Name: W pełni ludzka matryca oparta na guzie w trójwymiarowym teście inwazji sferoidów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Poznaj trójwymiarowy test inwazji sferoidów wykorzystujący ludzką matrycę z mięśniaka gładkokomórkowego do badania progresji raka. Ta metoda umożliwia analizę inwazji komórek nowotworowych i testowanie leków z próbek pacjentów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują fundatorom tego badania: Fundacji Sigrid Jusélius, Fińskie Towarzystwo Walki z Rakiem oraz fundusze badawcze Centralnego Szpitala Uniwersytetu w Helsinkach. Autorzy dziękują Zakładowi Obrazowania Biomedicum na Uniwersytecie w Helsinkach za pomoc techniczną.

1. Generowanie sferoidów wielokomórkowych nowotworów
UWAGA: Protokół jest tutaj zademonstrowany z liniami komórkowymi UT-SCC-42A i -42B, ale może być również zastosowany przy użyciu innych linii komórkowych.
<ol>
	<li>Przemyć komórki UT-SCC-42A i -42B 6 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), dodać 0,05% trypsyny-EDTA (3 ml na kolbę o długości 75cm2) i umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności) na 2-5 minut.</li>
	<li>Sprawdź, czy komórki odłączyły się pod mikroskopem. Następnie dodać kompletną zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco (DMEM + 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 250 ng/ml amfoterycyny B, 0,4 μg/ml hydrokortyzonu i 50 μg/ml kwasu askorbinowego) w celu zneutralizowania enzymu (6 ml na kolbę o długości 75 cm2) i przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: Wybierz pożywkę do hodowli komórkowych, która pasuje do badanych komórek.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i zawiesić osad komórkowy w 2-5 ml kompletnego DMEM.</li>
	<li>Policz komórki i rozcieńcz zawiesinę komórek kompletnym DMEM do końcowego stężenia 20 000 komórek/ml. 
	nuta: Dla każdej linii komórkowej należy określić optymalną liczbę komórek.</li>
	<li>Dozować 50 μl zawiesiny komórek do każdej 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie o bardzo niskim nasadce, aby uzyskać końcowe stężenie 1,000 komórek na studzienkę.</li>
	<li>Przenieść płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności). Cztery dni później wizualnie potwierdź tworzenie sferoidów guza za pomocą odwróconego mikroskopu i kontynuuj test. Upewnij się, że na studzienkę przypada tylko jeden sferoid. 
	nuta: Czas potrzebny do utworzenia sferoidy różni się w zależności od różnych linii komórkowych.</li>
</ol>
2. Trójwymiarowy test inwazji sferoidów
UWAGA: Przygotuj 2x roztwór, ponieważ żel zostanie rozcieńczony w stosunku 1:1 po dodaniu do studzienek.
<ol>
	<li>Rozmrozić HMDM na lodzie i roztworze podstawowym fibrynogenu w łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 °C. Nie należy zakłócać działania fibrynogenu, dopóki nie zostanie całkowicie rozpuszczony i nie umieszczać roztworu na lodzie; wystąpią opady.</li>
	<li>Wymieszaj ze sobą odpowiednią objętość każdego odczynnika: 1 mg/ml HMDM (stężenie końcowe: 0,5 mg/ml), 0,6 U/ml trombiny (stężenie końcowe: 0,3 U/ml), 66,6 mg/ml aprotyniny (stężenie końcowe: 33,3 ug/ml) i 1 mg/ml fibrynogenu (stężenie końcowe: 0,5 mg/ml). 
	nuta: Dodaj fibrynogen tuż przed dozowaniem mieszaniny do studzienek i pracuj szybko; W ciągu kilku minut utworzy żel. Traktuj tylko kilka studzienek na raz.</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać 50 μl żelu. Skieruj końcówkę w stronę wewnętrznej ścianki studzienki i powoli pipetuj. Unikaj pęcherzyków powietrza (stosując technikę odwróconego pipetowania) i staraj się nie przesuwać sferoidy ze środka studni.</li>
	<li>Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych i pozwól matrycy HMDM/fibryny zestalić się przez 30 minut, a następnie delikatnie dodaj 100 μl kompletnego DMEM do każdej studzienki na wierzchu żelu.</li>
</ol>
3. Obrazowanie
<ol>
	<li>Codziennie obrazuj sferoidy za pomocą mikroskopu światła odwróconego. Alternatywnie można skorzystać z automatycznych systemów obrazowania.</li>
</ol>
4. Segmentacja obrazów za pomocą Ilastik
<ol>
	<li>Otwórz ilastik i wybierz przepływ pracy Pixel Classification (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Klasyfikuje piksele na podstawie adnotacji dokonanych przez użytkownika. Zapisz projekt ilastik (.ilp) na komputerze.</li>
	<li>Dodawanie obrazów do analiz. Kliknij Dane wejściowe i Dodaj nowy, a następnie wybierz obrazy (Rysunek 1B).</li>
	<li>Aby wybrać obiekt, kliknij Wybór funkcji i wybierz cechy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C, czerwony prostokąt). 
	UWAGA: Wybrane funkcje powinny z grubsza odpowiadać właściwościom wizualnym, które oddzielają obiekty od tła i będą używane do trenowania klasyfikatora.
	<ol>
		<li>Wybierz obiekty, klikając odpowiednie pola. Wybrane pola zmienią kolor na zielony (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C, niebieski prostokąt). 
		nuta: Tutaj użytkownik może wybierać spośród kilku różnych typów obiektów i skal. Kolor/Intensywność należy wybrać w celu oddzielenia obiektów na podstawie koloru lub jasności. Krawędź powinna być wybrana w celu oddzielenia obiektów na podstawie jasności lub gradientów kolorów. Tekstura jest ważną cechą, jeśli obiekty na obrazie mają specjalny wygląd tekstury. Do tego testu używany jest kolor/intensywność (sigma 0) i krawędź (sigma 6).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku treningu kliknij Szkolenie, a w sekcji Szkolenie znajdują się dwie etykiety: Etykieta 1 i Etykieta 2 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D, czerwony prostokąt). Jeśli jest tylko jedna etykieta, dodaj nową etykietę, naciskając Dodaj etykietę (Rysunek 1D, niebieski prostokąt).
	<ol>
		<li>Zaznacz tło jedną z etykiet (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D, żółty), a komórki drugą etykietą (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D, niebieski).</li>
		<li>Przetrenuj oprogramowanie dla pierwszych 10% obrazów. Wybierz następny obraz z bieżącego widoku.</li>
		<li>Po zaznaczeniu komórek i tła (pierwszego obrazu) naciśnij Live Update (Rysunek 1D, fioletowy prostokąt). 
		UWAGA: Przy następnym obrazie ilastik automatycznie przeprowadzi analizę zgodnie z poprzednimi obrazami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu trenowania i przeanalizowaniu wszystkich obrazów przez ilastik kliknij przycisk Prediction Export (Eksport przewidywania). Wybierz prostą segmentację ze źródła; Nie wybieraj prawdopodobieństwa ani niczego innego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Wybierz żądany format pliku wyjściowego z Wybierz ustawienia eksportu obrazu... w sekcji Eksport przewidywania (Rysunek 1E). Wyeksportuj wyniki etykietowania, klikając Eksportuj wszystko (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F). Pliki zostaną wyeksportowane do tego samego folderu z oryginalnymi obrazami. 
	UWAGA: W tym eksperymencie używany jest format .h5.</li>
</ol>
5. Analiza obszaru za pomocą Fiji ImageJ
<ol>
	<li>Ustawienie skali
	<ol>
		<li>Otwórz oryginalny obraz z paskiem skali w Fiji ImageJ (Rysunek 2A). Upewnij się, że obraz ma taki sam rozmiar i wymiar jak analizowane obrazy. Użyj narzędzia Zaznaczanie linii, aby narysować linię o znanej długości (Rysunek 2B). 
		nuta: Ten protokół jest wykonywany przy użyciu Fiji ImageJ 1.51 (64-bit) i ilastik -1.3.2rc.</li>
		<li>Kliknij przycisk Analizuj i ustaw skalę (Rysunek 2C). Ustaw znaną odległość w polu Znana odległość i ustaw odpowiednią jednostkę, a następnie kliknij Globalny (Rysunek 2D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalowanie makra
	<ol>
