Wizualizacja antygenowych komórek CD4+ T za pomocą tetramerów klasy II MHC

Co naprawdę wyróżnia test Teera, to fakt, że pozwala on bezpośrednio wizualizować antygenowo-specyficzne limfocyty T. Te, teer, to główny unikalny aspekt naszego testu. Do tego dochodzi krok wzmacniający, który stosujemy.

Izolujemy limfocyty T, a potem hodujemy je w środowisku, które wzbogaca próbkę o interesujące nas limfocyty T. Potem możemy konkretnie oznaczyć tylko te komórki i wizualizować je na cytometrze przepływowym. I tak w przypadku wcześniejszych testów, takich jak CSFE czy testy proliferacyjne, które istnieją od dekad, otrzymujemy ogólne ogólne pomiary tego, co dzieje się w populacji limfocytów T.

Ale w organizmie są miliony limfocytów T, które widzą bardzo różnorodne wzorce. Jeśli masz szczęście, może jedna na dwie do 300 000 komórek w próbce będzie tą, którą oglądasz. I dlatego ten test wykonuje te kroki wzbogacające.

A potem, dzięki liczbie testowej, i ponieważ barwimy bezpośrednio, można zwizualizować z dala od tła populację mniejszą niż 1% całkowitej liczby komórek. Można więc zobaczyć bardzo, bardzo małe różnice i można dość precyzyjnie policzyć liczbę limfocytów T w tej próbce krwi, które rozpoznają Twój wzorzec zainteresowania. Ale na tym się nie kończy, ponieważ tetery pozwalają nie tylko oznaczać te limfocyty T, ale też izolować je do dalszej analizy.

A tetery, których używasz, są faktycznie produkowane tutaj, w BRI, czy to prawda? Tak. Jesteśmy jednym z nielicznych laboratoriów w kraju, które z powodzeniem zdobyły teterów klasy drugiej. Naszym celem jest dystrybucja tych odczynników kosztowo do wszystkich laboratoriów zainteresowanych importem tej technologii.

Co według Ciebie są najtrudniejsze lub najtrudniejsze aspekty tego testu przy jego replikowaniu w innych laboratoriach? Cóż, gdy o tym myślę, są właściwie dwie – wzrost limfocytów T. To coś, co naprawdę jest trochę sztuką.

Ty, ty masz niemal codzienne decyzje, czy komórki potrzebują dodatkowych składników odżywczych, czy więcej miejsca do wzrostu. A drugą częścią, która moim zdaniem jest najtrudniejsza do obsługi dla niedoświadczonego, jest analiza danych. Chodzi o to, by ustalić, która część sygnału jest naprawdę pozytywną reakcją, a która jest po prostu inherentna z, wiesz, fizyką i przyciąganiem.

A fakt, że wszystko ma pewien stopień przyczepności, to coś, co znowu wymaga dużo doświadczenia, zwłaszcza w sytuacjach, gdy ogólna reakcja może być trochę słaba. Jak informacje, które uzyskasz za pomocą tego testu, mogą teraz przynieść korzyści pacjentom? Jednym z pierwszych znaków charakterystycznych u każdego pacjenta autoimmunologicznego jest swego rodzaju zbiór przeciwciał specyficznych dla danej choroby.

Wiemy z fundamentalnych podstaw immunologii, że gdziekolwiek pojawia się odpowiedź przeciwciał, zawsze najpierw pojawia się odpowiedź limfocytów T. Gdybyśmy mogli spojrzeć na osoby zagrożone i zobaczyć skok aktywności komórek T, który poprzedzałby powstanie przeciwciał, pomogłoby nam to zdefiniować nowy poziom ryzyka, czyli osoby zmierzają w kierunku posiadania autoprzeciwciał, co miejmy nadzieję otworzyłoby okno na terapie interwentywne. Procedura ta ma na celu oczyszczenie i rozszerzenie antygenowo-specyficznych komórek CD 4 dodatnich T oraz ich wizualizację przy użyciu odczynników teterowych oraz szafek biologicznych o laminarnym przepływie typu 2.

