W pełni ludzka matryca oparta na guzie w trójwymiarowym teście inwazji sferoidów
7 maja 2019
Mikrośrodowisko guza jest istotną częścią wzrostu i inwazji raka. Aby naśladować postęp raka, potrzebna jest biologicznie istotna ludzka matryca. Protokół ten wprowadza ulepszenie trójwymiarowego testu inwazji sferoidalnej in vitro poprzez zastosowanie ludzkiej matrycy opartej na mięśniaku gładkokomórkowym. Protokół wprowadza również komputerową analizę inwazji komórek.
Jak już wiemy, mikrośrodowisko guza jest istotną częścią wzrostu i inwazji raka. Aby naśladować postęp raka, potrzebujemy biologicznie istotnej ludzkiej matrycy nowotworowej. Jest to jedyny test inwazji in vitro oparty na ludzkiej macierzy nowotworowej.
W porównaniu z klasycznym testem sferoidalnym, metoda ta nie jest tak wrażliwa na temperaturę i nie wymaga transferu sferoidów. Technika ta jest odpowiednia dla próbek raka litego pochodzących od pacjenta, takich jak rak głowy i szyi, i może zostać rozszerzona na medycynę spersonalizowaną, w tym terapie chemoradioterapią. Ta ludzka matryca oparta na nowotworach była już wykorzystywana do kilku zastosowań, w tym do wysokoprzepustowych testów leków, analizy żywych komórek, gojenia się ran i testów transferowych.
Najbardziej wrażliwym technicznie krokiem jest postępowanie z fibrynogenem w metodzie, więc możesz najpierw przećwiczyć ten krok z pustymi studzienkami. Ważne jest, aby pokazać prawidłowe obchodzenie się z macierzą i łatwo jest ją przeanalizować, pokazując metodę wizualnie. W celu wytworzenia sferoidy wielokomórkowego guza, dozuj jeden razy 10 do trzecich komórek z linii komórkowej będącej przedmiotem zainteresowania w 50 mikrolitrach kompletnej pożywki do każdej studzienki 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie o bardzo niskim mocowaniu.
Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórek o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na cztery dni, zanim wizualnie potwierdzisz tworzenie się sferoidów guza za pomocą odwróconego mikroskopu. Aby skonfigurować trójwymiarowy test inwazji sferoidów, rozmrozić matrycę pochodzącą z ludzkiego mięśniaka na lodzie i rozmrozić roztwór podstawowy fibrynogenu w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy odczynniki się ogrzeją, wymieszaj ze sobą odpowiednie objętości kompletnej pożywki, matrycy pochodzącej z mięśniaków ludzkich, trombiny, aprotyniny i fibrynogenu, dodając fibrynogen tuż przed dozowaniem mieszaniny matrycy do komórek.
Natychmiast dodaj 50 mikrolitrów powstałego żelu do każdej studzienki płytki hodowli sferoidów, kierując końcówkę w kierunku wewnętrznej ścianki każdej studzienki i pipetując zwalniając bez przesuwania sferoidy od środka studzienki. Ponieważ fibrynogen zaczyna żelować po kilku minutach, wymaga solidnego, ale precyzyjnego pipetowania wstecznego i obróbki tylko kilku studzienek na raz. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 30 minut, aby umożliwić zestalenie się żelu fibrynowego pochodzącego z mięśniaka ludzkiego, a następnie delikatnie dodaj 100 mikrolitrów kompletnej pożywki do górnej części każdego żelu.
Następnie wyobraź sobie codzienną inwazję sferoidów. Aby przeprowadzić segmentację obrazu za pomocą ilastik, otwórz oprogramowanie do klasyfikacji i segmentacji obrazów typu open source i wybierz przepływ pracy Klasyfikacja pikseli. Zapisz projekt ilastik na komputerze.
Piksele zostaną sklasyfikowane na podstawie adnotacji dokonanych przez użytkownika. Kliknij opcję Dane wejściowe i Dodaj nowy, aby wybrać obrazy do analizy. Aby wybrać element, kliknij opcję Wybór elementu i wybierz obiekty.
Kliknij odpowiednie pola, aby wybrać interesujące Cię obiekty. Wybrane pola zmienią kolor na zielony. W przypadku szkolenia kliknij opcję Szkolenie.
W sekcji Szkolenie powinny znajdować się dwie etykiety, Etykieta 1 i Etykieta 2. Zaznacz tło jedną z etykiet i oznacz komórki drugą etykietą. Gdy wszystkie komórki i tło na pierwszym obrazie zostaną oznaczone, wybierz następny obraz z bieżącego widoku, aby kontynuować oznaczanie komórek i tła, aż 10% obrazów zostanie zaznaczonych.
