Charakterystyka interaktomu lizosomu neuronalnego z proteomiką znakowania zbliżeniowego

Lizosomy to systemy usuwania śmieci w komórce. Aktywność lizosomów jest bardzo dynamiczna i bardzo trudna do uchwycenia. W tym badaniu opracowaliśmy podejście proteomiczne do znakowania zbliżeniowego, aby rozszyfrować mikrośrodowisko lizosomalne w żywych ludzkich neuronach.

Podejście to obejmuje białka błony lizosomów oraz stabilne i przejściowe interakcje z neuronami pochodzącymi z lizosomów i iPSC. Dysfunkcja lizosomów jest silnie związana z różnymi chorobami mózgu. Technika ta może być zastosowana do zrozumienia różnych chorób mózgu i zapewnienia potencjalnych celów molekularnych do projektowania nowych terapii.

Aby rozpocząć procedurę znakowania zbliżeniowego, obserwuj neurony pod mikroskopem, aby upewnić się, że są żywe i zdrowe. Weź połowę objętości pożywki z hodowli, aby wymieszać ją z biotyną fenolem i dodaj ją z powrotem do neuronów w końcowym stężeniu 500 mikromolów przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozpocząć reakcję znakowania, dodając świeżo przygotowany roztwór nadtlenku wodoru do kultury neuronów o końcowym stężeniu jednomilimolowym.

Po jednominutowej inkubacji odessać pożywkę i trzykrotnie przepłukać kulturę buforem hartującym. Przechylić płytkę, aby zassać cały pozostały bufor. Po dodaniu lodowatego buforu do lizy zeskrob lizaty komórkowe do zimnych 1,5-mililitrowych probówek.

Sonikuj rurki w lodowatej kąpieli wodnej o mocy ponad 100 watów przez 15 minut z naprzemiennymi cyklami 40 sekund włączenia i 20 sekund wyłączenia. Po lizie komórek dodaj zimny aceton w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do próbki o czterokrotnej objętości roztworu lizatu komórkowego. Krótko wirować i inkubować w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez trzy godziny, aby wytrącić białka i usunąć pozostałości biotyny fenolu.

Odwirować probówkę lizatu komórkowego o temperaturze 16 500 razy G przez 10 minut w temperaturze dwóch stopni Celsjusza i ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania osadu białkowego. Następnie przemyć granulkę dwukrotnie jednym mililitrem acetonu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, a następnie odwirować i usunąć supernatant. Następnie suszyć granulki białkowe za pomocą koncentratora próżniowego przez jedną minutę.

Dodaj bufor do lizy komórek, aby całkowicie rozpuścić osad za pomocą wiru lub sonikacji. Weź 20 mikrolitrów podwielokrotności, aby określić całkowite stężenie białka za pomocą testu DCA. Przechowuj pozostały roztwór komórkowy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Pobrać próbkę lizatu białkowego z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i poddać sonikę probówce z próbką przez 30 sekund w celu szybkiego rozmrożenia. Wirować, krótko odwirować za pomocą mini wirówki stołowej i umieścić probówkę z próbką na lodzie. Następnie przenieś 250 mikrolitrów zawiesiny kulek magnetycznych streptawidyny do każdej 1,5-mililitrowej probówki.

Umieść te probówki na stojaku magnetycznym na jedną minutę, umyj koraliki trzykrotnie jednym mililitrem 2% roztworu dodecylosiarczanu sodu i usuń pozostały bufor. Na podstawie całkowitego stężenia białka w lizatach komórkowych i wyników testu miareczkowania kulek dodaj obliczoną ilość próbki białka potrzebną do uzyskania 250 mikrolitrów zawiesiny kulek magnetycznych streptawidyny. Następnie dodaj bufor do lizy komórek do mieszaniny kulek magnetycznych i lizatu do całkowitej objętości jednego mikrolitra i obracaj probówkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia należy krótko odwirować probówkę z próbką na mikrowirówce stołowej i umieścić probówkę na stojaku magnetycznym na jedną minutę w celu usunięcia supernatantu. Następnie umyj kulki dwukrotnie za pomocą jednego mililitra buforu myjącego A z pięciominutowym obrotem w temperaturze pokojowej. Powtórzyć proces z każdym buforem do płukania dwa razy, sekwencyjnie, z buforem B, buforem C i buforem D w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na jedną minutę i usuń supernatant. Następnie ponownie zawieś kulki w 100 mikrolitrach pięciomilimolowego TCEP w 50-milimolowym buforze Tris do inkubacji przez 30 minut na termomikserze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie 15-milimolowego dodatku IAA przez 30 minut w ciemności i pięciomilimolowego TCEP przez pięć minut w celu stłumienia pozostałości IAA. Krótko odwirować probówkę z próbką na mikrowirówce i umieścić probówkę na stojaku magnetycznym na jedną minutę w celu usunięcia supernatantu.

