Name: Wizualizacja antygenowych komórek CD4+ T za pomocą tetramerów klasy II MHC (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 42 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji antygenowych komórek CD4+ T za pomocą tetramerów klasy II MHC. Technika ta umożliwia bezpośrednią identyfikację limfocytów T o określonej specyficzności antygenowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Dickowi Foleyou i Leigh Kimball za ich kluczową rolę w filmowaniu i produkcji wideo.

1. Izolacja mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC)
<ol>
	<li>Pobrać próbkę krwi – krew należy zebrać do strzykawek lub probówek do krwi i przeciwzakrzepić heparyną (w stosunku 1:50), aby zapobiec krzepnięciu. Przewidywana wydajność to około 1×106 PBMC na mL krwi – z czego około 40% stanowić będą limfocyty T CD4 dodatnie (CD4+).</li>
	<li>Rozdzielić krew do stożkowych probówek 50 mL, po 25 mL na probówkę. Jeśli krew uległa rozdzieleniu, przed rozdzieleniem należy ją delikatnie wymieszać w celu równomiernego rozłożenia osocza</li>
	<li>Dodać PBS, doprowadzając całkowitą objętość do 40 mL, a następnie utworzyć warstwę podkładową, pobierając 11 mL Ficollu, wprowadzając go do probówki z krwią i ostrożnie zdejmując Pipet-Aid z pipety. Ficoll powoli spłynie na dno probówki. Po wyrównaniu poziomów powoli wyjąć pipetę z probówki z krwią i ją wyrzucić.</li>
	<li>Zakręcić probówki z krwią i umieścić je w kanistrach Aerosolve. Szczelnie zamknąć kanistry i wirować przy 900×g przez 20 minut – bez hamowania. Jest kluczowe, aby na koniec wirowania nie stosować hamowania, ponieważ siła hamowania zakłóci warstwę komórek.</li>
	<li>Po wirowaniu PBMC powinny utworzyć wyraźną białą warstwę między żółtym osoczem (powyżej) a przezroczystym ficollu (poniżej). Delikatnie zebrać warstwę białych krwinek za pomocą pipety transferowej i przenieść do nowej probówki. Wraz z PBMC może zostać pobrane nieco osocza i Ficollu, należy jednak unikać pobierania warstwy czerwonych krwinek. Zazwyczaj na tym etapie można połączyć zawartość dwóch probówek z krwią w jednej probówce z komórkami, aby zwiększyć wielkość osadu.</li>
	<li>Dodać PBS, doprowadzając całkowitą objętość do 50 mL, i wirować przy 500×g przez 15 minut – słabe hamowanie w kanistrach Aerosolve.</li>
	<li>Odssać ciecz za pomocą pipety Pasteura, uważając, aby nie naruszyć osadu</li>
	<li>Potraktować buforem hemolitycznym, dodając 5-6 mL do każdej probówki i delikatnie mieszając w celu usunięcia grudek. Inkubować nie dłużej niż 5 minut.</li>
	<li>Dodać PBS, doprowadzając całkowitą objętość do 50 mL, i wirować przy 230×g przez 10 minut – słabe hamowanie. Kanistry Aerosolve nie są już potrzebne przy tych wolniejszych wirowaniach.</li>
	<li>Przemyć dwukrotnie: odessać ciecz za pomocą pipety Pasteura, napełnić probówkę PBS i wirować przy 230×g przez 10 minut.</li>
	<li>Przed końcowym etapem przemywania pobrać alikwot resuspendowanych komórek, rozcieńczyć błękitem trypanu i policzyć za pomocą hemocytometru. Liczba komórek określi objętości odczynników użytych w etapie separacji limfocytów T.</li>
</ol>
2. Separacja limfocytów T CD4+*
<ol>
	<li>Odssać ciecz i dodać bufor roboczy, aby uzyskać całkowitą objętość 40 uL na 10 milionów komórek. Zazwyczaj wymaga to dodania 30 uL buforu do pozostałej objętości osadu.</li>
	<li>Przenieść tę objętość do stożkowej probówki 15 mL.</li>
	<li>Dodać koktajl przeciwciał z zestawu do izolacji CD4 – 10 uL na 10 milionów komórek, zakręcić probówkę i pozostawić w lodzie na 10 minut.</li>
