Budowa plazmidów CRISPR i wykrywanie skuteczności nokautu w komórkach ssaków za pomocą systemu Dual Luciferaza Reporterowa

Protokół ten opisuje kluczowe etapy generowania i optymalizacji wydajnych wektorów sgRNA. Nasze wstępne przyspieszenie kandydata na sgRNA ma na celu względny czas i wnioskowanie. Główną zaletą tego protokołu jest to, że umożliwia analizę wycisków kodujących DNA dla każdego z sgRNA bez edycji endogennych genów.

Ta metoda wstępnej selekcji może być również zastosowana do innych środków edycji genów poprzez dwuniciowe przerwy. Rozpocznij od rozcieńczenia liofilizowanych oligonukleotydów do końcowego stężenia 10 mikromolów w wodzie podwójnie destylowanej. Wymieszaj oligonukleotydy do przodu i do tyłu w cienkościennej probówce do PCR w stosunku jeden do jednego bez dodawania dodatkowego buforu.

Inkubuj mieszaninę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie obniż temperaturę do 72 stopni Celsjusza na 10 minut. Usuń mieszaninę oligonukleotydów z maszyny do PCR i pozwól jej ostygnąć w temperaturze pokojowej. Aby strawić wektor pX330-xCas9 z Bbs1, połącz wektor, enzym i bufor trawienny w objętości 50 mikrolitrów i inkubuj reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Po przeprowadzeniu transformacji komórkowej wybierz od pięciu do 10 kolonii bakteryjnych z płytki LB i użyj każdej z nich do zaszczepienia jednego mililitra pożywki LB 60 miligramami ampicyliny w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Następnie inkubuj probówki na wytrząsarce obrotowej przez dwie do trzech godzin. Wykonaj PCR w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem rekombinowanych plazmidów, jak opisano w manuskrypcie tekstowym, a następnie uruchom produkty na 2% żelu agarozowym pod napięciem 10 woltów na centymetr.

Po zidentyfikowaniu dodatnich plazmidów należy ich użyć, wraz z wektorem reporterowym, do kotransfekcji odpowiedniej linii komórkowej. Aby zlizować komórki, usuń pożywkę wzrostową z hodowanych komórek. Delikatnie umyj powierzchnię naczynia hodowlanego PBS i dozuj 100 mikrolitrów PLB do każdej studzienki, aby całkowicie pokryć monowarstwę komórki.

Pozostaw płytkę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie przenieś lizat do probówki lub fiolki w celu dalszego obchodzenia się lub przechowywania. Aby wykonać test podwójnej lucyferazy, zaprogramuj luminometry tak, aby zapewniały dwusekundowe opóźnienie wstępnego odczytu, po którym następuje 10-sekundowy okres pomiaru. Następnie dozuj 100 mikrolitrów odczynnika do oznaczania lucyferazy do odpowiedniej liczby probówek luminometru.

Ostrożnie dodaj 20 mikrolitrów lizatu komórkowego do probówki luminometru i wymieszaj, pipetując dwa lub trzy razy. Umieść rurkę w luminometrze i rozpocznij odczyt. Wyjąć probówkę z próbką z luminometru.

Dodaj 100 mikrolitrów odczynnika stop i krótko zmieszaj, aby wymieszać. Zwróć próbkę do luminometru i rozpocznij odczyt. Rejestruj aktywność lucyferazy Renilla, znormalizowaną do aktywności lucyferazy świetlika, w szczególności odwrotność stosunku wyświetlanego na ekranie.

Po zakończeniu wyrzuć probówkę reakcyjną. Metodę tę wykorzystano do wygenerowania trzech wektorów sgRNA dla owiec DKK2 Exon 1. Wektory eksprymujące sgRNA i xCas9 zbudowano poprzez wstępne trawienie szkieletu wektora, a następnie ligowanie go w serii krótkich, dwuniciowych fragmentów DNA poprzez wyżarzanie par oligonugokątnych.

Siedem kolonii bakteryjnych przebadano za pomocą PCR kierowanego specyficzną parą starterów i wykryto kolonie dodatnie. Zdolności celowania genów pX330-xCas9 T1, T2 i T3 wykryto jednocześnie za pomocą testu podwójnej lucyferazy. Ostatni wektor sgRNA wykazywał najwyższy sygnał detekcji, a następnie został wykorzystany do badań nad edycją genów owiec.

Zgodnie z tym protokołem można przeprowadzić test T7EI lub test rybonukleazy. Te dodatkowe pomiary dają dokładniejsze wrażenia z edycji endogennych genów.