Name: Charakterystyka interaktomu lizosomu neuronalnego z proteomiką znakowania zbliżeniowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T14:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Poznaj metodę proteomiki znakowania zbliżeniowego do badania mikrośrodowiska lizosomalnego w żywych ludzkich neuronach pochodzących z komórek iPSC. Ta technika umożliwia identyfikację białek błonowych lizosomów i ich interakcji, co jest kluczowe dla zrozumienia dysfunkcji lizosomalnych w chorobach mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie jest wspierane przez grant NIH (R01NS121608). A.M.F. dziękuje za stypendium ARCS-Metro Washington Chapter oraz Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Dziękujemy laboratorium Michaela Warda w Narodowym Instytucie Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu (NINDS) za wsparcie w zakresie biologii molekularnej i rozwój technologii i3Neuron.

<ol><li>De Duve, C., Wattiaux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functions of lysosomes.</a> Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).</li>
<li>Ballabio, A., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes+as+dynamic+regulators+of+cell+and+organismal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).</li>
<li>Lawrence, R. E., Zoncu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lysosome+as+a+cellular+centre+for+signalling%2C+metabolism+and+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control.</a> Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).</li>
<li>Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteome+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The proteome of lysosomes.</a> Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).</li>
<li>Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome+trafficking+and+signaling+in+health+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases.</a> Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).</li>
<li>Leeman, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome+activation+clears+aggregates+and+enhances+quiescent+neural+stem+cell+activation+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging.</a> Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).</li>
<li>Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+dysfunction+at+the+centre+of+Parkinson%27s+disease+and+frontotemporal+dementia%2Famyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson's disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis.</a> Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).</li>
<li>Ferguson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Neuronal lysosomes.</a> Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).</li>
<li>Rost, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+acidification+of+synaptic+vesicles+and+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).</li>
<li>Liao, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+granules+hitchhike+on+lysosomes+for+long-distance+transport%2C+using+annexin+A11+as+a+molecular+tether%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether.</a> Cell. 179 (1), 147-164 (2019).</li>
<li>Kuijpers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+autophagy+regulates+presynaptic+neurotransmission+by+controlling+the+axonal+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum.</a> Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+serotonin+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).</li>
<li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+a+dish%3A+The+promise+of+iPSC-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145 (6), 831-834 (2011).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+production+of+iPSC-derived+human+neurons+to+identify+tau-lowering+compounds+by+high-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening.</a> Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).</li>
<li>Fernandopulle, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor-mediated+differentiation+of+human+iPSCs+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons.</a> Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).</li>
<li>Sunbul, M., Andres, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSunbul%2C+M+%22Proximity+labeling%3A+Methods+and+protocols%22">Proximity labeling: Methods and protocols</a>. , Humana Press. (2019).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li>
<li>Rhee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+mapping+of+mitochondria+in+living+cells+via+spatially+restricted+enzymatic+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging.</a> Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).</li>
<li>Lobingier, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+spatiotemporally+resolve+protein+interaction+networks+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells.</a> Cell. 169 (2), 350-360 (2017).</li>
<li>Paek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+tracking+of+GPCR+signaling+via+peroxidase-catalyzed+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling.</a> Cell. 169 (2), 338-349 (2017).</li>
<li>Fazal, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlas+of+subcellular+RNA+localization+revealed+by+APEX-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq.</a> Cell. 178 (2), 473-490 (2019).</li>
<li>Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+comparative+evaluation+of+endolysosomal+proximity+labeling-based+proteomic+methods+in+human+iPSC-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons.</a> Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).</li>
<li>Li, J., Pfeffer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+membrane+glycoproteins+bind+cholesterol+and+contribute+to+lysosomal+cholesterol+export%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export.</a> eLife. 5, 21635(2016).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+polypharmacology+platform+promotes+cytoprotection+and+viability+of+human+pluripotent+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells.</a> Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).</li>
<li>Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-cleavable+biotin+for+chemical+and+enzymatic+biotinylation+and+its+application+to+mitochondrial+TurboID+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+proteomic+and+metabolomic+analyses+of+the+mitochondrial+neurodegenerative+disease+MELAS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Omics%22%5BJournal%5D)">Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS.</a> Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSFragger%3A+Ultrafast+and+comprehensive+peptide+identification+in+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).</li>
<li>Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+protein+contaminants+influence+DDA+and+DIA+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichr%3A+A+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).</li>
<li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STRING+v11%3A+Protein-protein+association+networks+with+increased+coverage%2C+supporting+functional+discovery+in+genome-wide+experimental+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets.</a> Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).</li>
<li>Kissing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+vacuolar-type+H%2B-ATPase+complex+in+liver+causes+MTORC1-independent+accumulation+of+autophagic+vacuoles+and+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes.</a> Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).</li>
<li>kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CORVET+and+HOPS+tethering+complexes+-+coordinators+of+endosome+and+lysosome+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">CORVET and HOPS tethering complexes - coordinators of endosome and lysosome fusion.</a> Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).</li>
<li>Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab7%3A+Roles+in+membrane+trafficking+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Rab7: Roles in membrane trafficking and disease.</a> Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).</li>
<li>Cheng, X. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+LAMP1-labeled+nondegradative+lysosomal+and+endocytic+compartments+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons.</a> Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).</li>
<li>Eskelinen, E. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+LAMP-1+and+LAMP-2+in+lysosome+biogenesis+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy.</a> Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).</li>
<li>Sancak, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ragulator-rag+complex+targets+mTORC1+to+the+lysosomal+surface+and+is+necessary+for+its+activation+by+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids.</a> Cell. 141 (2), 290-303 (2010).</li>
<li>Abu-Remaileh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+metabolomics+reveals+V-ATPase-+and+mTOR-dependent+regulation+of+amino+acid+efflux+from+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes.</a> Science. 358 (6364), 807-813 (2017).</li>
<li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture%2C+SILAC%2C+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li>
<li>Tao, W. A., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+quantitative+proteomics+via+stable+isotope+tagging+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).</li>
<li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+analysis+of+a+genetically+induced+prostate+inflammation+mouse+model+via+custom+4-plex+DiLeu+isobaric+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).</li>
<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+mass+tags%3A+A+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.</a> Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).</li>
<li>Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+molecular+interactions+by+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deciphering molecular interactions by proximity labeling.</a> Nature Methods. 18, 133-143 (2021).</li>
<li>Go, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximity-dependent+biotinylation+map+of+a+human+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A proximity-dependent biotinylation map of a human cell.</a> Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Za pomocą sondy LAMP1-APEX białka na błonie lizosomalnej i w jej pobliżu są biotynylowane i wzbogacane. Biorąc pod uwagę typową średnicę lizosomów 100-1,200 nm, metoda ta zapewnia doskonałą rozdzielczość wewnątrzkomórkową przy promieniu znakowania 10-20 nm. LAMP1 jest obfitym lizosomalnym białkiem błonowym i klasycznym markerem lizosomów, służącym jako doskonałe białko przynęty do lizosomalnego znakowania APEX na endogennym poziomie ekspresji. Jednak istnieją również ograniczenia w przypadku stosowania LAMP1 do celowania...

