Przeszczepienie chemogenetycznie zmodyfikowanych progenitorów interneuronów korowych do wczesnych postnatalnych mózgów myszy
August 26th, 2019
Tutaj prezentujemy protokół, zaprojektowany do wykorzystania narzędzi chemogenetycznych do manipulowania aktywnością komórek progenitorowych interneuronów korowych przeszczepionych do kory mózgowej myszy po urodzeniu.
Dzięki tej metodzie możemy badać wpływ wewnętrznej aktywności na dojrzewanie prekursorów interneuronów korowych. Technika ta zapewnia skuteczny sposób celowania i manipulowania właściwościami komórkowymi komórek progenitorowych interneuronów korowych, który jest dostępny dla większości społeczności naukowej. Protokół ten wiąże się ze skrupulatnym obchodzeniem się z próbkami i sprzętem, a najlepiej można go docenić poprzez demonstrację wizualną.
Za pomocą wodoodpornego pisaka narysuj prostą linię w poprzek środkowej dolnej części dolnej powierzchni sześciu 35-milimetrowych szalek Petriego. Dodaj 10 mililitrów płynnej 4% agarozy o niskiej żelowości w PBS do dwóch z 35-milimetrowych szalek Petriego i umieść trzy do czterech wypreparowanych mózgów w agarozie z opuszkami węchowymi skierowanymi w dół na naczynie w poprzek linii prostej, pozostawiając od trzech do pięciu milimetrów przestrzeni między każdą próbką. Kiedy wszystkie mózgi zostaną osadzone, umieść szalki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby agaroza mogła się zestalić i pokroić trzy mózgi w jeden blok agarozy, pozostawiając około trzech milimetrów żelu wokół krawędzi próbek.
Przyklej blok do powierzchni podstawy mikrotomu i za pomocą ostrza chirurgicznego przeciąć całą dolną część bloku między każdą próbką tkanki, aby uzyskać trzy niezależne bloki. Następnie za pomocą mikrotomu z wibrującymi ostrzami pokrój bloki w lodowatym roztworze Krebsa na plastry o grubości 250 mikrometrów, używając wygiętej płaskiej mikroszpatułki, aby zebrać tylko te plastry, które zawierają wypukłości przyśrodkowego lub ogonowego. Następnie umieść każdą sekcję na indywidualnych membranach filtracyjnych o średnicy 13 mikrometrów i wielkości porów 8 mikrometrów unoszących się na minimalnym niezbędnym podłożu w indywidualnych polistyrenowych naczyniach do hodowli narządów.
Po uzyskaniu wszystkich skrawków umieść szalki w inkubatorze do hodowli tkankowych z dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną godzinę. Przed ogniskowym wstrzyknięciem DNA umieść kolumny agarozowe o średnicy jednego milimetra i długości 10 milimetrów przedziurskane szklaną pipetą o długości 225 milimetrów i pojemności dwóch mililitrów w lodowatym roztworze Krebsa. Za pomocą ostrza chirurgicznego wytnij jeden mniejszy kawałek agarozy, aby zmieścił się na powierzchni elektrody elektroporacyjnej i jeden większy kawałek, który zostanie użyty jako podstawa do ogniskowych zastrzyków DNA.
Następnie umieść bloki agarozy w lodowatym roztworze Krebsa. Do wstrzykiwania należy zmieszać DNA wektora ekspresyjnego i kontrolnego w stężeniu jednego mikrograma na mikrolitr dla każdego wektora i dodać szybki zielony roztwór podstawowy w rozcieńczeniu od jednego do 10. Napełnij wyciągniętą szklaną mikropipetę o średnicy wewnętrznej 0,5 milimetra i średnicy zewnętrznej o średnicy zewnętrznej 10 mikrolitrami mieszaniny DNA i załaduj mikropipetę do pneumatycznego wtryskiwacza PicoPump.
Umieść większy blok agarozy pod mikroskopem stereoskopowym i umieść plasterek do wstrzyknięcia na kawałku agarozy. Następnie wstrzyknij objętości od 25 do 50 nanolitrów do wybranego obszaru wypukłości przyśrodkowego zwoju lub wydrążenia ogonowego wycinka. Natychmiast po wstrzyknięciu umieścić mały blok agarozy na elektrodzie szalki Petriego i za pomocą mikroszpatułki z płaskim końcem przymocować kolumnę agarozową do ruchomej elektrody osłonowej.
Przenieś wstrzyknięty plasterek wraz z membraną nośną na blok agarozy i umieść górną elektrodę z kolumną agarozy na wybranym obszarze plasterka. Następnie naelektryzuj obszar dwoma pięciomilisekundowymi impulsami o napięciu 125 woltów w odstępie 500 milisekund. Po elektroporacji umieść plaster wraz z membraną podtrzymującą z powrotem w naczyniu do przechowywania i włóż szalkę z powrotem do inkubatora kultur tkankowych.
Po upływie jednej godziny należy zastąpić minimalną pożywkę niezbędną pożywką podstawową odpowiednią dla pierwotnych kultur neuronalnych i umieścić plastry z powrotem w inkubatorze na noc. W tych eksperymentach z elektroporacją około 50% neuronów GFP dodatnich wykazywało współekspresję wstrzykniętego białka RFP dodatniego, a zatem populacja GFP dodatnia RFP służyła jako wewnętrzna kontrola wpływu wstrzykniętych ligandów DNA. Podawanie klozapiny i tlenku selektywnie zwiększa aktywność transfekowanych komórek RFP dodatnich, o czym świadczy ekspresja białka zależnego od aktywności, c-Fos, w tych nowo narodzonych skrawkach tkanki koronalnej.
