Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w prekursory interneuronów korowych

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie progenitorów interneuronów korowych w postmitotycznych prekursorach interneuronów dla embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu metody zmodyfikowanego ciała zarodka do jednej warstwy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak to, w jaki sposób podtypy interneuronów korowych osiągają swoje indywidualne losy podczas rozwoju. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona efektywne wytwarzanie komórek progenitorowych interneuronów wykazujących ekspresję Nkx2.1, a także metody wzbogacania o podgrupy interneuronów parwalbuminy lub somatostatyny.

Aby rozpocząć tę procedurę, umieść mitotycznie nieaktywne komórki zasilające MEF w pożywce MEF na płytkach poddanych działaniu kultur tkankowych. Odczekaj co najmniej 12 godzin, aby osiadły w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed posiewem mESC. Jeśli nie zostaną natychmiast użyte, należy wymieniać pożywkę MEF co trzy dni.

Następnie dodaj mESC zawierające czynnik hamujący białaczkę myszy do płytek MEF. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Przejście mESC za pomocą trypsyny-EDTA, gdy naczynie stanie się zlewne w 70 do 80%, i utrzymanie mESC na warstwie zasilającej MEF w pożywce mESC, aby utrzymać pluripotencję.

Przed rozpoczęciem różnicowania należy przynajmniej raz umieścić komórki na płytkach pokrytych żelatyną bez MEF, aby je rozcieńczyć. W tym celu należy przygotować płytki pokryte żelatyną, dodając 0,1% żelatyny i PBS z wapniem i magnezem do naczynia poddanego hodowli tkankowej i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 1 godzinę. Płytka 1,5 do dwóch razy 10 do szóstych komórek na każdej dziesięciocentymetrowej płytce i pozwól im się rozszerzać przez dwa dni przed rozpoczęciem różnicowania.

W przypadku DD0, po tym jak mESC rosły na płytkach pokrytych żelatyną przez dwa dni, należy odessać pożywkę i raz przemyć komórki PBS bez wapnia i magnezu. Następnie dodaj tyle trypsyny-EDTA, aby pokryć powierzchnię płytek. I umieść komórki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na cztery minuty.

Po czterech minutach wygasić trypsynę-EDTA, używając dwukrotnie większej objętości pożywki mESC. Przenieś komórki do probówki wirówkowej o odpowiedniej wielkości i odwiruj komórki z prędkością 200 razy g przez pięć minut. Następnie wyjmij rurkę i zassaj pożywkę, nie naruszając osadu.

Zawiesić osad w jednym milileterze pożywki KSR-N2. Następnie zmierz stężenie komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Rozpocznij hodowlę komórek jako ciał embrionalnych, dodając 75 000 komórek na mililet w pożywce KSR-N2 w nieprzylegających szalkach do hodowli tkankowych.

I inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na DD1 przygotuj się do lądowania na komórce, pokrywając naczynia poddane kulturze tkankowej poli-L-lizyną przez co najmniej godzinę lub przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na DD2 odessać poli-L-lizynę i pokryć płytki lamininą przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Na DD3, przed rozpoczęciem dysocjacji EB, odessać lamininę i pozostawić płytki do całkowitego wyschnięcia w kapturze do hodowli tkankowych. Następnie przenieś EB wraz z pożywką do 15-mililitrowej probówki i odwiruj przez trzy do czterech minut przy 15 razy g lub do momentu, gdy EB się osadzą. Odessać pożywkę i dodać trzy mililitry roztworu do odrywania komórek zawierającego DNazę.

Następnie inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Delikatnie przesuwaj rurkę co trzy minuty, aby pomóc w dysocjacji EB. Gdy EB przestaną być widoczne lub upłynęło 15 minut, dodaj sześć mililitrów KSR-N2 zawierającego DNazę i odwiruj przez pięć minut w temperaturze 200 razy g.