Lizosomy to organelle kataboliczne, które rozkładają makrocząsteczki poprzez szlak lizosomalno-autofagiczny1. Oprócz degradacji, lizosomy biorą udział w różnych funkcjach komórkowych, takich jak transdukcja sygnałowa, wykrywanie składników odżywczych i wydzielanie2,3,4. Perturbacje w funkcji lizosomalnej są związane z lizosomalnymi zaburzeniami spichrzeniowymi, rakiem, starzeniem się i neurodegeneracją3,5,6,7. W przypadku neuronów postmitotycznych i silnie spolaryzowanych lizosomy odgrywają kluczową rolę w homeostazie komórek neuronalnych, uwalnianiu neuroprzekaźników i transporcie na duże odległości wzdłuż aksonów8,9,10,11. Jednak badanie lizosomów w ludzkich neuronach było trudnym zadaniem. Ostatnie postępy w technologiach neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) umożliwiły hodowlę żywych ludzkich neuronów, które wcześniej były niedostępne, wypełniając lukę między modelami zwierzęcymi a ludzkimi pacjentami w celu zbadania ludzkiego mózgu12,13. W szczególności zaawansowana technologia i3Neuron stabilnie integruje czynnik transkrypcyjny neurogeniny-2 z genomem iPSC pod promotorem indukowanym doksycykliną, powodując różnicowanie się iPSC w czyste neurony korowe w ciągu 2 tygodni14,15.
Ze względu na wysoce dynamiczną aktywność lizosomalną, uchwycenie interakcji lizosomalnych z innymi składnikami komórkowymi jest technicznie trudne, szczególnie w trybie wysokoprzepustowym. Technologia znakowania zbliżeniowego doskonale nadaje się do badania tych dynamicznych oddziaływań ze względu na jej zdolność do wychwytywania zarówno stabilnych, jak i przejściowych/słabych interakcji białkowych o wyjątkowej specyficzności przestrzennej16,17. Zmodyfikowana peroksydaza lub ligaza biotyny może być genetycznie połączona z białkiem przynęty. Po aktywacji wytwarzane są wysoce reaktywne rodniki biotyny, które kowalencyjnie znakują sąsiednie białka, które następnie mogą być wzbogacone o kulki pokryte streptawidyną do dalszej proteomiki bottom-up za pomocą platform chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS)17,18,19,20,21.
Endogenna metoda proteomiki oznaczania bliskości lizosomów została niedawno opracowana w celu uchwycenia dynamicznego mikrośrodowiska lizosomów w i3Neurons22. Zmodyfikowana peroksydaza askorbinianowa (APEX2) została wbita na C-koniec lizosomalnego białka błonowego 1 (LAMP1) w iPSC, które można następnie różnicować w neurony korowe. LAMP1 jest licznie występującym lizosomalnym białkiem błonowym i klasycznym markerem lizosomalnym23. LAMP1 ulega również ekspresji w późnych endosomach, które dojrzewają do lizosomów; Te późne lizosomy endosomów i lizosomy niedegradacyjne są w tym protokole określane jako lizosomy. Ta endogenna sonda LAMP1-APEX, ulegająca ekspresji na poziomie fizjologicznym, może zmniejszyć artefakty błędnej lokalizacji i nadekspresji LAMP1. Setki lizosomalnych białek błonowych i lizosomalnych interaktorów można zidentyfikować i określić ilościowo z doskonałą rozdzielczością przestrzenną w żywych ludzkich neuronach.
Tutaj opisano szczegółowy protokół proteomiki znakowania bliskosomów w ludzkich neuronach pochodzących z iPSC z dalszymi ulepszeniami w stosunku do niedawno opublikowanej metody22. Ogólny przebieg pracy jest zilustrowany na Rysunek 1. Protokół obejmuje hodowlę neuronów pochodzących z hiPSC, aktywację znakowania zbliżeniowego w neuronach, walidację aktywności APEX za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, określenie optymalnego stosunku kulek streptawidyny do białka wejściowego, wzbogacenie białek biotynylowanych, trawienie białek na kulkach, odsalanie i kwantyfikację peptydów, analizę LC-MS oraz analizę danych proteomicznych. Omówiono również wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów i optymalizacje eksperymentalne w celu poprawy jakości i wydajności etykietowania zbliżeniowego.

