Name: Budowa plazmidów CRISPR i wykrywanie skuteczności nokautu w komórkach ssaków za pomocą systemu Dual Luciferaza Reporterowa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Poznaj metodę budowy plazmidów CRISPR i oceny skuteczności nokautu w komórkach ssaków za pomocą systemu Dual Luciferaza Reporterowa. Protokół umożliwia preselekcję celów sgRNA bez edycji genów endogennych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został sfinansowany przez First Class Grassland Science Discipline Program of Shandong Province (Chiny), National Natural Science Foundation of China (31301936, 31572383), Special Fund for Agro-Science Research in the Public Interest (201403071), National risk assessment major special project of milk product quality and safety (GJFP201800804) oraz Projects of Qingdao People's Livelihood Science and Technology (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).

1. projekt oligonukleotydu sgRNA
<ol>
	<li>Projektuj sgRNA za pomocą narzędzi online, takich jak narzędzie online Cas-Designer (http://www.rgenome.net/cas-designer/). Sekwencja PAM jest ważna w oparciu o używany Cas9. W przypadku xCas9 odpowiednimi sekwencjami PAM są NG, a poprzednie narzędzie online Cas-Designer może generować sgRNA istotne dla xCas9.
	<ol>
		<li>Korzystaj z narzędzi do projektowania sgRNA, które obejmują algorytmy przewidywania na i poza celem (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)11. Preferowany jest wynik 0,2 lub wyższy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz do 3 celów edycji genów w celu optymalnego badania przesiewowego (np. T1, T2 i T3 zostały zaprojektowane dla genu DKK2 eksonu 1 owiec [Tabela 1]).</li>
</ol>
2. Modyfikacja oligonukleotydów
<ol>
	<li>Aby zmodyfikować oligonukleotyd sgRNA, należy usunąć motyw sąsiadujący z protospacerem 3'-NG (PAM), zachowując sekwencję protospacer (np. sekwencję początkową dla T1: TGCCTGCTCCTACTGGCCGC [20 nt]).</li>
	<li>Dodaj pentanukleotyd CACCG do końca 5' oligo. 
	UWAGA: Po podwiązaniu do szkieletu pX330-xCas9, sekwencja ta będzie zawierać koniec 3' promotora U6 motywującego transkrypcję sgRNA. Tablica "CACC" gwarantuje, że oligo pasuje do zwisów plazmidu pX330-xCas9 trawionego przez BbsI. Zasada "G" jest warunkiem wstępnym promotorów polimerazy III RNA i gwarantuje skuteczne uruchomienie transkrypcji sgRNA (np. dołączenie macierzy 5'-CACCG do protospacery T1, osiągnięcie T1-F: CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC [25 nt]). Wydajność rozszczepienia 21 nt gRNA znacznie różni się od wydajności 20 nt gRNA1,12,13,14. Generalnie zaleca się stosowanie 20 nt z 5'-G poprzez wygenerowanie krótszego protospaceranta, jeśli nie jest to możliwe, można użyć 21 nt z dodatkowym 5'-G.</li>
	<li>Utwórz odwrotne dopełnienie (rc) sekwencji protospacer. 
	UWAGA: Na przykład rc protospaceru T1 to GCGGCCAGTAGGAGCAGGCA (20 nt).</li>
	<li>Dołącz AAAC do końca 5' sekwencji protospacerowej rc. Dołącz dodatkowe C do końca 3' rc protospacer. 
	UWAGA: Sekwencja "AAAC" zapewnia, że oligonukleotyd nadaje się do klonowania do trawionego przez BbsI plazmidu pX330-xCas9. Dodatkowe "C" na końcu 3' jest niezbędne do wyżarzania z inicjującym "G" dla opisanej powyżej transkrypcji sgRNA (np. AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC [25 nt] jest końcową sekwencją oligonukleotydową dla protospaceru T1 rc).</li>
	<li>Zamów oligonukleotydy.</li>
</ol>
3. Wyżarzanie oligonukleotydowe
<ol>
	<li>Rozcieńczyć liofilizowane oligonukleotydy do końcowego stężenia 10 μM w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O).</li>
	<li>Wymieszaj oligonukleotydy do przodu i do tyłu w cienkościennej probówce PCR, zachowując stosunek 1:1 (np. 20 μl każdy) bez dodawania dodatkowego buforu.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie zmniejszać temperaturę do 72 °C przez 10 minut. Następnie następuje okres chłodzenia w temperaturze pokojowej (RT), polegający po prostu na wyjęciu próbki z maszyny do PCR i umieszczeniu jej w temperaturze RT. 
	UWAGA: Nie jest konieczne fosforylowanie mieszanin oligonukleotydów w celu ułatwienia ligacji.</li>
</ol>
4. trawienie wektorowe sgRNA/CRISPR
<ol>
	<li>Trawić 1 μg wybranego wektora pX330-xCas9 za pomocą BbsI (10 jednostek enzymu na 1 μg plazmidu) przez 2 godziny w temperaturze 37 °C (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2). Przeprowadzić trawienie wektora ekspresyjnego sgRNA pX330-xCas9 w całkowitej objętości 50 μl, zawierającej 5 μl 10-krotnego buforu wytrawiającego i wody destylowanej, aby osiągnąć ostateczną objętość.</li>
	<li>Oczyść strawiony wektor przez ekstrakcję pasmową z 2% żelu agarozowego poniżej 10 V/cm, a następnie oczyść za pomocą kolumny krzemionkowej przy użyciu dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu.</li>
</ol>
5. Ligacja wyżarzonych oligonukleotydów sgRNA do wektora ekspresji
<ol>
	<li>Wymieszać wyżarzone oligonukleotydy sgRNA (5 μl mieszaniny z kroku 4) z trawionym przez BbsI wektorem pX330-xCas9 (oczyszczonym, 100 ng).</li>
	<li>Dodać 1 μl ligazy i 1 μl 10x buforu ligazy.</li>
	<li>Dodać wodę destylowaną o odpowiedniej objętości, do 10 μL.</li>
	<li>Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
6. Właściwa transformacja komórek
<ol>
	<li>Wyjąć komórki E. coli DH5α z magazynu w temperaturze -80 °C i rozmrozić je na lodzie.</li>
	<li>Dodać 5 μl mieszanki do podwiązania do 50 μl kompetentnej E. coli DH5α i trzymać mieszaninę na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>Szok cieplny mieszaniny w temperaturze 42 °C przez 90 s.</li>
	<li>Odstaw go na lodzie na 2 minuty.</li>
