Name: Wizualizacja i kwantyfikacja endogennych interakcji białek wewnątrz organelli w miejscach kontaktu ER-mitochondria za pomocą testów ligacji zbliżeniowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Poznaj metodę PLA do wizualizacji i kwantyfikacji endogennych interakcji białek w miejscach kontaktu ER-mitochondria. Technika ta umożliwia badanie dynamiki białek ORP5 i ORP8 w komórkach HeLa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), Program ATIP-Avenir, Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548) oraz Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay Plant Sciences ANR-22-CE11-0024-01/MADE to FG) oraz AFM Telethon (Projekt AFM 23778).

1. Barwienie mitochondrialne i test ligacji zbliżeniowej (PLA)
<ol>
	<li>Płytka 0,5 x 105-2 x 105 komórek HeLa, utrzymywanych w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 1% aminokwasów endogennych w temperaturze 37 °C z 5% CO2, w szkiełkach nakrywkowych o średnicy 13 mm w płytkach 1,5 w 24 dołkach w rozcieńczeniu umożliwiającym zbieżność komórek w 75%-90% w dniu zabiegu. 
UWAGA: Warto zauważyć, że komórki HeLa można poddać dodatkowym zabiegom, takim jak leczenie siRNA i/lub transfekcja plazmidu DNA, przed barwieniem mitochondriów i PLA.</li>
	<li>Barwienie mitochondriów
	<ol>
		<li>Umyć komórki raz w pożywce niezawierającej surowicy, wstępnie podgrzanej w temperaturze 37 °C. Inkubować komórki z podgrzaną pożywką bez surowicy przez 10 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
		<li>Przygotować 1 μM czerwonego markera mitochondrialnego we wstępnie podgrzanym podłożu bez surowicy.</li>
		<li>Inkubować komórki z 500 μl mitochondrialnego roztworu markerowego przez 30 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Podczas leczenia markerami mitochondrialnymi i następujących po nim etapów protokołu, utrzymuj komórki na szkiełkach nakrywkowych chronione przed światłem w jak największym stopniu.</li>
		<li>Po inkubacji umyj komórki 1x we wstępnie podgrzanej pożywce wolnej od surowicy i 2x w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wykonaj ten krok tak szybko, jak to możliwe, ponieważ długie etapy mycia przed utrwaleniem mogą wpłynąć na morfologię mitochondriów.</li>
		<li>Usuń 1x PBS z szkiełek nakrywkowych i utrwal komórki, inkubując je w świeżo przygotowanym 4% PFA (w 1x PBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej (w ciemności) pod kapturem chemicznym. Myć 3x przez 2 minuty w 500 μL 1x PBS (przy użyciu jednorazowych pipet lub systemu próżniowego podłączonego do pompy).</li>
		<li>Usunąć 1x PBS i inkubować szkiełka nakrywkowe z 500 μL 50mM NH4Cl przez 15 minut w temperaturze pokojowej (w ciemności). Myć 1x przez 2 minuty w 500 μL 1x PSB za pomocą systemu próżniowego.</li>
		<li>Przemyć 3x przez 2 minuty w 500 μL buforu blokującego 1 (BB1, 1%BSA, 0,1% saponiny w 1x PBS) dla ORP5-ORP8 PLA lub buforu blokującego 2 (BB2, 2% BSA, 0,1% normalna surowica kozia, 0,1 saponiny w 1x PBS) dla ORP8-PTPIP51 PLA.</li>
		<li>Przenieść szkiełka nakrywkowe z płytki 24-dołkowej do komory wilgotnościowej. Po przeniesieniu szkiełek nakrywkowych do komory dodać 100 μl BB (BB1 lub BB2, w zależności od użytych par przeciwciał), aby uniknąć wysuszenia. 
		UWAGA: Komorę wilgotnościową chronioną przed światłem można łatwo i szybko uzyskać, owijając szalkę Petriego (plastikową lub szklaną) folią aluminiową i dodając kilka kawałków mokrego ręcznika papierowego na obrzeżach szalki Petriego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test ligacji zbliżeniowej (PLA) 
	UWAGA: Protokół PLA jest zgodny z instrukcjami producenta z niewielkimi modyfikacjami.
	<ol>
		<li>Inkubacja przeciwciał pierwotnych
		<ol>
			<li>Przygotować roztwór roboczy przeciwciała pierwotnego. Rozcieńczyć króliczy anty-ORP5 (1:150) plus mysi anty-ORP8 (1:200) w BB1, mysi anty-ORP8 (1:200) plus króliczy anty-PTPIP51 (1:200) w BB2 i króliczy anty-ORP5 (1:150) plus mysi anty-PTPIP51 (1:200) w BB1. Przygotować (co najmniej) 40 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych na szkiełko nakrywkowe (np. 0,27 μl króliczego anty-ORP5, 0,2 μl mysiego anty-ORP8, 39,53 μl BB1).</li>
			<li>Usunąć kulkę z poprzedniego płukania (krok 1.2.8) za pomocą systemu próżniowego i dodać 40 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do szkiełek nakrywkowych. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej chronionej przed światłem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Szkiełka nakrywkowe myć 3x przez 5 minut w 100 μl odpowiedniego BB za pomocą systemu próżniowego.</li>
		<li>Inkubacja sondy PLA
		<ol>
			<li>Przygotuj roztwór roboczy sond PLA. Rozcieńczyć sondy PLA rabbit PLUS (1:5) i mysie MINUS (1:5) w BB i wymieszać. Dla każdego szkiełka nakrywkowego należy przygotować (co najmniej) 40 μl roztworu sondy PLA (np. 8 μl sondy króliczej PLUS PLA, 8 μl mysiej sondy MINUS PLA, 24 μl BB). Przed użyciem pozostaw roztwór sondy PLA na 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Usunąć kulkę z szkiełek nakrywkowych (z kroku 1.3.2) za pomocą systemu próżniowego i dodać 40 μl roztworu sondy PLA do szkiełek nakrywkowych. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37°C w komorze wilgotnościowej chronionej przed światłem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Myć szkiełka nakrywkowe 2x przez 5 min w 100 μL 1x buforu do płukania A w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ligacji
		<ol>
			<li>Rozcieńczyć 5x bufor ligacyjny do proporcji 1:5 w ultraczystej wodzie i wymieszać. Dla każdego szkiełka nakrywkowego należy przygotować (co najmniej) 40 μl roztworu do ligacji (8 μl 5x buforu ligacyjnego, 31 μl ultraczystej wody).</li>
			<li>Dodać ligazę (1 U/μL, dostarczaną w zestawie PLA) do 1x buforu ligacyjnego przygotowanego w poprzednim kroku w rozcieńczeniu 1:40 i wymieszać.</li>
			<li>Usunąć 1x bufor płuczący A z szkiełek nakrywkowych (z kroku 1.3.4) za pomocą systemu próżniowego, dodać 40 μl roztworu ligazy do szkiełek nakrywkowych i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w komorze wilgotnościowej chronionej przed światłem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Szkiełka nakrywkowe myć 2x przez 2 minuty w 100 μl 1x buforu do płukania A w temperaturze pokojowej za pomocą systemu próżniowego.</li>
		<li>polimeryzacja
		<ol>
			<li>Rozcieńczyć 5-krotny bufor wzmacniający 1:5 w ultraczystej wodzie i wymieszać. Dla każdego szkiełka nakrywkowego należy przygotować (co najmniej) 40 μl roztworu do amplifikacji (8 μl 5-krotnego buforu do amplifikacji, 31,5 μl ultraczystej wody).</li>
			<li>Dodać polimerazę (10 U/μL, dostarczaną w zestawie PLA) do 1x buforu polimeryzacyjnego przygotowanego w poprzednim kroku w rozcieńczeniu 1:80 i wymieszać.</li>