<table><tbody><tr><td>10% (w/v) roztwór saponiny</td><td>Acros Organics</td><td>419231000</td><td>Mikroskopia fluorescencyjna</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>roztwór do odrywania komórek, Suplement do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>B27</td><td>Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>Cell Culture, Podłoże dla neuronów korowych</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-02</td><td>Hodowla komórkowa, podłoże</td></tr> <tr>dla neuronów korowych<td>Kwas borowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td>Hodowla komórkowa, Bufor boranowy</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Millipore Sigma</td><td>A8806</td><td>Do sporządzania roztworów wzorcowych do pomiaru całkowitych stężeń białek</td></tr><tr><td>Pożywka neuronalna Brainphys</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5790</td><td>Hodowla komórkowa, pożywka dla neuronów korowych</td></tr><tr><td>CD45R (B220) Przeciwciało Alexa Fluor 561</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>505-0452-82</td><td>Mikroskopia fluorescencyjna</td></tr><tr><td>Chroman1 Inhibitor ROCK</td><td>Tocris</td><td>716310</td><td>Cell Culture</td></tr><tr><td>cOmplete mini inhibitor proteazy</td><td>Roche</td><td>4693123001</td><td>inhibitor koktajlu w buforze do lizy</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek DC</td><td>Bio-Rad</td><td>5000112</td><td>Do oznaczania całkowitych stężeń białek w lizacie komórkowym</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Znakowanie zbliżeniowe Reakcja</td></tr><tr><td>DMEM/F12 podłoże Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>11320082</td><td>Hodowla komórkowa, Powlekanie naczyń</td></tr><tr><td>Pożywka DMEM/F12 z HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330057</td><td>Hodowla komórkowa, Pożywka indukcyjna</td></tr><tr><td>Surowica osła</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td>Mikroskopia fluorescencyjna</td></tr><tr><td>Hykulan doksycykliny, &ge; 98% (HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td>Hodowla komórkowa, pożywka indukcyjna</td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>Suplement</td></tr><tr><td>Cell Culture Essential 8 (50x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517101</td><td>Cell Culture</td></tr><tr><td>Zestaw kolektora próżniowego z płytką ekstrakcyjną</td><td>Wody</td><td>WAT097944</td><td>Do odsalania peptydów</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy (FA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11750</td><td>Do analizy LC-MS</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-10</td><td>Hodowla komórkowa, neuron korowy Medium Barwnik</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62239</td><td>Mikroskopia fluorescencyjna</td></tr><tr><td>Metanol klasy HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452</td><td>Do odsalania peptydów</td></tr><tr><td>Woda klasy HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5</td><td>do peptydu odsalanie</td></tr><tr><td>Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste</td><td>Corriell Institute</td><td>GM25256</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru, ACS, 29-32% w/w aq. soln., dźg.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AA33323AD</td><td>Reakcja znakowania zbliżeniowego</td></tr><tr><td>Jodoacetamid (IAA)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>I6125</td><td>do trawienia białek</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Fisher Scientific</td><td>23017015</td><td>Hodowla komórkowa, neuron korowy Medium</td></tr><tr><td>Acetonitryl klasy LC-MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955</td><td>Do analizy LC-MS</td></tr><tr><td>Woda klasy LC-MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>W64</td><td>Do analizy LC-MS</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-030-081</td><td>Hodowla komórkowa, pożywka indukcyjna</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-774-552</td><td>matryca błony podstawnej, Hodowla komórkowa, powlekanie naczyń</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzkie przeciwciało monoklonalne LAMP1</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>h4a3</td><td>Mikroskopia