	<li>Wyjąć probówkę z lodu, zdjąć zakrętkę i dodać 30 uL buforu roboczego na 10 milionów komórek.</li>
	<li>Dodać kulki magnetyczne z zestawu do izolacji CD4 – 20 uL na 10 milionów komórek, zakręcić probówkę i pozostawić w lodzie na 15 minut.</li>
	<li>Dodać dziesięciokrotność objętości buforu roboczego w celu przemycia i wirować przy 230×g przez 10 minut.</li>
	<li>Podczas wirowania przygotować magnes oraz polipropylenową probówkę 5 mL w miejscu pracy.</li>
	<li>Odssać ciecz znad osadu komórkowego, dodać 2 mL buforu roboczego i usunąć grudki za pomocą pipety transferowej.</li>
	<li>Używając tej samej pipety transferowej, przenieść komórki do probówki 5 mL i inkubować w magnesie przez 15 minut.</li>
	<li>Ostrożnie przelać frakcję komórek CD4+ do oznakowanej probówki 15 mL, odwracając magnes i opróżniając zawartość aż do ostatniej kropli.</li>
	<li>Dodać kolejne 2 mL buforu roboczego do probówki 5 mL i wyjąć ją z magnesu.</li>
	<li>Delikatnie spłukać komórki CD4- ze ścianek probówki i przenieść je do oznakowanej probówki 15 mL.</li>
	<li>Dodać 2 mL pożywki do limfocytów T do każdej probówki, pobrać alikwoty do zliczenia komórek i wirować przy 230×g przez 10 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć alikwoty komórek błękitem trypanu i zliczyć je za pomocą hemocytometru. Wyniki zliczenia komórek określą liczbę dołków wykorzystanych w etapie hodowli ekspansyjnej.</li>
</ol>
* Alternatywnie, zamiast kroków 2.2 – 2.11, można zastosować kolumny i kulek MACS (Miltenyi Biotec), separator komórek AutoMACS (Miltenyi Biotec) lub separator komórek Robosep (Stem Cell Technologies) zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Hodowla ekspansyjna in vitro
<ol>
	<li>Odssać ciecz z osadów komórek CD4+ i CD4-, a następnie, w zależności od liczby komórek, dodać pożywkę hodowlaną (zazwyczaj stężenie 3 milionów komórek CD4+ na mL i 10 milionów komórek CD4- na mL jest odpowiednie do przygotowania hodowli). Hodowla ekspansyjna wymaga 3–5 milionów komórek CD4- na studzienkę i 2–3 milionów komórek CD4+ na studzienkę w całkowitej objętości 1 mL pożywki w 48-studzienkowej płytce hodowlanej. Zazwyczaj populacja ograniczająca stanowią komórki CD4+</li>
	<li>W razie potrzeby naświetlić komórki CD4- (5000 Rad). Rozdzielić komórki CD4- do odpowiedniej liczby studzienek na płytce 48-studzienkowej, dodając po 300–500 μL do każdej z nich. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37°C na 1 godzinę. Adherentne komórki CD4- będą pełnić rolę komórek prezentujących antygen w hodowli ekspansyjnej.</li>
	<li>Wyjąć płytkę z inkubatora.</li>
	<li>Przemyć studzienki, dodając 500 uL świeżej pożywki, delikatnie pipetując w górę i w dół 12–20 razy za pomocą pipety transferowej, a następnie usuwając całą ciecz. Płukanie to pozostawi warstwę adherentnych komórek prezentujących antygen.</li>
	<li>Po zakończeniu płukania dodać tyle pożywki, aby zwilżyć dno każdej studzienki (około 100 uL) – w przeciwnym razie adherentne komórki wyschną.</li>
	<li>Dodać 2–3 miliony komórek CD4+ do każdej studzienki. W razie potrzeby dodać dodatkową pożywkę, aby zwiększyć całkowitą objętość w każdej studzience do 1 mL.</li>
	<li>Dodać wybrany peptyd do każdej studzienki. Typowe stężenie stymulujące to 10 ug/mL w stężeniu końcowym.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37°C na 7 dni.</li>
	<li>Po 7 dniach dodać 50 uL Hemogen IL-2 (lub odpowiednika, np. rekombinowanego IL-2, 10 IU/mL) do każdej studzienki.</li>
