Name: Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w prekursory interneuronów korowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj metodę różnicowania mysich embrionalnych komórek macierzystych w prekursory interneuronów korowych z wykorzystaniem modyfikowanej techniki embryoid body-to-monolayer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Qing Xu za opracowanie linii mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP, a także Jennifer Tyson, Asif Maroof i Timowi Petrosowi za ich wczesną pracę nad rozwojem tego protokołu. Dziękujemy również rdzeniowi cytometrii przepływowej CHOP za pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez NIH R01 MH066912 (SA) i F30 MH105045-02 (DT).

UWAGA: Linia mESC z podwójnym reporterem opisana w tym protokole jest dostępna na żądanie (sande@mail.med.upenn.edu).
1. Przygotowanie mediów
UWAGA: Podgrzej wszystkie podłoża do 37 °C przed użyciem w hodowli komórkowej.
<ol>
	<li>Pożywka z mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) (do przygotowania 500 ml)
	<ol>
		<li>Dodaj 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 449 ml zmodyfikowanej pożywki Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) i przefiltruj przez 500 ml 0,22 μm filtra porów.</li>
		<li>Dodać 1 ml środka przeciwbakteryjnego (50 mg/ml) po filtracji. Przechowywać media w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca lub podwielokrotności i przechowywać w temperaturze ≤ -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pożywka N2 (do przygotowania 500 ml)
	<ol>
		<li>Dodaj 5 ml L-alaniny-L-glutaminy (100x) i 500 μl 2-merkaptoetanolu (55 mM) do 489,5 ml DMEM: Mieszanka składników odżywczych F-12 (DMEM/F-12) i przefiltruj przez 500 ml 0,22 μm filtra porów.</li>
		<li>Dodać 1 ml środka przeciwdrobnoustrojowego (50 mg/ml) i 5 ml suplementu N2 B po filtracji. Przechowuj nośnik w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do 1 miesiąca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pożywka bez surowicy (KSR) (do przygotowania 500 ml)
	<ol>
		<li>Dodaj 75 ml pożywki bez surowicy, 5 ml L-glutaminy (100x), 5 ml aminokwasów endogennych MEM (MEM-NEAA) (100x) i 500 μl 2-merkaptoetanolu (55 mM) do 413,5 ml DMEM zawierającej glutaminę i przefiltruj przez 500 ml 0,22 μm filtra porowego.</li>
		<li>Dodać 1 ml środka przeciwbakteryjnego (50 mg/ml) po filtracji. Przechowuj nośnik w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pożywka z embrionalnych komórek macierzystych myszy (do przygotowania 500 ml)
	<ol>
		<li>Dodaj 75 ml FBS komórek macierzystych, 5 ml MEM-NEAA (100x), 5 ml L-glutaminy (100x) i 500 μl 2-merkaptoetanolu (55 mM) do 413,5 ml DMEM zawierającego nieglutaminę i przefiltruj przez 500 ml 0,22 μm filtra porowego.</li>
		<li>Dodać 1 ml środka przeciwbakteryjnego (50 mg/ml) po filtracji. Przechowywać nośniki w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do 1 miesiąca lub porcji i przechowywać w temperaturze ≤ -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla mESC
<ol>
	<li>Płytka mitotycznie nieaktywnych komórek zasilających MEF w pożywce MEF na płytkach poddanych działaniu kultur tkankowych w odległości 3-4 x 104 komórek/cm2. Przed posianiem mESC należy odczekać co najmniej 12 godzin, aby ustabilizowały się w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze ≥37 °C przy wilgotności względnej 95 % i 5 % zawartościCO2. Jeśli nie zostanie natychmiast użyty, wymieniaj nośnik MEF co 3 dni. MEF, jeśli nie zostaną użyte, należy usunąć w ciągu 7 dni od poszycia.</li>
	<li>Dodaj mESC (zakres gęstości od 1-4 x 104 komórek/cm2) do płytek MEF w pożywkach mESC zawierających czynnik hamujący białaczkę myszy (mLIF) (1,000 U/ml). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy wilgotności względnej ≥ 95% i 5%CO2.</li>
	<li>Przejście mESC za pomocą trypsyny-EDTA (0,05% trypsyny) (1:5-1:10), gdy naczynie stanie się ~ 70-80% zlewające się lub jeśli kolonie zaczynają się stykać. Zwykle odbywa się to co 2 dni, ale może potrwać do 4 lub 5 dni, w zależności od początkowej gęstości poszycia.</li>
	<li>Utrzymuj mESC na warstwie zasilającej MEF w pożywce mESC, aby utrzymać pluripotencję.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem różnicowania należy przynajmniej raz przenieść komórki na płytki pokryte żelatyną bez MEF w celu rozcieńczenia MEF.
	<ol>
		<li>Przygotować płytki pokryte żelatyną, dodając 0,1% żelatyny do buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS) z Ca2 + / Mg2 + do naczynia poddanego działaniu kultur tkankowych i pozostawiając w temperaturze 37 °C na co najmniej 1 godzinę. Płytka 1,5-2 x 10 6 komórek/10 cm płytka (2,7-3,6 x 104 komórki/cm2) i pozostawić komórki do ekspansji przez 2 dni przed rozpoczęciem różnicowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Różnicowanie mESC w kierunku progenitorów kresomózgowia podobnego do MGE
<ol>
	<li>Dzień różnicowania (DD) 0 = "komórki zmiennoprzecinkowe"
	<ol>
		<li>Po tym, jak mESC będą rosły na płytkach pokrytych żelatyną przez 2 dni, odessać pożywkę i raz przemyć komórki PBS bez Ca2 + / Mg2 +. Dodać tyle trypsyny-EDTA (0,05% trypsyny), aby pokryć powierzchnię płytki (zwykle 4 ml trypsyny-EDTA na jedno 10-centymetrowe naczynie do hodowli tkankowej) i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy wilgotności względnej ≥95% i 5% CO2 przez 4 minuty.</li>
		<li>Po 4 minutach wygasić trypsynę-EDTA, używając 2-krotności objętości za pomocą pożywki mESC. Przenieść komórki do probówki wirówkowej o odpowiedniej wielkości i odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut. Po 5 minutach wyjmij probówkę i zassaj pożywkę, nie naruszając osadu. Zawiesić osad w 1 ml pożywki KSR:N2 (1:1) zawierającej inhibitor BMP LDN-193189 (250 nM) i inhibitor Wnt XAV-939 (10 μM).</li>
		<li>Zmierz stężenie komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Rozpocznij hodowlę komórek jako ciał zarodkowych (EB), dodając 75 000 komórek/ml w pożywce KSR:N2 (1:1) zawierającej LDN-193189 (250 nM) i XAV-939 (10 μM) w nieprzylegających naczyniach do hodowli tkankowych. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy wilgotności względnej ≥ 95% i 5%CO2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku DD1 przygotuj się do "lądowania" komórki, pokrywając naczynia poddane kulturze tkankowej poli-L-lizyną (10 μg/ml w PBS z Ca2+/Mg2+) przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C przy wilgotności względnej ≥ 95% lub przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>W przypadku DD2 odessać poli-L-lizynę i pokryć płytki lamininą (10 μg/ml w PBS z Ca2+/Mg2+) O/N w temperaturze 37 °C przy wilgotności względnej ≥ 95%. 
	UWAGA: Chociaż O/N jest optymalne, wystarczy zaledwie 2 godziny. Jeśli płytki nie zostaną zużyte do następnego dnia, odessać lamininę, zastąpić PBS bez Ca2+/Mg2+ i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.</li>
	<li>DD3 ("komórki lądowe")