fluorescencyjna</td></tr><tr><td>Suplement N-2 ( 100x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-502-048</td><td>Hodowla komórkowa, pożywka indukcyjna</td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa, wstępnie przycięta, 0,45 i mikro; m, 7 x 8,5 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>1620145</td><td>Do przeprowadzania testu punktowego do miareczkowania kulek</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne (NEAA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-140-050</td><td>Hodowla komórkowa, pożywka indukcyjna</td></tr><tr><td>NT-3</td><td>PeproTech</td><td>450-03</td><td>Hodowla komórkowa, kora mózgowa Neuron Medium</td></tr><tr><td>Oasis HLB 96-dołkowa płytka ekstrakcyjna do fazy stałej</td><td>Wody</td><td>186000309</td><td>Do odsalania peptydów</td></tr><tr><td>Bufor blokujący Odyssey (TBS)</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-50000</td><td>Do przeprowadzania testu punktowego do miareczkowania kulek</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td>Mikroskopia fluorescencyjna</td></tr><tr><td>Fenol Biotyna (1,000x magazyn)</td><td>Adipogen</td><td>41994-02-9</td><td>Znakowanie zbliżeniowe Reakcja</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) bez wapnia i magnezu</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td>Hodowla komórkowa, reakcja znakowania zbliżeniowego, mikroskopia fluorescencyjna</td></tr><tr><td>Pierce Ilościowy kolorymetryczny test peptydowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>23275</td><td>Test stężenia peptydów</td></tr><tr><td>Poli-L-ornityna (PLO)</td> <td>Milipor Sigma</td><td>P3655</td><td>Hodowla komórkowa, powlekanie naczyń</td></tr><tr><td>Askorbinian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>Znakowanie bliskości Bufor hartowniczy, Bufor do lizy</td></tr><tr><td>Sód azydek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td>Bufor do znakowania zbliżeniowego, Bufor do lizy, Mikroskopia fluorescencyjna</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S271500</td><td>Hodowla komórkowa, Bufor boranowy</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td>Bufor do lizy <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1311220</td>, <td>Bufor do oznaczania kropek, Bufor do płukania kulek</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>Hodowla komórkowa, bufor boranowy</td></tr><tr><td>Tetraboran sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221732</td><td>Hodowla komórkowa, bufor boranowy</td></tr><tr><td>Koncentrator</td><td></td><td></td><td>próżniowy</td>SpeedVac</tr><tr><td>Streptawidyna Magnetyczne kulki sefarozy</td><td>Cytiva (formalne GE)</td><td>28-9857-99</td><td>Wzbogacenie biotynylowanych białek</td></tr><tr><td>Streptawidyna, Alexa Fluor 680 Sprzężony</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S32358</td><td>Do przeprowadzenia testu punktowego do miareczkowania kulek</td></tr><tr><td>Mieszalnik termomieszalnik</td><td></td><td></td> z <td>kontrolowaną temperaturą</td></tr><tr><td>Kwas trifluooctowy (TFA)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>302031</td><td>do odsalania peptydów</td></tr><tr><td>Chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>C4706</td><td>do trawienia białek</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152500</td><td>Bufor do lizy, Bufor do oznaczania plam punktowych, Bufor do płukania kulek</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP151500</td><td>Bufor do płukania kulek</td></tr><tr><td>TROLOX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>648471</td><td>Bufor do znakowania bliskościowego, Bufor do lizy</td></tr><tr><td>Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade</td><td>Promega</td><td>V5073</td><td>do trawienia białek</td></tr><tr><td>TWEEN&nbsp; 20</td><td>miliporów Sigma</td><td>P1379</td><td>Bufor do oznaczania plam punktowych</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP169500</td><td>Bufor do mycia i trawienia na kulkach</td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7180</td><td>Hodowla komórkowa, powlekanie naczyń</td></tr><tr><td>Y-27632 Inhibitor ROCK</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr></tbody></table>