		<li>Jeśli wtyczka ilastik nie jest zainstalowana, wykonaj następujące kroki: kliknij Pomoc, Aktualizuj.... W otwartym oknie ImageJ Updater kliknij Zarządzaj witrynami aktualizacji. W otwartym oknie Manage Update Sites (Zarządzaj witrynami aktualizacji) kliknij obok pozycji ilastik, a następnie kliknij przycisk Zamknij. Następnie kliknij Zastosuj zmiany w oknie ImageJ Updater. Ten proces może zająć trochę czasu. Następnym oknem będą Informacje z tekstem Zaktualizowano pomyślnie. Kliknij przycisk OK i uruchom ponownie program ImageJ.</li>
		<li>Kliknij Wtyczki, makra i instalacja (Rysunek 3A). Następnie wybierz plik counter.ijm (patrz Informacje dodatkowe) i kliknij przycisk Otwórz. 
		nuta: Makro zostało napisane specjalnie do pomiaru powierzchni. Makro powinno być instalowane za każdym razem, gdy oprogramowanie jest otwierane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza obszaru
	<ol>
		<li>Analizuj obrazy, gdy wszystkie wtyczki są zainstalowane. Kliknij Wtyczki i przewiń w dół do ilastik (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). Wybierz Importuj HDF5, wybierz plik w formacie .h5, kliknij Otwórz i załaduj i zastosuj LUT (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3C,D).</li>
		<li>Naciśnij przycisk a na klawiaturze (makro), a obszar pojawi się w oknie Podsumowanie jako Całkowity obszar (<silna klasa="xfig">Rysunek 3E).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Spheroids+with+Enhanced+Aggressiveness+to+Mimic+Human+Liver+Cancer+In+vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell Spheroids with Enhanced Aggressiveness to Mimic Human Liver Cancer In vitro and In Vivo.</a> Scientific Reports. 7, 10499-10514 (2017).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29(2012).</li>
<li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research%3A+Focus+on+tumor+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology and Therapeutics. , 94-108 (2016).</li>
<li>Albanese, A., Lam, A. K., Sykes, E. A., Rocheleau, J. V., Chan, W. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-on-a-chip+provides+an+optical+window+into+nanoparticle+tissue+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumour-on-a-chip provides an optical window into nanoparticle tissue transport.</a> Nature Communications. 4, 2718(2013).</li>
<li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+drug+screen%3A+considerations+and+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nature Protocols. 4, 309-324 (2009).</li>
<li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53409(2015).</li>
<li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+%283D%29+Tumor+Spheroid+Invasion+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52686(2015).</li>
<li>Salo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+leiomyoma+tissue+derived+matrix+for+cell+culture+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel human leiomyoma tissue derived matrix for cell culture studies.</a> BMC Cancer. 15, 981(2015).</li>
<li>Nurmenniemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+organotypic+model+mimics+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">A novel organotypic model mimics the tumor microenvironment.</a> The American Journal of Pathology. 175, 1281-1291 (2009).</li>
<li>Salo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+three-dimensional+assays+based+on+human+leiomyoma-derived+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Organotypic three-dimensional assays based on human leiomyoma-derived matrices.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160482(2018).</li>
<li>Overall, C. M., Blobel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+partners%3A+linking+extracellular+proteases+to+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In search of partners: linking extracellular proteases to substrates.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 245-257 (2007).</li>
<li>Ahmed, T. A. E., Dare, E. V., Hincke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin%3A+a+versatile+scaffold+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 14 (2), 199-215 (2008).</li>
<li>Hoornstra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fermented+Lingonberry+Juice+Inhibits+Oral+Tongue+Squamous+Cell+Carcinoma+Invasion+In+vitro+Similarly+to+Curcumin%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Fermented Lingonberry Juice Inhibits Oral Tongue Squamous Cell Carcinoma Invasion In vitro Similarly to Curcumin.</a> In Vivo. 32, 1089-1095 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiona metoda zapewnia test 3D oparty na ludzkim guzie w celu oceny inwazyjności komórek nowotworowych w matrycy naśladującej mikrośrodowisko ludzkiego guza. Inwazję komórek rakowych można łatwo zmierzyć poprzez codzienne obrazowanie za pomocą standardowego mikroskopu oraz za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Metoda ta demonstruje inwazję komórek, a nie tylko ich proliferację.
W przeciwieństwie do MSDM, matryca HMDM/fibryna nie wymaga żadnej kontroli temperatury. Ta metoda jest łatwa do wykonania, w szczególności bez konieczności przenoszenia sferoid z jednej płytki na drugą. Ma tylko jeden technicznie wrażliwy krok, dodanie fibrynogenu do matrycy. Ponieważ fibrynogen zaczyna żelować po kilku minutach, dodanie fibrynogenu wymaga solidnego pipetowania i leczenia tylko kilkoma studzienkami na raz. Istnieje również ryzyko zakłócenia sferoidy i przesunięcia jej z centralnego położenia w studzience w kształcie litery U, jeśli pipetowanie odbywa się pod wysokim ciśnieniem. Zwichnięcie sferoidy może skomplikować obrazowanie i ostatecznie analizę.
Test można modyfikować poprzez zmianę stężenia HMDM lub fibrynogenu. Komórki można również utrwalać i barwić do kolejnych badań molekularnych. Mimo że metodę tę można zmodyfikować do w pełni zautomatyzowanej formy, można ją również przeprowadzić za pomocą zwykłego mikroskopu i dwóch programów open source, bez konieczności stosowania kosztownego sprzętu.
W porównaniu z tradycyjnymi testami 3D opartymi na MSDM, ten test może wykazywać lepsze właściwości inwazji komórek. Sferoidy hodowane w macierzy bogatej w lamininę zawierającej błonę podstawną, takie jak MSDM, mogą mieć większą proliferację komórek rakowych niż rzeczywista inwazja, co czyni je nieodpowiednimi do testów inwazji w kilku liniach komórek rakowych ze względu na ich niską zdolność inwazyjną. Inna często stosowana matryca, kolagen typu I, ma tendencję do kurczenia się od krawędzi podczas uprawy 3D, co wpływa na lokalizację sferoidów i obrazowanie studzienek. Ponadto wykazano różnice między wewnętrznymi właściwościami inwazyjnymi linii komórkowych agresywnego raka języka więcej (HSC-3) i mniej (SCC-25) przy użyciu modeli naśladujących mikrośrodowisko ludzkiego guza (krążki mięśniaka i jego rozpuszczalna forma macierzy)10,13.
Test jest również bardziej etyczny niż stosowanie MSDM, ponieważ HMDM jest ekstrahowany z pozostałości ludzkiego guza mięśniaka gładkokomórkowego. Obecnie HMDM jest jedynym dostępnym produktem ECM pochodzącym z ludzkiego nowotworu, który wydaje się być odpowiedni do wielu testów in vitro związanych z rakiem 8,10. W przyszłości matryce pochodzące z tkanek zwierzęcych mogą zostać zastąpione matrycami opartymi na ludzkich nowotworach, aby zmniejszyć potrzebę poświęcania zwierząt w celu produkcji matrycy.
Zastąpienie testów hodowli komórkowych 2D metodami 3D zapewnia dokładniejsze informacje na temat zachowania komórek nowotworowych. Obecnie istnieje kilka modeli 3D i komercyjnych matryc, ale niestety żaden nie jest odpowiedni dla wszystkich linii komórek rakowych. Badacze powinni wybrać najbardziej odpowiednią matrycę dla swojego konkretnego testu. Optymalne dopasowanie testu i matrycy może być wyzwaniem, ale może znacznie zwiększyć wiarygodność wyników.