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem dysocjacji EB należy odessać lamininę i pozostawić płytki do całkowitego wyschnięcia w kapturze do hodowli tkankowej. Nie używaj talerzy, które wydają się błyszczące lub widocznie mokre. Przenieś EB z pożywką do probówki o pojemności 15 ml i wiruj przez 3-4 minuty przy 15 x g lub do momentu, gdy EB się zagnieżdżą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odessać pożywkę i dodać 3 ml roztworu do oddzielania komórek zawierającego DNazę (2 U/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C przy wilgotności względnej ≥ 95% i 5% CO2 przez 15 minut. Delikatnie przesuwaj probówkę co 3 minuty, aby wspomóc dysocjację EB.</li>
	<li>Gdy EB przestaną być widoczne lub upłynęło 15 minut, dodać 6 ml KSR:N2 (1:1) zawierającego DNazę (1 U/ml) i wirować przez 5 minut przy 200 x g.</li>
	<li>Umieść komórki w KSR:N2 (1:1) zawierającym LDN-193189 (250 nM), XAV-939 (10 μM) i inhibitor ROCK Y-27632 (10 μM) w proporcji 4,5-5 x 104 komórki/cm2.</li>
</ol>
4. Protokół wzbogacający SST: "DD12 GFP High Sonic Hedgehog (SHH)" (kontynuacja kroku 3.7)
<ol>
	<li>W DD5 zmień pożywkę na KSR:N2 (1:1) zawierającą FGF-2 (10 ng/ml), IGF-1 (20 ng/ml) i SSH (50 ng/ml).</li>
	<li>Przygotować płytki do hodowli tkankowych do ponownego posiewu w dniu 8 (etap 4.4), postępując zgodnie z instrukcjami przedstawionymi w krokach 3.2-3.3.</li>
	<li>W DD7 zmień pożywkę na KSR:N2 (1:1) zawierającą FGF-2 (10 ng/ml), IGF-1 (20 ng/ml) i SHH (50 ng/mL).</li>
	<li>Na DD8 ponownie pokryj ogniwa. 
	UWAGA: Chociaż ten krok nie jest niezbędny, ponowne posiew komórek może zmniejszyć wcześnie różnicowane, niepożądane typy komórek. Powtórne posiewanie powoduje również rozbicie kulek komórek, co utrudnia dalsze analizy immunohistochemiczne i zwiększa wydajność FACS w późniejszych punktach czasowych.
	<ol>
		<li>Aby ponownie ułożyć komórki, odłącz je od płytki za pomocą trypsyny-EDTA (0,05% trypsyny) na 5 minut w temperaturze 37 °C przy wilgotności względnej ≥95% i 5% CO2 . Ugasić trypsynę-EDTA, używając 2-krotności objętości za pomocą KSR:N2 i odwirować przy 200 x g przez 5 minut. Przefiltruj komórki przez rurkę filtracyjną o średnicy 40 μm, aby usunąć wszelkie grudki. Ponownie pokryj komórki w ilości 250 000 komórek/cm2 w N2/KSR (1:1) zawierającym FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) i Y-27632 (10 μM) z SHH (50 ng/mL). 
		UWAGA: Jeśli zamiast tego zostanie podjęta decyzja, aby nie pokrywać ponownie komórek DD8, zmieniaj pożywkę z KSR:N2 zawierającą SHH (50 ng/mL) co 2 dni z DD7 na DD12 i kontynuuj dodawanie IGF-1 (20 ng/ml) i FGF-2 (10 ng/ml) aż do DD9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W DD10 zmień nośnik na KSR:N2 zawierający SHH (50 ng/ml).</li>
	<li>Na DD12, aby uzyskać komórki, które są wzbogacone o podtypy SST, użyj FACS do wyizolowania komórek eksprymujących Lhx6::GFP.
	<ol>
		<li>Aby odłączyć komórki, użyj odczynnika do dysocjacji komórek niezawierającego trypsyny, a nie trypsyny-EDTA. Umyj komórki raz PBS bez Ca2 + / Mg2+. Dodaj do komórek wstępnie podgrzany odczynnik do dysocjacji komórek niezawierający trypsyny zawierający DNazę (2 U/ml). Umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy wilgotności względnej ≥95% i 5% CO2 na 10-30 minut lub do momentu odłączenia komórek. Delikatnie postukaj w płytki co 5 minut, aby wspomóc dysocjację. 
		UWAGA: W przypadku kultur DD11-12 może być konieczne tylko 10-15 minut. W przypadku kultur DD15-16 do całkowitej dysocjacji może być wymagane 30 minut lub więcej.</li>
		<li>Gdy komórki całkowicie oderwą się od płytki, przystąp do izolacji FACS przy użyciu standardowych protokołów lub użyj komórek w innych dalszych analizach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Protokół wzbogacania PV: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (kontynuacja kroku 3.7)
<ol>
	<li>W DD5 zmień pożywkę na KSR:N2 (1:1) zawierającą FGF-2 (10 ng/ml) i IGF-1 (20 ng/ml).</li>
	<li>Przygotować płytki do hodowli tkankowych do ponownego posiewu na DD8 (krok 4.4), postępując zgodnie z instrukcjami przedstawionymi w krokach 3.2-3.3.</li>
	<li>W DD7 zmień pożywkę na KSR:N2 (1:1) zawierającą FGF-2 (10 ng/ml) i IGF-1 (20 ng/ml).</li>
	<li>W przypadku DD8 ponownie posieńcie komórki zgodnie z opisem w kroku 4.4 z następującymi wyjątkami: podczas ponownego powlekania komórek zastąp SHH wygładzonym agonistą (SAG; 30 nM) i dodaj atypowy inhibitor PKC (aPKCi; 2 μM). Podsumowując, pożywka do ponownego powlekania to teraz N2/KSR (1:1) zawierająca FGF-2 (10 ng/ml), IGF-1 (20 ng/ml), Y-27632 (10 μM), SAG (30 nM) i aPKCi (2 μM).</li>
	<li>W DD10 zmień nośnik na KSR:N2 zawierający aPKCi (2 μM).</li>
	<li>DD11 
	UWAGA: W tym momencie ogniwa Nkx2.1::mCherry+ są wzbogacane, aby stać się ogniwami PV.
	<ol>
		<li>Odłącz komórki od płytki dla FACS, korzystając z tego samego protokołu opisanego w kroku 4.6. Jeśli zostanie podjęta decyzja o pobraniu komórek Nkx2.1::mCherry+ w późniejszym dniu różnicowania, zignoruj ten krok.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W DD12 zmień nośnik na KSR:N2 zawierający aPKCi (2 μM). W DD14 zmień nośnik na KSR:N2 zawierający aPKCi (2 μM). W DD16 zmień nośnik na KSR:N2 zawierający aPKCi (2 μM). Na DD17 zbierz komórki Nkx2.1::mCherry+ przy użyciu tego samego protokołu opisanego w kroku 4.6.</li>
</ol>
6. Protokół wzbogacania PV: "DD17 mCherry Low SHH" (kontynuacja kroku 3.7)
<ol>
	<li>W DD5 zmień pożywkę na KSR:N2 (1:1) zawierającą FGF-2 (10 ng/ml) i IGF-1 (20 ng/ml). W DD7 zmień pożywkę na KSR:N2 (1:1) zawierającą FGF-2 (10 ng/ml) i IGF-1 (20 ng/ml).</li>
	<li>W DD9 zmień nośnik za pomocą KSR:N2 (1:1). Od tego momentu nie są potrzebne żadne dodatkowe czynniki wzrostu.
	<ol>
		<li>Kontynuuj wymianę pożywki co 2 dni, aż do zebrania komórek na DD17.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jones, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+of+cortical+interneurons%3A+mouse+versus+monkey+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human.</a> Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).</li>
<li>Wonders, C. P., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+specification+of+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The origin and specification of cortical interneurons.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).</li>
<li>Ascoli, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Petilla+terminology%3A+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).</li>
<li>DeFelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).</li>
<li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+characterization+of+inhibitory+mouse+cortical+neurons%3A+three+chemically+distinct+classes+of+inhibitory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells.</a> J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).</li>
<li>Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Losing+your+inhibition%3A+Linking+cortical+GABAergic+interneurons+to+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia.</a> Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).</li>
<li>Benes, F. M., Berretta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+interneurons%3A+implications+for+understanding+schizophrenia+and+bipolar+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder.</a> Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).</li>
<li>Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+of+culture+and+Sonic+Hedgehog+signaling+differentially+specify+PV+versus+SST+cortical+interneuron+fates+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells.</a> Development. 142, 1267-1278 (2015).</li>