			<li>Usunąć 1x bufor płuczący A z szkiełek nakrywkowych (z kroku 1.3.6) za pomocą systemu próżniowego, dodać 40 μl roztworu polimerazy do szkiełek nakrywkowych i inkubować przez 1 godzinę 40 minut w temperaturze 37 °C w komorze wilgotnościowej chronionej przed światłem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Usunąć roztwór polimerazy ze szkiełek nakrywkowych i przemyć 2x przez 10 min w 100 μL 1x bufora do płukania B w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej chronionej przed światłem.</li>
		<li>Szkiełka nakrywkowe myć 1x przez 1 minutę w 100 μL 0,001x buforu B do mycia w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej chronionej przed światłem.</li>
		<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych do mikroskopii za pomocą podłoża montażowego z DAPI (stężenie między 1,6-0,4 μg/ml). Uszczelnij lakierem do paznokci.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Obserwuj wyniki PLA i uzyskuj obrazy za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej z obiektywem z 63-krotnym zanurzeniem w oleju za pomocą dołączonego oprogramowania.</li>
	<li>Ustaw wzbudzenie fluorescencji za pomocą diody laserowej 405 nm lub lasera światła białego i zbierz okna widmowe za pomocą detektorów GaAsP PMT lub hybrydowych. W każdej płaszczyźnie ogniskowej (obejmującej 300 nm) należy zebrać sygnały fluorescencyjne dla PLA (λex = 488 nm, λem = 505-560 nm) i mitochondriów (λex = 543 nm, λem = 606-670 nm).</li>
</ol>
3. Przetwarzanie obrazu i ocena plam PLA związanych z mitochondriami
<ol>
	<li>Przetwarzaj obrazy konfokalne za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, które generuje mapy odległości między komponentami komórkowymi. Wykonaj poniższe czynności, aby wygenerować rekonstrukcje 3D plamek PLA i sieci mitochondrialnej oraz uzyskać dostęp do odległości między nimi za pomocą oprogramowania do obrazowania komórek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Instalacja rozszerzenia mapy odległości 3D
	<ol>
		<li>Zainstaluj zarówno pakiet oprogramowania do analizy komórek z opcją XT, jak i oprogramowanie MATLAB lub tylko środowisko uruchomieniowe kompilatora MATLAB (MRC), które można bezpłatnie pobrać ze strony internetowej.</li>
		<li>Skonfiguruj oprogramowanie do analizy komórek, aby uruchamiało program MATLAB po uruchomieniu programu XTension w następujący sposób: z opcji Imaris (Mac OS X) lub menu Edycja (Windows) wybierz Preferencje, przejdź do panelu Narzędzia niestandardowe, a następnie ustaw ścieżkę: 
		C:\Program Files\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB.exe dla systemu Windows lub/Applications/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab dla systemu Mac OS X.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaimportuj obrazy do oprogramowania
	<ol>
		<li>Konwertuj obrazy stosu konfokalnego na plik . IMS, bezpośrednio w sekcji Arena lub za pomocą samodzielnego konwertera plików, który umożliwia konwersję wsadową.</li>
		<li>Po zaimportowaniu sprawdź, czy obrazy pozostają prawidłowo skalibrowane. Kliknij Edytuj > Właściwości obrazu > Geometria obrazu i sprawdź, czy rozmiar woksela odpowiada w X i Y rozmiarowi piksela oczekiwanemu dla rzeczywistego obrazu (patrz kalibracja obrazu w oprogramowaniu do akwizycji) i czy rozmiar woksela w Z odpowiada krokowi zastosowanemu przez mikroskop do wygenerowania stosu Z. Jeśli wartości nie są poprawne, zmodyfikuj je, aby zapewnić prawidłowe oszacowanie odległości w poniższych krokach.</li>
		<li>Dostosuj kontrast różnych kanałów w menu Regulacja wyświetlania, klikając Edytuj > Pokaż regulację wyświetlania. Dostosuj każdy kanał niezależnie, aby zoptymalizować wyświetlanie każdego koloru. Ten krok nie ma bezpośredniego wpływu na wartości obrazu, ale jest niezbędny do ustawienia precyzyjnych progów lub wykrycia słabych obiektów.</li>
		<li>Ogranicz analizę do pojedynczej komórki, przycinając obraz za pomocą opcji Edytuj > Przytnij 3D. Aby przeanalizować inną komórkę w tym samym polu widzenia, otwórz ponownie ten sam obraz i przytnij go w inny sposób.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Detekcja punktowa ORP5-ORP8
	<ol>
		<li>Wykryj sygnały PLA generowane w miejscu interakcji ORP5 i ORP8, klikając opcję Dodaj nowe miejsca, która tworzy nowy zestaw obiektów i otwiera kreatora wykrywania punktów.</li>
		<li>Wybierz kanał, na którym ma być wykonana detekcja punktowa.</li>
		<li>Dostosuj szacowaną średnicę XY (zakres musi zostać dostosowany, jeśli rozmiar obiektu jest inny), aby pomóc algorytmowi wykrywania plamek w znalezieniu interesujących obiektów. Zwróć uwagę, że jeśli wybrana wartość jest zbyt wysoka, pobliskie obiekty zostaną połączone. Jeśli wartość jest zbyt mała, jeden sygnał może zostać uznany za wiele obiektów lub mogą zostać wykryte nieprawidłowe sygnały.</li>
		<li>Kliknij Odejmowanie tła, aby usunąć tło obrazu przed wykryciem punktu, aby zwiększyć lokalny kontrast wokół interesujących obiektów.</li>
		<li>Dostosuj próg wykrywania punktowego, zachowując jakość (intensywność w środku obiektu) jako parametr progowy i automatyczny próg oprogramowania, lub nieznacznie zmodyfikuj tę wartość, aby wykryć wszystkie obiekty. Po zakończeniu wykrywania plamek zapisz parametry wykrywania i użyj ich ponownie do przetwarzania innych obrazów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie sieci mitochondrialnej
	<ol>
		<li>Wykryj sieć mitochondrialną, aby wygenerować renderowanie powierzchni, klikając pozycję Dodaj nowe powierzchnie, aby utworzyć nowy obiekt, a następnie otwórz kreatora wykrywania powierzchni.</li>
		<li>Wybierz kanał, na którym ma zostać wykonane tworzenie powierzchni.</li>
		<li>Zastosuj filtr Gaussa, aby uzyskać gładszą powierzchnię, klikając pole wyboru Wygładzanie i ustawiając próg wskazujący najmniejsze szczegóły widoczne na powierzchni.</li>
		<li>Wykonaj odejmowanie tła, aby wzmocnić lokalne kontrasty i pomóc w kroku progowym.</li>
		<li>Dostosuj próg, aby wykryć sieć mitochondrialną na podstawie intensywności sygnału. Jeśli prawidłowe ustawienie progu jest trudne, zaleca się powrót do poprzedniego kroku, aby dostosować stopień gładkości i odejmowania tła.</li>
		<li>W razie potrzeby nałóż filtr na powierzchnię, aby usunąć drobne pozostałości wynikające z progu. W tym celu wybierz filtr Liczba wokseli w oknie klasyfikowania powierzchni i pobaw się górnymi i dolnymi progami, aby zachować tylko interesujące obiekty. Po zakończeniu tworzenia powierzchni zapisz parametry tworzenia i użyj ich ponownie do przetwarzania innych obrazów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie mapy odległości 3D wokół mitochondriów
	<ol>
		<li>Wygeneruj mapę odległości poza powierzchnią mitochondriów, która została wcześniej utworzona w następujący sposób. Wybierz powierzchnię mitochondriów w polu drzewa sceny. Kliknij funkcję przetwarzania obrazu > powierzchni > transformacji odległości. Spowoduje to wywołanie programu Matlab XTension, który poprosi użytkownika o wybranie, czy mapa ma być obliczana na zewnątrz, czy wewnątrz powierzchni obiektu.</li>
