W pełni ludzka matryca oparta na guzie w trójwymiarowym teście inwazji sferoidów

Jak już wiemy, mikrośrodowisko guza jest istotną częścią wzrostu i inwazji raka. Aby naśladować postęp raka, potrzebujemy biologicznie istotnej ludzkiej matrycy nowotworowej. Jest to jedyny test inwazji in vitro oparty na ludzkiej macierzy nowotworowej.

W porównaniu z klasycznym testem sferoidalnym, metoda ta nie jest tak wrażliwa na temperaturę i nie wymaga transferu sferoidów. Technika ta jest odpowiednia dla próbek raka litego pochodzących od pacjenta, takich jak rak głowy i szyi, i może zostać rozszerzona na medycynę spersonalizowaną, w tym terapie chemoradioterapią. Ta ludzka matryca oparta na nowotworach była już wykorzystywana do kilku zastosowań, w tym do wysokoprzepustowych testów leków, analizy żywych komórek, gojenia się ran i testów transferowych.

Najbardziej wrażliwym technicznie krokiem jest postępowanie z fibrynogenem w metodzie, więc możesz najpierw przećwiczyć ten krok z pustymi studzienkami. Ważne jest, aby pokazać prawidłowe obchodzenie się z macierzą i łatwo jest ją przeanalizować, pokazując metodę wizualnie. W celu wytworzenia sferoidy wielokomórkowego guza, dozuj jeden razy 10 do trzecich komórek z linii komórkowej będącej przedmiotem zainteresowania w 50 mikrolitrach kompletnej pożywki do każdej studzienki 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie o bardzo niskim mocowaniu.

Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórek o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na cztery dni, zanim wizualnie potwierdzisz tworzenie się sferoidów guza za pomocą odwróconego mikroskopu. Aby skonfigurować trójwymiarowy test inwazji sferoidów, rozmrozić matrycę pochodzącą z ludzkiego mięśniaka na lodzie i rozmrozić roztwór podstawowy fibrynogenu w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy odczynniki się ogrzeją, wymieszaj ze sobą odpowiednie objętości kompletnej pożywki, matrycy pochodzącej z mięśniaków ludzkich, trombiny, aprotyniny i fibrynogenu, dodając fibrynogen tuż przed dozowaniem mieszaniny matrycy do komórek.

Natychmiast dodaj 50 mikrolitrów powstałego żelu do każdej studzienki płytki hodowli sferoidów, kierując końcówkę w kierunku wewnętrznej ścianki każdej studzienki i pipetując zwalniając bez przesuwania sferoidy od środka studzienki. Ponieważ fibrynogen zaczyna żelować po kilku minutach, wymaga solidnego, ale precyzyjnego pipetowania wstecznego i obróbki tylko kilku studzienek na raz. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 30 minut, aby umożliwić zestalenie się żelu fibrynowego pochodzącego z mięśniaka ludzkiego, a następnie delikatnie dodaj 100 mikrolitrów kompletnej pożywki do górnej części każdego żelu.

Następnie wyobraź sobie codzienną inwazję sferoidów. Aby przeprowadzić segmentację obrazu za pomocą ilastik, otwórz oprogramowanie do klasyfikacji i segmentacji obrazów typu open source i wybierz przepływ pracy Klasyfikacja pikseli. Zapisz projekt ilastik na komputerze.

Piksele zostaną sklasyfikowane na podstawie adnotacji dokonanych przez użytkownika. Kliknij opcję Dane wejściowe i Dodaj nowy, aby wybrać obrazy do analizy. Aby wybrać element, kliknij opcję Wybór elementu i wybierz obiekty.

Kliknij odpowiednie pola, aby wybrać interesujące Cię obiekty. Wybrane pola zmienią kolor na zielony. W przypadku szkolenia kliknij opcję Szkolenie.

W sekcji Szkolenie powinny znajdować się dwie etykiety, Etykieta 1 i Etykieta 2. Zaznacz tło jedną z etykiet i oznacz komórki drugą etykietą. Gdy wszystkie komórki i tło na pierwszym obrazie zostaną oznaczone, wybierz następny obraz z bieżącego widoku, aby kontynuować oznaczanie komórek i tła, aż 10% obrazów zostanie zaznaczonych.