<li>Au, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+gain-of-function+approach+to+generate+cortical+interneuron+subtypes+from+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells.</a> Neuron. 80, 1145-1158 (2013).</li>
<li>Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+derivation+of+mouse+ESC-derived+cortical+interneurons+by+expression+of+Nkx2.1%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1.</a> Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).</li>
<li>Cambray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+induces+cortical+interneuron+identity+and+differentiation+in+embryonic+stem+cell-derived+telencephalic+neural+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors.</a> Nat Commun. 3, 841(2012).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+%22MGE+Enhancers%22+for+Labeling+and+Selection+of+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Medial+Ganglionic+Eminence+%28MGE%29+Progenitors+and+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Use of "MGE Enhancers" for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons.</a> PloS one. 8, e61956(2013).</li>
<li>Danjo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subregional+specification+of+embryonic+stem+cell-derived+ventral+telencephalic+tissues+by+timed+and+combinatory+treatment+with+extrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).</li>
<li>Tyson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+of+culture+and+sonic+hedgehog+signaling+differentially+specify+PV+versus+SST+cortical+interneuron+fates+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells.</a> Development. 142, 1267-1278 (2015).</li>
<li>Maroof, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+and+functional+maturation+of+cortical+interneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).</li>
<li>Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+PKC+and+Notch+Inhibition+Differentially+Modulate+Cortical+Interneuron+Subclass+Fate+from+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).</li>
<li>Liodis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lhx6+activity+is+required+for+the+normal+migration+and+specification+of+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).</li>
<li>Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKX2.1+specifies+cortical+interneuron+fate+by+activating+Lhx6%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6.</a> Development. 135, 1559-1567 (2008).</li>
<li>Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+molecular+specification+of+striatal+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Origin and molecular specification of striatal interneurons.</a> Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).</li>
<li>Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+maintains+the+identity+of+cortical+interneuron+progenitors+in+the+ventral+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon.</a> Development. 132, 4987-4998 (2005).</li>
<li>Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+cyclin+D2+and+D1+protein+expression+distinguish+forebrain+progenitor+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets.</a> Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).</li>
<li>Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+versus+Basal+Neurogenesis+Directs+Cortical+Interneuron+Subclass+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate.</a> Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).</li>
<li>Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+Nkx2.1-lineage+cells+in+the+mouse+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon.</a> J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).</li>
<li>Wonders, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+bias+for+the+origins+of+interneuron+subgroups+within+the+medial+ganglionic+eminence%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence.</a> Dev Biol. 314, 127-136 (2008).</li>
<li>Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+bias+in+the+mitotic+origins+of+somatostatin-+and+parvalbumin-expressing+interneuron+subgroups+and+the+chandelier+subtype+in+the+medial+ganglionic+eminence%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence.</a> Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).</li>
<li>Flames, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+multiple+subpallial+progenitor+domains+by+the+combinatorial+expression+of+transcriptional+codes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).</li>
<li>Fogarty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+genetic+patterning+of+the+embryonic+neuroepithelium+generates+GABAergic+interneuron+diversity+in+the+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).</li>
<li>Colasante, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Conversion+of+Fibroblasts+into+Functional+Forebrain+GABAergic+Interneurons+by+Direct+Genetic+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).</li>
<li>Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://homes.mpimf-heidelberg.mpg.de/~mhelmsta/pdf/2004%20Xu%20et%20al%20JNeurosci.pdf">Origins of cortical interneuron subtypes.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).</li>
<li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> Science. 344, 1240622(2014).</li>
<li>Tyson, J. A., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+interneuron+transplants+to+study+development+and+treat+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease.</a> Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).</li>
<li>Donegan, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+interneuron+transplants+as+a+treatment+for+schizophrenia%3A+preclinical+validation+in+a+rodent+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model.</a> Mol Psychiatry. , (2016).</li>
<li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+human+embryonic+stem+cells+on+micropatterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns.</a> Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+naive-like+human+pluripotent+stem+cells+based+on+HERVH+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression.</a> Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).</li>
<li>Zeltner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+biology+of+disease+severity+in+a+PSC-based+model+of+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia.</a> Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).</li>
<li>Blahos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+site+on+the+Galpha+-protein+that+recognizes+heptahelical+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors.</a> J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż metoda ta jest wysoce skuteczna w modelowaniu mESC pochodzących z J1 (SCRC-1010), doświadczyliśmy zmiennego sukcesu z innymi liniami mESC i izolatami klonalnymi. Na przykład mESC Foxg1::wenus (pochodzące z EB3; Danjo i wsp.13) słabo reagują na ten protokół, a indukcja Foxg1 przez DD12 jest zwykle rzędu 1-2%. Z powodów, których nie do końca rozumiemy, inny klon podwójnego reportera Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP (określany jako JQ59), który został wyizolowany jednocześnie z linią opisan...

