Wielolocusowa analiza tandemowo-powtórzeniowa bakterii Yersinia ruckeri patogennej dla ryb metodą Multiplex PCR i elektroforezy kapilarnej

Ten protokół genotypowania MLB znacznie poszerzył naszą wiedzę na temat epidemiologii i globalnej struktury populacji Yersinia ruckeri, bakterii chorobotwórczej dla ryb o znaczeniu międzynarodowym. W porównaniu z wcześniej ustalonymi schematami pisania Yersinia ruckeri, oferuje bardzo wysoką rozdzielczość szczepu. Procedura jest prosta, tania i zapewnia przenośne wyniki, które można łatwo porównać w różnych laboratoriach.

Technika ta znacznie poprawia swoistość diagnostyczną i umożliwia śledzenie zakażeń. Na przykład, obecnie często możemy odróżnić zjadliwe klony Yersinia ruckeri istniejące na tle niezjadliwych szczepów środowiskowych. Procedurę zademonstruje Saima Nasrin Mohammad, technik w naszym laboratorium.

Na początek użyj sterylnych pętli zaszczepiających, aby wysiać czyste kultury Yersinia ruckeri na dowolnym odpowiednim rodzaju agaru na szalkach Petriego. Inkubować w temperaturze 22 stopni Celsjusza przez jeden do dwóch dni lub 15 stopni Celsjusza przez trzy do czterech dni. Następnie, za pomocą pętli zaszczepiających, wybierz pojedynczą reprezentatywną kolonię z każdej szalki Petriego i przenieś do 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych, zawierających 50 mikrolitrów ultra oczyszczonej wody do ponownego zawieszenia.

Krótko wirować i inkubować przez siedem minut na bloku grzewczym w temperaturze 100 stopni Celsjusza. Następnie odwirować przy 16 000 g przez trzy minuty i za pomocą pipety ostrożnie przenieść matrycę DNA supernatantu do pustych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych. Przejdź do następnego kroku lub przechowuj DNA w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Aby przygotować mieszanki wzorcowe, najpierw oblicz objętości odczynników zgodnie z liczbą próbek bakterii do analizy, uwzględniając również jedną kontrolę ujemną i jedną pozytywną oraz końcową 10% nadwyżkę objętości, jak szczegółowo opisano w manuskrypcie. Należy pamiętać, że stosowane są różne stężenia podkładu. W dwóch oddzielnych probówkach wirówkowych, po jednej na test PCR, dodaj multiplex PCR plus mieszankę główną, startery i wodę wolną od RNaz.

Delikatnie zmieszać przygotowane mieszanki wzorcowe przy niskiej prędkości, a następnie rozprowadzić 22 mikrolitry każdej mieszanki głównej osobno do indywidualnych dołków na paskach lub płytkach PCR. Następnie dodać trzy mikrolitry przygotowanej matrycy DNA do każdej studzienki zawierającej mieszankę główną; dwie studzienki na próbkę bakterii, po jednej na każdy test. Użyj DNA ze zweryfikowanego szczepu Yersinia ruckeri do kontroli pozytywnej i ultra oczyszczonej wody do kontroli negatywnej.

Uszczelnić i krótko odwirować. Załaduj przygotowane reakcje do termocyklera PCR i skonfiguruj program zgodnie z manuskryptem. Program zakończy się w mniej niż trzy godziny.

Zgodnie z zaleceniami producenta, dodaj proszek żelu agarozowego do jednorazowego bufora TBE, aby osiągnąć 1,5 procenta wagowo-objętościowego i podgrzej, aby się rozpuścił. Przed odlewaniem rozpuszczony roztwór żelu krótko schłodzić pod bieżącą wodą, dodać 5 mikrolitrów fluorescencyjnego barwnika kwasu nukleinowego na 50 mikrolitrów roztworu żelu i wymieszać. Zamontuj i wypoziomuj tacę odlewniczą.

Dodać stożki odpowiednio do liczby próbek. Wlej roztwór żelu do odlewu i poczekaj, aż stwardnieje. Następnie zanurzyć odlew zawierający żel w jednorazowym buforze TBE w żelowym systemie elektroforezy.

Wymieszaj pięć mikrolitrów produktów PCR z dwoma mikrolitrami barwnika ładującego w nowych paskach PCR. Przenieś pięć mikrolitrów mieszanin do studzienek w żelu. Zachowaj co najmniej jedną studnię pustą.

Dodaj pięć mikrolitrów drabiny DNA do pustej studzienki w celach informacyjnych. Podłącz elektrody i uruchom żel pod napięciem 110 woltów na 15 centymetrów przez około godzinę. Użyj systemu obrazowania żelu opartego na promieniowaniu UV, aby zweryfikować obecność wielu prążków reprezentujących amplikony ChRL.

Po potwierdzeniu amplikonów PCR użyj nowych pasków lub płytek PCR do rozcieńczenia produktów PCR od 1 do 10 w oczyszczonej wodzie. Wirować i krótko odwirować. Podczas pracy w dygestorium należy przygotować mieszankę wzorcową w probówce wirówkowej składającej się z formamidu i roztworu wzorcowego o rozmiarze referencyjnym.

W zależności od liczby produktów PCR, które mają być analizowane, należy użyć objętości odczynników, jak opisano w manuskrypcie. Pozwól na 10% nadwyżki objętości. Krótko odwirować i rozprowadzić 9,5 mikrolitra do poszczególnych studzienek na płytce PCR odpowiedniej dla dostępnego systemu elektroforezy kapilarnej.