To będzie główne miejsce pracy podczas zabiegu. 50-mililitrowe rury stożkowe jako rura pierwotna do izolacji PBMC z jednym XPBS. Powinien to być folpack bez wapnia i magnezu oraz folia owinięta przed światłem pipety pomocnicze, pipety CoStar 10 mil z wkładkami aerozolowymi z wkładkami 50 mil, które zapobiegają zanieczyszczeniu krwi w wirówce.

GS 6 pipet transferowych do wirówki R, pipety Pasteura z buforem hemolitycznym zawierającym 8,3 grama na litr. Chlorek amonu 1,0 grama na litr. Wodorowęglan sodu 0,04 grama na litr, DI sod, EDTA trian blue 0,2%roztwór w PBS hemo CYTOMETER 15 mililitrów, bufor stożkowy z rurką biegnącą zawierający PBS, uzupełniony o dwa milimolarne EDTA plus pięć gramów na litr.

Zestaw izolacyjny BSA max CD 4 dwa zakupiony od Milin Biotech EP magnetyczny blok zakupiony od Stem Cell Technologies. Inne platformy wzbogacania komórek magnetycznych mogłyby być stosowane z równą skutecznością. Pięciomilimetrowa rurka polipropylenowa RPMI 1640 uzupełniona o 25-milimolarne hipisy używane do produkcji surowicy ludzkiej o średnim poziomie T, używanej do uzupełniania medium T-komórkowego paska długopisowego używanego do uzupełnienia medium T-komórkowego, filtr od nakrętki 0,22 mikrona, sterylna płytka o objętości 0,22 mikrona, sterylna płytka użyta do hodowli in vitro, inkubator CO2 kroku 37 stopni, roztwór 20 miligramów na mililitr syntetycznego peptydu zawierającego interesujący się epitop.

Pięciomililitrowy peptyd z rurki faksowej z 5-mililitrowym zestawem klasy dwa służy do wizualizacji antygenowo-specyficznych limfocytów T, anty-CD 3, anty-CD 4 oraz anty-CD 25 do powłokowania antygenowo-specyficznych limfocytów T. Przed rozpoczęciem procedury użyj cytometru przepływowego kalibru faksu lub odpowiednika. Zbierz wszystkie materiały i sprzęt w swoim miejscu pracy.

Poniższa demonstracja obejmie następujące kroki. Izolacja PBMC, IV pozytywna separacja komórek T in vitro, hodowla ekspansji T wizualizująca komórki T przez teem lub barwienie. Krok pierwszy: izolacja PBMC.

Pobierz próbkę krwi. Krew powinna być pobierana w strzykawkach lub rurkach i antykoagulowana heparyną w proporcji 1 do 50, aby zapobiec krzepaniu, spodziewaj się wynosu około 1 miliona PBMC na mililitr krwi. Około 40% z nich to komórki T z czwartym wynikiem CD.

Zrób krew do 50-mililitrowych stożkowych rurek. 25 mililitrów krwi w probówce. Delikatnie wymieszaj krew przed krzepnięciem ALI, aby rozprowadzić osocze.

Dodaj PBS, co daje całkowitą objętość 40 mililitrów, a podłoże wysusza 11 mililitrów fialu, wkłada się do rurki z krwią i ostrożnie usuwa pipetę z pipety. Fial powoli odpływa na dno rurki. Gdy poziom się wyrówna, powoli wyjmij pipetę z rurki z krwią, odłóż zakrętki i przenieś się do aerozolu z pojemników.

Mocno zamknij puszki i wiruj w wirówce 900 razy G przez 20 minut bez przerwy. Kluczowe jest, aby na końcu tego spinu nie było zatrzymywania się, ponieważ siła pęknięć zakłóci warstwę komórek po spinze. PBMC powinien tworzyć wyraźną białą warstwę pomiędzy żółtą plazmą powyżej a przezroczystą fialną poniżej.