Konwencjonalne dwuwymiarowe (2D) badania nad hodowlą komórek znacząco przyczyniły się do badań nad rakiem. Obecnie naukowcy skłaniają się ku trójwymiarowym (3D) testom hodowli komórkowych, aby lepiej naśladować warunki in vivo1. Hodowla komórek nowotworowych 3D dokładniej odzwierciedla złożone mikrośrodowisko guza pod względem interakcji komórka-komórka i komórka-macierz, profili ekspresji genów, wrażliwości leku i aktywności szlaku sygnałowego2,3.
W badaniach nad rakiem wykorzystuje się kilka modeli hodowli komórek 3D, takich jak eksplantacja tkanki nowotworowej, guz na chipie i sferoidy guza wielokomórkowego3,4. Sferoidy wielokomórkowe guzów są obecnie szeroko stosowane, ponieważ naśladują kilka cech warunków in vivo w ludzkich nowotworach1,5. Gdy średnica sferoidy jest większa niż 500 μm, ma nawet obszary niedotlenione i nekrotyczne centrum, reprezentujące w ten sposób sytuację guza in vivo2.
Wiele syntetycznych (np. polidimetylosiloksan) i zwierzęcych (np. kolagen z ogona szczura typu I i matryca pochodząca z mięsaka myszy, Matrigel, określana jako MSDM) zostało opracowanych do testów hodowli komórkowych 3D3,6,7,8. Do tej pory żadna z dostępnych na rynku matryc nie pochodziła z ludzkiej tkanki nowotworowej. W związku z tym brakuje im cech mikrośrodowiska ludzkiego nowotworu, które ma znaczący wpływ na procesy inwazji komórek nowotworowych8.
Myogel (matryca pochodząca z ludzkiego mięśniaka, określana jako HMDM) jest pobierana z tkanki guza mięśniaka gładkokomórkowego ludzkiej macicy9. Wykazano, że zawartość białka w HMDM różni się znacznie od zawartości MSDM. W rzeczywistości 66% białek HMDM różni się od białek MSDM. Z drugiej strony, niektóre białka, takie jak lamina, kolagen typu IV, proteoglikany siarczanu heparanu, nidoken i naskórkowy czynnik wzrostu, są obecne w obu matrycach10. Dodatkowo mysz różni się od człowieka zawartością enzymów, przy czym ludzie mają o 78 mniej proteaz niż myszy11.
Fibryna jest powszechnie stosowana samodzielnie lub w połączeniu z innymi materiałami jako materiał na rusztowania12. W testach hodowli komórkowych 3D dostępny na rynku ludzki fibrynogen i trombinę są łączone w celu utworzenia hydrożelu fibrynowego12.
Ten protokół opisuje ulepszenie wcześniej wprowadzonego testu 3D na inwazję sferoidów nowotworów7. Ten nowy protokół stosuje macierz pochodzącą z ludzkiego guza zamiast macierzy nowotworowej pochodzącej od myszy. Obejmuje również techniki obrazowania i analizy z wykorzystaniem oprogramowania ilastik i Fiji ImageJ. Protokół ten może być wykorzystany do oznaczania sferoidalnego kilku różnych litych linii komórek rakowych. Jest to biologicznie istotne narzędzie do opracowywania nowych terapii przeciwnowotworowych oraz do badania wpływu określonych cząsteczek na inwazję komórek nowotworowych.