	<li>Odzyskać kulturę na wytrząsarce obrotowej w 500 μl pożywki LB przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umieścić 200 μl kultury na płytce z agarozą LB odpornej na ampicylinę i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
7. Identyfikacja prawidłowych rekombinowanych plazmidów metodą PCR
<ol>
	<li>Wybierz od 5 do 10 kolonii bakteryjnych z płytki LB i użyj każdej z nich do zaszczepienia jednej 1,5 ml probówki zawierającej 1 ml pożywki LB z ampicyliną 60 mg/ml.</li>
	<li>Inkubować probówki na wytrząsarce obrotowej przez 2-3 godziny.</li>
	<li>Przeprowadzić detekcję prawidłowych rekombinowanych plazmidów przy użyciu specyficznych par starterów dla oligonukleotydów sgRNA [np. starter do przodu dla konstrukcji wektora ekspresji T1 sgRNA (T1-F): CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC, starter odwrotny (BbsI-R): AAAGTCCCTATTGGCGTTAC, wytwarzając amplikon 287 bp (<silna klasa="xfig">Rysunek 3)].
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę do PCR (tabela 2).</li>
		<li>Stosować następujące warunki cykliczne PCR: 95 °C przez 5 minut w przypadku denaturacji wstępnej; 30 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 s w przypadku denaturacji, 60 °C przez 30 s w przypadku wyżarzania i 72 °C przez 30 s w przypadku przedłużenia. Po zakończeniu 30 cykli wykonać ostatni etap przedłużania, ogrzewając przez 5 minut w temperaturze 72 °C.</li>
		<li>Uruchom produkt PCR na 2% żelu agarozowym poniżej 10 V/cm. Pasma o odpowiedniej wielkości [np. 287 pz] jest uważana za pozytywną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Sprawdź poprawność sekwencji plazmidu ekspresji sgRNA
<ol>
	<li>Sprawdź sekwencję kolonii dodatnich metodą PCR za pomocą sekwencjonowania Sangera15 przy użyciu odwrotnego startera BbsI-R (patrz krok 7.3). Ten starter wyżarza się w miejscu za wkładem oligo sgRNA. Skonstruowano sekwencję pX330-xCas9-T1 z ekspresją sgRNA zawierającą protospacer TGCCTGCTCCTACTGGGGGCGG i xCas9.</li>
	<li>Użyj startera T1-F, aby zsekwencjonować dodatnie kolonie. Do przodu nie można było podać pełnych informacji o sekwencji dla miejsca otaczającego miejsce insercji oligonugokształtu sgRNA, ponieważ nie można było dokładnie odczytać fragmentu 30-50 pz następującego po starterze sekwencjonowania.</li>
</ol>
9. Budowa wektora reporterowego podwójnej lucyferazy
<ol>
	<li>Zsyntetyzuj fragmenty DNA o długości 300-500 pz zawierające cele sgRNA i sklonuj je do podwójnego wektora reporterowego lucyferazy poprzez podwójne trawienie [np. Subklonuj fragment eksonu DKK2 owiec o długości 440 pz do plazmidu pSSA-Dual16,17 przy użyciu podwójnego trawienia z AscI i SalI, w wyniku czego powstaje pSSA-Dual-DKK2].</li>
	<li>Zsyntetyzuj fragmenty DNA o długości 300-500 pz zawierające cele sgRNA. Należy pamiętać, że sekwencje fragmentów DNA muszą być częściami sekwencji genomowych, które można uzyskać ze strony internetowej NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) lub powiązanych odniesień.</li>
	<li>Wybierz odpowiedni wektor reporterowy podwójnej lucyferazy, taki jak pSSA-Dual16,17 (lub dwa wektory wyrażające odpowiednio lucyferazy świetlika i lucyferazy renilli), a następnie trawią ten wektor i fragmenty DNA wymienione powyżej za pomocą dwóch endonukleaz, takich jak AscI i SalI.</li>
	<li>Na koniec podwiązaj te dwa fragmenty za pomocą ligazy DNA T4, w wyniku czego powstaje pSSA-Dual-Target. Szczegółowe informacje dotyczące podwójnego trawienia i podwiązania przedstawiono odpowiednio w Tabeli 3 i Tabeli 4. Warto wspomnieć, że wektor reporterowy powinien być amplifikowany w stabilnych szczepach bakterii (takich jak Top10), które zaleca się hodować z mniejszą prędkością obrotową (zwykle nie większą niż 200 obr./min), w celu uniknięcia rekombinacji DNA.</li>
</ol>
10. Transfekcja komórek
<ol>
	<li>Wyodrębnij plazmidy wolne od endotoksyn dla wektorów wymienionych powyżej. Oceń czystość i stężenie plazmidów za pomocą odpowiednich instrumentów. Dla tych plazmidów zaleca się stężenie końcowe nie mniejsze niż 500 ng/μl i stosunek czystości 1,7-1,9 przy absorbancji 260/280 nm (A260/A280).</li>
	<li>Współtransfekować odpowiednią linię komórkową, taką jak PIEC18 z plazmidami w równych proporcjach (np. pX330-xCas9-T1: pSSA-Dual-DKK2=1:1, plazmid 0,5 μg dla każdej duplikacji przy użyciu płytki 24-dołkowej). Użyj pustego wektora, takiego jak pX330-xCas9, jako kontroli ujemnej.
	<ol>
		<li>Na dzień przed transfekcją umieścić komórki w 24-dołkowej płytce hodowlanej o gęstości 2 x 105 komórek/basenik. Komórki będą gotowe do transfekcji, gdy osiągną konfluencję 60-80%.</li>
		<li>Przed punktem czasowym transfekcji usunąć supernatant tak bardzo, jak to możliwe i delikatnie dodać 0,5 ml świeżej pożywki do każdej studzienki.</li>
		<li>Rozcieńczyć odczynnik do transfekcji w pożywce DMEM w stosunku 1:25 i dobrze wymieszać.</li>
		<li>Przygotować wzorcową mieszaninę DNA, rozcieńczając 0,5 μg DNA w 25 μl pożywki DMEM, a następnie dodać 1 μl odczynnika P3000.</li>
		<li>Dodaj rozcieńczone DNA do każdej probówki rozcieńczonego odczynnika do transfekcji (stosunek 1:1).</li>
		<li>Inkubować przez 10–15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodaj 50 μl kompleksu DNA-lipid do komórek.</li>
		<li>Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Następnie przeanalizuj transfekowane komórki, jak w kroku 11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
11. Wykrywanie podwójnej lucyferazy
<ol>
	<li>Przygotuj wystarczającą ilość 1x pasywnego buforu do lizy (PLB), dodając 1 objętość 5x PLB do 4 objętości wody destylowanej i dobrze wymieszaj.</li>