Następnie wybierz opcję Live Update, aby przeanalizować wszystkie obrazy. Po zakończeniu szkolenia i przeanalizowaniu wszystkich obrazów przez ilastik kliknij opcję Prediction Export (Eksport przewidywania) i wybierz opcję Simple Segmentation from Source (Prosta segmentacja ze źródła). Następnie wybierz żądany format pliku wyjściowego z Wybierz ustawienia eksportu obrazu i kliknij przycisk Eksportuj wszystko, aby wyeksportować wyniki etykietowania.
Pliki zostaną wyeksportowane do tego samego folderu z oryginalnymi obrazami. W przypadku analizy obszaru najpierw otwórz oryginalny obraz z paskiem skali w Fiji ImageJ, upewniając się, że obraz ma taki sam rozmiar i wymiar jak analizowane obrazy. Użyj narzędzia do zaznaczania linii, aby narysować linię o znanej długości, a następnie kliknij przycisk Analizuj i ustaw skalę.
Następnie ustaw znaną odległość w polu Znana odległość. Ustaw odpowiednią jednostkę i kliknij przycisk Globalne. Aby zainstalować wtyczkę ilastik, kliknij Pomoc i aktualizacja, a następnie kliknij Zarządzaj witrynami aktualizacji w oknie aktualizatora ImageJ.
Kliknij obok ilastik, Zamknij i Zastosuj zmiany. Po kilku minutach pojawi się okno informacyjne z informacją, że aktualizacja została pomyślnie zrealizowana. Kliknij przycisk OK i uruchom ponownie program ImageJ.
Następnie kliknij Wtyczki, makra i Zainstaluj i wybierz licznik. ijm plik. Następnie kliknij przycisk Otwórz.
Aby zakończyć analizę obszaru, kliknij Wtyczki i przewiń, aby wybrać ilastik. Wybierz opcję Importuj HDF5 i wybierz plik w formacie h5. Kliknij przycisk Otwórz i załaduj i zastosuj tabelę przeglądową.
Następnie kliknij przycisk A na klawiaturze, a obszar pojawi się w oknie podsumowania jako obszar całkowity. W tym reprezentatywnym eksperymencie, cztery dni po wysiewie linii komórkowej przerzutowego raka płaskonabłonkowego krtani, matrycę dodano do utworzonych sferoid, jak pokazano, a inwazję monitorowano codziennie pod odwróconym mikroskopem. Po osadzeniu komórki w macierzy fibrynowej pochodzącej z ludzkiego mięśniaka zaczęły szybko atakować po jednym dniu i rozszerzały się do macierzy w ciągu następnych dwóch dni.
Komórki w macierzy pochodzącej z mięsaka myszy nie wnikały w otaczającą macierz, zamiast tego tworząc asymetryczną strukturę. Komórki w kolagenie nieznacznie się zaostrzyły, ale z powodu kurczenia się matrycy analiza stała się trudna. W niektórych studniach sferoidy znikały nawet po trzech dniach.
W tym miejscu przedstawiono ilościowe określenie inwazji pierwotnej i przerzutowej komórki raka płaskonabłonkowego krtani w ludzkiej macierzy fibrynowej pochodzącej z mięśniaka. Analiza żywych komórek inwazji sferoidalnej macierzy fibryny pochodzącej z mięśniaka ludzkiego ujawnia ruch komórek w pasmach w całej macierzy, za którym z czasem podążają inne komórki. Pamiętaj, aby uważać, aby nie przesunąć sferoidy z pozycji środkowej podczas dodawania matrycy do studzienek.
Procedura ta może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób napromienianie i określone cząsteczki, takie jak leki przeciwnowotworowe, wpływają na inwazję. Komórki można utrwalić i wybarwić do kolejnych badań. W klasycznym modelu mięsaka myszy komórki głównie się namnażają, a aspekt inwazji jest minimalny.
Ta ludzka matryca oparta na guzie indukuje inwazję, dzięki czemu badania nad hamowaniem są bardziej efektywne.
Przegląd
To badanie przedstawia nowy in vitro trójwymiarowy test inwazji sferycznej wykorzystujący ludzką matrycę pochodzącą z mięśniaka macicy, poprawiającą naśladownictwo progresji karcinomu. Metoda ta pozwala na lepszą analizę inwazji komórek nowotworowych i jest zastosowana do próbek raka stałego pochodzących od pacjenta.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia nowotworów
- Mikrośrodowisko nowotworu
- Testy in vitro
Tło
- Mikrosrodowisko nowotworu odgrywa krytyczną rolę w wzroście i inwazji raka.