<table><tbody><tr><td>Roztwór amfoterycyny B</td><td>Merck</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Aprotynina z płuc bydlęcych</td><td>Merck</td><td>A6279</td><td>Zmierz stężenie białka przed użyciem.</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Applichem</td><td>A1052</td><td></td></tr><tr><td>Kolby poddane hodowli komórkowej BioLite</td><td>Thermo Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy DS-Fi2</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DS-U3 Kontroler aparatu cyfrowego</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TS100 Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon Instrumenty</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>10270106</td><td>Ciepło dezaktywować przez 30 minut w temperaturze 56 &; C w łaźni wodnej przed użyciem.</td></tr><tr><td>Fibrynogen, zubożone w plazminogen, osocze ludzkie</td><td>Merck</td><td>341578</td><td>Rozpuszczalność: 25 mg/ml w H2O. Ogrzej H2O i fibrynogen do 37 &deg; C przed rozwiązaniem. Nie przeszkadzać, dopóki fibrynogen nie zostanie całkowicie rozpuszczony. Roztwory podstawowe przechowywane w temperaturze -70 stopni C należy rozmrażać w łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 °C.</td></tr><tr><td>Fiji ImageJ 1.51 program do przetwarzania obrazów</td><td>Freeware, NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Merck</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Ilastik oprogramowanie do klasyfikacji i segmentacji obrazów</td><td>Freeware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myogel</td><td>Lab made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Laboratoryjnie wyprodukowane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek Scepter 2.0</td><td>Merck</td><td>PHCC20040</td><td></td></tr><tr><td>Scepter Czujniki licznika komórek, 60 i mikro; m</td><td>Merck</td><td>PHCC60050</td><td></td></tr><tr><td>Trombina z ludzkiego osocza</td><td>Merck</td><td>T6884-100UN</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,5%) 10x, bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka Ultra-Low Attachment</td><td>Linie</td><td></td> komórkowe Corning 7007 <td></td></tr><tr><td>UT-SCC-42A i UT-SCC-42-B</td><td></td><td></td><td>Linie komórkowe zostały założone na Oddziale Otorynolaryngologii-Chirurgii Głowy i Szyi Szpitala Uniwersyteckiego w Turku (Turku, Finlandia).</td></tr></tbody></table>