		<li>Wybierz opcję Obiekt na powierzchni zewnętrznej, aby zmierzyć odległość między plamkami PLA a powierzchnią mitochondriów. Po wygenerowaniu mapa odległości pojawia się jako nowy kanał w panelu regulacji wyświetlania. W tym kanale każdy piksel ma wartość odpowiadającą odległości do najbliższych mitochondriów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja odległości obiektów od najbliższych mitochondrów
	<ol>
		<li>Aby zmierzyć odległość od każdego punktu do najbliższych mitochondrów oraz zidentyfikować i zwizualizować najbliższe, wybierz wcześniej wygenerowane miejsca w polu drzewa sceny.</li>
		<li>W statystykach i dzienniku szczegółowym wybierz Określone wartości (aby uzyskać jeden pomiar dla każdego miejsca). Wybierz Center Intensity Ch=X (gdzie X odpowiada numerowi kanału mapy odległości). Spowoduje to zmierzenie wartości każdego środka punktu, która odpowiada jego odległości do najbliższego mitochondrium na mapie odległości.</li>
		<li>Wyeksportuj dane jako plik .csv, klikając ikonę dyskietki w lewym dolnym rogu okna.</li>
		<li>Aby wyodrębnić subpopulację plam na podstawie ich odległości do mitochondriów, wybierz miejsca w drzewie sceny i kliknij kartę Filtry.</li>
		<li>W tym oknie dodaj nowy filtr oparty ponownie na środku intensywności Ch=X i wyodrębnij miejsca oddalone od mitochondriów o mniej niż 380 nm, ustawiając dolny próg na 0 μm, a górny próg na 0,380 μm. 
		UWAGA: Próg 380 nm oszacowano na podstawie reakcji PLA, w tym związku między przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi (30 nm) oraz połową pełnej szerokości w połowie maksimum (FWHM) sygnałów amplifikacji PLA (350 nm).</li>
		<li>Aby skupić się na zaznaczonych miejscach i na przykład nadać im wyraźny kolor, wykonaj krok duplikacji, naciskając przycisk Duplikuj zaznaczenie do nowych miejsc.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Scorrano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+together+to+define+membrane+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Coming together to define membrane contact sites.</a> Nature Communications. 10, 1287(2019).</li>
<li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAM+%28mitochondria-associated+membranes%29+in+mammalian+cells%3A+Lipids+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).</li>
<li>Giordano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-vesicular+lipid+trafficking+at+the+endoplasmic+reticulum-mitochondria+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface.</a> Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
<li>Gomez-Suaga, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ER-mitochondria+tethering+complex+VAPB-PTPIP51+regulates+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy.</a> Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).</li>
<li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Mfn2+in+the+structure+and+function+of+endoplasmic+reticulum-mitochondrial+tethering+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo.</a> Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443(2021).</li>
<li>Stoica, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS%2FFTD-associated+FUS+activates+GSK-3%CE%B2+to+disrupt+the+VAPB-PTPIP51+interaction+and+ER-mitochondria+associations%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3β to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations.</a> EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).</li>
<li>Tubbs, E., Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+interactions+by+in+situ+proximity+ligation+assay+in+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54899(2016).</li>
<li>Cuello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+the+ER%2Fmitochondria+compartment+in+human+cardiomyocytes+with+PLN+p.Arg14del+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074(2021).</li>
<li>Paillusson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Synuclein+binds+to+the+ER-mitochondria+tethering+protein+VAPB+to+disrupt+Ca2%2B+homeostasis+and+mitochondrial+ATP+production%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">α-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production.</a> Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).</li>
<li>Tubbs, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-associated+endoplasmic+reticulum+membrane+%28MAM%29+integrity+is+required+for+insulin+signaling+and+is+implicated+in+hepatic+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance.</a> Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).</li>
<li>Chung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI4P%2Fphosphatidylserine+countertransport+at+ORP5-+and+ORP8-mediated+ER-plasma+membrane+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts.</a> Science. 349 (6246), 428-432 (2015).</li>
<li>Galmes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORP5%2FORP8+localize+to+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contacts+and+are+involved+in+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function.</a> EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).</li>
<li>Ghai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORP5+and+ORP8+bind+phosphatidylinositol-4%2C+5-biphosphate+%28PtdIns%284%2C5%29P+2%29+and+regulate+its+level+at+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane.</a> Nature Communications. 8, 757(2017).</li>
<li>Monteiro-Cardoso, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORP5%2F8+and+MIB%2FMICOS+link+ER-mitochondria+and+intra-mitochondrial+contacts+for+non-vesicular+transport+of+phosphatidylserine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine.</a> Cell Reports. 40 (12), 111364(2022).</li>
<li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORP5+localizes+to+ER-lipid+droplet+contacts+and+regulates+the+level+of+PI%284%29P+on+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets.</a> Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162(2020).</li>
<li>Guyard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORP5+and+ORP8+orchestrate+lipid+droplet+biogenesis+and+maintenance+at+ER-mitochondria+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites.</a> The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107(2022).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten został opracowany w celu identyfikacji i ilościowego określenia interakcji między białkami organelli PLA w MCS, w szczególności w MERCS. Nowatorstwo protokołu polega na tym, że łączy on PLA z znakowaniem wielu organelli, mikroskopią konfokalną i analizą obrazu 3D w celu zlokalizowania i ilościowego określenia interakcji PLA między dwoma białkami znajdującymi się w tej samej błonie, w tym przypadku w błonie ER w bliskiej odległości od błony mitochondriów (MAM) lub jednocześnie z MAM i LD. Protokół ten może by...