- Biologicznie istotna ludzka matryca nowotworowa jest niezbędna do dokładnego modelowania progresji karcinomu.
- Ta metoda jest mniej wrażliwa na temperaturę w porównaniu z klasycznymi testami sferycznymi.
- Jest odpowiednia do zastosowań w medycynie spersonalizowanej, w tym do terapii chemioradiologicznych.
Cel badania
- Opracowanie testu opartego na ludzkiej matrycy nowotworowej do badania inwazji komórek nowotworowych.
- Dostarczenie protokołu, który minimalizuje wyzwania techniczne związane z tradycyjnymi metodami.
- Umożliwienie wysokowydajnych testów leków i analizy żywych komórek.
Zastosowane metody
- Generacja wielokomórkowych sferycznych guzów nowotworowych w płytkach o ultraniskim przyleganiu.
- Przygotowanie ludzkiej matrycy pochodzącej z mięśniaka i fibrynogenu do testu inwazji.
- Codzienna obrazowanie inwazji sferycznej za pomocą mikroskopu odwróconego.
- Analiza obrazów przy użyciu ilastik do segmentacji i ilościowej oceny obszaru.
Główne wyniki
- Komórki w ludzkiej matrycy pochodzącej z mięśniaka inwazowały szybko, co wykazało skuteczne modelowanie zachowania guza.
- Porównanie z innymi matrycami wykazało różne wzorce inwazji, podkreślając zalety matrycy pochodzenia ludzkiego.
- Analiza żywych komórek ujawniła dynamiczny ruch komórek i inwazję w czasie.
- Metoda ta może być dostosowana do badania efektów różnych leczeń na inwazję guza.
Wnioski
- Matryca pochodząca z ludzkiego mięśniaka zapewnia solidną platformę do badania inwazji komórek nowotworowych.
- Ten test może ułatwić badania nad interwencjami terapeutycznymi w raku.
- Właściwe prowadzenie i metodologia są kluczowe dla pomyślnej implementacji testu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This assay addresses a critical gap in preclinical cancer research by providing a human tumor-derived matrix that better recapitulates the in vivo microenvironment compared to animal-derived alternatives. It enables more predictive modeling of carcinoma invasion, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The platform is suitable for screening applications and translational continuity, particularly for head and neck carcinoma and patient-derived samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by enabling functional validation of targets in a human-relevant extracellular matrix context.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity through direct observation of invasion phenotypes in a biologically pertinent system.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that modulate invasion in a model predictive of human tumor behavior.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible 3D system for quantitative assessment of compound effects on cell invasion.
- Operational Value: Enables high-throughput drug testing with minimal technical variability due to reduced temperature sensitivity and no spheroid transfer requirement.
- Scalability: Compatible with 96-well ultra-low attachment plates, supporting assay miniaturization and multi-condition screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses human leiomyoma-derived matrix to bridge discovery findings with preclinical validation in a disease-relevant system.
- Biomarker Alignment: Facilitates live-cell analysis of invasion dynamics, enabling correlation with molecular signatures or treatment responses.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying invasion inhibition, a key phenotypic endpoint in metastasis prevention.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for metastasis-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of invasion drivers and pathway modifiers in a human tumor microenvironment context.
- Screening: Delivers quantitative, imaging-based readouts suitable for automated analysis and compound profiling.
- Analytics: Generates invasion area measurements via ilastik and ImageJ, enabling statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling a key step in metastasis using a human-derived matrix.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform applicable across solid cancer types and therapeutic modalities, including chemoradiation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by reducing reliance on non-human matrices that poorly mimic human tumor stroma.
- Operational Value: Improves reproducibility and standardization through a defined matrix preparation protocol and imaging workflow.
- Strategic Value: Increases capital efficiency by improving early prediction of clinical translatability, reducing late-stage failure due to poor metastasis modeling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads based on invasion inhibition potency in a human-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture, matrix handling, and sterile technique for fibrin gel preparation.
- Dependent on access to inverted microscopes, ilastik, and Fiji ImageJ for imaging and analysis.
- Necessitates cross-team standardization of spheroid formation and matrix dispensing to avoid positional artifacts.
- Adaptation to other model systems requires validation of matrix compatibility and invasion kinetics.
- Practical limitation: Fibrinogen initiates rapid gelation, demanding precise, timed pipetting to maintain spheroid integrity.
