Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Ogólnym celem poniższego protokołu jest umożliwienie badania funkcji genów w skali całego genomu poprzez jednoczesne monitorowanie wielu odczytów komórkowych. W tej demonstracji reportery oparte na lucyferazach Firefly RAN i Cipro Dina są wykorzystywane odpowiednio do monitorowania aktywności szlaków P 53, WINT i KRAS. Trzy te reportery są współtransfekowane wraz z irna skierowanym przeciwko wybranemu genowi do komórek HCT one 16, linii komórkowej raka jelita grubego.

Następnie w lizatach komórkowych mierzy się aktywności lucyferazy świetlika i waniliowej, natomiast aktywność lucyferazy Cipro DEA, która jest enzymem wydzielanym, mierzy się w pożywce hodowlanej. Uzyskane wyniki wykazują powtarzalność systemu analizy oraz zdolność do ujawniania wspólnych i unikalnych działań genów w obrębie tych trzech ścieżek istotnych dla procesów nowotworowych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikromacierze czy sondy wielokolorowe, jest to, że stanowi ona przystępny, uniwersalny i kosztowo efektywny sposób analizy komórkowych produktów transkrypcji. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na pytania w badaniach nad nowotworami, takie jak opracowanie strategii terapeutycznych ukierunkowanych molekularnie. Choć nasz protokół transfekcji przejściowej wymaga nakładu IL i minimalnego czasu przygotowawczego do konfiguracji przesiewu, prawdopodobnie zwiększy on zmienność sygnału między poszczególnymi studniami, co można zniwelować poprzez analizę stosunków raportowych zamiast wartości bezwzględnych z poszczególnych studni. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przemyć PBS pięć płytek o wymiarach 10 cm² z komórkami HCT 116 o konfluencji 80-90%, a następnie zebrać komórki z każdej płytki poprzez trypsynizację.

Użyj jednego mililitra roztworu trypsyny, a następnie zneutralizuj go 10 mililitrami DMEM zawierającego 2% FBS i 1% penicyliny. Streptomyciny. Przenieś zawiesinę komórek do probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów i wiruj przy około 130 G przez pięć minut. Odlej supernatant i resuspenduj osad komórkowy w 10 mililitrach pożywki.

Policz komórki za pomocą licznika komórek, a następnie przygotuj zawiesinę komórkową o stężeniu 10⁵ komórek/ml. Odmierz 150 ml zawiesiny komórkowej do kolejnego etapu, używając automatycznego dozownika cieczy MultiDrop do płytek. Do każdej studzienki 96-dołkowej płytki hodowlanej nanieś 100 µl, co odpowiada 10⁴ komórek na studzienkę.

Zawiesina komórkowa w tym przypadku powinna być wystarczająca do wysiania w 1296 studzienkach. Płytki z komórkami należy inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 podczas przygotowywania mieszaniny do transfekcji. Wykorzystany tutaj wysokiej jakości DNA konstruktu reporterowego został wyizolowany przy użyciu standardowych zestawów MIDI prep i rozcieńczony do stężenia końcowego 1 mg/mL.

Dla każdego reportera przygotować 100 µL roztworu zapasu konstruktu reporterowego, łącząc następujące składniki: 30 µL P 53, FL, 30 µL eight X-T-C-F-R-L, 30 µL elk one G, 4 µL U-A-S-C-L oraz 4 µL H₂O. W wyniku tego powstanie mieszanina DNA z końcowym stosunkiem reporterów wynoszącym 1:1:1:0,2 i końcowym stężeniem DNA wynoszącym 0,3 mg/mL. Następnie przygotować mieszaniny do transfekcji I-R-N-A-D-N-A w ilości wystarczającej do transfekcji 1296.

W płytkach do hodowli rozcieńczamy 80 µL roztworu zapasu konstruktu reporterowego w 8 mL buforu EC z zestawu QIAGEN, aby otrzymać roztwór DNA o końcowej stężeniu 3 µg/mL na płytkę. Następnie przenosimy 20 µL roztworu DNA do każdego dołka płytki PCR z 96 dołkami. Liczba płytek 96-dołkowych zależy od liczby testowanych pul irna.

Na przykład w tym przypadku będziemy potrzebować 4 płytek 96-dołkowych do oceny 384 różnych pul siRNA. Używając zautomatyzowanego systemu do pipetowania Biome, przenieś 2 µL każdego siRNA o stężeniu 5 µM do odpowiedniego dołka płytki PCR zawierającej rozcieńczony zapas DNA. Następnie dodaj 1 µL roztworu wzmacniającego (enhancer solution) do każdego dołka płytki z DNA i siRNA.

