Ocena liczebności synaps za pomocą elektrofizjologii patch-clamp całkowych

W mózgu para neuronów często tworzy wiele kontaktów synaptycznych, co nazywa się wielością synaptyczną. Jednak precyzyjne badanie wielości synaps wymaga trudnych technicznie eksperymentów. Protokół ten opisuje prostą metodę ogólnego szacowania liczebności synaps przy użyciu elektrofizjologii klamrów krosowych całych komórek.

Metodę tę można zastosować do dowolnego gatunku i obszaru mózgu w celu zbadania wielości synaptycznej. Metoda ta wymaga podstawowych umiejętności w zakresie elektrofizjologii klamrów krosowych całych komórek. Uzyskanie wysokiej jakości nagrań o niskiej i stabilnej rezystancji dostępu ma kluczowe znaczenie dla dokładnej interpretacji danych.

Aby uzyskać konfigurację całej komórki, umieść pipetę rejestrującą tuż nad wycinkiem i zrównoważ prąd pipety w trybie cęgowania napięcia. Zastosuj lekkie nadciśnienie w pipecie i zablokuj kurek. Następnie wybierz zdrową komórkę z nienaruszoną błoną i zbliż się do tkanki za pomocą pipety.

Nadciśnienie powinno powodować lekkie zaburzenie w tkance. Powoli zbliżaj pipetę do celi ruchem ukośnym, aż na powierzchni komórki utworzy się mały wgłębienie. Następnie zwolnij blokadę nadciśnienia.

Ogniwo zacznie tworzyć uszczelnienie, a rezystancja wzrośnie powyżej jednego gigaoma. W zacisku napięciowym utrzymuj ogniwo na poziomie minus 68 miliwoltów. Następnie delikatnie odciągnij pipetę od kuwety po przekątnej, aby usunąć nadmierne ciśnienie.

Kompensacja pojemności pipet szybkich i wolnych. Zastosuj krótkie ssanie przez rurkę podłączoną do uchwytu pipety, aby przebić się przez kuwetę i uzyskać konfigurację całej komórki. Następnie przełącz się na tryb komórkowy w oknie testu membranowego w oprogramowaniu do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych.

Utrzymuj temperaturę kąpieli rejestrującej na poziomie od 27 do 30 stopni Celsjusza, a natężenie przepływu od 1,5 do dwóch mililitrów na minutę do kolejnych eksperymentów. W synapsie wielorakiej potencjał czynnościowy synchronizuje uwalnianie neuroprzekaźników i generuje większy prąd postsynaptyczny. Blokowanie potencjału czynnościowego i zależnego od wapnia uwalniania pęcherzykowego za pomocą TTX i kadmu zapobiega sumowaniu prądów postsynaptycznych i zmniejsza amplitudę.

Gdy nie ma wielokrotności, blokujący potencjał czynnościowy nie zmieni amplitudy. W eksperymencie pierwszym, aby oszacować liczebność, utrzymuj komórkę na minus 68 miliwoltów, jednocześnie perfundując ją aCSF o niskiej zawartości wapnia. Rejestruj spontaniczne EPSC przez co najmniej pięć minut, aby zapewnić stabilny poziom podstawowy.

Następnie dodaj 30 mikromolowców 4-AP do aCSF, aby zwiększyć zdarzenia zależne od potencjału czynnościowego i rejestruj spontaniczne EPSC przez co najmniej 10 minut, aby uzyskać pełny efekt leku. Następnie dodać 0,5 mikromola TTX i 10 mikromoli kadmu do aCSF za pomocą 4-AP i rejestrować miniaturowe EPSC przez co najmniej 10 minut. W przypadku analizy w trybie offline należy użyć ostatniej jednej minuty linii bazowej bezpośrednio przed zastosowaniem 4-AP, 10. minuty aplikacji 4-AP i 10. minuty aplikacji TTX.

W tym eksperymencie zewnątrzkomórkowy wapń jest zastępowany strontem w celu desynchronizacji uwalniania pęcherzyków synaptycznych. Dlatego, jeśli występuje mnogość, powinno to zmniejszyć amplitudę prądów postsynaptycznych. W drugim eksperymencie rejestruj spontaniczne EPSC przez co najmniej pięć minut, jednocześnie perfundując komórkę normalnym wapniem aCSF.

Aby zdesynchronizować uwalnianie pęcherzyków, rozpocznij perfuzję komórki za pomocą strontu aCSF i zarejestruj spontaniczne EPSC. W przypadku analizy offline, aby określić, czy spontaniczne EPSC o dużej amplitudzie są spowodowane synchronicznym uwalnianiem pęcherzyków, należy porównać ostatnią minutę linii podstawowej z 10. minutą aplikacji strontu aCSF. Mnogość może wiązać się z uwalnianiem wielopęcherzykowym, co powoduje wyższe stężenie neuroprzekaźników w szczelinie synaptycznej.

