Wykrywanie patogenów ryb za pomocą analizy powtarzania tandemowego o zmiennej liczbie (VNTR)

Zacznij od płytki PCR zawierającej roztwór denaturujący na bazie formamidu.

Do każdego dołku dodaj rozcieńczone amplikony PCR pochodzące z bakterii patogennej ryb.

Te amplicony zawierają fluorescencyjnie oznakowane powtarzania tandemowe o zmiennej liczbie (VNTR), krótkie powtarzalne sekwencje wykorzystywane jako markery genetyczne do identyfikacji bakterii.

Uszczelnij płytę i wirówkę, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza.

Podgrzej płytę w cyklerze termicznym, aby odnaturować podwójnie niowe VNTR.

Formamid zwiększa rozdzielanie nici i hamuje ponowne wyżarzanie.

Szybko schładzaj płytę, aby ustabilizować jednoniciowe DNA.

Wirówka do pobrania objętości próbki.

Usuń uszczelkę i zabezpiecz płytkę ramą.

Umieść rurkę kapilarną i wykonaj elektroforezę kapilarną.

Podczas elektroforezy fragmenty VNTR migrują przez kapilarę pod wpływem pola elektrycznego i rozdzielają się pod względem wielkości.

Laser pobudza fluorescencyjne znaczniki na każdym fragmencie, generując sygnały oznaczone kolorami.

Uzyskany elektroferogram pokazuje wzory szczytowe VNTR odpowiadające patogennej bakterii.

Po potwierdzeniu amplikonów PCR użyj nowych pasków lub płytek PCR do rozcieńczenia produktów PCR w stężeniu 1 do 10 w oczyszc