	<li>W każdym kolejnym dniu monitorować wzrost komórek za pomocą mikroskopu. Studzienki, w których nie osiągnięto jeszcze konfluencji, dokarmiać poprzez usunięcie połowy pożywki, dodanie świeżej pożywki oraz 50 uL IL-2. Studzienki konfluentne rozdzielić poprzez resuspensję komórek, przeniesienie połowy z nich do pustej studzienki oraz dodanie świeżej pożywki i 50 uL IL-2. Przenieść komórki z powrotem do inkubatora.</li>
	<li>Komórki w fazie ekspansji będą gotowe do analizy tetramerem po 13–15 dniach hodowli.</li>
</ol>
4. Wizualizacja limfocytów T za pomocą barwienia tetramerami
<ol>
	<li>Należy zakupić lub przygotować tetramery odpowiadające kombinacjom peptyd/MHC, które pasują do stymulowanych komórek T CD4+ (źródła odczynników tetramerycznych opisano w dyskusji). Tetramery powinny znajdować się w roztworze o stężeniu ~0,5 mg/mL.</li>
	<li>Wyjmij płytkę z inkubatora</li>
	<li>Ostrożnie odessij połowę pożywki z każdej studni</li>
	<li>Przenieś alikwot komórek z każdej studni – zazwyczaj 75 μL lub około 50 000 komórek – do polistyrenowej probówki FACS o pojemności 5 mL</li>
	<li>Dodaj tetramer – zazwyczaj 1 μL na 50 μL całkowitej objętości – i inkubuj w temperaturze 37°C przez 1-2 godziny. Zaleca się również zabarwienie drugiej alikwoty komórek z każdej studni nietrafionym tetramerem w celu uzyskania kontroli negatywnej.</li>
	<li>Oznacz komórki przeciwciałami anty-CD3, anty-CD4 i anty-CD25, dodając 3-10 μL każdego przeciwciała. Można zastosować dodatkowe lub alternatywne markery przeciwciał. Należy jednak unikać przeciwciał znakowanych PE, ponieważ kanał ten musi być zarezerwowany dla tetramerów. W tym samym czasie oznacz kontrole jednobarwne lub izotypowe, wykorzystując dodatkowe komórki.</li>
	<li>Inkubuj komórki oznakowane przeciwciałami przez 15-30 minut w lodzie lub w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Przemyj każdą probówkę 0,5 do 2 mL buforu płukającego i wiruj przy 230×g przez 10 minut.</li>
	<li>Ostrożnie odlej ciecz z probówek FACS. Przechowuj wszystkie probówki w zamkniętym pojemniku (najlepiej w lodzie) do czasu przeprowadzenia analizy FACS.</li>
</ol>
5. Akwizycja i analiza za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Kalibruj cytometr przepływowy za pomocą kulek referencyjnych.</li>
	<li>Zweryfikuj ustawienia instrumentu:
	<ol>
		<li>Używając niebarwionych komórek kontrolnych lub kontroli izotypowych, dostosuj położenie bramki dla żywych limfocytów (FSC vs. SSC). Usuń autofluorescencję ze wszystkich kanałów poprzez wycentrowanie populacji (poprzez zmianę ustawień wzmocnienia) poniżej pierwszej dekady na każdej osi.</li>
		<li>Używając probówek z kontrolami jednobarwnymi, wycentruj zdarzenia w odpowiednich kwadrantach dla każdego pojedynczego koloru (poprzez zmianę ustawień kompensacji).</li>
		<li>Dokonaj precyzyjnej regulacji ustawień instrumentu, używając probówki barwionej nieistotnym tetramerem. W szczególności ustawienia dla kanału PE mogą wymagać korekty, ponieważ tetramery często barwią intensywniej niż kontrola przeciwciał. Nieistotny tetramer powinien barwić &lt;0,5% komórek CD4+.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nabywaj dane dla każdej probówki
	<ol>
		<li>Zbierz zdarzenia dla każdej probówki z próbką oraz probówki z kontrolą negatywną.</li>
		<li>Nabyj i zapisz co najmniej 20 000 zdarzeń do analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj dane
	<ol>
		<li>Zaimportuj pliki danych do oprogramowania do analizy FACS (np. oprogramowania CellQuest, WinMDI lub FlowJo). Rozpocznij analizę od probówki barwionej nieistotnym tetramerem.</li>
		<li>Wygeneruj wykres FSC vs. SSC i wyznacz bramkę wokół żywych limfocytów (Rysunek 1, górny lewy panel).</li>