charakterystyka interaktomu lizosomu neuronalnego z proteomiką znakowania zbliżeniowego

Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics

Lizosomy często komunikują się z różnymi biomolekułami, aby osiągnąć degradację i inne różnorodne funkcje komórkowe. Lizosomy mają kluczowe znaczenie dla funkcjonowania ludzkiego mózgu, ponieważ neurony są postmitotyczne i w dużym stopniu polegają na szlaku autofagia-lizosom w celu utrzymania homeostazy komórkowej. Pomimo postępów w zrozumieniu różnych funkcji lizosomalnych, uchwycenie wysoce dynamicznej komunikacji między lizosomami a innymi składnikami komórkowymi jest technicznie trudne, szczególnie w przypadku wysokiej przepustowości. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół dla niedawno opublikowanej endogennej (knock-in) metody proteomicznego znakowania zbliżeniowego lizosomów w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). 
Zarówno lizosomalne białka błonowe, jak i białka otaczające lizosomy w promieniu 10-20 nm mogą być z pewnością zidentyfikowane i dokładnie określone ilościowo w żywych ludzkich neuronach. Każdy etap protokołu jest szczegółowo opisany, tj. hodowla neuronów hiPSC, znakowanie zbliżeniowe, zbieranie neuronów, mikroskopia fluorescencyjna, wzbogacanie białek biotynylowanych, trawienie białek, analiza LC-MS i analiza danych. Podsumowując, ta unikalna endogenna metoda proteomiki znakowania lizosomalnego zapewnia wysokowydajne i solidne narzędzie analityczne do badania wysoce dynamicznej aktywności lizosomalnej w żywych ludzkich neuronach.

Niniejsze badanie proteomiczne z wykorzystaniem znakowania bliskościowego lizosomów przeprowadzono na neuronach pochodzących z ludzkich iPSC, aby uchwycić dynamiczne mikrośrodowisko lizosomalne in situ w żywych neuronach. Morfologia komórek hiPSC oraz neuronów pochodzących z hiPSC w różnych punktach czasowych przedstawiona jest na Rysunku 2A. Ludzkie iPSC rosną w koloniach w pożywce E8. Dyferencjację inicjuje wysianie iPSC do pożywki indukującej neurony zawierającej doksycyklinę. Wy...

Protokół proteomiki znakowania bliskości lizosomów neuronalnych jest tutaj opisany w celu scharakteryzowania dynamicznego mikrośrodowiska lizosomów w ludzkich neuronach pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Lizosomalne białka błonowe i białka, które oddziałują z lizosomami (stabilnie lub przejściowo), można dokładnie określić ilościowo w tej metodzie z doskonałą wewnątrzkomórkową rozdzielczością przestrzenną w żywych ludzkich neuronach.

Charakterystyka interaktomu lizosomu neuronalnego z proteomiką znakowania zbliżeniowego

Lysosomes frequently communicate with a variety of biomolecules to achieve the degradation and other diverse cellular functions. Lysosomes are critical to ...