	<li>Bierna liza komórek hodowanych na 24-dołkowych płytkach hodowlanych.
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę wzrostową z hodowanych komórek i delikatnie nałożyć wystarczającą ilość soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby umyć powierzchnię naczynia hodowlanego. Krótko zamieszaj naczynie, aby usunąć oderwane komórki i resztki pożywki wzrostowej. Całkowicie usuń roztwór płuczący przed nałożeniem odczynnika PLB.</li>
		<li>Dozuj 100 μl 1x PLB do każdej studzienki, aby całkowicie pokryć monowarstwę komórkową. Pozostaw płytki hodowlane na 20 minut.</li>
		<li>Przenieść lizat do probówki lub fiolki w celu dalszego obchodzenia się lub przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować odczynnik do oznaczania lucyferazy (LAR) poprzez ponowne zawieszenie dostarczonego liofilizowanego substratu do oznaczania lucyferazy w 10 ml dostarczonego buforu do oznaczania lucyferazy.</li>
	<li>Przygotować odpowiednią objętość do wykonania żądanej liczby testów reporterowych podwójnej lucyferazy (100 μl odczynnika na test). Dodaj 1 objętość 50-krotnego substratu do 50 objętości buforu zatrzymującego w szklanej lub silikonowanej probówce polipropylenowej.</li>
	<li>Test reporterowy z podwójną lucyferazy (DLR)
	<ol>
		<li>Zaprogramuj luminometry tak, aby zapewniały 2-sekundowe opóźnienie wstępnego odczytu, po którym następuje 10-sekundowy okres pomiaru.</li>
		<li>Wstępnie dozuj 100 μl odczynnika do oznaczania lucyferazy do odpowiedniej liczby probówek luminometru, aby ukończyć żądaną liczbę testów DLR.</li>
		<li>Ostrożnie przenieść do 20 μl lizatu komórkowego do probówki luminometru zawierającej LAR; wymieszać pipetując 2 lub 3 razy. Umieść rurkę w luminometrze i rozpocznij odczyt.</li>
		<li>Wyjąć probówkę z próbką z luminometru, dodać 100 μl odczynnika zatrzymującego i krótko odmieszać, aby wymieszać. Wymień próbkę w luminometrze i rozpocznij odczyt.</li>
		<li>Zapisz aktywność lucyferazy renilla znormalizowaną do aktywności lucyferazy świetlika, a mianowicie odwrotność stosunku wyświetlanego na ekranie.</li>
		<li>Wyrzuć probówkę reakcyjną i przejdź do następnego testu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surrogate+reporter+system+for+multiplexable+evaluation+of+CRISPR%2FCas9+in+targeted+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1042(2018).</li>
<li>Nageshwaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+Guide+RNA+Cloning+for+Mammalian+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li>
<li>Dang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+sgRNA+structure+to+improve+CRISPR-Cas9+knockout+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency.</a> Genome Biology. 16, 280(2015).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRscan%3A+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
<li>Yang, L., Yang, J. L., Byrne, S., Pan, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Directed+Genome+Editing+of+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 107, 1-17 (2014).</li>
<li>Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas-mediated+targeted+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas-mediated targeted genome editing in human cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).</li>
<li>Vidigal, J. A., Ventura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+one-step+generation+of+paired+gRNA+CRISPR-Cas9+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries.</a> Nature Communications. 6, 8083(2015).</li>
<li>Mazon, G., Mimitou, E. P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Homologous+recombination+in+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Homologous recombination in DNA double-strand break repair.</a> Cell. 142 (4), 646(2010).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li>
<li>Lee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+CRISPR-Cas9+to+increase+its+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity.</a> Nature Communications. 9 (1), 3048(2018).</li>
<li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+gene+knockout+in+mice+and+zebrafish+with+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases.</a> Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Ruan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+transgene+knockin+at+the+H11+locus+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs.</a> Scientific Reports. 5, 14253(2015).</li>
<li>An plasmid with double fluorescent groups and its application as standard substance. China patent. , 201210509946.1 (2012).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+porcine+p65+subunit+of+NF-kappaB+and+its+association+with+virus+antibody+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the porcine p65 subunit of NF-kappaB and its association with virus antibody levels.</a> Molecular Immunology. 48 (6-7), 914-923 (2011).</li>
<li>A pair of sgRNAs targeting porcine RELA gene. China patent. , 201510398717.0 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisane przez nas procedury klonowania wektorów sgRNA ułatwiają wydajną produkcję sgRNA, przy czym większość kosztów wynika z porządkowania oligonukleotydów i sekwencjonowania wektorów. Podczas gdy opisana metoda została zaprojektowana, aby umożliwić użytkownikom generowanie sgRNA do użytku z CRISPR/Cas9, protokół można łatwo dostosować do użytku z ortologiami Cas9 lub innymi endonukleazami kierowanymi przez RNA, takimi jak Cpf1, wprowadzając drobne modyfikacje do szkieletu wektora i sekwencji zwisających oligonukleotydó...