Dodaj 200 mikrolitrów pięciomilimolowego TCEP do 50-milimolowego buforu Tris, aby ponownie zawiesić kulki. Dodaj jeden mikrogram mieszanki trypsyny/Lys-C przez 14 godzin przy 1, 200 obr./min i 37 stopniach Celsjusza. Po 14 godzinach dodaj dodatkowe 0,2 mikrograma mieszanki trypsyny/Lys-C na trzy godziny, odwiruj probówki z próbkami i umieść je na stojaku magnetycznym na jedną minutę.

Następnie przenieś supernatant peptydowy do czystych probówek. Następnie przemyj kulki 50 mikrolitrami 50-milimolowego buforu Tris z wytrząsaniem przez pięć minut, połącz supernatanty peptydowe i dodaj 30 mikrolitrów 10% kwasu trifluorooctowego do probówki, aby obniżyć pH do mniej niż trzech. Po odsalaniu i suszeniu peptydów.

zawiesić próbki peptydów w buforze LC do analizy LC-MS. Przenieść supernatant do fiolki z próbką LC w celu analizy za pomocą nano LC-MS. W pliku metody LC-MS dodaj niestandardową listę wykluczeń LC-MS z określonymi masami i zakresami czasu retencji dla bardzo obfitych pików peptydów zanieczyszczeń, takich jak streptawidyna, trypsyna i Lys-C.

Analizuj surowe dane LC-MC za pomocą oprogramowania do analizy danych proteomicznych. Dołącz dwie biblioteki FASTA: bazę danych referencyjnych Swiss-Prot Homo sapiens oraz nowo utworzoną uniwersalną bibliotekę FASTA dotyczącą zanieczyszczeń z prefiksem zanieczyszczeń w UniProt ID.Skonfiguruj parametry analizy danych z 1% współczynnikiem fałszywych odkryć dla identyfikacji dopasowania widmowego białek i peptydów. Wybierz trawienie trypsyny z trzema pominiętymi rozszczepieniami, ustaloną modyfikacją metylacji cystyny karbamidylu, zmienną modyfikacją utleniania metioniny i acetylacją końcową białka.

W celu kwantyfikacji bez znaczników należy znormalizować intensywność pików peptydu MS-I do endogennie biotynylowanej karboksylazy PCCA i zmniejszyć różnice w eksperymentach znakowania zbliżeniowego. Eksportuj wyniki poziomu białka z oprogramowania proteomicznego jako plik Excel. Przed analizą statystyczną należy usunąć białka zanieczyszczające i białka za pomocą tylko jednego wyniku PSM lub bez wyniku kwantyfikacji.

Morfologie komórek w różnych punktach czasowych neuronów iPSC zilustrowały wzrost neurytów w trzydniowym okresie różnicowania. Po przejściu na płytki pokryte poli-L-ornityną w pożywce neuronowej, neuryty utworzyły sieć między neuronami, a przedłużenia aksonów stały się bardziej widoczne po dojrzewaniu w ciągu dwóch tygodni. W obrazowaniu fluorescencyjnym szczytowa aktywność LAMP1 biotynylowanych białek była barwiona streptawidyną i współlokalizowana z barwieniem LAMP1 w neuronach.

Wyniki testu miareczkowania kulek wykazały spadek niewychwyconych sygnałów białkowych biotynylowanych przy zwiększaniu ilości kulek streptawidyny. Pięć mikrolitrów kulek streptawidyny było optymalnych dla 50 mikrogramów białek wejściowych z endogennych próbek wierzchołkowych LAMP1. Trawienie na kulkach z mieszanką trypsyny / Lys-C spowodowało większą identyfikację białka i peptydów oraz mniej pominiętych rozszczepień w porównaniu z samą trypsyną.

Ponadto stwierdzono, że od 1 do 1,5 mikrograma trypsyny/Lys-C jest optymalne do trawienia na kulkach w celu uzyskania największej liczby zidentyfikowanych białek i najniższego odsetka pominiętych rozszczepień. Znane lizosomalne białka błonowe były zwiększone w wierzchołku LAMP1 w porównaniu z brakiem kontroli wierzchołka. Endogennie biotynylowane białka występują w dużych ilościach, ale pozostają niezmienione.

Termin GO i analiza sieci białek sugerują, że stabilne lizosomalne białka błonowe i przejściowe interakcje lizosomalne związane z transportem i transportem endolizosomalnym zostały wzbogacone w proteomikę wierzchołkową LAMP1. Etykietowanie zbliżeniowe wierzchołka musi być wygaszone dokładnie po jednej minucie, aby zmniejszyć stres oksydacyjny i różnice eksperymentalne. Niedawno opracowaliśmy metodę rozszczepialnej biotyny, która pozwala nam wzbogacić biotynylowane białka.

Ta metoda, w połączeniu z naszą obecną metodą, pozwoli nam zmniejszyć zakłócenia ze strony streptawidyny i endogennie biotynylowanych białek. Możemy zastosować tę metodę zarówno do neuronów typu dzikiego, jak i zmutowanych z wariantami genetycznymi, które powodują choroby mózgu. Może to pomóc nam zrozumieć, w jaki sposób i dlaczego mutacje genetyczne wpływają na mikrośrodowisko lizosomalne w ludzkich neuronach.