Lizosomy to systemy usuwania śmieci w komórce. Aktywność lizosomów jest bardzo dynamiczna i bardzo trudna do uchwycenia. W tym badaniu opracowaliśmy podejście proteomiczne do znakowania zbliżeniowego, aby rozszyfrować mikrośrodowisko lizosomalne w żywych ludzkich neuronach.Podejście to obejmuje białka błony lizosomów oraz stabilne i przejściowe interakcje z neuronami pochodzącymi z lizosomów i iPSC. Dysfunkcja lizosomów jest silnie związana z różnymi chorobami mózgu. Technika ta może być zastosowana do zrozumienia różnych chorób mózgu i zapewnienia potencjalnych celów molekularnych do projektowania nowych terapii.Aby rozpocząć procedurę znakowania zbliżeniowego, obserwuj neurony pod mikroskopem, aby upewnić się, że są żywe i zdrowe. Weź połowę objętości pożywki z hodowli, aby wymieszać ją z biotyną fenolem i dodaj ją z powrotem do neuronów w końcowym stężeniu 500 mikromolów przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozpocząć reakcję znakowania, dodając świeżo przygotowany roztwór nadtlenku wodoru do kultury neuronów o końcowym stężeniu jednomilimolowym.Po jednominutowej inkubacji odessać pożywkę i trzykrotnie przepłukać kulturę buforem hartującym. Przechylić płytkę, aby zassać cały pozostały bufor. Po dodaniu lodowatego buforu do lizy zeskrob lizaty komórkowe do zimnych 1,5-mililitrowych probówek.Sonikuj rurki w lodowatej kąpieli wodnej o mocy ponad 100 watów przez 15 minut z naprzemiennymi cyklami 40 sekund włączenia i 20 sekund wyłączenia. Po lizie komórek dodaj zimny aceton w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do próbki o czterokrotnej objętości roztworu lizatu komórkowego. Krótko wirować i inkubować w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez trzy godziny, aby wytrącić białka i usunąć pozostałości biotyny fenolu.Odwirować probówkę lizatu komórkowego o temperaturze 16 500 razy G przez 10 minut w temperaturze dwóch stopni Celsjusza i ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania osadu białkowego. Następnie przemyć granulkę dwukrotnie jednym mililitrem acetonu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, a następnie odwirować i usunąć supernatant. Następnie suszyć granulki białkowe za pomocą koncentratora próżniowego przez jedną minutę.Dodaj bufor do lizy komórek, aby całkowicie rozpuścić osad za pomocą wiru lub sonikacji. Weź 20 mikrolitrów podwielokrotności, aby określić całkowite stężenie białka za pomocą testu DCA. Przechowuj pozostały roztwór komórkowy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Pobrać próbkę lizatu białkowego z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i poddać sonikę probówce z próbką przez 30 sekund w celu szybkiego rozmrożenia. Wirować, krótko odwirować za pomocą mini wirówki stołowej i umieścić probówkę z próbką na lodzie. Następnie przenieś 250 mikrolitrów zawiesiny kulek magnetycznych streptawidyny do każdej 1,5-mililitrowej probówki.Umieść te probówki na stojaku magnetycznym na jedną minutę, umyj koraliki trzykrotnie jednym mililitrem 2% roztworu dodecylosiarczanu sodu i usuń pozostały bufor. Na podstawie całkowitego stężenia białka w lizatach komórkowych i wyników testu miareczkowania kulek dodaj obliczoną ilość próbki białka potrzebną do uzyskania 250 mikrolitrów zawiesiny kulek magnetycznych streptawidyny. Następnie dodaj bufor do lizy komórek do mieszaniny kulek magnetycznych i lizatu do całkowitej objętości jednego mikrolitra i obracaj probówkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia należy krótko odwirować probówkę z próbką na mikrowirówce stołowej i umieścić probówkę na stojaku magnetycznym na jedną minutę w celu usunięcia supernatantu. Następnie umyj kulki dwukrotnie za pomocą jednego mililitra buforu myjącego A z pięciominutowym obrotem w temperaturze pokojowej. Powtórzyć proces z każdym buforem do płukania dwa razy, sekwencyjnie, z buforem B, buforem C i buforem D w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na jedną minutę i usuń supernatant. Następnie ponownie zawieś kulki w 100 mikrolitrach pięciomilimolowego TCEP w 50-milimolowym buforze Tris do inkubacji przez 30 minut na termomikserze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie 15-milimolowego dodatku IAA przez 30 minut w ciemności i pięciomilimolowego TCEP przez pięć minut w celu stłumienia pozostałości IAA. Krótko odwirować probówkę z próbką na mikrowirówce i umieścić probówkę na stojaku