		<li>Wygeneruj wykres CD4 vs. CD3 (z bramkowaniem ograniczonym tylko do żywych limfocytów) i wyznacz bramki wokół populacji CD3+ oraz CD4+ (Rysunek 1, górny prawy panel).</li>
		<li>Wygeneruj wykres CD4 vs. Tetramer (z bramkowaniem ograniczonym tylko do limfocytów CD3+) i ustaw granice kwadrantów tak, aby populacja CD4+Tetramer+ stanowiła mniej niż 0,5% (Rysunek 1, dolny lewy panel).</li>
		<li>Wygeneruj wykres CD25 vs. Tetramer (z bramkowaniem ograniczonym tylko do limfocytów CD4+) i ustaw granice kwadrantów tak, aby populacja CD25+Tetramer+ stanowiła mniej niż 0,5% (Rysunek 1, dolny prawy panel).</li>
		<li>Przeanalizuj wszystkie probówki z próbkami bez zmiany bramek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej; bramkowanie limfocytów i analiza CD3+, CD4+; różnicowanie populacji komórek." height="342" src="/files/ftp_upload/1167/1167fig1.jpg" width="600" data-altupdatedat="1773047343000" data-alt="Rysunek 1">
Rycina 1. Reprezentatywne wyniki barwienia tetramerem dla kontroli negatywnej. Panel w lewym górnym rogu przedstawia rozproszenie przednie (forward scatter) względem rozproszenia bocznego (side scatter) oraz bramkę wielkości limfocytów (R1). Panel w prawym górnym rogu jest ograniczony do bramki R1 i przedstawia przeciwciało anty-CD4 względem anty-CD3 oraz bramki CD3+ (R2) i CD4+ (R3). Panel w lewym dolnym rogu jest ograniczony do bramki R2 i przedstawia przeciwciało anty-CD4 względem tetrameru. Panel w prawym dolnym rogu jest ograniczony do bramki R3 i przedstawia przeciwciało anty-CD25 względem tetrameru. Kwadranty dla obu wykresów tetramerów zostały ustawione na 0,5%.
6. Reprezentatywne wyniki
<ol>
	<li>Komórki tetramer-dodatnie powinny stanowić wyraźną populację wśród wyekspandowanych komórek CD4+ (Rycina 2).</li>
	<li>Komórki tetramer-dodatnie są zazwyczaj CD25+ i często charakteryzują się wysoką ekspresją CD4.</li>
	<li>W niektórych przypadkach kombinacja MHC/peptyd może powodować barwienie tła (często spowodowane słabą rozpuszczalnością peptydu). Takie barwienie tła można odróżnić od prawdziwego wyniku dodatniego, ponieważ komórki „fałszywie dodatnie” nie tworzą pojedynczej, wyraźnej populacji ani na wykresach CD4 vs. Tetramer, ani na wykresach CD25 vs. Tetramer (Rycina 3).</li>
</ol>
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej przedstawiający bramkowanie limfocytów; analiza CD3+, CD4+ na wykresach rozrzutu." height="362" src="/files/ftp_upload/1167/1167fig2.jpg" width="600" data-altupdatedat="1773047343000" data-alt="Rycina 2">
Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki pozytywnego barwienia tetramerem. Układ paneli i strategia bramkowania są identyczne jak na Rysunku 1. Komórki pozytywne pod kątem tetrameru pojawiają się jako wyraźna populacja CD4 high na panelu anty-CD4 względem tetrameru oraz jako wyraźna populacja CD25+ na panelu anty-CD25 względem tetrameru.
<img alt="Wykres kropkowy z cytometrii przepływowej; bramkowanie limfocytów, analiza komórek CD3+ i CD4+, dane fluorescencyjne." height="336" src="/files/ftp_upload/1167/1167fig3.jpg" width="600" data-altupdatedat="1773047343000" data-alt="Rycina 3">
Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki barwienia tetramerem dające „fałszywie dodatnie” rezultaty. Układ paneli oraz strategia bramkowania są identyczne jak na Rysunku 1. Panel przeciw-CD4 względem tetrameru wykazuje niewyraźne, „kopulaste” barwienie. Panel przeciw-CD25 względem tetrameru również wykazuje barwienie „kopulaste”, bez wyraźnej tendencji do bycia CD25+.