SgRNA CRISPR składają się z 20-nukleotydowej sekwencji (protospacer), która jest komplementarna do genomowej sekwencji docelowej1,2. Chociaż system CRISPR/Cas jest bardzo wydajny, zdolność systemu CRISPR/Cas do modyfikowania danego miejsca genomowego wymaga wygenerowania wektora przenoszącego wydajne sgRNA unikalne dla miejsca docelowego (miejsc docelowych)2. W tym artykule opisano kluczowe etapy generowania tego wektora sgRNA.
Dla udanej edycji genomu za pomocą systemu CRISPR/Cas, kluczowym warunkiem wstępnym jest użycie wysoce wydajnych sgRNA3,4,5. Ponieważ zmodyfikowane nukleazy używane do edycji genomu wykazują różną wydajność w różnych docelowych loci1, wstępna selekcja potencjalnych celów sgRNA jest konieczna, aby zaoszczędzić czas i wysiłek6,7,8,9. System podwójnej lucyferazy reporterowej został opracowany w celu oceny skuteczności nokautu poprzez badanie naprawy pęknięć dwuniciowych za pomocą wyżarzania pojedynczej nici3,10. Tutaj używamy tego systemu reporterowego, aby wybrać preferowany cel CRISPR sgRNA spośród różnych potencjalnych wektorów sgRNA przeznaczonych do określonej edycji genów. Przedstawiony tutaj protokół był wdrażany w naszej grupie i współpracujących laboratoriach przez ostatnie kilka lat w celu generowania i oceny sgRNA CRISPR.
Poniższy protokół podsumowuje, jak zaprojektować odpowiednie sgRNA za pomocą oprogramowania sieciowego. Po wybraniu odpowiednich sgRNA opisujemy różne etapy uzyskiwania wymaganych oligonukleotydów, a także podejście do wprowadzania sparowanych oligonukleotydów do wektora ekspresyjnego pX330-xCas9. Przedstawiamy również metodę składania wektorów reporterowych z ekspresją sgRNA i podwójnej lucyferazy opartej na ligacji tych sekwencji do wstępnie strawionego wektora ekspresji (kroki 2-10, <silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Na koniec opisujemy, jak analizować skuteczność cięcia DNA dla każdego z sgRNA (kroki 11-12).

