Badanie interakcji retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ w komórkach utrwalonych
10 grudnia 2016
Tutaj opisujemy procedurę wizualizacji i ilościowego określania z dużą czułością endogennych interakcji między retikulum endoplazmatycznym a mitochondriami w komórkach stałych. Protokół zawiera zoptymalizowany test ligacji zbliżeniowej in situ ukierunkowany na receptor 1,4,5-trifosforanu inozytolu / białko regulowane glukozą 75 / zależny od napięcia kanał anionowy / kompleks cyklofiliny D na granicy faz błony związanej z mitochondriami.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest wizualizacja i ilościowe określenie interakcji mitochondriów retikulum endoplazmatycznego za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ w komórkach stałych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomedycyny, aby lepiej analizować interakcje mitochondriów ER w utrwalonych komórkach przy użyciu prostej techniki immunofluorescencji. Miejmy nadzieję, że sugeruje to nowe strategie leczenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy wizualizować i określać ilościowo interakcje mitochondriów ER w stałych komórkach, a technika ta może być stosowana do biopsji tkanek zatopionych w parafinie u pacjentów. Korzystając z testu ligacji zbliżeniowej in situ pokazanego w tym filmie, mysie przeciwciało pierwszorzędowe skierowane przeciwko VDAC1 na zewnętrznej błonie mitochondrialnej i pierwszorzędowe przeciwciało królika skierowane przeciwko IP3R1 na błonę retikulum endoplazmatycznego łączą się ze swoimi epitopami w pobliżu na granicy faz błony związanej z mitochondriami. Sondy ligacji zbliżeniowej, które mają przyczepione ogony końcowe DNA i które są skierowane na mysie i królicze IgG, są dodawane i mogą tworzyć szablony do ligacji oligonukleotydów łączników i mogą być amplifikowane i wizualizowane za pomocą czerwonych oligonukleotydów Texas. Może się to zdarzyć tylko wtedy, gdy dwa docelowe białka znajdują się w odległości poniżej 40 nanometrów. Zgodnie z odległością między obiema błonami organelli, na granicy faz błon związanych z mitochondriami. Aby utrwalić i zablokować komórki do testu ligacji zbliżeniowej in situ, umieść ludzkie komórki H7 w 150 000 komórek na niekodowanym naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 35 mm. Następnego dnia usuń pożywkę hodowlaną i użyj 1 ml PBS do przemycia komórek. Następnie odessać bufor i dodać 1 ml dziesięcioprocentowego formaldehydu. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej z mieszaniem przez 10 minut, aby utrwalić komórki. Aby zatrzymać reakcję, dodaj 1 ml 1 M glicyny i wymieszaj płytki na zmianę. Usuń roztwór glicyny i dodaj 1 ml 1XPBS. Następnie krótko wymieszać płytki i odessać bufor. Następnie dodaj 1 ml 100 mM glicyny do komórek. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej z mieszaniem przez 15 minut. Po zasysaniu roztworu należy przeniknąć komórki, dodając 1 ml 0,1% tritonu-X100 do PBS. I powtórz inkubację. Odessać detergent i dodać 1 ml PBS, aby umyć komórki. Po usunięciu buforu dodać 40 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej płytki komórek i inkubować próbki w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie stuknij roztwór blokujący z naczyń, starając się uzyskać równe resztkowe objętości bufora dla każdego szkiełka, nie dopuszczając do wyschnięcia szkiełek. Aby przeprowadzić test ligacji zbliżeniowej, użyj PBS do rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych. Wiruj i dodaj roztwór do naczyń. Inkubować próbki w temperaturze 4
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia procedurę wizualizacji i ilościowego określania interakcji między retikulum endoplazmatycznym a mitochondriami w komórkach fiksowanych z wysoką czułością. Metoda wykorzystuje zoptymalizowane in situ proximity ligation assay do uwidocznienia specyficznych kompleksów białkowych na interfejsie błony związanej z mitochondriami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Neuronauka
- Biochemia
Tło
- Retikulum endoplazmatyczne i mitochondria odgrywają kluczową rolę w metabolizmie komórkowym.
- Zrozumienie ich interakcji jest istotne dla wyjaśnienia funkcji komórkowych.
- Asezy bliskowstecznego wiązania dostarczają wrażliwej metody badania interakcji białkowych.
- To badanie koncentruje się na konkretnym kompleksie białkowym zaangażowanym w te interakcje.
Cel badania
- Rozwój metody wizualizacji interakcji ER-mitochondria.
- Ilościowe określenie tych interakcji z wysoką czułością.
- Zwiększenie zrozumienia metabolizmu i sygnalizacji komórkowej.
Stosowane metody
- In situ proximity ligation assay
- Uzwięzłowienie receptora inozytolu 1,4,5-trifosforanu
- Zaangażowanie białka 75 regulowanego glukozą
- Analiza kanału anionowego zależnego od napięcia i kompleksu cyklofiliny D
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja interakcji ER-mitochondria.
- Ilościowe określenie kompleksów białkowych na interfejsie błony.
- Wykazanie wysokiej czułości w wykrywaniu interakcji.
Wnioski
- Opracowany protokół pozwala na szczegółowe badania interakcji komórkowych.
- Zdobyte wglądy mogą przyczynić się do zrozumienia procesów metabolicznych.
- Ta metoda może być stosowana w różnych dziedzinach badań biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying endogenous ER-mitochondria interactions is critical for de-risking early discovery hypotheses related to cellular signaling and metabolic regulation. The in situ proximity ligation assay enables sensitive, multiplexed detection of organelle contact sites without protein overexpression, supporting predictive confidence in disease-relevant systems. This capability strengthens portfolio decisions at the intersection of target validation and mechanistic pathway analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and quantification of ER-mitochondria contacts at the molecular level.
- Supports mechanistic de-risking by confirming endogenous protein proximity in fixed cells and tissue biopsies.
- Facilitates functional target validation for pathways involving calcium signaling and organelle crosstalk.
- Improves predictive confidence for advancing targets implicated in metabolic and signaling disorders.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible assay for quantifying protein-protein interactions at sub-organelle resolution.
- Enables multi-condition testing to assess the impact of compounds or genetic perturbations on ER-mitochondria contacts.
- Delivers quantitative outputs suitable for comparative analysis across experimental arms.
- Supports assay scalability and platform reuse for broader screening initiatives.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by enabling analysis in patient-derived tissue biopsies.
- Maintains translational continuity from discovery through preclinical validation of organelle interaction targets.
- Supports risk-adjusted advancement by providing mechanistic evidence of pathway engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This in situ proximity ligation assay bridges early discovery and preclinical research by enabling robust quantification of ER-mitochondria interactions in fixed cells and tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for organelle crosstalk mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound or genetic screening campaigns.
- Analytics: Provides sensitive detection of protein proximity below 40 nm, enabling statistical comparison of interaction frequencies.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and mechanistic validation in disease-relevant samples.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse protein interaction studies across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes detection of endogenous protein interactions with high sensitivity and specificity.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by providing robust mechanistic data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with validated organelle interaction profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence and proximity ligation assay protocols.
- Needs access to high-quality antibodies and fluorescence imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible quantification across studies.
- Adaptable to both cell lines and paraffin-embedded tissue biopsies for translational relevance.
- Limited to fixed samples; not suitable for live-cell dynamic interaction studies.