Delikatnie zdejmij warstwę białych krwinek za pomocą pipety transferowej i przenieś do nowej rurki. Część plazmy i fialu może być pobierana za pomocą PBMC, ale unikaj pobierania warstwy czerwonych krwinek. Zazwyczaj na tym etapie można połączyć dwie probówki z krwią w jedną komórkę.

Aby zwiększyć rozmiar granulatu, dodaj PBS, co daje całkowitą objętość 15 mililitrów, i wiruj w wirowaniu przy 500 razy G przez 15 minut na niskim rozbiciu i aerozoli pojemników zasysaj ciecz za pomocą pipety pastowej, uważając, by nie zakłócać granulki. Leczcie buforem hemolitycznym, dodając do każdej probówki od pięciu do sześciu mililitrów i delikatnie mieszając, aby usunąć grudki. Inkubuj nie dłużej niż pięć minut.

Dodaj PBS, co daje całkowitą objętość 50 mililitrów i wiruj w 230 razy G przez 10 minut. Przy niskim przerwaniu aerozolowe pojemniki nie są już potrzebne do tych wolniejszych obrotów. Przemyj dwukrotnie, zasysaj płyn za pomocą rurki wypełnionej pipetą pastwiskową PBS i wiruj w 230 razy G przez 10 minut przed ostatnim krokiem płukania, usuń aliquot komórek zawiesowanych, rozcieńcz trianowym błękitem i licz za pomocą cytometru hemo.

Ta liczba komórek będzie decydować o objętościach reagentów używanych podczas separacji limfocytów T. Krok drugi: czwarta faza separacji limfocytów T, aspiracja cieczy i dodanie buforu biegającego, aby całkowita objętość wzrosła do 40 mikrolitrów na 10 milionów komórek. Zazwyczaj wymaga to 30 mikrolitrów buforu plus resztkowa objętość granulek.

Przenieś tę objętość do stożkowej rurki o pojemności 15 milimetrów. Dodaj koktajl przeciwciał z zestawów izolacyjnych CD 4, 10 mikrolitrów na 10 milionów komórek kapsułki i umieść w lodzie na 10 minut. Wyjmij rurkę z lodu, zdejmij pokrywkę i dodaj 30 mikrolitrów buforu na 10 milionów komórek.

Dodaj magnetyczne kulki z zestawu izolacyjnego CD 4. 20 mikrolitrów na 10 milionów komórek, zakręcaj rurkę i umieszczaj w lodzie na 15 minut. Dodaj 10 objętości buforu do mycia i wiruj w 230 razy G przez 10 minut.

Podczas obracania ustaw magnes i rurkę z polipropylenu pięciomilimetrowych w swoim miejscu pracy. Aspiruj płyn z pelletu komórkowego. Dodaj dwa mililitry buforu i usuń grudki za pomocą pipety transferowej.

Używając tych samych komórek transferowych pipety transferowej do rurki pięciomililitrowej i inkubuj w magnese przez 15 minut. Ostrożnie przelać czterocylindrową dodatnią frakcję limfocytu T CD do oznaczonej rurki 15 mil, odwracając magnes i opróżniając wszystkie oprócz ostatniej kropli. Dodaj kolejne dwa mililitry bufora do rurki pięciomililitrowej i wyjmij z magnesu.

Delikatnie spłukaj komórki CD z czterech ujemnych boków rurki i przełóż do oznaczonej 15-milimetrowej rurki. Dodaj do każdej probówki dwa mililitry pożywki z limfocytami T. Usuń aliquoty do liczenia komórek i wiruj w wirówce przy 230 razy G przez 10 minut.

Rozcieńcz alikwoty komórek za pomocą błękitu trianowego i licz za pomocą cytometru hemo. Te liczby komórek będą decydować o liczbie studni użytych do hodowli ekspansyjnej. Krok trzeci.

Kultura ekspansji in vitro aspiruje płyn z osadów komórek o 4 pozytywnych i 4 % na podstawie liczby komórek. Dodaj medium do czterech komórek pozytywnych CD, aby dostosować objętość do 3 milionów komórek na mil. Dodaj medium do czterech komórek ujemnych CD, aby dostosować objętość do 10 milionów komórek na mil.