Komunikacja między organellami jest cechą charakterystyczną komórek eukariotycznych. Jednym ze sposobów, w jaki organelle komunikują się, jest tworzenie miejsc kontaktu z błoną (MCS), które są bliskimi opozycjami błonowymi między dwiema organellami, które są utrzymywane przez białka strukturalne i funkcjonalne, takie jak pęta, białka przenoszące lipidy i kanały wapniowe1. MCS mogą powstawać między podobnymi lub różnymi organellami i pośredniczą w wymianie składników komórkowych, co jest ważne dla utrzymania homeostazy komórkowej. Do tej pory zidentyfikowano kilka MCS, w tym mitochondria retikulum endoplazmatycznego (ER), błonę plazmatyczną ER (PM) i kontakty z kroplami lipidów (LD) ER1. Wśród nich te utworzone między ER a mitochondriami (MERCS) są jednymi z najlepiej przebadanych, ponieważ biorą udział w regulacji kilku funkcji komórkowych, w tym homeostazy lipidów i wapnia2. Ponieważ mitochondria są w dużej mierze wykluczone z klasycznych szlaków transportu pęcherzykowego, polegają na MERCS i ich składnikach molekularnych w celu importu kluczowych lipidów lub prekursorów lipidów z ER. Niepęcherzykowy transport tych lipidów przez MERCS zapewnia utrzymanie prawidłowego składu lipidów mitochondrialnych, a także ich integralności funkcjonalnej i strukturalnej3.
Biorąc pod uwagę kluczowe znaczenie MCS w różnych funkcjach komórkowych, zainteresowanie głębszym zrozumieniem ich molekularnych składników znacznie wzrosło w ostatnich latach. W celu pogłębienia wiedzy na temat MCS zastosowano kilka rodzajów podejść opartych na obrazowaniu. Wśród nich test ligacji zbliżeniowej oparty na sondzie fluorescencji (PLA) jest szeroko stosowany jako wskaźnik obfitości MCS poprzez wykrywanie interakcji białko-białko między organellami (w zakresie wykrywania 40 nm) na poziomach endogennych<klasa sup="xref">4. Na przykład MERCS zostały zwizualizowane i określone ilościowo za pomocą PLA między kilkoma parami białek mitochondria-ER, w tym VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 i PTPIP51-VAPB5,6,7,8. Chociaż technologia ta została wykorzystana do wykrywania i ilościowego określania interakcji białko-białko między organellami, które są obecne w klasie MCS<sup="xref">5,7,9,10,11, większość badań nie łączyła PLA z barwieniem organelli. W związku z tym nie opracowano jeszcze metody ilościowej, która pozwala na pomiar bliskości między oddziaływaniami PLA a powiązanymi organellami. Tak więc, do tej pory, w przypadku białek ER, ich interakcja w obrębie subdomen błonowych w kontakcie z innymi organellami nie została odróżniona od ich interakcji w obrębie szeroko rozpowszechnionej sieci ER.
Tutaj opisujemy protokół do wykrywania interakcji PLA między białkami rezydującymi w błonie tych samych organelli i do analizy ich bliskości do błony organelli partnerskiej w MCS. Protokół ten został opracowany w oparciu o dwie przesłanki: 1) wcześniejsze badania wykazały, że w warunkach nadekspresji białka przenoszące lipidy ER ORP5 i ORP8 kolokalizują się i oddziałują w mitochondriach ER-mitochondriów i ER-PM MCSs12,13,14,15 i że ORP5 lokalizuje się w kontaktach ER-LD16,17; 2) istniejące technologie, w tym PLA, mikroskopia konfokalna, znakowanie organelli i analiza obrazowania 3D.