Zarówno u myszy, jak i u ludzi, mniej więcej połowa wszystkich korowych interneuronów hamujących (CIns) wywodzi się z przejściowej struktury podkorowej znanej jako przyśrodkowa wyniosłość zwojowa (MGE), gdzie neuroepitelialne progenitory CIns i innych podgrup neuronalnych i glejowych wyrażają czynnik transkrypcyjny Nkx2.11,2. Podgrupy lub podtypy CIn są definiowane przez przecinające się cechy morfologiczne, neurochemiczne, elektrofizjologiczne i łączności3,4. CIns pochodzące z MGE można pogrupować w przeważnie nienakładające się podgrupy na podstawie ich ekspresji PV lub SST, której ekspresja koreluje z określonymi tendencjami elektrofizjologicznymi i łącznościami5. Dysfunkcja interneuronów, zwłaszcza tych z podgrupy PV, jest związana z wieloma zaburzeniami i chorobami neuropsychiatrycznymi6,7. Ogólnym celem tej metody jest wytworzenie mitotycznych progenitorów pochodzących z komórek macierzystych i prekursorów migracyjnych wzbogaconych o los PV lub SST CIn do badania biologii interneuronów korowych i do stosowania w terapiach komórkowych.
Opracowaliśmy skalowalną, wysoce efektywną metodę wyprowadzania z mESC komórek progenitorowych interneuronów wykazujących ekspresję Nkx2.1 i ich potomstwa. Korzystając z podwójnego reportera mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP mESC line8, progenitorzy Nkx2.1 lub ich postmitotyczne potomstwo eksprymujące Lhx6 mogą być izolowane za pomocą FACS, a następnie wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach. Manipulując wieloma szlakami sygnałowymi, czasem trwania hodowli i trybem neurogenezy, możemy uzyskać miliony znakowanych fluorescencyjnie prekursorów interneuronów odpowiednich do wielu dalszych zastosowań.
Chociaż istnieje kilka innych metod generowania progenitorów podobnych do MGE z mESCs9,10,11,12,13,14, nasza metoda, która opiera się na antagoniście Wnt XAV-939, jest szczególnie skuteczna w generowaniu współekspresji komórek progenitorowych Foxg1/Nkx2.1. Ponadto możliwość selekcji pod kątem progenitorów interneuronów lub ich potomstwa z ekspresją Lhx6 po mitozie za pośrednictwem naszego podwójnego systemu reporterowego znacznie zwiększa zdolność do generowania odrębnych komórek progenitorowych i ich potomstwa.