w pełni ludzka matryca oparta na guzie w trójwymiarowym teście inwazji sferoidów

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Dwuwymiarowe testy oparte na hodowli komórkowych są powszechnie stosowane w badaniach nad rakiem in vitro. Brakuje im jednak kilku podstawowych elementów, które tworzą mikrośrodowisko guza. Aby uzyskać bardziej wiarygodne wyniki in vitro, wprowadzono kilka trójwymiarowych (3D) testów hodowli komórkowych. Testy te umożliwiają komórkom rakowym interakcję z macierzą zewnątrzkomórkową. Ta interakcja wpływa na zachowanie komórek, takie jak proliferacja i inwazja, a także na morfologię komórki. Ponadto interakcja ta może indukować lub hamować ekspresję kilku cząsteczek pro- i przeciwnowotworowych. Test inwazji sferoidalnej został opracowany w celu zapewnienia odpowiedniej metody 3D in vitro do badania inwazji komórek rakowych. Obecnie matryce pochodzenia zwierzęcego, takie jak matryca pochodząca z mięsaka myszy (MSDM) i kolagen typu I z ogona szczura, są głównie stosowane w testach inwazji sferoidów. Biorąc pod uwagę różnice między mikrośrodowiskiem ludzkiego guza a matrycami pochodzącymi od zwierząt, opracowano macierz pochodzącą z mięśniaka ludzkiego (HMDM) z łagodnej tkanki mięśniaka gładkokomórkowego macicy. Wykazano, że HMDM indukuje migrację i inwazję komórek rakowych lepiej niż MSDM. Protokół ten zapewnił prosty, powtarzalny i niezawodny test inwazji sferoidalnej 3D na podstawie ludzkiego guza przy użyciu macierzy HMDM/fibryny. Zawiera również szczegółowe instrukcje dotyczące obrazowania i analizy. Sferoidy rosną w ultra niskiej płytce mocującej w kształcie litery U w matrycy HMDM/fibryny i przenikają przez nią. Inwazja jest codziennie obrazowana, mierzona i analizowana za pomocą oprogramowania ilastik i Fiji ImageJ. Platformę testową zademonstrowano przy użyciu linii komórkowych ludzkiego pierwotnego i przerzutowego raka płaskonabłonkowego krtani. Jednak protokół jest odpowiedni również dla innych linich litych komórek rakowych.