<table><tbody><tr><td>1X Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (1X DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu (NH4Cl)</td><td>VWR</td><td>21236.291</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe okrągłe szklane 13mm nr 1,5</td><td>Agar Scientific</td><td>L46R13-15</td><td></td></tr><tr><td>CMXRos czerwony MitoTracker</td><td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td>czerwony marker mitochondrialny</td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop odwrócony SP8-X</td><td>Leica</td><td>DMI 6000</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Płytki 24-dołkowe z powłoką TC Odczynniki</td><td>do</td> wykrywania in situ Merck <td>CLS3526</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Zielony&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Medium montażowe In Situ z DAPI&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ PLA Sonda Anty-Mysia MINUS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92014</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescencja&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>DUO82049</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM I Zredukowana pożywka w surowicy, suplement GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>51985026</td><td>pożywka wolna od surowicy</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Imaris v 9.3</td><td>Oprogramowanie do obrazowania komórek</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Inkubator UINCU-line IL10</td><td>VWR</td><td>390-0384</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe StarFrost (3" x 1")&nbsp;</td><td>Mysz Knittel Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anty-ORP8&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>134409</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>królik anty-ORP5&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>HAP038712</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Ultra czysta woda destylowana, wolna od DNaz/RNaz</td><td>Invitrogen</td><td>10977-035</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja i kwantyfikacja endogennych interakcji białek wewnątrz organelli w miejscach kontaktu er-mitochondria za pomocą testów ligacji zbliżeniowej

Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays

Miejsca kontaktu z błoną (MCS) to obszary o bliskiej bliskości błony, które umożliwiają i regulują dynamiczną wymianę różnych biomolekuł (tj. wapnia i lipidów) między zestawionymi organellami bez angażowania fuzji błonowej. MCS są niezbędne dla homeostazy komórkowej, a ich funkcje są zapewnione przez rezydentne składniki, które często występują jako multimeryczne kompleksy białkowe. MCS często obejmują retikulum endoplazmatyczne (ER), główne miejsce syntezy lipidów i magazynowania wapnia w komórkach, i są szczególnie ważne dla organelli, takich jak mitochondria, które są wykluczone z klasycznych szlaków transportu pęcherzykowego. W ostatnich latach MCS między ER a mitochondriami były szeroko badane, ponieważ ich funkcje silnie wpływają na metabolizm komórkowy/bioenergetykę. W tych miejscach kontaktu zaczęto identyfikować kilka białek, w tym pęta błonowe, kanały wapniowe i białka przenoszące lipidy, co zwiększa zapotrzebowanie na nowe metodologie i podejścia techniczne do badania tych składników MCS. W tym miejscu opisujemy protokół składający się z połączonych podejść technicznych, które obejmują test ligacji zbliżeniowej (PLA), barwienie mitochondriów i segmentację obrazowania 3D, która umożliwia wykrycie białek, które są fizycznie blisko siebie (>40 nm) i które znajdują się na tej samej błonie w MCS ER-mitochondriów. Na przykład użyliśmy dwóch zakotwiczonych w ER białek transferu lipidów, ORP5 i ORP8, które, jak wykazano wcześniej, oddziałują i lokalizują się w MCS mitochondriów ER-mitochondriów i błony plazmatycznej ER. Łącząc PLA ORP5-ORP8 z analizą oprogramowania do obrazowania komórek, możliwe było oszacowanie odległości kompleksu ORP5-ORP8 od powierzchni mitochondriów i określenie, że około 50% interakcji ORP5-ORP8 PLA zachodzi w subdomenach ER w bliskiej odległości od mitochondriów.

Stosując opisany powyżej protokół, wykryliśmy miejsca oddziaływania dwóch zakotwiczonych w ER białek transportu lipidów, ORP5 i ORP8, oraz oceniliśmy ich występowanie w subdomenach błony ER w kontakcie z innymi organellami, w szczególności z mitochondriami. W tym celu sieć mitochondrialną w komórkach HeLa zabarwiono czerwonym markerem mitochondrialnym, a zielone punkty PLA dla ORP5-ORP8 wykryto po utrwaleniu, stosując przeciwciała pierwszorzędowe anty-ORP5 i anty-ORP8, których swoistość została wcześniej przetestowana me...

Potrzeba nowych podejść do badania miejsc kontaktu z błoną (MCS) wzrosła ze względu na rosnące zainteresowanie badaniem tych struktur komórkowych i ich składników. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który integruje wcześniej dostępne technologie mikroskopowe w celu identyfikacji i ilościowego określenia kompleksów białkowych wewnątrz organelli i między organellami, które znajdują się w MCS.

Wizualizacja i kwantyfikacja endogennych interakcji białek wewnątrz organelli w miejscach kontaktu ER-mitochondria za pomocą testów ligacji zbliżeniowej

Membrane contact sites (MCSs) are areas of close membrane proximity that allow and regulate the dynamic exchange of diverse biomolecules (i.e., calcium ...

