Badanie interakcji retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ w komórkach utrwalonych

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wizualizacja i ilościowe określenie interakcji mitochondriów retikulum endoplazmatycznego za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ w komórkach stałych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomedycyny, aby lepiej analizować interakcje mitochondriów ER w utrwalonych komórkach przy użyciu prostej techniki immunofluorescencji. Miejmy nadzieję, że sugeruje to nowe strategie leczenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy wizualizować i określać ilościowo interakcje mitochondriów ER w stałych komórkach, a technika ta może być stosowana do biopsji tkanek zatopionych w parafinie u pacjentów. Korzystając z testu ligacji zbliżeniowej in situ pokazanego w tym filmie, mysie przeciwciało pierwszorzędowe skierowane przeciwko VDAC1 na zewnętrznej błonie mitochondrialnej i pierwszorzędowe przeciwciało królika skierowane przeciwko IP3R1 na błonę retikulum endoplazmatycznego łączą się ze swoimi epitopami w pobliżu na granicy faz błony związanej z mitochondriami. Sondy ligacji zbliżeniowej, które mają przyczepione ogony końcowe DNA i które są skierowane na mysie i królicze IgG, są dodawane i mogą tworzyć szablony do ligacji oligonukleotydów łączników i mogą być amplifikowane i wizualizowane za pomocą czerwonych oligonukleotydów Texas. Może się to zdarzyć tylko wtedy, gdy dwa docelowe białka znajdują się w odległości poniżej 40 nanometrów. Zgodnie z odległością między obiema błonami organelli, na granicy faz błon związanych z mitochondriami. Aby utrwalić i zablokować komórki do testu ligacji zbliżeniowej in situ, umieść ludzkie komórki H7 w 150 000 komórek na niekodowanym naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 35 mm. Następnego dnia usuń pożywkę hodowlaną i użyj 1 ml PBS do przemycia komórek. Następnie odessać bufor i dodać 1 ml dziesięcioprocentowego formaldehydu. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej z mieszaniem przez 10 minut, aby utrwalić komórki. Aby zatrzymać reakcję, dodaj 1 ml 1 M glicyny i wymieszaj płytki na zmianę. Usuń roztwór glicyny i dodaj 1 ml 1XPBS. Następnie krótko wymieszać płytki i odessać bufor. Następnie dodaj 1 ml 100 mM glicyny do komórek. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej z mieszaniem przez 15 minut. Po zasysaniu roztworu należy przeniknąć komórki, dodając 1 ml 0,1% tritonu-X100 do PBS. I powtórz inkubację. Odessać detergent i dodać 1 ml PBS, aby umyć komórki. Po usunięciu buforu dodać 40 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej płytki komórek i inkubować próbki w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie stuknij roztwór blokujący z naczyń, starając się uzyskać równe resztkowe objętości bufora dla każdego szkiełka, nie dopuszczając do wyschnięcia szkiełek. Aby przeprowadzić test ligacji zbliżeniowej, użyj PBS do rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych. Wiruj i dodaj roztwór do naczyń. Inkubować próbki w temperaturze 4