<ol><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+Class+II+tetramers+permit+detection+and+characterization+of+peptide-specific+human+CD4%2B+T+cells+proliferating+to+influenza+A+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen.</a> J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).</li>
<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramer-guided+epitope+mapping%3A+rapid+identification+and+characterization+of+immunodominant+CD4%2B+T+cell+epitopes+from+complex+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens.</a> J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).</li>
</ol>

Zrozumienie roli limfocytów T CD4+ w odporności jest fundamentalnie ważne. Jednakże detekcja i izolacja swoistych dla antygenu limfocytów T CD4+ za pomocą tradycyjnych metod może być trudna. W przeciwieństwie do nich, tetramery MHC klasy II umożliwiają bezpośrednią wizualizację limfocytów T CD4+ o pożądanej specyficzności antygenowej. Niniejszy film demonstruje izolację, puryfikację i amplifikację in vitro limfocytów T CD4+ oraz ich późniejszą wizualizację przy użyciu tetramerów. Tetramery klasy II są fluorescencyjnymi k...

<table><tbody><tr><td>Komora z laminarnym przepływem powietrza klasy 2</td><td>sprzęt</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>1200</td><td>Lub równoważna</td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 50 mL</td><td>sprzęt</td><td>VWR international</td><td>47747-182</td><td>Lub równoważna</td></tr><tr><td>1X PBS (bez Ca/Mg)</td><td>odczynnik</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td>Lub równoważny</td></tr><tr><td>Ficoll-paque PLUS</td><td>odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>owinięty w folię w celu ochrony przed światłem</td></tr><tr><td>Pipet Aid XP</td><td>sprzęt</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td>Lub równoważny</td></tr><tr><td>Pipeta 10 mL</td><td>sprzęt</td><td>Corning</td><td>CLS4492</td><td>Lub równoważna</td></tr><tr><td>Kanistry Aerosolve</td><td>sprzęt</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>359481</td><td>z wkładkami 50 mL</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>sprzęt</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>GS-6R</td><td>Lub równoważna</td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>sprzęt</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>202-20S</td><td>Lub równoważne</td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>sprzęt</td><td>VWR international</td><td>14672-200</td><td>Lub równoważne</td></tr><tr><td>Bufor hemolityczny</td><td>odczynnik</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L EDTA dwusodowy</td></tr><tr><td>Błękit trypanu</td><td>odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>0.2% w PBS</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>sprzęt</td><td>VWR international</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 15 mL</td><td>sprzęt</td><td>VWR international</td><td>05-527-90</td><td>Lub równoważna</td></tr><tr><td>Bufor do elektroforezy</td><td>odczynnik</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji limfocytów T CD4+ MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II</td><td>odczynnik</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-155</td><td>Lub równoważny</td></tr><tr><td>Magnes EasySep&amp;#174;</td><td>sprzęt</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Probówka polipropylenowa 5 mL</td><td>sprzęt</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>22400-089</td><td>z 25 mM HEPES</td></tr><tr><td>Zbiór ludzkiej surowicy</td><td>odczynnik</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>pobrana od zdrowych dawców, inaktywowana ciepłem i filtrowana</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>1570-063</td><td>Lub równoważny</td></tr><tr><td>Filtr nakrętkowy 500mL 0.22 mikrona</td><td>sprzęt</td><td>Nalge Nunc international</td><td>595-3320</td><td>Lub równoważny</td></tr><tr><td>Płytka 48-dołkowa</td><td>sprzęt</td><td>Costar</td><td>3548</td><td>Lub równoważna</td></tr><tr><td>Inkubator 37&amp;#x00B0;C CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>sprzęt</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td>Lub równoważny</td></tr><tr><td>20 mg/mL syntetycznego peptydu</td><td>odczynnik</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Synteza na zamówienie u dowolnego dostawcy peptydów</td></tr><tr><td>Probówka FACS 5 mL</td><td>sprzęt</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>Polistyren</td></tr><tr><td>Tetramer klasy II obciążony peptydem (zgodnie z opisem)</td><td>odczynnik</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Przygotowany przez BRI tetramer core</td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>odczynnik</td><td>BD Biosciences</td><td>347344</td><td>Lub równoważny</td></tr><tr><td>Anti-CD4</td><td>odczynnik</td><td>eBioscience</td><td>17-0049-73</td><td>Lub równoważny</td></tr><tr><td>Anti-CD25</td><td>odczynnik</td><td>eBioscience</td><td>11-0259-73</td><td>Lub równoważny</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Facs Calibur</td><td>sprzęt</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td>Lub równoważny</td></tr></tbody></table>

