmiarowi piksela oczekiwanemu dla rzeczywistego obrazu w X i Y oraz kroku zastosowanego przez mikroskop do wygenerowania stosu Z w Z.To dostosuj kontrast różnych kanałów, kliknij edytuj w menu, przejdź do regulacji wyświetlania i wybierz pokaż korektę wyświetlania.

Dostosuj każdy kanał niezależnie, aby zoptymalizować wyświetlanie każdego koloru. Ten krok jest niezbędny do ustawienia precyzyjnych progów lub wykrycia słabych obiektów. Następnie kliknij edytuj i wybierz opcję Przytnij 3D, aby ograniczyć analizę do jednej komórki poprzez przycięcie obrazu.

Aby przeanalizować inną komórkę w tym samym polu widzenia, ponownie otwórz ten sam obraz i przytnij go w inny sposób. Wykryj sygnały PLA generowane w miejscu interakcji ORP5 i ORP8, klikając opcję dodaj nowe punkty, która tworzy nowy zestaw obiektów i otwiera kreatora wykrywania plam. Wybierz kanał, na którym ma być wykonana detekcja punktowa.

Dostosuj szacowaną średnicę XY, aby pomóc algorytmowi wykrywania plamek w znalezieniu interesujących obiektów. Jeśli wybrana wartość jest zbyt wysoka, pobliskie obiekty ulegną fuzji, a jeśli wartość jest zbyt mała, mogą zostać wykryte nieprawidłowe sygnały. Teraz kliknij odejmowanie tła, aby usunąć tło obrazu przed wykryciem punktu, aby zwiększyć lokalny kontrast wokół interesujących obiektów.

Dostosuj próg wykrywania punktowego, zachowując jakość jako parametr progowy w automatycznym progu oprogramowania lub nieznacznie zmodyfikuj tę wartość, aby wykryć wszystkie obiekty. Po zakończeniu wykrywania punktowego zapisz parametry wykrywania i wykorzystaj je ponownie do przetwarzania innych obrazów. Następnie wykryj sieć mitochondrialną, aby wygenerować renderowanie powierzchni, klikając dodaj nowe powierzchnie, aby utworzyć nowy obiekt i otworzyć kreatora wykrywania powierzchni.

Wybierz kanał, na którym ma zostać wykonane tworzenie powierzchni. Zastosuj filtr Gaussa, aby uzyskać gładszą powierzchnię, klikając pole wyboru wygładzanie i ustawiając próg wskazujący drobne szczegóły widoczne na powierzchni. Następnie wykonaj odejmowanie tła, aby wzmocnić lokalne kontrasty i dostosować próg, aby wykryć sieć mitochondrialną na podstawie intensywności sygnału.

Zastosuj filtr na powierzchni, aby usunąć małe resztki z progu, wybierając filtr liczby wokseli w oknie klasyfikowania powierzchni, a następnie pobaw się górnymi i dolnymi progami, aby zachować tylko interesujące obiekty. Po zakończeniu tworzenia powierzchni zapisz parametry tworzenia i użyj ich ponownie do przetwarzania innych obrazów. Aby wygenerować mapę odległości poza utworzoną powierzchnią mitochondriów, wybierz powierzchnię mitochondriów w polu drzewa sceny.

Kliknij przycisk Przetwarzanie obrazu i wybierz funkcję powierzchni, a następnie transformację odległości. Pojawi się rozszerzenie MATLAB z prośbą o wybranie, czy mapa ma być obliczana na zewnątrz, czy wewnątrz powierzchni obiektu. Wybierz obiekt na powierzchni zewnętrznej, aby zmierzyć odległość między plamkami PLA a powierzchnią mitochondriów.

Po wygenerowaniu mapy pojawia się ona jako nowy kanał w panelu dopasowania wyświetlania. W tym kanale każdy piksel ma wartość odpowiadającą odległości do najbliższych mitochondriów. Wybierz wcześniej wygenerowane miejsca w polu drzewa sceny, aby zmierzyć odległość od każdego punktu do najbliższego mitochondrium, a następnie zidentyfikować i zwizualizować najbliższe.

Teraz wybierz określone wartości i intensywność środka kanału odpowiadającą mapie odległości w statystykach i szczegółowym dzienniku, aby zmierzyć wartość każdego środka punktu, która odpowiada jego odległości do najbliższego mitochondrium na mapie odległości. Wyeksportuj dane jako plik CSV, klikając ikonę dyskietki w lewym dolnym rogu okna. Aby wyodrębnić subpopulację plam na podstawie ich odległości do mitochondriów, wybierz miejsca w drzewie sceny i kliknij zakładkę filtrów.

Dodaj nowy filtr oparty na intensywności środka kanału odpowiadającej mapie odległości w tym oknie i wyodrębnij miejsca oddalone od mitochondriów o mniej niż 380 nanometrów, ustawiając dolny próg na zero mikrometrów, a górny próg na 0,380 mikrometra. Wykonaj krok duplikacji, naciskając przycisk zduplikowanego zaznaczenia do nowych miejsc, aby ustawić ostrość na wybranych miejscach. Konfokalne obrazy endogennego ORP5-ORP8 PLA wykazały interakcje w komórkach HeLa w siatkowatych poddomenach ER, korowych ER i ER w bliskim kontakcie z mitochondriami, powszechnie nazywanymi błonami ER związanymi z mitochondriami.

Analiza obrazowania 3D wykazała, że około 50% endogennych interakcji ORP5-ORP8 PLA wykryto w błonach ER związanych z mitochondriami. Odsetek interakcji ORP5-ORP8 PLA zachodzących na błonach ER związanych z mitochondriami w komórkach z nadekspresją ORP5 i ORP8 był podobny do obserwowanego w komórkach, w których białka te ulegały ekspresji na poziomie endogennym. Regulacja w dół ORP5 i ORP8 spowodowała ogromny spadek całkowitej liczby sygnałów PLA, podczas gdy ich ko-nadekspresja zwiększyła PLA.

Sygnały PLA wykryto w parach ORP5-PTPIP51 i ORP8-PTPIP51, a ich średnia liczba była podobna do pary ORP5-ORP8 PLA, potwierdzając lokalizację ORP5 i ORP8 w miejscach kontaktu z błoną ER-mitochondria. Ponadto oddziaływanie ORP5-ORP8 PLA na stykach błony plazmatycznej ER w trójkierunkowym miejscu kontaktu między mitochondriami, ER i kropelkami lipidów identyfikuje się za pomocą komórek HeLa transfekowanych PHPLCD-RFP lub mCherry-PLN1. Jak w każdej metodzie analizy obrazu, jakość obrazu jest kluczowym punktem, dlatego optymalizacja sygnału ma decydujące znaczenie dla automatycznego wykrywania obiektów.

Technika ta może być również wykorzystana do badania powiązań między dwoma lub wieloma organellami komórkowymi, tak jak zrobiliśmy to w naszym niedawnym badaniu dotyczącym funkcji ORP5 i ORP8 w trójstronnym ER, mitochondriach, miejscach kontaktu kropelek lipidów. Technika ta może być pomocna w innych badaniach w dziedzinie komunikacji wewnątrzkomórkowej w celu zidentyfikowania nowych wieloczęściowych powiązań między organellami.