<table><tbody><tr><td>Nowa generacja pełnodotykowego gradientowego instrumentu PCR</td><td>LongGene</td><td>A200</td><td>Amplifikacja genu docelowego</td></tr><tr><td>Enzymy restrykcyjne AscI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0558V</td><td>Cięcie wektorów docelowych</td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny BbsI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0539S</td><td>Cięcie wektorów docelowych</td></tr><tr><td>Czysty stół warsztatowy</td><td>AIRTECH</td><td>SW-CJ-2FD/VS-1300L-U</td><td>Urządzenie do częściowego oczyszczania w postaci pionowego przepływu laminarnego, które tworzy lokalne środowisko o wysokim poziomie czystości powietrza</td></tr><tr><td>DH5&alpha; Kompetentne komórki</td><td>TaKaRa</td><td>K613</td><td>Transformacja wektora plazmidowego</td></tr><tr><td>System testów reporterowych Dual-Lucyferas</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td>Test reporterowy z podwójnymi lucyferami</td></tr><tr><td>Elektryczna termostatyczna łaźnia wodna</td><td>Sanfa Scientific Instruments</td><td>DK-S24</td><td>Odczynnik grzewczy o stałej temperaturze w łaźni wodnej</td></tr><tr><td>Elektroforeza</td><td>Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.</td><td>DYY-6C</td><td>Napięcie sterujące, prąd itp.</td></tr><tr><td>Eppendorf Reference 2</td><td>Eppendorf Chiny Sp. z o.o.</td><td>Odniesienie 2</td><td>Dokładnie narysuj i przenieś ślady analizatora obrazowania płynnego</td></tr><tr><td>żelu</td><td>Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.</td><td>WD-9413B</td><td>Do analizy obrazów żelu do elektroforezy</td></tr><tr><td>Luminometr GloMax 20/20</td><td>Promega</td><td>E5311</td><td>Wykrywanie podwójnej aktywności lucyferazy</td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem o dużej prędkości</td><td>BMH</td><td>sigma 3K15</td><td>Ekstrakcja i oczyszczanie kwasów nukleinowych</td></tr><tr><td>Inteligentny inkubator biochemiczny</td><td>Sanfa Scientific Instruments</td><td>SHP-160</td><td>Zapewnij odpowiednie środowisko temperaturowe do eksperymentu z trawieniem enzymatycznym</td></tr><tr><td>LB Broth Agar</td><td>Sangon Biotech</td><td>A507003-0250</td><td>Do hodowli E.coli</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Zestaw odczynników do transfekcji</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000015</td><td>Transfekcja DNA</td></tr><tr><td>Enzymy restrykcyjne SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3138V</td><td>Cięcie wektorów docelowych</td></tr><tr><td>Żel DNA w kolumnie SanPrep Zestaw do ekstrakcji</td><td>Sangon Biotech</td><td>B518131-0050</td><td>Recykling fragmentów DNA</td></tr><tr><td>SanPrep Kolumna Plasmid Mini-Preps Kit</td><td>Sangon Biotech</td><td>B518191-0100</td><td>Ekstrakcja plazmidu DNA</td></tr><tr><td>Ligaza DNA</td><td>T4 New England Biolabs</td><td>M0202V</td><td>Link Fragment DNA</td></tr><tr><td>TaKaRa MiniBEST Zestaw do oczyszczania fragmentów DNA Ver.4.0</td><td>TaKaRa</td><td>9761</td><td>Oczyszczanie DNA</td></tr><tr><td>Pionowy ciśnieniowy sterylizator parowy</td><td>JIBIMED</td><td>LS-50LD</td><td>Wysoka temperatura i autoklaw do zabijania bakterii, grzybów i innych mikroorganizmów w sprzęcie laboratoryjnym</td></tr><tr><td>Termostat do kąpieli wodnej</td><td>Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.</td><td>SHZ-82</td><td>Niech bakterie nadal się trzęsą, co jest dobre w kontakcie z powietrzem.</td></tr></tbody></table>