magnetycznym na jedną minutę w celu usunięcia supernatantu.Dodaj 200 mikrolitrów pięciomilimolowego TCEP do 50-milimolowego buforu Tris, aby ponownie zawiesić kulki. Dodaj jeden mikrogram mieszanki trypsyny/Lys-C przez 14 godzin przy 1, 200 obr./min i 37 stopniach Celsjusza. Po 14 godzinach dodaj dodatkowe 0,2 mikrograma mieszanki trypsyny/Lys-C na trzy godziny, odwiruj probówki z próbkami i umieść je na stojaku magnetycznym na jedną minutę.Następnie przenieś supernatant peptydowy do czystych probówek. Następnie przemyj kulki 50 mikrolitrami 50-milimolowego buforu Tris z wytrząsaniem przez pięć minut, połącz supernatanty peptydowe i dodaj 30 mikrolitrów 10% kwasu trifluorooctowego do probówki, aby obniżyć pH do mniej niż trzech. Po odsalaniu i suszeniu peptydów.zawiesić próbki peptydów w buforze LC do analizy LC-MS. Przenieść supernatant do fiolki z próbką LC w celu analizy za pomocą nano LC-MS. W pliku metody LC-MS dodaj niestandardową listę wykluczeń LC-MS z określonymi masami i zakresami czasu retencji dla bardzo obfitych pików peptydów zanieczyszczeń, takich jak streptawidyna, trypsyna i Lys-C.Analizuj surowe dane LC-MC za pomocą oprogramowania do analizy danych proteomicznych. Dołącz dwie biblioteki FASTA: bazę danych referencyjnych Swiss-Prot Homo sapiens oraz nowo utworzoną uniwersalną bibliotekę FASTA dotyczącą zanieczyszczeń z prefiksem zanieczyszczeń w UniProt ID.Skonfiguruj parametry analizy danych z 1% współczynnikiem fałszywych odkryć dla identyfikacji dopasowania widmowego białek i peptydów. Wybierz trawienie trypsyny z trzema pominiętymi rozszczepieniami, ustaloną modyfikacją metylacji cystyny karbamidylu, zmienną modyfikacją utleniania metioniny i acetylacją końcową białka.W celu kwantyfikacji bez znaczników należy znormalizować intensywność pików peptydu MS-I do endogennie biotynylowanej karboksylazy PCCA i zmniejszyć różnice w eksperymentach znakowania zbliżeniowego. Eksportuj wyniki poziomu białka z oprogramowania proteomicznego jako plik Excel. Przed analizą statystyczną należy usunąć białka zanieczyszczające i białka za pomocą tylko jednego wyniku PSM lub bez wyniku kwantyfikacji.Morfologie komórek w różnych punktach czasowych neuronów iPSC zilustrowały wzrost neurytów w trzydniowym okresie różnicowania. Po przejściu na płytki pokryte poli-L-ornityną w pożywce neuronowej, neuryty utworzyły sieć między neuronami, a przedłużenia aksonów stały się bardziej widoczne po dojrzewaniu w ciągu dwóch tygodni. W obrazowaniu fluorescencyjnym szczytowa aktywność LAMP1 biotynylowanych białek była barwiona streptawidyną i współlokalizowana z barwieniem LAMP1 w neuronach.Wyniki testu miareczkowania kulek wykazały spadek niewychwyconych sygnałów białkowych biotynylowanych przy zwiększaniu ilości kulek streptawidyny. Pięć mikrolitrów kulek streptawidyny było optymalnych dla 50 mikrogramów białek wejściowych z endogennych próbek wierzchołkowych LAMP1. Trawienie na kulkach z mieszanką trypsyny / Lys-C spowodowało większą identyfikację białka i peptydów oraz mniej pominiętych rozszczepień w porównaniu z samą trypsyną.Ponadto stwierdzono, że od 1 do 1,5 mikrograma trypsyny/Lys-C jest optymalne do trawienia na kulkach w celu uzyskania największej liczby zidentyfikowanych białek i najniższego odsetka pominiętych rozszczepień. Znane lizosomalne białka błonowe były zwiększone w wierzchołku LAMP1 w porównaniu z brakiem kontroli wierzchołka. Endogennie biotynylowane białka występują w dużych ilościach, ale pozostają niezmienione.Termin GO i analiza sieci białek sugerują, że stabilne lizosomalne białka błonowe i przejściowe interakcje lizosomalne związane z transportem i transportem endolizosomalnym zostały wzbogacone w proteomikę wierzchołkową LAMP1. Etykietowanie zbliżeniowe wierzchołka musi być wygaszone dokładnie po jednej minucie, aby zmniejszyć stres oksydacyjny i różnice eksperymentalne. Niedawno opracowaliśmy metodę rozszczepialnej biotyny, która pozwala nam wzbogacić biotynylowane białka.Ta metoda, w połączeniu z naszą obecną metodą, pozwoli nam zmniejszyć zakłócenia ze strony streptawidyny i endogennie biotynylowanych białek. Możemy zastosować tę metodę zarówno do neuronów typu dzikiego, jak i zmutowanych z wariantami genetycznymi, które powodują choroby mózgu. Może to pomóc nam zrozumieć, w jaki sposób i dlaczego mutacje genetyczne wpływają na mikrośrodowisko lizosomalne w ludzkich neuronach.