wizualizacja antygenowo swoistych limfocytów t cd4+ z wykorzystaniem tetramerów mhc klasy ii

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Tetramery głównego układu zgodności tkankowej (MHC) klasy II umożliwiają bezpośrednią wizualizację antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta opiera się na wysoce swoistej interakcji między kompleksami MHC obciążonymi peptydem a odpowiadającymi im receptorami limfocytów T. Chociaż powinowactwo pojedynczej cząsteczki MHC/peptyd jest niskie, sieciowanie kompleksów MHC/peptyd za pomocą streptawidyny zwiększa awidność interakcji, co umożliwia ich wykorzystanie jako odczynników do barwienia. Ze względu na stosunkowo niską częstotliwość występowania limfocytów T CD4+ (~1 na 300 000 dla jednej swoistości), w badaniu tym zastosowano etap amplifikacji in vitro w celu zwiększenia progu detekcji. Komórki mononuklearne są oczyszczane z krwi obwodowej metodą warstwową z użyciem Ficollu. Następnie komórki CD4+ są izolowane poprzez selekcję negatywną z wykorzystaniem koktajlu biotynylowanych przeciwciał i kulek magnetycznych znakowanych przeciwciałami antybiotynowymi. Przy użyciu komórek adherentnych z frakcji komórek CD4- jako komórek prezentujących antygen, limfocyty T CD4+ są namnażane w pożywce poprzez dodanie antygenowego peptydu oraz IL-2. Namnożone komórki barwi się odpowiadającym im tetramerem klasy II poprzez inkubację w temperaturze 37°C przez jedną godzinę, a następnie barwi się je za pomocą przeciwciał powierzchniowych, takich jak anty-CD4, anty-CD3 i anty-CD25. Po znakowaniu komórki można poddać bezpośredniej analizie cytometrycznej. Komórki dodatnie pod względem tetrameru zazwyczaj tworzą odrębną populację wśród namnożonych limfocytów T CD4+. Komórki tetramer-dodatnie są zazwyczaj CD25+ i często wykazują wysoką ekspresję CD4. Ponieważ poziom tła w barwieniu tetramerami może być zmienny, dodatnie wyniki barwienia należy zawsze porównywać z barwieniem tych samych komórek nieistotnym tetramerem. Możliwe są liczne modyfikacje tego podstawowego badania. Komórki tetramer-dodatnie mogą być sortowane w celu dalszej analizy fenotypowej, włączenia do testów ELISPOT lub testów proliferacyjnych bądź innych analiz pomocniczych. Kilka grup badawczych zademonstrowało również możliwość jednoczesnego barwienia z użyciem tetramerów oraz przeciwciał antycytokinowych lub anty-FoxP3.