budowa plazmidów crispr i wykrywanie skuteczności nokautu w komórkach ssaków za pomocą systemu dual luciferaza reporterowa

Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System

Chociaż wysoce efektywna, modyfikacja miejsca genomowego przez enzym CRISPR wymaga wcześniejszego wygenerowania sgRNA unikalnego dla docelowego miejsca (miejsc). W pracy opisano kluczowe kroki prowadzące do budowy wydajnych wektorów sgRNA przy użyciu strategii, która pozwala na skuteczne wykrywanie dodatnich kolonii za pomocą PCR przed sekwencjonowaniem DNA. Ponieważ wydajna edycja genomu przy użyciu systemu CRISPR wymaga wysoce wydajnego sgRNA, konieczna jest wstępna selekcja potencjalnych celów sgRNA, aby zaoszczędzić czas i wysiłek. System podwójnej lucyferazy reporterowej został opracowany w celu oceny skuteczności nokautu poprzez badanie naprawy pęknięć dwuniciowych poprzez wyżarzanie pojedynczej nici. Tutaj używamy tego systemu reporterowego, aby wybrać preferowany cel xCas9 / sgRNA z kandydatów na wektory sgRNA do określonej edycji genów. Przedstawiony protokół zapewni preferowany wektor enzymatyczny sgRNA/CRISPR w ciągu 10 dni (zaczynając od odpowiednio zaprojektowanych oligonukleotydów).

Metody opisane w niniejszym protokole służą do konstrukcji wektorów ekspresyjnych sgRNA i xCas9, a następnie do przesiewowej optymalizacji oligos sgRNA o stosunkowo wyższej wydajności celowania w gen. Przedstawiamy tutaj reprezentatywny przykład 3 celów sgRNA dla eksonu 1 genu DKK2 owcy. Wektory ekspresyjne sgRNA i xCas9 można zbudować poprzez wstępne trawienie szkieletu wektora (Ryc. 2), a następnie ligację serii krótkich dwuniciowych fragmentów DNA poprzez hybrydyzację par oligosó...

Tutaj prezentujemy protokół opisujący uproszczoną metodę efektywnego generowania plazmidów wyrażających zarówno enzym CRISPR, jak i związane z nim pojedyncze przewodnikowe RNA (sgRNA). Kotransfekcja komórek ssaków za pomocą tego wektora sgRNA/CRISPR i wektora reporterowego podwójnej lucyferazy, który bada naprawę pęknięć dwuniciowych, umożliwia ocenę skuteczności nokautu.