characterization-neuronal-lysosome-interactome-with-proximity

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film opisuje test ligacji zbliżeniowej do badania in situ interakcji białko-białko w komórkach nicieni. Bliskie sąsiedztwo badanych białek generuje kolistą matrycę DNA za pomocą sondy PLA dołączonej do przeciwciała wtórnego. Sonda jest dalej amplifikowana za pomocą roztworu do amplifikacji, który wytwarza długie, jednoniciowe DNA, a następnie hybrydyzuje sondę detektora, umożliwiając lokalizację interakcji białko-białko w komórkach.

Test ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ

Tutaj opisujemy procedurę wizualizacji i ilościowego określania z dużą czułością endogennych interakcji między retikulum endoplazmatycznym a mitochondriami w komórkach stałych. Protokół zawiera zoptymalizowany test ligacji zbliżeniowej in situ ukierunkowany na receptor 1,4,5-trifosforanu inozytolu / białko regulowane glukozą 75 / zależny od napięcia kanał anionowy / kompleks cyklofiliny D na granicy faz błony związanej z mitochondriami.

Badanie interakcji retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ w komórkach utrwalonych

Interakcje białko-białko mogą zachodzić zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie komórki. Aby zbadać te interakcje, stosuje się tradycyjną koimmunoprecypitację i nowoczesny test ligacji zbliżeniowej. W tym badaniu porównujemy te dwie metody wizualizacji rozkładu oddziaływań NF90-RBM3 w jądrze i cytoplazmie.

Wizualizacja interakcji białko-białko we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej in situ

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Opisana tutaj jest metoda etykietowania zbliżeniowego do identyfikacji partnerów interakcji domeny TIR receptora immunologicznego NLR w tkance liścia Nicotiana benthamiana. Podano również szczegółowy protokół identyfikacji interakcji między innymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania przy użyciu tej techniki u Nicotiana i innych gatunków roślin.

Znakowanie zbliżeniowe oparte na TurboID do identyfikacji sieci interakcji białko-białko in planta

Tutaj prezentujemy protokół do profilowania interakcji między gospodarzem a patogenem podczas infekcji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas. Protokół ten wykorzystuje kwantyfikację bez znaczników do pomiaru zmian w obfitości białek zarówno gospodarza (np. Makrofagi), jak i patogenu (np. Cryptococcus neoformans) w jednym eksperymencie.

Bezznacznikowy przepływ pracy proteomiki ilościowej dla interakcji gospodarz-patogen opartych na odkryciach

Prezentujemy narzędzie do biologii systemów JUMPn do przeprowadzania i wizualizacji analizy sieci dla ilościowych danych proteomicznych, ze szczegółowym protokołem obejmującym wstępne przetwarzanie danych, grupowanie koekspresji, wzbogacanie szlaków i analizę sieci interakcji białko-białko.

JUMPn: Usprawniona aplikacja do grupowania koekspresji białek i analizy sieci w proteomice

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół do przeprowadzenia eksperymentu z etykietowaniem zbliżeniowym (PL) na ogórku (Cucumis sativus L.) przy użyciu białka AT4G18020 (APRR2)-AirID jako modelu. Metoda opisuje budowę wektora, transformację konstruktu poprzez agroinfiltrację, infiltrację biotyny, ekstrakcję białek i oczyszczanie białek znakowanych biotyną za pomocą techniki oczyszczania powinowactwa.

Etykietowanie zbliżeniowe oparte na AirID dla interakcji białko-białko w roślinach

Potrzeba nowych podejść do badania miejsc kontaktu z błoną (MCS) wzrosła ze względu na rosnące zainteresowanie badaniem tych struktur komórkowych i ich składników. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który integruje wcześniej dostępne technologie mikroskopowe w celu identyfikacji i ilościowego określenia kompleksów białkowych wewnątrz organelli i między organellami, które znajdują się w MCS.

Wizualizacja i kwantyfikacja endogennych interakcji białek wewnątrz organelli w miejscach kontaktu ER-mitochondria za pomocą testów ligacji zbliżeniowej

W tym badaniu ustalamy szczegółowy protokół znakowania zbliżeniowego (PL) opartego na TurboID w jajniku D. melanogaster, obejmujący etapy od suplementacji biotyną i rozwarstwienia jajników do walidacji ekspresji transgenu i wzbogacenia biotynylowanych peptydów do spektrometrii mas.

In vivo (in vivo) Zastosowanie znakowania zbliżeniowego opartego na TurboID u Drosophila melanogaster

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Poznaj metodę proteomiki znakowania zbliżeniowego do badania mikrośrodowiska lizosomalnego w żywych ludzkich neuronach pochodzących z komórek iPSC. Ta technika umożliwia identyfikację białek błonowych lizosomów i ich interakcji, co jest kluczowe dla zrozumienia dysfunkcji lizosomalnych w chorobach mózgu.

Charakterystyka interaktomu lizosomu neuronalnego z proteomiką znakowania zbliżeniowego

Przeglądaj więcej filmów