Pozostawić reakcję wzmacniania w temperaturze pokojowej na pięć minut. Następnie dodać trzy µL odczynnika do transfekcji do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez kolejne 10 minut. Aby przerwać tworzenie kompleksów transfekcyjnych, dodać 10 µL DMEM zawierającego 2% FBS oraz 1% penicyliny i streptomycyny do każdego dołka płytki PCR.

Wyjąć z inkubatora płytki 96-dołkowe zawierające komórki HCT 116. Przenieść 10 µL mieszaniny do transfekcji do każdego dołka płytki 96-dołkowej z komórkami, ponieważ każda transfekcja będzie przeprowadzona w trzech powtórzeniach. Tą samą mieszaninę należy nanieść na dwie dodatkowe płytki 96-dołkowe zawierające komórki.

Inkubuj komórki z mieszaninami do transfekcji w temperaturze 37°C w środowisku nawilżonym z 5% carbon dioxide przez 36 godzin. 36 godzin po transfekcji komórek aktywność lucyferazy jest gotowa do pomiaru.

Ponieważ badanie to obejmuje wiele reporterów, z czego jeden jest wydzielany do pożywki hodowlanej, a dwa pozostałe są ekspresyjne w cytoplazmie komórkowej, pomiary będą wykonywane zarówno w pożywce hodowlanej, jak i w lizacie komórkowym w celu wykrycia aktywności lucyferazy Cipro Dina lub CL w hodowli. Płyta powtórna pożywki.

20 µL pożywki hodowlanej do białej nieprzezroczystej płytki 96-dołkowej. Za pomocą dozownika wielokanałowego dodaj 20 µL buforu do analizy CL do każdego dołka. Następnie dodaj 10 µL Cipro Dina Lucifer i substratu do każdego dołka i zmierz aktywność CL za pomocą luminometru w celu wykrycia aktywności lucyferazy świetlika oraz lucyferazy vanilla; uprzednio należy przygotować lizaty komórkowe.

Usuń pożywkę z hodowli komórkowych, odwracając każdą płytkę do góry dnem i wylewając pożywkę do zlewu. Pozostałą pożywkę usuń, delikatnie stukując odwróconą płytkę o ręczniki papierowe. Do każdego dołka z komórkami dodaj 30 µL jednokrotnego buforu do pasywnej lizy.

Umieść płytki na platformie kołyszącej ustawionej na średnią prędkość na pięć minut w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach dodaj 20 µL odczynnika do analizy lucyferazy do każdej studni z komórkami i natychmiast zmierz aktywność lucyferazy świetlikowej za pomocą luminometru. Następnie dodaj odczynnik stop and glow, aby wygasić aktywność lucyferazy świetlikowej, a następnie zmierz aktywność lucyferazy.

Przed zastosowaniem multipleksowania indywidualnie oceniono odporność trzech różnych platform przesiewowych. Wskazane linie komórkowe raka jelita grubego przetransfekowano ośmioma konstruktami reporterowymi kodującymi Firefly Luciferase dla XTCF, PP 53, ta Luke lub ALK1, wraz z pulami siRNAs celujących odpowiednio w WINT, beta-Catenin, P 53 lub KAS. Dla każdej linii komórkowej wskazano genotypy istotne dla danej ścieżki sygnałowej.

Skuteczność każdej platformy przesiewowej oceniono na podstawie powtarzalności tych indukowanych efektów w odpowiednim szlaku transdukcji sygnału. Jak pokazują te reprezentatywne wyniki, betaina i siRNA nie wpływają na aktywność ośmiu reporterów XTCF w komórkach RKO. Jest to kontrast w stosunku do komórek DLD1 i HCT116, które odpowiednio wykazują niedobór w szlaku APC, białka supresorowego oraz ekspresują aktywowaną formę β-kateniny.

Następnie wykazano, że reportery te mogą być stosowane wspólnie do jednoczesnych pomiarów aktywności genów w szlakach transdukcji sygnału beta-catenin, P 53 oraz KRAS z wykorzystaniem pul siRNA wskazanych na tych wykresach. Względna aktywność lucyferazy jest przedstawiona na osi Y, natomiast na osi X znajdują się siRNA celujące w wskazane geny zainteresowania. Na przykład pula siRNA celująca w beta-catenin redukuje aktywność szlaku beta-catenin, nie wpływając znacząco na szlaki P 53 i KRAS.

Podczas próby opracowania multipleksowego systemu reporterowego ważne jest zoptymalizowanie wybranej linii komórkowej pod kątem regionu transfekcji oraz zamierzonego sygnału reporterowego.