Nasz protokół PLA pozwala na identyfikację i ilościowe określenie endogennych interakcji między białkami w miejscach kontaktu z błoną. Użyliśmy go do zbadania interakcji między dwoma białkami retikulum endoplazmatycznego w miejscach kontaktu mitochondriów retikulum endoplazmatycznego. Technika ta łączy PLA z barwieniem organelli i analizą odległości organelli.Pozwala na lokalizację i ilościowe określenie interakcji między białkami w miejscach kontaktu błony między organellami. Po wykonaniu testu ligacji zbliżeniowej lub PLA i akwizycji obrazu, skonfiguruj oprogramowanie do analizy komórek, aby uruchomić MATLAB i uruchomić rozszerzenie, klikając opcję Imaris w systemie operacyjnym Mac lub menu edycji w systemie Windows. Wybierz preferencje, przejdź do niestandardowego panelu narzędzi i ustaw ścieżkę.Aby zaimportować obrazy do oprogramowania, przekonwertuj obrazy stosu konfokalnego na plik IMS, bezpośrednio przez sekcję areny lub za pomocą samodzielnego konwertera plików, który umożliwia konwersję wsadową. Po zaimportowaniu kliknij edytuj, przejdź do właściwości obrazu i wybierz geometrię obrazu, aby sprawdzić kalibrację obrazu. Sprawdź, czy rozmiar woksela odpowiada rozmiarowi piksela oczekiwanemu dla rzeczywistego obrazu w X i Y oraz kroku zastosowanego przez mikroskop do wygenerowania stosu Z w Z.To dostosuj kontrast różnych kanałów, kliknij edytuj w menu, przejdź do regulacji wyświetlania i wybierz pokaż korektę wyświetlania.Dostosuj każdy kanał niezależnie, aby zoptymalizować wyświetlanie każdego koloru. Ten krok jest niezbędny do ustawienia precyzyjnych progów lub wykrycia słabych obiektów. Następnie kliknij edytuj i wybierz opcję Przytnij 3D, aby ograniczyć analizę do jednej komórki poprzez przycięcie obrazu.Aby przeanalizować inną komórkę w tym samym polu widzenia, ponownie otwórz ten sam obraz i przytnij go w inny sposób. Wykryj sygnały PLA generowane w miejscu interakcji ORP5 i ORP8, klikając opcję dodaj nowe punkty, która tworzy nowy zestaw obiektów i otwiera kreatora wykrywania plam. Wybierz kanał, na którym ma być wykonana detekcja punktowa.Dostosuj szacowaną średnicę XY, aby pomóc algorytmowi wykrywania plamek w znalezieniu interesujących obiektów. Jeśli wybrana wartość jest zbyt wysoka, pobliskie obiekty ulegną fuzji, a jeśli wartość jest zbyt mała, mogą zostać wykryte nieprawidłowe sygnały. Teraz kliknij odejmowanie tła, aby usunąć tło obrazu przed wykryciem punktu, aby zwiększyć lokalny kontrast wokół interesujących obiektów.Dostosuj próg wykrywania punktowego, zachowując jakość jako parametr progowy w automatycznym progu oprogramowania lub nieznacznie zmodyfikuj tę wartość, aby wykryć wszystkie obiekty. Po zakończeniu wykrywania punktowego zapisz parametry wykrywania i wykorzystaj je ponownie do przetwarzania innych obrazów. Następnie wykryj sieć mitochondrialną, aby wygenerować renderowanie powierzchni, klikając dodaj nowe powierzchnie, aby utworzyć nowy obiekt i otworzyć kreatora wykrywania powierzchni.Wybierz kanał, na którym ma zostać wykonane tworzenie powierzchni. Zastosuj filtr Gaussa, aby uzyskać gładszą powierzchnię, klikając pole wyboru wygładzanie i ustawiając próg wskazujący drobne szczegóły widoczne na powierzchni. Następnie wykonaj odejmowanie tła, aby wzmocnić lokalne kontrasty i dostosować próg, aby wykryć sieć mitochondrialną na podstawie intensywności sygnału.Zastosuj filtr na powierzchni, aby usunąć małe resztki z progu, wybierając filtr liczby wokseli w oknie klasyfikowania powierzchni, a następnie pobaw się górnymi i dolnymi progami, aby zachować tylko interesujące obiekty. Po zakończeniu tworzenia powierzchni zapisz parametry tworzenia i użyj ich ponownie do przetwarzania innych obrazów. Aby wygenerować mapę odległości poza utworzoną powierzchnią mitochondriów, wybierz powierzchnię mitochondriów w polu drzewa sceny.Kliknij przycisk Przetwarzanie obrazu i wybierz funkcję powierzchni, a następnie transformację odległości. Pojawi się rozszerzenie MATLAB z prośbą o wybranie, czy mapa ma być obliczana na zewnątrz, czy wewnątrz powierzchni obiektu. Wybierz obiekt na powierzchni zewnętrznej, aby zmierzyć odległość między plamkami PLA a powierzchnią mitochondriów.Po wygenerowaniu mapy pojawia się ona jako nowy kanał w panelu dopasowania wyświetlania. W tym kanale każdy piksel ma wartość odpowiadającą odległości do najbliższych mitochondriów. Wybierz wcześniej wygenerowane miejsca w polu drzewa sceny, aby zmierzyć odległość od każdego punktu do najbliższego mitochondrium, a następnie zidentyfikować i zwizualizować najbliższe.Teraz wybierz określone wartości i intensywność środka kanału odpowiadającą mapie odległości w statystykach i szczegółowym dzienniku, aby zmierzyć wartość każdego środka punktu, która odpowiada jego odległości do najbliższego mitochondrium na mapie odległości. Wyeksportuj dane jako plik CSV, klikając ikonę dyskietki w lewym dolnym rogu okna. Aby wyodrębnić subpopulację plam na podstawie ich odległości do mitochondriów, wybierz miejsca w drzewie sceny i kliknij zakładkę filtrów.Dodaj nowy filtr oparty na intensywności środka kanału odpowiadającej mapie odległości w tym oknie i wyodrębnij miejsca oddalone od mitochondriów o mniej niż 380 nanometrów, ustawiając dolny próg na zero mikrometrów, a górny próg na 0,380 mikrometra. Wykonaj krok duplikacji, naciskając przycisk zduplikowanego zaznaczenia do nowych miejsc, aby ustawić ostrość na wybranych miejscach. Konfokalne obrazy endogennego ORP5-ORP8 PLA wykazały interakcje w komórkach HeLa w siatkowatych poddomenach ER, korowych ER i ER w bliskim kontakcie z mitochondriami, powszechnie nazywanymi błonami ER związanymi z mitochondriami.Analiza obrazowania 3D wykazała, że około 50% endogennych interakcji ORP5-ORP8 PLA wykryto w błonach ER związanych z mitochondriami. Odsetek interakcji ORP5-ORP8 PLA zachodzących na błonach ER związanych z mitochondriami w komórkach z nadekspresją ORP5 i ORP8 był podobny do obserwowanego w komórkach, w których białka te ulegały ekspresji na poziomie endogennym. Regulacja w dół ORP5 i ORP8 spowodowała ogromny spadek całkowitej liczby sygnałów PLA, podczas gdy ich ko-nadekspresja zwiększyła PLA.Sygnały PLA wykryto w parach ORP5-PTPIP51 i ORP8-PTPIP51, a ich średnia liczba była podobna do pary ORP5-ORP8 PLA, potwierdzając lokalizację ORP5 i ORP8 w miejscach kontaktu z błoną ER-mitochondria. Ponadto oddziaływanie ORP5-ORP8 PLA na stykach błony plazmatycznej ER w trójkierunkowym miejscu kontaktu między mitochondriami, ER i kropelkami lipidów identyfikuje się za pomocą komórek HeLa transfekowanych PHPLCD-RFP lub mCherry-PLN1. Jak w każdej metodzie analizy obrazu, jakość obrazu jest kluczowym punktem, dlatego optymalizacja sygnału ma decydujące znaczenie dla automatycznego wykrywania obiektów.Technika ta może być również wykorzystana do badania powiązań między dwoma lub wieloma organellami komórkowymi, tak jak zrobiliśmy to w naszym niedawnym badaniu dotyczącym funkcji ORP5 i ORP8 w trójstronnym ER, mitochondriach, miejscach kontaktu kropelek lipidów. Technika ta może być pomocna w innych badaniach w dziedzinie komunikacji wewnątrzkomórkowej w celu zidentyfikowania nowych wieloczęściowych powiązań między organellami.