Cztery dni po wysianiu komórek UT-SCC-42B (linia komórkowa przerzutnego SCC krtani), na utworzone sferoidy nałożono macierz (HMDM/fibryna, MSDM lub kolagen) (dzień 0), a następnie przez trzy dni monitorowano inwazję. Przedstawione tutaj obrazy uzyskano codziennie przy użyciu mikroskopu odwróconego (Rycina 4).
Po osadzeniu komórki w macierzy HMDM/fibryna zaczęły gwałtownie naciekać po jednym dniu i rozprzestrzeniać się w głąb macierzy (Rycina 4A). Komórki w MSDM nie naciekały do otaczającej macierzy, lecz tworzyły strukturę asymetryczną (Rycina 4B). Z kolei komórki w kolagenie naciekały w niewielkim stopniu, jednak ze względu na kurczenie się macierzy analiza była utrudniona (Rycina 4C). W niektórych studzienkach z kolagenem sferoidy całkowicie zanikły po trzech dniach (Rycina 4C).
Rysunek 5 przedstawia ilościowe określenie inwazji komórek w HMDM/fibrynie dla pierwotnej linii komórkowej SCC krtani UT-SCC-42A oraz odpowiadającej jej przerzutowej linii komórkowej UT-SCC-42B. Film (Film 1>) zarejestrowany za pomocą systemu analizy żywych komórek w sferoidzie HMDM/fibrynie pokazuje ruch komórek SCC w obrębie macierzy, gdzie tworzą one pasma, za którymi podążają pozostałe komórki.
<img alt="Przebieg pracy oprogramowania do klasyfikacji pikseli; schemat przedstawia wprowadzanie danych, wybór cech i etapy trenowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Segmentacja obrazu. Wybrane etapy segmentacji obrazu z wykorzystaniem programu ilastik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza równowagi statycznej; cyfrowe przetwarzanie obrazu, kalibracja skali; interfejs oprogramowania mikroskopowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ustawianie skali. Wybrane kroki ustawiania skali przy użyciu Fiji ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Interfejs oprogramowania, sekwencja instalacji makra, import danych, narzędzia analityczne, etapy wizualizacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Analiza inwazji z wykorzystaniem ImageJ. Wybrane etapy analizy obrazu przy użyciu Fiji ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Time-lapse wzrostu komórek, dni 0-3. Obrazy mikroskopowe, wyniki eksperymentalne, zmiany morfologii komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Inwazja komórek UT-SCC-42B w trzech różnych macierzach. Reprezentatywne obrazy inwazji komórek SCC w sferoidach 3D. Inwazję monitorowano przez trzy dni, wykonując zdjęcia codziennie za pomocą mikroskopu odwróconego. (A) HMDM/fibryna, (B) MSDM, (C) kolagen. Ostatnia kolumna przedstawia wyjaśnienie inwazji w 3. dniu. Pasek skali = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres wzrostu inwazji komórkowej w czasie; wykres liniowy porównujący UT-SCC-42A i UT-SCC-42B." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Ilościowe oznaczenie inwazji komórek SCC w HMDM/fibrynie. Inwazję pierwotnej linii komórkowej SCC krtani UT-SCC-42A oraz odpowiadającej jej przerzutowej linii komórkowej SCC krtani UT-SCC-42B analizowano przy użyciu oprogramowania ilastik i Fiji ImageJ. Wyniki przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe z trzech niezależnych eksperymentów, każdy wykonany w trzech powtórzeniach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy hodowli komórkowej, analiza fluorescencyjna, badanie wzrostu i morfologii komórek." src="/files/ftp_upload/59567/59567video1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Wideo 1"> 
Wideo 1: Ruch komórek SCC w obrębie HMDM/fibryny przez trzy dni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/Video_1.wmv" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)</a>

Mikrośrodowisko guza jest istotną częścią wzrostu i inwazji raka. Aby naśladować postęp raka, potrzebna jest biologicznie istotna ludzka matryca. Protokół ten wprowadza ulepszenie trójwymiarowego testu inwazji sferoidalnej in vitro poprzez zastosowanie ludzkiej matrycy opartej na mięśniaku gładkokomórkowym. Protokół wprowadza również komputerową analizę inwazji komórek.