Budowa plazmidów CRISPR i wykrywanie skuteczności nokautu w komórkach ssaków za pomocą systemu Dual Luciferaza Reporterowa

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. ...

Protokół ten opisuje kluczowe etapy generowania i optymalizacji wydajnych wektorów sgRNA. Nasze wstępne przyspieszenie kandydata na sgRNA ma na celu względny czas i wnioskowanie. Główną zaletą tego protokołu jest to, że umożliwia analizę wycisków kodujących DNA dla każdego z sgRNA bez edycji endogennych genów.Ta metoda wstępnej selekcji może być również zastosowana do innych środków edycji genów poprzez dwuniciowe przerwy. Rozpocznij od rozcieńczenia liofilizowanych oligonukleotydów do końcowego stężenia 10 mikromolów w wodzie podwójnie destylowanej. Wymieszaj oligonukleotydy do przodu i do tyłu w cienkościennej probówce do PCR w stosunku jeden do jednego bez dodawania dodatkowego buforu.Inkubuj mieszaninę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie obniż temperaturę do 72 stopni Celsjusza na 10 minut. Usuń mieszaninę oligonukleotydów z maszyny do PCR i pozwól jej ostygnąć w temperaturze pokojowej. Aby strawić wektor pX330-xCas9 z Bbs1, połącz wektor, enzym i bufor trawienny w objętości 50 mikrolitrów i inkubuj reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.Po przeprowadzeniu transformacji komórkowej wybierz od pięciu do 10 kolonii bakteryjnych z płytki LB i użyj każdej z nich do zaszczepienia jednego mililitra pożywki LB 60 miligramami ampicyliny w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Następnie inkubuj probówki na wytrząsarce obrotowej przez dwie do trzech godzin. Wykonaj PCR w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem rekombinowanych plazmidów, jak opisano w manuskrypcie tekstowym, a następnie uruchom produkty na 2% żelu agarozowym pod napięciem 10 woltów na centymetr.Po zidentyfikowaniu dodatnich plazmidów należy ich użyć, wraz z wektorem reporterowym, do kotransfekcji odpowiedniej linii komórkowej. Aby zlizować komórki, usuń pożywkę wzrostową z hodowanych komórek. Delikatnie umyj powierzchnię naczynia hodowlanego PBS i dozuj 100 mikrolitrów PLB do każdej studzienki, aby całkowicie pokryć monowarstwę komórki.Pozostaw płytkę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie przenieś lizat do probówki lub fiolki w celu dalszego obchodzenia się lub przechowywania. Aby wykonać test podwójnej lucyferazy, zaprogramuj luminometry tak, aby zapewniały dwusekundowe opóźnienie wstępnego odczytu, po którym następuje 10-sekundowy okres pomiaru. Następnie dozuj 100 mikrolitrów odczynnika do oznaczania lucyferazy do odpowiedniej liczby probówek luminometru.Ostrożnie dodaj 20 mikrolitrów lizatu komórkowego do probówki luminometru i wymieszaj, pipetując dwa lub trzy razy. Umieść rurkę w luminometrze i rozpocznij odczyt. Wyjąć probówkę z próbką z luminometru.Dodaj 100 mikrolitrów odczynnika stop i krótko zmieszaj, aby wymieszać. Zwróć próbkę do luminometru i rozpocznij odczyt. Rejestruj aktywność lucyferazy Renilla, znormalizowaną do aktywności lucyferazy świetlika, w szczególności odwrotność stosunku wyświetlanego na ekranie.Po zakończeniu wyrzuć probówkę reakcyjną. Metodę tę wykorzystano do wygenerowania trzech wektorów sgRNA dla owiec DKK2 Exon 1. Wektory eksprymujące sgRNA i xCas9 zbudowano poprzez wstępne trawienie szkieletu wektora, a następnie ligowanie go w serii krótkich, dwuniciowych fragmentów DNA poprzez wyżarzanie par oligonugokątnych.Siedem kolonii bakteryjnych przebadano za pomocą PCR kierowanego specyficzną parą starterów i wykryto kolonie dodatnie. Zdolności celowania genów pX330-xCas9 T1, T2 i T3 wykryto jednocześnie za pomocą testu podwójnej lucyferazy. Ostatni wektor sgRNA wykazywał najwyższy sygnał detekcji, a następnie został wykorzystany do badań nad edycją genów owiec.Zgodnie z tym protokołem można przeprowadzić test T7EI lub test rybonukleazy. Te dodatkowe pomiary dają dokładniejsze wrażenia z edycji endogennych genów.

construction-crispr-plasmids-detection-knockout-efficiency-mammalian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Zegary okołodobowe funkcjonują w obrębie poszczególnych komórek, tzn. są autonomiczne komórkowo. W niniejszej pracy opisujemy metody tworzenia autonomicznych komórkowo modeli zegara z wykorzystaniem nieinwazyjnej technologii bioluminescencji w czasie rzeczywistym opartej na lucyferazie. Komórki reporterowe stanowią praktyczne, funkcjonalne systemy modelowe do badania biologii okołodobowej.