Dodanie gamma-DGG, antagonisty receptora AMPA o niskim powinowactwie, prowadzi do mniej skutecznego hamowania większych prądów postsynaptycznych w porównaniu z mniejszymi jednokwantowymi. Bez uwalniania wielopęcherzykowego gamma-DGG będzie równie skuteczny w przypadku większych, jak i mniejszych prądów postsynaptycznych. W eksperymencie trzecim, w celu zbadania uwalniania wielopęcherzykowego, rejestruj spontaniczne EPSC w aCSF o niskiej zawartości wapnia przez co najmniej pięć minut.

Dodać 30 mikromolowców 4-AP do aCSF przez system perfuzyjny. Rejestruj spontaniczne EPSC przez co najmniej 10 minut. Następnie dodaj 200 mikromolowych promieni gamma-DGG do aCSF za pomocą 4-AP i rejestruj spontaniczne EPSC przez co najmniej 10 minut.

W ramach eksperymentu kontrolnego w oddzielnej komórce powtórz procedury, ale zastosuj niskie stężenie DNQX zamiast gamma-DGG. W przypadku analizy offline należy przeanalizować ostatnią minutę każdej aplikacji leku. Wybuchy aktywności synaptycznej mogą przejściowo zwiększać spontaniczne wystrzeliwanie potencjału czynnościowego i prawdopodobieństwo uwolnienia stymulowanych aferentów.

Jeśli neurony wykazują mnogość, wzrost potencjałów czynnościowych powinien powodować przejściowy wzrost amplitudy prądów postsynaptycznych. W czwartym eksperymencie zarejestruj spontaniczne EPSC w normalnym wapniu aCSF. Aby zwiększyć wyzwalanie potencjału czynnościowego, stymuluj aferenty za pomocą monopolarnej elektrody szklanej wypełnionej CSF z częstotliwością 20 Hz przez dwie sekundy i powtórz 10 razy z odstępem między impulsami wynoszącym 20 sekund.

Do analizy należy użyć 5 000 milisekund spontanicznych EPSC przed pierwszym bodźcem jako punktu odniesienia i porównać z 10 do 300 milisekundowymi spontanicznymi EPSC po ostatnim bodźcu. Następnie weź średnią zmianę amplitudy i częstotliwości w ciągu 10 prób. Analizuj spontaniczne EPSC i miniaturowe EPSC za pomocą programu, który wykrywa i analizuje prądy synaptyczne.

Użyj sugerowanych parametrów detekcji i funkcji analizy non-stop do wykrywania EPSC, w których pośredniczy receptor AMPA. Ręcznie skanuj każde nagranie, aby upewnić się, że program dokładnie wykrywa każde zdarzenie. Wyeksportuj dane zdarzenia, kopiując je do schowka, a następnie wklej je do oprogramowania do zarządzania danymi.

Następnie należy obliczyć średnią częstość i amplitudę dla każdego leczenia farmakologicznego i przeprowadzić odpowiednie analizy statystyczne. W pokazanym przykładzie 4-AP zwiększa zarówno amplitudę, jak i częstotliwość spontanicznych EPSC. Późniejsze zastosowanie TTX i kadmu zmniejsza zarówno amplitudę, jak i częstotliwość.

Oto rozkład spontanicznej amplitudy EPSC z nagrania. W badanych tutaj neuronach podwzgórza amplituda i częstość warunków wyjściowych i TTX są takie same, co sugeruje, że wyjściowe spontaniczne EPSC zawierają bardzo mało EPSC zależnych od potencjału czynnościowego. W związku z tym kolejne eksperymenty mogą porównać różnicę między wartością bazową a 4-AP w celu zmierzenia wielokrotności.

Siła transmisji synaptycznej może być przejściowo zwiększona przez wybuchy aktywności synaptycznej. Aby zbadać mnogość w bardziej fizjologicznych warunkach, stymulacja aferentna może być wykorzystana do zwiększenia prawdopodobieństwa wystrzeliwania i uwalniania potencjału czynnościowego. Poniżej znajdują się podsumowania spontanicznych zmian częstotliwości i amplitudy EPSC po stymulacji synaptycznej.

Stabilne nagrania są niezbędne do dokładnej interpretacji danych. Opisz dane, jeśli opór dostępu zmieni się o więcej niż 20% podczas nagrywania, ponieważ może to zakłócić analizę. Protokół ten oferuje prosty sposób oszacowania wielości synaptycznej, która jest kluczowym wyznacznikiem skuteczności synaps i jej plastyczności w różnych stanach fizjologicznych i patofizjologicznych.