W pełni ludzka matryca oparta na guzie w trójwymiarowym teście inwazji sferoidów

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Jak już wiemy, mikrośrodowisko guza jest istotną częścią wzrostu i inwazji raka. Aby naśladować postęp raka, potrzebujemy biologicznie istotnej ludzkiej matrycy nowotworowej. Jest to jedyny test inwazji in vitro oparty na ludzkiej macierzy nowotworowej.W porównaniu z klasycznym testem sferoidalnym, metoda ta nie jest tak wrażliwa na temperaturę i nie wymaga transferu sferoidów. Technika ta jest odpowiednia dla próbek raka litego pochodzących od pacjenta, takich jak rak głowy i szyi, i może zostać rozszerzona na medycynę spersonalizowaną, w tym terapie chemoradioterapią. Ta ludzka matryca oparta na nowotworach była już wykorzystywana do kilku zastosowań, w tym do wysokoprzepustowych testów leków, analizy żywych komórek, gojenia się ran i testów transferowych.Najbardziej wrażliwym technicznie krokiem jest postępowanie z fibrynogenem w metodzie, więc możesz najpierw przećwiczyć ten krok z pustymi studzienkami. Ważne jest, aby pokazać prawidłowe obchodzenie się z macierzą i łatwo jest ją przeanalizować, pokazując metodę wizualnie. W celu wytworzenia sferoidy wielokomórkowego guza, dozuj jeden razy 10 do trzecich komórek z linii komórkowej będącej przedmiotem zainteresowania w 50 mikrolitrach kompletnej pożywki do każdej studzienki 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie o bardzo niskim mocowaniu.Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórek o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na cztery dni, zanim wizualnie potwierdzisz tworzenie się sferoidów guza za pomocą odwróconego mikroskopu. Aby skonfigurować trójwymiarowy test inwazji sferoidów, rozmrozić matrycę pochodzącą z ludzkiego mięśniaka na lodzie i rozmrozić roztwór podstawowy fibrynogenu w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy odczynniki się ogrzeją, wymieszaj ze sobą odpowiednie objętości kompletnej pożywki, matrycy pochodzącej z mięśniaków ludzkich, trombiny, aprotyniny i fibrynogenu, dodając fibrynogen tuż przed dozowaniem mieszaniny matrycy do komórek.Natychmiast dodaj 50 mikrolitrów powstałego żelu do każdej studzienki płytki hodowli sferoidów, kierując końcówkę w kierunku wewnętrznej ścianki każdej studzienki i pipetując zwalniając bez przesuwania sferoidy od środka studzienki. Ponieważ fibrynogen zaczyna żelować po kilku minutach, wymaga solidnego, ale precyzyjnego pipetowania wstecznego i obróbki tylko kilku studzienek na raz. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 30 minut, aby umożliwić zestalenie się żelu fibrynowego pochodzącego z mięśniaka ludzkiego, a następnie delikatnie dodaj 100 mikrolitrów kompletnej pożywki do górnej części każdego żelu.Następnie wyobraź sobie codzienną inwazję sferoidów. Aby przeprowadzić segmentację obrazu za pomocą ilastik, otwórz oprogramowanie do klasyfikacji i segmentacji obrazów typu open source i wybierz przepływ pracy Klasyfikacja pikseli. Zapisz projekt ilastik na komputerze.Piksele zostaną sklasyfikowane na podstawie adnotacji dokonanych przez użytkownika. Kliknij opcję Dane wejściowe i Dodaj nowy, aby wybrać obrazy do analizy. Aby wybrać element, kliknij opcję Wybór elementu i wybierz obiekty.Kliknij odpowiednie pola, aby wybrać interesujące Cię obiekty. Wybrane pola zmienią kolor na zielony. W przypadku szkolenia kliknij opcję Szkolenie.W sekcji Szkolenie powinny znajdować się dwie etykiety, Etykieta 1 i Etykieta 2. Zaznacz tło jedną z etykiet i oznacz komórki drugą etykietą. Gdy wszystkie komórki i tło na pierwszym obrazie zostaną oznaczone, wybierz następny obraz z bieżącego widoku, aby kontynuować oznaczanie komórek i tła, aż 10% obrazów zostanie zaznaczonych.Następnie wybierz opcję Live Update, aby przeanalizować wszystkie obrazy. Po zakończeniu szkolenia i przeanalizowaniu wszystkich obrazów przez ilastik kliknij opcję Prediction Export (Eksport przewidywania) i wybierz opcję Simple Segmentation from Source (Prosta segmentacja ze źródła). Następnie wybierz żądany format pliku wyjściowego z Wybierz ustawienia eksportu obrazu i kliknij przycisk Eksportuj wszystko, aby wyeksportować wyniki etykietowania.Pliki zostaną wyeksportowane do tego samego folderu z oryginalnymi obrazami. W przypadku analizy obszaru najpierw otwórz oryginalny obraz z paskiem skali w Fiji ImageJ, upewniając się, że obraz ma taki sam rozmiar i wymiar jak analizowane obrazy. Użyj narzędzia do zaznaczania linii, aby narysować linię o znanej długości, a następnie kliknij przycisk Analizuj i ustaw skalę.Następnie ustaw znaną odległość w polu Znana odległość. Ustaw odpowiednią jednostkę i kliknij przycisk Globalne. Aby zainstalować wtyczkę ilastik, kliknij Pomoc i aktualizacja, a następnie kliknij Zarządzaj witrynami aktualizacji w oknie aktualizatora ImageJ.Kliknij obok ilastik, Zamknij i Zastosuj zmiany. Po kilku minutach pojawi się okno informacyjne z informacją, że aktualizacja została pomyślnie zrealizowana. Kliknij przycisk OK i uruchom ponownie program ImageJ.Następnie kliknij Wtyczki, makra i Zainstaluj i wybierz licznik. ijm plik. Następnie kliknij przycisk Otwórz.Aby zakończyć analizę obszaru, kliknij Wtyczki i przewiń, aby wybrać ilastik. Wybierz opcję Importuj HDF5 i wybierz plik w formacie h5. Kliknij przycisk Otwórz i załaduj i zastosuj tabelę przeglądową.Następnie kliknij przycisk A na klawiaturze, a obszar pojawi się w oknie podsumowania jako obszar całkowity. W tym reprezentatywnym eksperymencie, cztery dni po wysiewie linii komórkowej przerzutowego raka płaskonabłonkowego krtani, matrycę dodano do utworzonych sferoid, jak pokazano, a inwazję monitorowano codziennie pod odwróconym mikroskopem. Po osadzeniu komórki w macierzy fibrynowej pochodzącej z ludzkiego mięśniaka zaczęły szybko atakować po jednym dniu i rozszerzały się do macierzy w ciągu następnych dwóch dni.Komórki w macierzy pochodzącej z mięsaka myszy nie wnikały w otaczającą macierz, zamiast tego tworząc asymetryczną strukturę. Komórki w kolagenie nieznacznie się zaostrzyły, ale z powodu kurczenia się matrycy analiza stała się trudna. W niektórych studniach sferoidy znikały nawet po trzech dniach.W tym miejscu przedstawiono ilościowe określenie inwazji pierwotnej i przerzutowej komórki raka płaskonabłonkowego krtani w ludzkiej macierzy fibrynowej pochodzącej z mięśniaka. Analiza żywych komórek inwazji sferoidalnej macierzy fibryny pochodzącej z mięśniaka ludzkiego ujawnia ruch komórek w pasmach w całej macierzy, za którym z czasem podążają inne komórki. Pamiętaj, aby uważać, aby nie przesunąć sferoidy z pozycji środkowej podczas dodawania matrycy do studzienek.Procedura ta może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób napromienianie i określone cząsteczki, takie jak leki przeciwnowotworowe, wpływają na inwazję. Komórki można utrwalić i wybarwić do kolejnych badań. W klasycznym modelu mięsaka myszy komórki głównie się namnażają, a aspekt inwazji jest minimalny.Ta ludzka matryca oparta na guzie indukuje inwazję, dzięki czemu badania nad hamowaniem są bardziej efektywne.