Niniejsza procedura demonstruje oczyszczanie i ekspansję in vitro antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ z pełnej krwi obwodowej oraz ich wizualizację przy użyciu tetramerów MHC klasy II. Tetramery umożliwiają bezpośrednią wizualizację limfocytów T o pojedynczej swoistości antygenowej i określonym ograniczeniu MHC klasy II.

Wizualizacja antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ z wykorzystaniem tetramerów MHC klasy II

Tetramery głównego układu zgodności tkankowej (MHC) klasy II umożliwiają bezpośrednią wizualizację antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta ...

Tym, co czyni test TEER naprawdę wyjątkowym, jest możliwość bezpośredniej wizualizacji limfocytów T specyficznych dla antygenu. Pomiar TEER stanowi główny, unikalny aspekt naszego testu, który łączymy z etapem amplifikacji.Jak państwo wiedzą, izolujemy limfocyty T, a następnie hodujemy je w środowisku, które wzbogaca próbkę o limfocyty T, na których nam zależy. Dzięki temu jesteśmy w stanie specyficznie oznakować tylko te komórki i zwizualizować je za pomocą cytometru przepływowego. W przypadku wcześniejszych testów, takich jak CFSE czy testy proliferacji stosowane od dziesięcioleci, otrzymuje się jedynie ogólne pomiary zbiorcze dotyczące tego, co dzieje się z całą populacją limfocytów T.W organizmie znajdują się jednak miliony limfocytów T, które rozpoznają cały zróżnicowany zestaw wzorców. Jeśli będziesz mieć szczęście, być może jedna na dwa do 300 000 komórek w próbce będzie tą, której poszukujesz. Właśnie dlatego w tym teście zastosowano etapy wzbogacania.Następnie, dzięki numeracji testów oraz bezpośredniemu barwieniu, można w rzeczywistości zwizualizować, oddzielając sygnał od tła, populację stanowiącą mniej niż 1% całkowitej liczby komórek. Pozwala to dostrzec bardzo niewiel

visualizing-antigen-specific-cd4-t-cells-using-mhc-class-ii-tetramers

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wizualizacja antygenowych komórek CD4+ T za pomocą tetramerów klasy II MHC

Technika łącząca barwienie tetramerami in situ i hybrydyzację in situ (ISTH) umożliwia wizualizację, mapowanie i analizę bliskości przestrzennej wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ względem zainfekowanych wirusem komórek docelowych oraz określenie ilościowych zależności między tymi efektorami odpornościowymi a celami w kontekście wyników infekcji.

Technika jednoczesnej wizualizacji wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ i komórek zainfekowanych wirusem in situ

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie tetramerów peptyd:MHC oraz magnetycznych mikrokulek do izolacji populacji limfocytów T specyficznych dla epitopu o niskiej częstotliwości oraz ich analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta umożliwia bezpośrednie badanie endogennych populacji limfocytów T w systemach eksperymentalnych in vivo.

Wzbogacanie limfocytów T swoistych dla epitopu z wykorzystaniem tetramerów peptyd-MHC

Ten film demonstruje metodę charakteryzowania limfocytów T pamięci CD8+ specyficznych dla małpiego wirusa niedoboru odporności (SIV) przy użyciu tetramerów peptydowo-głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I (pMHC-I). Tetramer pMHC-I to kompleks czterech cząsteczek MHC-I związanych z peptydami specyficznymi dla SIV i sprzężonych z fluoroforem. Te tetramery selektywnie wiążą się z receptorami limfocytów T (TCR) na limfocytach T CD8 + specyficznych dla SIV, ułatwiając charakterystykę tych...