<table><tbody><tr><td>Butelkowy system filtrów próżniowych</td><td>Corning</td><td>CLS430769</td><td></td></tr><tr><td>probówka z sitkiem do komórek Zatrzask</td><td>ThermoFisher</td><td>Corning 352235</td><td></td></tr><tr><td>Mysie fibroblasty embrionalne (CF-1 MEF IRR 7M)</td><td>MTI-Globalstem</td><td>GSC-6101G</td><td>1 fiolka z 7M MEF wystarcza na cztery 10-centymetrowe płytki TC. Przypisy: 29,35</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>Ant-pm-2</td><td>Znany również jako środek przeciwdrobnoustrojowy. Nie filtrować z mediami bazowymi - dodać po filtracji. Referencje: 9,11,36,37</td></tr><tr><td>N2 suplement-B</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7156</td><td>Nie filtruj za pomocą podłoża bazowego -- dodaj po filtracji</td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td>Znany również jako L-alanina-L-glutamina. Referencje: 9,11,38,39</td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy do nokautu (KSR)</td><td>ThermoFisher</td><td>10828028</td><td>Znany również jako średni suplement bez surowicy. Referencje: 9,11</td></tr><tr><td>L-glutamina (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>ThermoFisher</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM</td><td></td><td>ThermoFisher 10829018</td><td>Znany również jako DMEM zawierający nieglutaminę. Przypisy: 9,11</td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>VWR</td><td>82013-578</td><td>Znany również jako FBS klasy komórek macierzystych. Przypisy: 9,11</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowej (10cm)</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Nieprzywierająca sterylna szalka Petriego (10cm)</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik hamujący białaczkę (mLIF)</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td>Nie zamrażać, przechowywać w temperaturze 4'C. Przypisy: 9,11</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>0,1% roztwór żelatyny</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-999-027</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ThermoFisher</td><td>A1110501</td><td>Znany również jako odczynnik dysocjacji komórek niezawierający trypsyny. Referencje: 9,11</td></tr><tr><td>RQ1 DNase Free RNase-Free</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td>Zawiesić w DMSO i przechowywać w temperaturze -80'C w jednorazowych porcjach</td></tr><tr><td>XAV939</td><td>Stemgent</td><td>04-0046</td><td>Zawiesić w DMSO i przechowywać w temperaturze -80'C w podwielokrotnościach jednorazowego użytku</td></tr><tr><td>rhFGF-2</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB</td><td>Zawiesić w PBS z 0,1% BSA i przechowywać w temperaturze -80'C w jednorazowych podwielokrotnościach</td></tr><tr><td>rhIGF-2</td><td>R& D Systems</td><td>291-G1</td><td>Zawiesić w PBS z 0,1% BSA i przechowywać w temperaturze -80'C w jednorazowych podwielokrotnościach</td></tr><tr><td>inhibitora ROCK (Y-27632)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Zawiesić w DMSO i przechowywać w temperaturze -80'C w podwielokrotnościach jednorazowego użytku</td></tr><tr><td>Wygładzony agonista (SAG)</td><td>Milipore</td><td>566660-1MG</td><td>Zawiesić w H20 i przechowywać w temperaturze -80'C w jednorazowych podwielokrotnościach</td></tr><tr><td>rm Sonic Hedgehog/SHH</td><td>R& D Systems</td><td>464-SH-025</td><td>Zawiesić w PBS z 0,1% BSA i przechowywać w temperaturze -80'C w jednorazowych podwielokrotnościach</td></tr><tr><td>PKC&zeta; Inhibitor pseudosubstratu, mirystoilowany</td><td>milipor EMD</td><td>539624</td><td>zawiesić w H20 i przechowywać w temperaturze -80'C w jednorazowych podwielokrotnościach</td></tr></tbody></table>

różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w prekursory interneuronów korowych

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergiczne interneurony korowe to heterogeniczna populacja komórek, które odgrywają kluczową rolę w regulacji wydajności pobudzających neuronów piramidowych, jak również w synchronizacji wyników zespołów neuronów piramidowych. Deficyty w funkcjonowaniu interneuronów są związane z różnymi zaburzeniami neuropsychiatrycznymi, w tym schizofrenią, autyzmem i padaczką. Wyprowadzenie interneuronów korowych z embrionalnych komórek macierzystych nie tylko pozwala na badanie ich rozwoju i funkcji, ale także zapewnia wgląd w mechanizmy molekularne leżące u podstaw patogenezy zaburzeń związanych z interneuronami korowymi. Interneurony mają również niezwykłą zdolność do przetrwania, migracji i integracji z obwodami korowymi gospodarza po przeszczepie, co czyni je idealnymi kandydatami do stosowania w terapiach komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy skalowalną, wysoce wydajną, zmodyfikowaną metodę przekształcania ciała zarodkowego w monowarstwę do wyprowadzania komórek progenitorowych interneuronów z ekspresją Nkx2.1 i ich potomstwa z embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC). Korzystając z podwójnej linii reporterowej mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, progenitorzy Nkx2.1 lub ich postmitotyczne potomstwo eksprymujące Lhx6 mogą być izolowane poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a następnie wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach. Oferujemy również metody wzbogacania podgrup interneuronów parwalbuminy (PV) lub somatostatyny (SST), które mogą być pomocne w badaniu aspektów determinacji losu lub do wykorzystania w zastosowaniach terapeutycznych, które skorzystałyby z przeszczepów wzbogaconych w podgrupy interneuronów.

Protokół opisany w niniejszej pracy jest zmodyfikowaną wersją naszych opublikowanych protokołów15,16,17 i został zoptymalizowany do użytku z naszą linią mESC z podwójnym reporterem Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. Poprzez dodanie inhibitora Wnt XAV-939 od DD0-5, w połączeniu z ponownym wysianiem w DD8, osiągamy silną indukcję Nkx2.1, w której ponad 50% wszystkich jąder DAPI+ w hodowli wykazuje również ...

Ten protokół opisuje metodę generowania prekursorów interneuronów korowych i prekursorów interneuronów postmitotycznych z embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu zmodyfikowanej metody embrionalnej ciała do monowarstwy. Te progenitory/prekursory mogą być używane in vitro lub sortowane fluorescencyjnie i przeszczepiane do kory nowej noworodka w celu badania determinacji losu lub wykorzystywane w zastosowaniach terapeutycznych.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w prekursory interneuronów korowych

