Przeszczepienie chemogenetycznie zmodyfikowanych progenitorów interneuronów korowych do wczesnych postnatalnych mózgów myszy

Dzięki tej metodzie możemy badać wpływ wewnętrznej aktywności na dojrzewanie prekursorów interneuronów korowych. Technika ta zapewnia skuteczny sposób celowania i manipulowania właściwościami komórkowymi komórek progenitorowych interneuronów korowych, który jest dostępny dla większości społeczności naukowej. Protokół ten wiąże się ze skrupulatnym obchodzeniem się z próbkami i sprzętem, a najlepiej można go docenić poprzez demonstrację wizualną.

Za pomocą wodoodpornego pisaka narysuj prostą linię w poprzek środkowej dolnej części dolnej powierzchni sześciu 35-milimetrowych szalek Petriego. Dodaj 10 mililitrów płynnej 4% agarozy o niskiej żelowości w PBS do dwóch z 35-milimetrowych szalek Petriego i umieść trzy do czterech wypreparowanych mózgów w agarozie z opuszkami węchowymi skierowanymi w dół na naczynie w poprzek linii prostej, pozostawiając od trzech do pięciu milimetrów przestrzeni między każdą próbką. Kiedy wszystkie mózgi zostaną osadzone, umieść szalki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby agaroza mogła się zestalić i pokroić trzy mózgi w jeden blok agarozy, pozostawiając około trzech milimetrów żelu wokół krawędzi próbek.

Przyklej blok do powierzchni podstawy mikrotomu i za pomocą ostrza chirurgicznego przeciąć całą dolną część bloku między każdą próbką tkanki, aby uzyskać trzy niezależne bloki. Następnie za pomocą mikrotomu z wibrującymi ostrzami pokrój bloki w lodowatym roztworze Krebsa na plastry o grubości 250 mikrometrów, używając wygiętej płaskiej mikroszpatułki, aby zebrać tylko te plastry, które zawierają wypukłości przyśrodkowego lub ogonowego. Następnie umieść każdą sekcję na indywidualnych membranach filtracyjnych o średnicy 13 mikrometrów i wielkości porów 8 mikrometrów unoszących się na minimalnym niezbędnym podłożu w indywidualnych polistyrenowych naczyniach do hodowli narządów.

Po uzyskaniu wszystkich skrawków umieść szalki w inkubatorze do hodowli tkankowych z dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną godzinę. Przed ogniskowym wstrzyknięciem DNA umieść kolumny agarozowe o średnicy jednego milimetra i długości 10 milimetrów przedziurskane szklaną pipetą o długości 225 milimetrów i pojemności dwóch mililitrów w lodowatym roztworze Krebsa. Za pomocą ostrza chirurgicznego wytnij jeden mniejszy kawałek agarozy, aby zmieścił się na powierzchni elektrody elektroporacyjnej i jeden większy kawałek, który zostanie użyty jako podstawa do ogniskowych zastrzyków DNA.

Następnie umieść bloki agarozy w lodowatym roztworze Krebsa. Do wstrzykiwania należy zmieszać DNA wektora ekspresyjnego i kontrolnego w stężeniu jednego mikrograma na mikrolitr dla każdego wektora i dodać szybki zielony roztwór podstawowy w rozcieńczeniu od jednego do 10. Napełnij wyciągniętą szklaną mikropipetę o średnicy wewnętrznej 0,5 milimetra i średnicy zewnętrznej o średnicy zewnętrznej 10 mikrolitrami mieszaniny DNA i załaduj mikropipetę do pneumatycznego wtryskiwacza PicoPump.

Umieść większy blok agarozy pod mikroskopem stereoskopowym i umieść plasterek do wstrzyknięcia na kawałku agarozy. Następnie wstrzyknij objętości od 25 do 50 nanolitrów do wybranego obszaru wypukłości przyśrodkowego zwoju lub wydrążenia ogonowego wycinka. Natychmiast po wstrzyknięciu umieścić mały blok agarozy na elektrodzie szalki Petriego i za pomocą mikroszpatułki z płaskim końcem przymocować kolumnę agarozową do ruchomej elektrody osłonowej.

Przenieś wstrzyknięty plasterek wraz z membraną nośną na blok agarozy i umieść górną elektrodę z kolumną agarozy na wybranym obszarze plasterka. Następnie naelektryzuj obszar dwoma pięciomilisekundowymi impulsami o napięciu 125 woltów w odstępie 500 milisekund. Po elektroporacji umieść plaster wraz z membraną podtrzymującą z powrotem w naczyniu do przechowywania i włóż szalkę z powrotem do inkubatora kultur tkankowych.

Po upływie jednej godziny należy zastąpić minimalną pożywkę niezbędną pożywką podstawową odpowiednią dla pierwotnych kultur neuronalnych i umieścić plastry z powrotem w inkubatorze na noc. W tych eksperymentach z elektroporacją około 50% neuronów GFP dodatnich wykazywało współekspresję wstrzykniętego białka RFP dodatniego, a zatem populacja GFP dodatnia RFP służyła jako wewnętrzna kontrola wpływu wstrzykniętych ligandów DNA. Podawanie klozapiny i tlenku selektywnie zwiększa aktywność transfekowanych komórek RFP dodatnich, o czym świadczy ekspresja białka zależnego od aktywności, c-Fos, w tych nowo narodzonych skrawkach tkanki koronalnej.

Leczenie klozapiną i tlenkiem powoduje również zwiększenie odsetka komórek RFP-dodatnich GFP w stosunku do liczby komórek GFP-dodatnich RFP-ujemnych w porównaniu z rodzeństwem z miotu podawanym na nośniku. Procedura ta może być wykorzystana do badania wpływu przeszczepionych interneuronów z modulacją aktywności na plastyczność krążenia i funkcjonowanie mózgu gospodarza.