Technika barwienia tetramerów peptydowych MHC-I do analizy komórek T pamięci CD8 + specyficznych dla SIV

Protokół wykrywania samoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu poprzez bezpośrednie barwienie głównymi dekstramerami klasy II kompleksu zgodności tkankowej został opisany w tym raporcie. Do kompleksowej analizy opracowano również wiarygodną metodę wyliczania częstości występowania limfocytów T CD4+ specyficznych dla antygenu in situ.

In Situ Wykrywanie autoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu przy użyciu dekstramerów klasy II o głównym kompleksie zgodności tkankowej

Opisujemy obrazowanie całego zwierzęcia i techniki oparte na cytometrii przepływowej do monitorowania ekspansji limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu w odpowiedzi na immunizację nanocząstkami w mysim modelu szczepienia.

Obrazowanie całych zwierząt i techniki cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu po szczepieniu nanocząstkami

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do liczenia i charakteryzowania limfocytów T CD8+ makaków rezusów przeciwko wirusowi AIDS. Ten artykuł jest przydatny nie tylko w dziedzinie immunologii HIV, ale także w innych obszarach badań biomedycznych, w których wiadomo, że odpowiedzi limfocytów T CD8 + wpływają na wynik choroby.

Analiza limfocytów T CD8 + specyficznych dla małpiego wirusa niedoboru odporności u makaków rezusów za pomocą barwienia tetramerem peptydowo-MHC-I

Tutaj opisujemy metodę, która łączy barwienie in situ MHC-tetrameru z immunohistochemią w celu określenia lokalizacji, fenotypu i ilości limfocytów T specyficznych dla antygenu w tkankach. Protokół ten służy do określania charakterystyki przestrzennej i fenotypowej limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w stosunku do innych typów komórek i struktur w tkankach.

In Situ Barwienie tetrameru MHC i analiza ilościowa w celu określenia lokalizacji, liczebności i fenotypu limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w tkankach

Tutaj prezentujemy protokół jakościowego wykrywania ex vivo specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+. Analiza jest możliwa w przypadku zawiesin pojedynczych komórek z narządów lub z niewielkich ilości krwi. Szeroki zakres badań wymaga analizy odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T (badania nad szczepieniami i immunoterapią nowotworów).

Jednoczesna kwantyfikacja limfocytów T CD8 + specyficznych dla antywektorów i anty-transgenów za pomocą barwienia tetramerem MHC I po szczepieniu wektorem wirusowym

Ten protokół opisuje użycie jednołańcuchowych kompleksów MHC klasy I do badania interakcji molekularnych w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8+: generowanie zmodyfikowanych komórek prezentujących antygen wyrażających konstrukty jednołańcuchowe, hodowla klonu ludzkich komórek T CD8+ i eksperymenty z aktywacją limfocytów T.

Zastosowanie technologii jednołańcuchowej MHC do badania koagonizmu w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8 +

Ten artykuł opisuje protokół generowania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 i ich ekspansji in vitro, w celu uzyskania dużej liczby funkcjonalnych limfocytów T do użycia in vitro i in vivo.

Wysokowydajne wytwarzanie pierwotnych cytotoksycznych limfocytów T myszy specyficznych dla antygenu do testów funkcjonalnych w autoimmunologicznym modelu cukrzycy

Dostarczamy szczegółowy protokół do izolowania i identyfikacji rzadkich populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu w płucach myszy poprzez magnetyczne wzbogacanie limfocytów T na bazie kulek magnetycznych i tetramery peptydu:głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC).

Identyfikacja rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu z płuc myszy za pomocą peptydów: głównych tetramerów kompleksu zgodności tkankowej

Poznaj metodę wizualizacji antygenowych komórek CD4+ T za pomocą tetramerów klasy II MHC. Technika ta umożliwia bezpośrednią identyfikację limfocytów T o określonej specyficzności antygenowej.

Wizualizacja antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ z wykorzystaniem tetramerów MHC klasy II

Przeglądaj więcej filmów