Następnie wybierz opcję Live Update, aby przeanalizować wszystkie obrazy. Po zakończeniu szkolenia i przeanalizowaniu wszystkich obrazów przez ilastik kliknij opcję Prediction Export (Eksport przewidywania) i wybierz opcję Simple Segmentation from Source (Prosta segmentacja ze źródła). Następnie wybierz żądany format pliku wyjściowego z Wybierz ustawienia eksportu obrazu i kliknij przycisk Eksportuj wszystko, aby wyeksportować wyniki etykietowania.

Pliki zostaną wyeksportowane do tego samego folderu z oryginalnymi obrazami. W przypadku analizy obszaru najpierw otwórz oryginalny obraz z paskiem skali w Fiji ImageJ, upewniając się, że obraz ma taki sam rozmiar i wymiar jak analizowane obrazy. Użyj narzędzia do zaznaczania linii, aby narysować linię o znanej długości, a następnie kliknij przycisk Analizuj i ustaw skalę.

Następnie ustaw znaną odległość w polu Znana odległość. Ustaw odpowiednią jednostkę i kliknij przycisk Globalne. Aby zainstalować wtyczkę ilastik, kliknij Pomoc i aktualizacja, a następnie kliknij Zarządzaj witrynami aktualizacji w oknie aktualizatora ImageJ.

Kliknij obok ilastik, Zamknij i Zastosuj zmiany. Po kilku minutach pojawi się okno informacyjne z informacją, że aktualizacja została pomyślnie zrealizowana. Kliknij przycisk OK i uruchom ponownie program ImageJ.

Następnie kliknij Wtyczki, makra i Zainstaluj i wybierz licznik. ijm plik. Następnie kliknij przycisk Otwórz.

Aby zakończyć analizę obszaru, kliknij Wtyczki i przewiń, aby wybrać ilastik. Wybierz opcję Importuj HDF5 i wybierz plik w formacie h5. Kliknij przycisk Otwórz i załaduj i zastosuj tabelę przeglądową.

Następnie kliknij przycisk A na klawiaturze, a obszar pojawi się w oknie podsumowania jako obszar całkowity. W tym reprezentatywnym eksperymencie, cztery dni po wysiewie linii komórkowej przerzutowego raka płaskonabłonkowego krtani, matrycę dodano do utworzonych sferoid, jak pokazano, a inwazję monitorowano codziennie pod odwróconym mikroskopem. Po osadzeniu komórki w macierzy fibrynowej pochodzącej z ludzkiego mięśniaka zaczęły szybko atakować po jednym dniu i rozszerzały się do macierzy w ciągu następnych dwóch dni.

Komórki w macierzy pochodzącej z mięsaka myszy nie wnikały w otaczającą macierz, zamiast tego tworząc asymetryczną strukturę. Komórki w kolagenie nieznacznie się zaostrzyły, ale z powodu kurczenia się matrycy analiza stała się trudna. W niektórych studniach sferoidy znikały nawet po trzech dniach.

W tym miejscu przedstawiono ilościowe określenie inwazji pierwotnej i przerzutowej komórki raka płaskonabłonkowego krtani w ludzkiej macierzy fibrynowej pochodzącej z mięśniaka. Analiza żywych komórek inwazji sferoidalnej macierzy fibryny pochodzącej z mięśniaka ludzkiego ujawnia ruch komórek w pasmach w całej macierzy, za którym z czasem podążają inne komórki. Pamiętaj, aby uważać, aby nie przesunąć sferoidy z pozycji środkowej podczas dodawania matrycy do studzienek.

Procedura ta może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób napromienianie i określone cząsteczki, takie jak leki przeciwnowotworowe, wpływają na inwazję. Komórki można utrwalić i wybarwić do kolejnych badań. W klasycznym modelu mięsaka myszy komórki głównie się namnażają, a aspekt inwazji jest minimalny.

Ta ludzka matryca oparta na guzie indukuje inwazję, dzięki czemu badania nad hamowaniem są bardziej efektywne.