Leczenie klozapiną i tlenkiem powoduje również zwiększenie odsetka komórek RFP-dodatnich GFP w stosunku do liczby komórek GFP-dodatnich RFP-ujemnych w porównaniu z rodzeństwem z miotu podawanym na nośniku. Procedura ta może być wykorzystana do badania wpływu przeszczepionych interneuronów z modulacją aktywności na plastyczność krążenia i funkcjonowanie mózgu gospodarza.
Przegląd
To badanie przedstawia protokół manipulacji aktywnością progenitorów interneuronów korowych za pomocą narzędzi chemogenetycznych u wczesnych myszy postnatalnych. Metoda pozwala badaczom na zbadanie wpływu aktywności wewnętrznej na dojrzewanie tych prekursorów interneuronów, przyczyniając się do głębszego zrozumienia funkcji kory.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Rozwój kory
- Chemogenetyka
Tło
- Interneurony korowe odgrywają kluczowe role w funkcjonowaniu mózgu.
- Zrozumienie ich dojrzewania może przyczynić się do poszerzenia wiedzy w dziedzinie neurologii.
- Chemogenetyka oferuje precyzyjną kontrolę aktywności neuronów.
- Myszy postnatalne służą jako odpowiednie modele do badania rozwoju kory.
Cel badania
- Manipulowanie aktywnością przeszczepionych progenitorów interneuronów korowych.
- Badanie wpływu aktywności wewnętrznej na dojrzewanie interneuronów.
- Dostarczenie szeroko dostępnego protokołu dla badaczy.
Zastosowane metody
- Ex vivo kawałki mózgu zostały przygotowane z wczesnych myszy postnatalnych do manipulacji.
- Model biologiczny obejmował przeszczepione progenitory interneuronów korowych.
- Kluczowymi krokami było osadzanie tkanki w agarose i ukierunkowane wstrzyknięcie DNA, po którym następowało elektroporacja.
- Po manipulacji, kawałki były hodowane i analizowane pod kątem odpowiedzi aktywności neuronów.
Główne wyniki
- Około 50% neuronów wykazało współwystępowanie GFP i RFP, co wskazuje na pomyślną manipulację.
- Leczenia klozapiną i tlenkiem zwiększyły aktywność komórek pozytywnych na RFP, z wzrostem ekspresji c-Fos.
- Ta metoda zapewnia wgląd w sposób, w jaki przeszczepione interneurony wpływają na funkcjonowanie mózgu gospodarza.
Wnioski
- To badanie demonstruje skuteczny protokół manipulacji progenitorów interneuronów, umożliwiając dalsze badania ich ról w plastyczności korowej.
- Zrozumienie mechanizmów interneuronów modulowanych aktywnością może poszerzyć wiedzę w dziedzinie neuronauki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Genetic and chemogenetic manipulation of cortical interneuron progenitors enables precise interrogation of neuronal maturation mechanisms, supporting early-stage target validation in neurodevelopmental research. This approach provides predictive confidence for understanding how intrinsic activity and environmental factors influence integration and function of inhibitory circuits. The protocol's ability to dissect gene-environment interactions in a controlled, transplantable system positions it as a valuable tool for de-risking neurobiological targets in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of interneuron maturation and integration in disease-relevant neural circuits.
- Supports mechanistic de-risking by isolating genetic and environmental contributions to neuronal development.
- Facilitates predictive assessment of target modulation effects on inhibitory network assembly.
Screening & Assay Development
- Provides a validated system for quantitative measurement of neuronal activity and gene expression in engineered progenitors.
- Enables reproducible manipulation and tracking of transplanted cell populations using fluorescent reporters.
- Supports assay standardization for evaluating chemogenetic tool efficacy and specificity in neural tissue.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling in situ analysis of activity-dependent protein expression (e.g., c-Fos).
- Offers continuity from discovery to preclinical validation by modeling integration of engineered cells in host brain circuits.
- De-risks advancement decisions by providing quantitative readouts of graft function and host response.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery and preclinical research by enabling genetic manipulation, transplantation, and functional analysis of interneuron progenitors in a single workflow.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on gene-environment interactions in interneuron maturation.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for evaluating chemogenetic modulation in neural tissue.
- Analytics: Provides molecular and cellular readouts (e.g., co-expression of fluorescent proteins, c-Fos induction) for comparative analysis.
- Translational Research: Models integration and function of engineered cells in vivo, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for testing diverse genetic constructs and activity modulators in neural progenitors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in neuronal development.
- Operational Value: Standardizes manipulation and analysis of neural progenitors for scalable, reproducible studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing robust, quantitative data on engineered cell integration and function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ex vivo electroporation, transplantation, and chemogenetic manipulation of neural tissue.
- Demands access to specialized instrumentation for tissue sectioning, microinjection, and fluorescence imaging.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different interneuron subtypes or host models.
- Potential limitations include variability in graft integration and chemogenetic tool specificity.