Hodowla ekspansji wymaga 3 milionów komórek CD o czterech ujemnych na dołek oraz od dwóch do 3 milionów komórek CD o czterech dodatnich komórkach na dołek. Zazwyczaj komórki z czwartym dodatnim zapłodnieniem są populacją ograniczającą. Aliquot CD włóż cztery ujemne komórki do odpowiedniej liczby dołków na płytce 48-dołkowej.

Dodając do każdego 300 mikrolitrów, umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni na jedną godzinę. Usuń płytę, inkubator, umyj studnie, dodając 500 mikrolitrów świeżego medium i delikatnie pipetując 12 do 20 razy pipetą transferową, usuwając cały płyn. To płukanie pozostawi warstwę przylegających komórek prezentujących antygen.

Po zakończeniu mycia dodaj tylko tyle medium, żeby zwilżyło dno każdego z nich, czyli około 100 mikrolitrów. W przeciwnym razie komórki przylegające do A wyschną. W razie potrzeby do każdego dołka dodaj od 2 do 3 milionów komórek CD o czterech dodatniach.

Dodaj dodatkowe media, aby całkowita objętość w każdym odwiercie wzrosła do jednego mililitra. Dodaj do każdego z nich pożądany peptyd. Studnia. Typowe stężenie stymulujące to 10 mikrogramów na mililitr.

Ostatnia talerz do inkubatora 37 stopni na siedem dni. Po siedmiu dniach. Każdego kolejnego dnia dodaj 50 mikrolitrów hemo IL po dwa do każdej studni.

Monitoruj wzrost komórek za pomocą mikroskopu, dołki zasilające, które jeszcze nie są połączone, usuwając połowę ośrodka, dodając świeże medium i 50 mikrolitrów IL, dwóch podzielonych dołków zbiegowych, poprzez resusowanie komórek, przenosząc połowę komórek do pustej dołki. Dodanie świeżego medium i 50 mikrolitrów IL, dwóch komórek powrotnych do inkubatora. Rozrastające się komórki będą gotowe do barwienia teera po 13 do 15 dniach hodowli.

Krok czwarty, wizualizacja limfocytów T poprzez barwienie teer, zakup lub zmontowanie teterów dopasowanych do peptydu. Kombinacje MHC używane do stymulacji czterech dodatnich limfocytów T CD. Wyjmij talerz z inkubatora.

Ostrożnie wyciągnij połowę materiału z każdego z nich. Z każdego otworu przenosi się aliquot komórek, zwykle 75 mikrolitrów lub około 50 000 komórek, do rurki faksowej z polistyrenu o wartości 5 mililitrów, zwykle po jednym mikrolitrze na 50 mikrolitrów całkowitej objętości i umieść w inkubatorze 37 stopni na godzinę. Zaleca się również barwienie drugiego aliquotu każdej dołki niedopasowanym teerem jako komórek z negatywną kontrolą antyciałami anty-CD 3, anty-CD 4 i anty-CD 25.

Można stosować dodatkowe lub alternatywne markery przeciwciał. Jednak nie należy używać przeciwciał oznaczonych PE, ponieważ kanał ten musi być obecnie zarezerwowany dla teemów. Oznaczaj też pojedyncze elementy koloru lub izotypu za pomocą dodatkowych komórek.

Inkubuj komórki oznaczone przeciwciałami przez 15 do 30 minut w temperaturze czterech stopni. Przemyj każdą probówkę 0,5 do jednego mililitra bufora i wiruj w 230 razy G przez 10 minut. Ostrożnie przelewaj płyn z lamp faksowych, kalibruj cytometr przepływowy za pomocą kulek referencyjnych, jednokolorowych lamp kontrolujących, kontroli izotypu i innych.

Przeanalizuj każdą rurkę za pomocą cytometru przepływowego. Komórki tetra dodatnie powinny stanowić odrębną populację wśród rozszerzonych komórek T z czterocylindrowym dodatkiem CD. Komórki tetra dodatnie zwykle są pozytywne na 25. dzień i często na 4. wysoką temperaturę.