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie progenitorów interneuronów korowych w postmitotycznych prekursorach interneuronów dla embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu metody zmodyfikowanego ciała zarodka do jednej warstwy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak to, w jaki sposób podtypy interneuronów korowych osiągają swoje indywidualne losy podczas rozwoju. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona efektywne wytwarzanie komórek progenitorowych interneuronów wykazujących ekspresję Nkx2.1, a także metody wzbogacania o podgrupy interneuronów parwalbuminy lub somatostatyny.Aby rozpocząć tę procedurę, umieść mitotycznie nieaktywne komórki zasilające MEF w pożywce MEF na płytkach poddanych działaniu kultur tkankowych. Odczekaj co najmniej 12 godzin, aby osiadły w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed posiewem mESC. Jeśli nie zostaną natychmiast użyte, należy wymieniać pożywkę MEF co trzy dni.Następnie dodaj mESC zawierające czynnik hamujący białaczkę myszy do płytek MEF. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Przejście mESC za pomocą trypsyny-EDTA, gdy naczynie stanie się zlewne w 70 do 80%, i utrzymanie mESC na warstwie zasilającej MEF w pożywce mESC, aby utrzymać pluripotencję.Przed rozpoczęciem różnicowania należy przynajmniej raz umieścić komórki na płytkach pokrytych żelatyną bez MEF, aby je rozcieńczyć. W tym celu należy przygotować płytki pokryte żelatyną, dodając 0,1% żelatyny i PBS z wapniem i magnezem do naczynia poddanego hodowli tkankowej i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 1 godzinę. Płytka 1,5 do dwóch razy 10 do szóstych komórek na każdej dziesięciocentymetrowej płytce i pozwól im się rozszerzać przez dwa dni przed rozpoczęciem różnicowania.W przypadku DD0, po tym jak mESC rosły na płytkach pokrytych żelatyną przez dwa dni, należy odessać pożywkę i raz przemyć komórki PBS bez wapnia i magnezu. Następnie dodaj tyle trypsyny-EDTA, aby pokryć powierzchnię płytek. I umieść komórki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na cztery minuty.Po czterech minutach wygasić trypsynę-EDTA, używając dwukrotnie większej objętości pożywki mESC. Przenieś komórki do probówki wirówkowej o odpowiedniej wielkości i odwiruj komórki z prędkością 200 razy g przez pięć minut. Następnie wyjmij rurkę i zassaj pożywkę, nie naruszając osadu.Zawiesić osad w jednym milileterze pożywki KSR-N2. Następnie zmierz stężenie komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Rozpocznij hodowlę komórek jako ciał embrionalnych, dodając 75 000 komórek na mililet w pożywce KSR-N2 w nieprzylegających szalkach do hodowli tkankowych.I inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na DD1 przygotuj się do lądowania na komórce, pokrywając naczynia poddane kulturze tkankowej poli-L-lizyną przez co najmniej godzinę lub przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na DD2 odessać poli-L-lizynę i pokryć płytki lamininą przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Na DD3, przed rozpoczęciem dysocjacji EB, odessać lamininę i pozostawić płytki do całkowitego wyschnięcia w kapturze do hodowli tkankowych. Następnie przenieś EB wraz z pożywką do 15-mililitrowej probówki i odwiruj przez trzy do czterech minut przy 15 razy g lub do momentu, gdy EB się osadzą. Odessać pożywkę i dodać trzy mililitry roztworu do odrywania komórek zawierającego DNazę.Następnie inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Delikatnie przesuwaj rurkę co trzy minuty, aby pomóc w dysocjacji EB. Gdy EB przestaną być widoczne lub upłynęło 15 minut, dodaj sześć mililitrów KSR-N2 zawierającego DNazę i odwiruj przez pięć minut w temperaturze 200 razy g.Następnie umieść komórki w KSR-N2 zawierającym LDN193189, XAV939 i inhibitor ROCK, Y27632, w odległości od 4,5 do pięciu razy dziesięć do czwartej komórki na centymetr kwadratowy. W DD5 zmień nośnik na KSR-N2 zawierający FGF2, IGF1 i SSH. Następnie należy przygotować płytki do hodowli tkankowej do ponownego posiewu w 8 dniu, postępując zgodnie z instrukcjami przedstawionymi w procedurach dotyczących DD1 i DD2.W DD7 zmień nośnik na KSR-N2 zawierający FGF2, IGF1 i SHH. Na DD8 ponownie plateruj komórki, odłączając je od płytek za pomocą trypsyny-EDTA na pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ugasić trypsynę-EDTA, używając dwukrotnie większej objętości za pomocą KSR-N2.I wirować 200 razy g przez pięć minut. Przefiltruj komórki przez rurkę filtracyjną o średnicy 40 mikronów, aby usunąć wszelkie grudki. Następnie ponownie plateruj komórki w odległości 250 000 komórek na centymetr kwadratowy w N2-KSR zawierającym FGF2, IGF1 i Y27632 z SHH.W DD10 zmień nośnik na KSR-N2 zawierający SHH. Umyj komórki raz PBS bez wapnia i magnezu i dodaj do komórek wstępnie podgrzany odczynnik dysocjacji komórek niezawierający trypsyny, zawierający DNazę. Umieść je w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 do 30 minut lub do momentu, gdy komórki się odłączą.Następnie delikatnie stukaj w płytki co pięć minut, aby wspomóc dysocjację. W DD5 zmień nośnik na KSR-N2 zawierający FGF2 i IGF1. Następnie przygotuj płytki do hodowli tkankowych do ponownego posiewu na DD8.W DD7 zmień nośnik na KSR-N2 zawierający FGF2 i IGF1. Na DD8 ponownie pokryć komórki wygładzonym agonistą i dodać atypowy inhibitor PKC. W DD10 zmień nośnik na KSR-N2 zawierający aPKCi.W DD11 odłącz komórki od płytek dla FACS. Jeśli komórki nie zostały odłączone dla FACS na DD11, zmień nośnik na DD12 z KSR-N2 zawierającym aPKCi. W DD14 zmień nośnik na KSR-N2 zawierający aPKCi.A na DD16 zmień nośnik na KSR-N2 zawierający aPKCi. Następnie na DD17 zbierz komórki dodatnie Nkx-2.1:mCherry. Pokazano tutaj reprezentatywne obrazy barwienia immunologicznego dla Nkx2.1, Nkx2.1:mCherry i Lhx6:GFP z hodowli różnicowania w 12. dniu.Zwróć uwagę, że te obrazy są nakładającymi się kanałami z tego samego pola widzenia. Ten wykres przedstawia kwantyfikację średniego odsetka jąder DAPI dodatnich, które wyrażają Nkx2.1 w DD12 w hodowli. Jest to reprezentatywny wykres FACS, pokazujący cztery różne populacje komórek, które można wyizolować za pomocą naszej podwójnej linii reporterowej mESC.Zauważ, że mCherry znajduje się na osi x, a GFP na osi y. Tak więc prawe górne pole reprezentuje komórki, które są podwójnie dodatnie mCherry-GFP. Oto przebieg czasowy indukcji Nkx2.1: mCherry i Lhx6: GFP od DD6 do 16, wyrażony jako procent komórek w hodowli, które wykazują ekspresję tylko mCherry, GFP tylko ekspresję lub współekspresję mCherry-GFP.Po opanowaniu protokół ten można ukończyć w ciągu 17 dni od początku do końca, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby zawsze zaczynać od opłucnowych, niezróżnicowanych, zdrowo wyglądających komórek macierzystych. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak przeszczep do kory nowej noworodka lub dorosłego myszy, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące determinacji losu interneuronów lub wpływu przeszczepu interneuronów na funkcję obwodu i zachowanie zwierząt.Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się neuronauką rozwojową do zbadania czynników wpływających na determinację losu interneuronów u myszy, a co za tym idzie, u pacjentów dotkniętych zaburzeniami związanymi z interneuronami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać ekspresję Nkx2.1 i ich post-mitotyczne potomstwo z embrionalnych komórek macierzystych myszy. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-into-cortical-interneuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie opisano metodę izolacji neuroprekursorów z rozwijającej się kory zarodków myszy. Przedstawiono procedurę usuwania zarodków z macicy, wycinania tkanki korowej oraz trawienia wyizolowanej kory mózgu.