fully-human-tumor-based-matrix-three-dimensional-spheroid-invasion

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano test do ilościowego pomiaru inwazji indukowanej przez czynnik wzrostu transformującego (TGF)-β w trójwymiarowych żelach kolagenowych. Test ten wykorzystuje serię linii komórkowych MCF10A, które reprezentują różne stadia rozwoju raka piersi. Metodę tę można dostosować do użytku z innymi liniami komórkowymi oraz wykorzystać do badania innych potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów inwazji.

Test sferoidów do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β

Ten film opisuje technikę wykorzystania natywnej matrycy do badania inwazji komórek nowotworowych. Technika zastosowana w tym teście zapewnia możliwość oceny interakcji komórek nabłonkowo-mezenchymalnych w warunkach 3D bez konieczności stosowania syntetycznej lub obcej matrycy.

Test inwazji komórek nowotworowych: natywna metoda 3D oparta na macierzy in vitro do oceny interakcji komórek nabłonkowo-mezenchymalnych

Źródło: Guyon, J., et al. Model sferoidalny 3D glejaka. J. Vis. Exp. (2020)Film demonstruje generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych. Sferoidy są tworzone z ludzkich komórek nowotworowych mózgu i osadzone w macierzy kolagenowej. Komórki nowotworowe na obrzeżach sferoidy przyjmują fenotyp inwazyjny, wydzielając proteazy w celu degradacji kolagenu i posuwając się do inwazji na otaczającą macierz.

Generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Procesy rządzące inwazją raka pęcherza moczowego stanowią okazję do rozwoju biomarkerów i terapii. Poniżej przedstawiamy model inwazji raka pęcherza moczowego, który obejmuje hodowlę 3D sferoid guza, obrazowanie poklatkowe i mikroskopię konfokalną. Technika ta jest przydatna do definiowania cech procesu inwazyjnego oraz do badań przesiewowych środków terapeutycznych.

System hodowli komórkowych 3D do badania inwazji i oceny terapii w raku pęcherza moczowego

Celem tego protokołu jest stworzenie modelu 3D in vitro do badania różnicowania fibroblastów związanych z rakiem (CAF) w środowisku podobnym do masy guza, które mogą być adresowane w różnych systemach analizy, takich jak immunofluorescencja, analiza transkrypcyjna i obrazowanie żywych komórek.

Model sferoidalny 3D jako bardziej fizjologiczny system do różnicowania i inwazji fibroblastów związanych z rakiem w badaniach in vitro

Tutaj opisujemy łatwy w użyciu test na inwazję glejaka. Ten test jest odpowiedni dla komórek macierzystych podobnych do glejaka. Opisano również makro Fidżi do łatwego ilościowego określania inwazji, migracji i proliferacji.

Model sferoidalny 3D glejaka wielopostaciowego

Przedstawione podejście jednocześnie ocenia inwazję komórek rakowych w testach sferoidalnych 3D i cytotoksyczność limfocytów T. Sferoidy są generowane w odlewie wielodołkowym z agarozy bez rusztowań. Kohodowla i osadzanie w macierzy kolagenu typu I są wykonywane w tym samym urządzeniu, które pozwala monitorować inwazję komórek rakowych i cytotoksyczność za pośrednictwem limfocytów T.

Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D

Inwazja jest głównym zjawiskiem biologicznym w rozwoju i postępie raka. Na proces ten mają wpływ komórki nienowotworowe i składniki mikrośrodowiska guza. Celem pracy jest opisanie alternatywnej metody analizy inwazji komórek nowotworowych in vitro z wykorzystaniem kultur trójwymiarowych (3D).

Alternatywna strategia analizy inwazji komórek in vitro w kulturach 3D

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji pierwotnych ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów z sferoidą guza w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenu I, z możliwością porównania wpływu rozpuszczalnych i fizycznych właściwości mikrośrodowiska na inwazję komórek.

Test koinwazji sferoidów makrofagów i guzów

Poznaj trójwymiarowy test inwazji sferoidów wykorzystujący ludzką matrycę z mięśniaka gładkokomórkowego do badania progresji raka. Ta metoda umożliwia analizę inwazji komórek nowotworowych i testowanie leków z próbek pacjentów.

W pełni ludzka matryca oparta na guzie w trójwymiarowym teście inwazji sferoidów

Przeglądaj więcej filmów