Wizualizacja mitofagii za pomocą barwników fluorescencyjnych dla mitochondriów i lizosomów

Metoda ta pomaga obserwować mitofagię w żywych komórkach za pomocą barwnika mitochondriów o zielonej fluorescencji i barwnika lizosomu o czerwonej fluorescencji. Mitofagia odgrywa ważną rolę w utrzymaniu homeostazy mitochondriów i różnych aspektów funkcji komórkowych. Technika ta może zapewnić nowe podejście do leczenia chorób związanych z mitochondriami.

Ta procedura nie jest bardzo skomplikowana. Uchwycenie wyraźnych obrazów jest bardzo ważne dla zliczania nakładki mitochondriów i lizosomów. Na początek hoduj mysie fibroblasty embrionalne lub komórki MEF w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórek z 10 mililitrami zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium lub DMEM firmy Dulbecco.

Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i monitoruj komórki pod mikroskopem przy 100-krotnym powiększeniu. Gdy komórki osiągną zbieżność od 80 do 90%, przemyj je dwoma mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco. Następnie dodaj dwa mililitry 0,05% trypsyny EDTA na jedną minutę, aby zdysocjować komórki, a następnie dwa mililitry DMEM, aby zatrzymać reakcję.

Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 100 G przez trzy minuty i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze DMEM. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i szkiełek komory do liczenia komórek i zaszczepij 1,5 razy 10 do szóstych komórek w nowej 10-centymetrowej naczyniu do hodowli komórkowej zawierającej 10 mililitrów DMEM. Do testu mitofagii przygotuj zawiesinę komórkową zgodnie z opisem i rozcieńczyć zawiesinę komórkową do jednego razy 10 do piątej komórki na mililitr świeżego DMEM.

Dodaj dwa mililitry rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do 20-milimetrowego naczynia konfokalnego i potrząśnij naczyniem na krzyż. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Przygotować roztwory robocze barwników, rozcieńczając roztwory podstawowe.

Dodaj po dwa mikrolitry 0,2 milimolowego barwnika mitochondrialnego i 50 mikromolowego barwnika lizosomu do dwóch mililitrów DMEM, aby uzyskać stężenie robocze 0,2 mikromolowego barwnika mitochondrialnego i 50 nanomolowego barwnika lizosomowego. Usuń pożywkę z naczynia do hodowli konfokalnej i dodaj jeden mililitr roztworu barwiącego, aby pokryć komórki. Umieść naczynie do hodowli komórkowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 20 do 30 minut.

Ustaw parametry oprogramowania do obrazowania mikroskopii konfokalnej. W przypadku obrazów z podwójnym wzbudzeniem należy użyć wzbudzenia sekwencyjnego przy 488 nanometrach i 543 nanometrach i zbierać emisję odpowiednio przy 505 do 545 nanometrach i większych niż 560 nanometrów. Wyjąć z inkubatora szalkę z podłożem hodowlanym zawierającą barwnik i dodać do naczynia jeden mililitr buforu Krebs-Henseleit lub KH.

Aby wywołać mitofagię, należy potraktować komórki FCCP w jednym mikromolowym buforze KH przez 10 minut w temperaturze pokojowej i natychmiast przystąpić do obrazowania komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego. Nałóż odpowiednią ilość oleju na górną część soczewki olejowej 63X. Umieść próbkę na stoliku na próbkę mikroskopu konfokalnego i przesuń ją bezpośrednio nad soczewkę obiektywu.

Użyj oprogramowania do obrazowania, aby znaleźć próbkę, klikając kartę Zlokalizuj w lewym górnym rogu interfejsu oprogramowania. Wybierz zestaw filtrów zielonych dla eksperymentu. Użyj pokrętła regulacji zgrubnej, aby szybko ustawić ostrość, przesuwając soczewkę obiektywu w górę iw dół.

Po tym, jak próbka komórki jest wyraźnie widoczna przez okular, wyszukaj i ustaw ostrość na obszarze pojedynczych komórek, a następnie przesuń go do środka pola view. Kliknij kartę Akwizycja w lewym górnym rogu interfejsu oprogramowania, aby uzyskać obrazy. Wybierz tylko kanał 488 nanometrów i rozdzielczość klatki 1024 na 1024 dla podglądu.

Kliknij kartę Na żywo w lewym górnym rogu, aby rozpocząć skanowanie na żywo. Dostosuj pole widzenia do najostrzejszego i dostosuj moc lasera, przesuwając suwak w lewo lub w prawo. Utrzymuj ustawienie wzmocnienia poniżej 600, aby uniknąć nadmiernej ekspozycji.

Ustaw wartość otworka na 156, wartość wzmocnienia na 545 i wartość przesunięcia cyfrowego na zero. Wybierz najlepsze pole widzenia, sprawdź dwa kanały i wybierz rozdzielczość klatki 1024 na 1024. Kliknij przycisk Snap (Przyciągaj), aby uzyskać obrazy 2D i zapisać uzyskane obrazy.

W tym badaniu FFCP zastosowano do wywołania mitofagii w komórkach MEF do obrazowania konfokalnego. Przedstawiono tutaj reprezentatywne obrazy komórek wybarwionych barwnikiem mitochondriów o zielonej fluorescencji pokazującym mitochondria i wybarwionych barwnikiem lizosomów o czerwonej fluorescencji pokazującym lizosom. Kiedy uszkodzone mitochondria zabarwione na zielono są pochłonięte przez zabarwione na czerwono lizosomy, zielona i czerwona fluorescencja nakładają się na siebie, odsłaniając żółte, kolokalizowane lizosomy mitochondriów.

Żółte kropki odpowiadają tym kolokalizowanym lizosomom mitochondriów reprezentującym trwającą mitofagię, a zatem można je policzyć w celu oceny zakresu mitofagii. Przygotowanie roztworu roboczego barwników do barwienia mitochondriów i lizosomów oraz utrzymanie odpowiedniej konfluencji komórek podczas obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej to kluczowe kroki, o których należy pamiętać. Procedura ta może być również wykorzystana do analizy liczby i morfologii mitochondriów, co jest ważne dla oceny dynamiki mitochondriów.

Mitofagia jest ściśle związana z różnymi chorobami ludzkimi, a technika ta może być wykorzystana do zbadania związku między mitofagią a chorobami człowieka.