Hodowla prekursorów neuronalnych komórek macierzystych myszy

Opisujemy protokół oparty na małych cząsteczkach służący do różnicowania mysich embrionalnych komórek macierzystych w komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPC). Protokół ten pozwala na wysokowydajne generowanie komórek OPC Olig2+NG2+ w ciągu 30 dni różnicowania. Opisujemy również metodę generowania „spiking” OPC, które są zdolne do generowania potencjałów czynnościowych.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych w prekursory oligodendrocytów

Opracowaliśmy nowy protokół w celu zwiększenia wydajności różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe in vitro. Zróżnicowane komórki ES nabyły cechy neuronów ruchowych, co potwierdzono poprzez wykazanie ekspresji markerów neuronalnych i neuronów ruchowych z wykorzystaniem technik immunohistochemicznych.

Efektywna różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe

Ten film pokazuje różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, czyli hESC, bezpośrednio w neuronalne komórki progenitorowe bez użycia komórek zasilających lub jakichkolwiek etapów pośrednich. Selektywne hamowanie szlaków sygnałowych białka morfogenetycznego kości lub BMP i transformacji czynnika wzrostu-beta lub TGF-β prowadzi do różnicowania hESC w nerwowe komórki progenitorowe lub NPC.

Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w progenitory nerwowe

Ten film przedstawia metodę generowania prekursorów interneuronów korowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy. Protokół zakłada hodowlę komórek macierzystych w pożywkach zawierających specyficzne inhibitory małocząsteczkowe, które ułatwiają proliferację i agregację komórek macierzystych w ciała zarodkowe (EB). Następnie EB są dysocjowane z enzymami i siane na płytkach hodowlanych pokrytych białkami adhezyjnymi, aby promować ich różnicowanie w prekursory interneuronów korowych.

Generowanie prekursorów interneuronów korowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Ten film demonstruje metodę generowania in vitro nerwowych komórek progenitorowych (NPC) z embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC). MESC są hodowane w zawiesinie w celu wytworzenia ciał embrionalnych (EB), które są następnie kierowane do różnicowania się w NPC poprzez traktowanie kwasem retinowym w kulturze adherentnej.

Technika generowania nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Film prezentował metodę hodowli komórkowej do różnicowania neuronalnych komórek progenitorowych w neurony. Poprzez inkubację komórek w pożywce bogatej w składniki odżywcze uzupełnionej czynnikami wzrostu, komórki progenitorowe dojrzewały do neuronów z rozwiniętymi aksonami i dendrytami. Środek stabilizujący zapewniał żywotność komórek i chronił przed uszkodzeniami oksydacyjnymi w całym procesie różnicowania.

Różnicowanie nerwowych komórek progenitorowych w neurony

Ten film demonstruje technikę różnicowania embrionalnych komórek macierzystych w połączoną w sieć populację neuronów z funkcjonującymi synapsami. Przedstawiono w nim etapy związane z różnicowaniem embrionalnych komórek macierzystych w neurony, indukcją tworzenia sieci neuronalnej i wzbogacaniem kultury w neurony połączone w sieć.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w populację neuronów połączonych w sieć

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę generowania neuronalnych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu metody monowarstwowej bez surowicy. Te progenitory mogą być wykorzystywane do uzyskiwania dojrzałych typów komórek nerwowych lub do badania procesu specyfikacji neuronalnej i są podatne na skalowanie w formacie wielodołkowym w celu przeprowadzenia badań przesiewowych związków.

Różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli jednowarstwowej bez surowicy

Tutaj stworzyliśmy tanią i łatwą w obsłudze metodę, która kieruje szybkim i efektywnym różnicowaniem się od embrionalnych komórek macierzystych do neuronów. Metoda ta nadaje się do popularyzacji wśród laboratoriów i może być przydatnym narzędziem do badań neurologicznych.

Różnicowanie neuronalne na podstawie embrionalnych komórek macierzystych myszy in vitro

Opisujemy procedurę różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w komórki neuronalne za pomocą metody wiszącej kropli. Ponadto przeprowadzamy kompleksową analizę fenotypową za pomocą RT-qPCR, immunofluorescencji, sekwencjonowania RNA i cytometrii przepływowej.

Różnicowanie i charakterystyka neuronalnych progenitorów i neuronów z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Poznaj metodę różnicowania mysich embrionalnych komórek macierzystych w prekursory interneuronów korowych z wykorzystaniem modyfikowanej techniki embryoid body-to-monolayer.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w prekursory interneuronów korowych

Przeglądaj więcej filmów