Monitorowanie komórkowych autonomicznych rytmów okołodobowych ekspresji genów z wykorzystaniem reporterów bioluminescencyjnych lucyferazy

Opisano metodę obserwacji pojedynczych cząsteczek DNA w żywych komórkach. Technika ta opiera się na wiązaniu białka represora lac znakowanego fluorescencyjnie do miejsc wiążących wprowadzonych do badanego DNA. Metodę tę można dostosować do śledzenia wielu rekombinowanych cząsteczek DNA w żywych komórkach w czasie.

Monitorowanie replikacji plazmidów w żywych komórkach ssaków na przestrzeni wielu pokoleń za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Prezentujemy szybką i tanią metodę przesiewową do identyfikacji regulatorów transkrypcji za pomocą wysokoprzepustowych transfekcji robotycznych i domowego testu lucyferazy o podwójnym świeceniu.  Protokół ten szybko generuje bezpośrednie dane funkcjonalne dla tysięcy genów i można go łatwo modyfikować w celu ukierunkowania na dowolny gen będący przedmiotem zainteresowania.

Wysokoprzepustowe funkcjonalne badania przesiewowe przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

CRISPR/Cas9 to solidny system do wywoływania zakłóceń w genach i elementach genetycznych. W tym miejscu opisujemy protokół skutecznego tworzenia delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR/Cas9.

Generowanie delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków za pomocą CRISPR/Cas9

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

CRISPR-Cas to potężna technologia do inżynierii złożonych genomów roślin i zwierząt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół skutecznej edycji ludzkiego genomu przy użyciu różnych endonukleaz Cas. Zwracamy uwagę na ważne kwestie i parametry projektowe, aby zoptymalizować wydajność edycji.

Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas

Technologia CRISPR-Cas9 zapewnia efektywną metodę precyzyjnej edycji genomu ssaków w dowolnym typie komórki i stanowi nowatorski sposób przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych całego genomu. Szczegółowy protokół omawiający kroki wymagane do pomyślnego przeprowadzenia zbiorczych badań przesiewowych CRISPR-Cas9 dla całego genomu znajduje się tutaj.

Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków

Ten protokół wykorzystuje fluorescencyjne reportery i sortowanie komórek, aby uprościć eksperymenty z wykorzystaniem fagów i linii komórek T. Do tych uproszczonych eksperymentów knock-in stosuje się dwa plazmidy, a mianowicie plazmid z ekspresją CRISPR/Cas9 i DsRed2 oraz plazmid dawcy z ekspresją rekombinacji homologicznej EBFP2, który jest trwale zintegrowany w locus Rosa26 w komórkach odpornościowych.

Knock-in genu przez CRISPR/Cas9 i sortowanie komórek w liniach makrofagów i limfocytów T

To badanie przedstawia podwójny system CRISPRi ukierunkowany na długie, niekodujące RNA w komórkach czerniaka. Umożliwia kombinatoryczne knockdown genów i syntetyczne badania przesiewowe ze skutkiem śmiertelnym, identyfikując interakcje lncRNA specyficzne dla raka dla potencjalnych strategii terapeutycznych.

Strategia podwójnej interferencji CRISPR do celowania w syntetyczne śmiertelne interakcje między niekodującymi RNA w komórkach nowotworowych

Badanie opisuje metodę eksperymentów o wysokiej przepustowości z wykorzystą matrycę LED drukowaną w 3D, aby zoptymalizować ekspresję genów indukowanych światłem w HEK293T komórkach.

Szybka optymalizacja systemu indukowalnego światłem do kontroli ekspresji genów ssaków

Poznaj metodę budowy plazmidów CRISPR i oceny skuteczności nokautu w komórkach ssaków za pomocą systemu Dual Luciferaza Reporterowa. Protokół umożliwia preselekcję celów sgRNA bez edycji genów endogennych.

Budowa plazmidów CRISPR i wykrywanie skuteczności nokautu w komórkach ssaków za pomocą systemu Dual Luciferaza Reporterowa

Przeglądaj więcej filmów