Wykrywanie patogenów ryb za pomocą analizy powtarzania tandemowego o zmiennej liczbie (VNTR)

Zacznij od płytki PCR zawierającej roztwór denaturujący na bazie formamidu.

Do każdego dołku dodaj rozcieńczone amplikony PCR pochodzące z bakterii patogennej ryb.

Te amplicony zawierają fluorescencyjnie oznakowane powtarzania tandemowe o zmiennej liczbie (VNTR), krótkie powtarzalne sekwencje wykorzystywane jako markery genetyczne do identyfikacji bakterii.

Uszczelnij płytę i wirówkę, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza.

Podgrzej płytę w cyklerze termicznym, aby odnaturować podwójnie niowe VNTR.

Formamid zwiększa rozdzielanie nici i hamuje ponowne wyżarzanie.

Szybko schładzaj płytę, aby ustabilizować jednoniciowe DNA.

Wirówka do pobrania objętości próbki.

Usuń uszczelkę i zabezpiecz płytkę ramą.

Umieść rurkę kapilarną i wykonaj elektroforezę kapilarną.

Podczas elektroforezy fragmenty VNTR migrują przez kapilarę pod wpływem pola elektrycznego i rozdzielają się pod względem wielkości.

Laser pobudza fluorescencyjne znaczniki na każdym fragmencie, generując sygnały oznaczone kolorami.

Uzyskany elektroferogram pokazuje wzory szczytowe VNTR odpowiadające patogennej bakterii.

Po potwierdzeniu amplikonów PCR użyj nowych pasków lub płytek PCR do rozcieńczenia produktów PCR w stężeniu 1 do 10 w oczyszczonej wodzie. Krótko wiruj i wiruj. Podczas pracy w szafie z dymami przygotuj mieszankę główną w rurce wirówki składającą się z formamidu i standardowego roztworu o rozmiarze referencyjnym.

Według liczby produktów PCR do analizy należy stosować objętości odczynników opisane w manuskrypcie. Pozwól na 10% nadwyżki objętości. Krótko zawiruj i rozprowadz 9,5 mikrolitra do pojedynczych dołków na płycie PCR odpowiedniej dla dostępnego systemu elektroforezy kapilarnej.

Następnie dodaj 0,5 mikrolitra rozcieńczonego produktu PCR. Zamknąć i krótko wirować. Następnie załaduj płytę z próbkami do termocyklera PCR i denaturuj próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez trzy minuty, po czym schłodzę do 4 stopni Celsjusza na czas nieokreślony.

Wiruj w 1000 g przez minutę, ostrożnie usuń uszczelkę i załaduj płytkę na skalibrowany system kapilarnej elektroforezy zgodnie z instrukcjami producenta. Przeprowadzić analizę fragmentów kapilarną elektroforezą, używając odczynników odpowiednich dla wybranego aparatu, i dostosować warunki działania zgodnie z opisem w rękopisie.