Następnie umieść komórki w KSR-N2 zawierającym LDN193189, XAV939 i inhibitor ROCK, Y27632, w odległości od 4,5 do pięciu razy dziesięć do czwartej komórki na centymetr kwadratowy. W DD5 zmień nośnik na KSR-N2 zawierający FGF2, IGF1 i SSH. Następnie należy przygotować płytki do hodowli tkankowej do ponownego posiewu w 8 dniu, postępując zgodnie z instrukcjami przedstawionymi w procedurach dotyczących DD1 i DD2.

W DD7 zmień nośnik na KSR-N2 zawierający FGF2, IGF1 i SHH. Na DD8 ponownie plateruj komórki, odłączając je od płytek za pomocą trypsyny-EDTA na pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ugasić trypsynę-EDTA, używając dwukrotnie większej objętości za pomocą KSR-N2.

I wirować 200 razy g przez pięć minut. Przefiltruj komórki przez rurkę filtracyjną o średnicy 40 mikronów, aby usunąć wszelkie grudki. Następnie ponownie plateruj komórki w odległości 250 000 komórek na centymetr kwadratowy w N2-KSR zawierającym FGF2, IGF1 i Y27632 z SHH.

W DD10 zmień nośnik na KSR-N2 zawierający SHH. Umyj komórki raz PBS bez wapnia i magnezu i dodaj do komórek wstępnie podgrzany odczynnik dysocjacji komórek niezawierający trypsyny, zawierający DNazę. Umieść je w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 do 30 minut lub do momentu, gdy komórki się odłączą.

Następnie delikatnie stukaj w płytki co pięć minut, aby wspomóc dysocjację. W DD5 zmień nośnik na KSR-N2 zawierający FGF2 i IGF1. Następnie przygotuj płytki do hodowli tkankowych do ponownego posiewu na DD8.

W DD7 zmień nośnik na KSR-N2 zawierający FGF2 i IGF1. Na DD8 ponownie pokryć komórki wygładzonym agonistą i dodać atypowy inhibitor PKC. W DD10 zmień nośnik na KSR-N2 zawierający aPKCi.

W DD11 odłącz komórki od płytek dla FACS. Jeśli komórki nie zostały odłączone dla FACS na DD11, zmień nośnik na DD12 z KSR-N2 zawierającym aPKCi. W DD14 zmień nośnik na KSR-N2 zawierający aPKCi.

A na DD16 zmień nośnik na KSR-N2 zawierający aPKCi. Następnie na DD17 zbierz komórki dodatnie Nkx-2.1:mCherry. Pokazano tutaj reprezentatywne obrazy barwienia immunologicznego dla Nkx2.1, Nkx2.1:mCherry i Lhx6:GFP z hodowli różnicowania w 12. dniu.

Zwróć uwagę, że te obrazy są nakładającymi się kanałami z tego samego pola widzenia. Ten wykres przedstawia kwantyfikację średniego odsetka jąder DAPI dodatnich, które wyrażają Nkx2.1 w DD12 w hodowli. Jest to reprezentatywny wykres FACS, pokazujący cztery różne populacje komórek, które można wyizolować za pomocą naszej podwójnej linii reporterowej mESC.

Zauważ, że mCherry znajduje się na osi x, a GFP na osi y. Tak więc prawe górne pole reprezentuje komórki, które są podwójnie dodatnie mCherry-GFP. Oto przebieg czasowy indukcji Nkx2.1: mCherry i Lhx6: GFP od DD6 do 16, wyrażony jako procent komórek w hodowli, które wykazują ekspresję tylko mCherry, GFP tylko ekspresję lub współekspresję mCherry-GFP.

Po opanowaniu protokół ten można ukończyć w ciągu 17 dni od początku do końca, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby zawsze zaczynać od opłucnowych, niezróżnicowanych, zdrowo wyglądających komórek macierzystych. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak przeszczep do kory nowej noworodka lub dorosłego myszy, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące determinacji losu interneuronów lub wpływu przeszczepu interneuronów na funkcję obwodu i zachowanie zwierząt.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się neuronauką rozwojową do zbadania czynników wpływających na determinację losu interneuronów u myszy, a co za tym idzie, u pacjentów dotkniętych zaburzeniami związanymi z interneuronami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać ekspresję Nkx2.1 i ich post-mitotyczne potomstwo z embrionalnych komórek macierzystych myszy. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.