Następnie dodać 0,5 mikrolitra rozcieńczonego produktu PCR. Uszczelnić i krótko odwirować. Następnie załaduj płytkę zawierającą próbki do termocyklera PCR i denaturuj próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez trzy minuty, a następnie schładzaj do czterech stopni Celsjusza w nieskończoność.

Wirować przy 1000 g przez jedną minutę, ostrożnie zdjąć uszczelkę i załadować płytkę do skalibrowanego systemu elektroforezy kapilarnej zgodnie z instrukcjami producenta. Przeprowadź analizę fragmentów elektroforezy kapilarnej, używając odczynników odpowiednich dla wybranej aparatury i dostosuj warunki pracy zgodnie z opisem w manuskrypcie. W przypadku wywołania wielkości elektroforezy kapilarnej Yersinia ruckeri VNTR, najpierw zaimportuj pliki wyników elektroforezy kapilarnej do oprogramowania Gene Mapper 5.

Ustaw metodę analizy na Domyślna mikrosatelita, wybierz odpowiedni wybór produktu w obszarze Norma rozmiaru, a następnie naciśnij przycisk Analizuj. Za pomocą edytora dopasowania rozmiaru sprawdź poprawność identyfikacji fragmentów o standardowym rozmiarze i popraw wszelkie widocznie błędne alokacje. Następnie wybierz próbkę do odczytania, naciśnij przycisk Wyświetl wykres i naciśnij Control A, aby włączyć widok tabeli rozmiarów.

Będąc w górnym panelu, przytrzymaj Control, klikając jednocześnie pięć szczytów reprezentujących wzmacniacze VNTR. Naciśnij Control G, aby przefiltrować tabelę rozmiarów, pokazującą tylko charakterystykę pięciu podświetlonych pików, i zarejestrować wywołania rozmiaru dla każdego locus VNTR dla dalszej aplikacji. Aby uwzględnić tendencyjne wzorce ruchliwości amplikonów podczas elektroforezy kapilarnej, należy obliczyć dokładną liczbę powtórzeń VNTR, wykorzystując uzyskane wywołania wielkości w połączeniu ze zmiennymi specyficznymi dla locus.

Formułę można zaimplementować w szablonie arkusza kalkulacyjnego w celu automatyzacji. W arkuszu kalkulacyjnym okrągłe obliczenia powtórzeń VNRT są odliczane do najbliższej liczby całkowitej przed dalszą analizą. W oprogramowaniu BioNumerics utwórz nową bazę danych i zdecyduj się na aktywację wtyczki MLVA.

W panelu typu eksperymentu naciśnij Utwórz nowy typ eksperymentu, wybierz Typ znaku i użyj ustawień domyślnych, gdy zostaniesz o to poproszony. Następnie wybierz nowy eksperyment i dodaj nowe znaki dla każdego z 10 loci VNTR, przyjmując od zera do 100 jako zakres wartości. Wróć do panelu głównego, zaimportuj Yersinia ruckeri VNTR powtórzenia i dane metody, wybierając opcję importuj pola i znaki.

Znajdź plik, w którym jest to przechowywane, i dokonaj wyboru w kolumnie Typ miejsca docelowego. W przypadku VNTR oznacza to wybranie odpowiedniej wartości znaku, podczas gdy różne metadane są klasyfikowane jako pola informacji wejściowych. Dokonane wybory mogą być przechowywane jako szablon, aby ułatwić proces na później.

Wybierz zaimportowane próbki przeznaczone do analizy skupień MST, a następnie kliknij przycisk Utwórz nowe porównanie w panelu Porównania. Jeśli jest to pożądane w celu wizualnej prezentacji MST, przydziel próbki do kolorowych grup, na przykład zgodnie z określoną funkcją metadanych. Następnie wybierz pozycję Zaawansowana analiza skupień i MST dla danych podzielonych na kategorie, aby wygenerować diagram MST na podstawie wybranych próbek.

Dalej modyfikuj wizualną prezentację MST, dodając parametry partycji, długości krzyżyków, etykietowanie rozgałęzień węzłów itp. W razie potrzeby wyeksportuj sfinalizowany plik MST w żądanym formacie, korzystając z opcji Eksportuj obraz. Po multipleksowym PCR obraz elektroforezy żelowej weryfikuje obecność wielu amplikonów we wszystkich 12 pasach zawierających próbki, przy czym pierwsza linia reprezentuje użytą drabinkę DNA.

Na elektroferogramach powstałych w wyniku elektroforezy kapilarnej różne loci VNTR można zidentyfikować na podstawie kombinacji rozmiaru i oznakowania barwnika. Pomarańczowe szczyty reprezentują zastosowany standard wielkości. Pokazano przykładowe drzewo rozpinające minimalną rozpiętość, oparte na profilach MLVA z izolatów Yersinia Ruckeri odzyskanych z łososia atlantyckiego w pięciu różnych norweskich hodowlach.

Można zaobserwować wyraźną tendencję do grupowania związaną z pochodzeniem z gospodarstwa. Identyfikacja za pomocą MLVA różnych klonów Yersinia ruckeri dominujących na przykład w określonych regionach geograficznych gatunków ryb została już wykorzystana do ulepszenia strategii szczepień przeciwko temu patogenowi.