visualization-quantification-endogenous-intra-organelle-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje test ligacji zbliżeniowej do badania in situ interakcji białko-białko w komórkach nicieni. Bliskie sąsiedztwo badanych białek generuje kolistą matrycę DNA za pomocą sondy PLA dołączonej do przeciwciała wtórnego. Sonda jest dalej amplifikowana za pomocą roztworu do amplifikacji, który wytwarza długie, jednoniciowe DNA, a następnie hybrydyzuje sondę detektora, umożliwiając lokalizację interakcji białko-białko w komórkach.

Test ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ

Tutaj opisujemy procedurę wizualizacji i ilościowego określania z dużą czułością endogennych interakcji między retikulum endoplazmatycznym a mitochondriami w komórkach stałych. Protokół zawiera zoptymalizowany test ligacji zbliżeniowej in situ ukierunkowany na receptor 1,4,5-trifosforanu inozytolu / białko regulowane glukozą 75 / zależny od napięcia kanał anionowy / kompleks cyklofiliny D na granicy faz błony związanej z mitochondriami.

Badanie interakcji retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ w komórkach utrwalonych

Interakcje białko-białko mogą zachodzić zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie komórki. Aby zbadać te interakcje, stosuje się tradycyjną koimmunoprecypitację i nowoczesny test ligacji zbliżeniowej. W tym badaniu porównujemy te dwie metody wizualizacji rozkładu oddziaływań NF90-RBM3 w jądrze i cytoplazmie.

Wizualizacja interakcji białko-białko we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej in situ

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Tutaj pokazujemy, jak używać testu ligacji zbliżeniowej (PLA) do wizualizacji heterodimeryzacji MST1/MST2 w stałych komórkach z wysoką czułością.

Wykrywanie heterodimeryzacji izoform białek za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Pokrewne białka domeny J współpracują z opiekunem Hsp70, aby pomóc w niezliczonych procesach biologicznych, począwszy od fałdowania białek, a skończywszy na degradacji. W tym miejscu opisujemy test ligacji zbliżeniowej in situ, który umożliwia monitorowanie tych przejściowo utworzonych mechanizmów opiekuńczych w komórkach bakteryjnych, drożdżowych i ludzkich.

Monitorowanie in situ przejściowo utworzonych molekularnych zespołów opiekuńczych w bakteriach, drożdżach i komórkach ludzkich

Protokół proteomiki znakowania bliskości lizosomów neuronalnych jest tutaj opisany w celu scharakteryzowania dynamicznego mikrośrodowiska lizosomów w ludzkich neuronach pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Lizosomalne białka błonowe i białka, które oddziałują z lizosomami (stabilnie lub przejściowo), można dokładnie określić ilościowo w tej metodzie z doskonałą wewnątrzkomórkową rozdzielczością przestrzenną w żywych ludzkich neuronach.

Charakterystyka interaktomu lizosomu neuronalnego z proteomiką znakowania zbliżeniowego

Ustanowiliśmy test ponownego składania lucyferazy z podziałem na monitorowanie kontaktów endoplazmatycznych retikulum-mitochondriów w żywych komórkach. Za pomocą tego testu opisujemy protokół ilościowego pomiaru poziomu tych sprzężeń między organellami w komórkach HEK293T w warunkach obróbki chemicznej.

Test ponownego składania rozszczepionej lucyferazy w celu pomiaru kontaktów retikulum-mitochondria endoplazmatyczne w żywych komórkach

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Poznaj metodę PLA do wizualizacji i kwantyfikacji endogennych interakcji białek w miejscach kontaktu ER-mitochondria. Technika ta umożliwia badanie dynamiki białek ORP5 i ORP8 w komórkach HeLa.

Wizualizacja i kwantyfikacja endogennych interakcji białek wewnątrz organelli w miejscach kontaktu ER-mitochondria za pomocą testów ligacji zbliżeniowej (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja i kwantyfikacja endogennych interakcji białek wewnątrz organelli w miejscach kontaktu ER-mitochondria za pomocą testów ligacji zbliżeniowej

Przeglądaj więcej filmów