Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Ogólnym celem poniższego protokołu jest umożliwienie badania funkcji genów w skali genomu poprzez jednoczesne monitorowanie wielu odczytów komórkowych. W tej demonstracji reportery oparte na Firefly RAN i lucyferazie Cipro Dina są używane do monitorowania aktywności szlaku P 53 WINT i KRAS. Ci trzej reporterzy są transektowani za pomocą irna, którego celem jest gen będący przedmiotem zainteresowania w HCT 16 komórek, linii komórkowej raka jelita grubego.

Następnie w lizatach komórkowych mierzy się aktywność lucyferazy świetlika i wanilii, podczas gdy aktywność lucyferazy Cipro DEA. Wydzielany enzym jest mierzony w kulturze. Uzyskuje się wyniki pożywki, które pokazują odtwarzalność systemu testowego, a także zdolność do ujawnienia wspólnych i unikalnych działań genów w obrębie tych trzech szlaków istotnych dla raka.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikropromieniowanie lub wielokolorowe, jest to, że jest to niedrogi, uniwersalny i opłacalny sposób patrzenia na wyniki transkrypcji komórkowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania w badaniach nad rakiem, takie jak rozwój strategii terapeutycznych ukierunkowanych molekularnie. Chociaż nasz przejściowy protokół transfekcji wysiłek IL i minimalne początkowe zaangażowanie czasowe na konfigurację ekranu, prawdopodobnie zwiększy to zmienność sygnału od studni do studni, czemu można przeciwdziałać, patrząc na proporcje raportu, zamiast patrzeć na bezwzględne awarie ze studni Aby rozpocząć tę procedurę, umyj pięć 10-centymetrowych kwadratowych płytek z 80 do 90% zlewającymi się HCT 16 komórkami PBS, a następnie zbierz komórki przez trypsynę dla każdej płytki.

Użyj jednego mililitra roztworu trypsyny, a następnie zneutralizuj 10 mililitrami DMEM zawierającego 2% FBS i 1% penicyliny. Streptomycyna przenosi zawieszone komórki do 50-mililitrowej stożkowej probówki i wiruje przy około 130 G przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach pożywki.

Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek, a następnie przygotuj roztwór komórek z 10 do piątych komórek na mililitr. Zachowaj 150 mililitrów zawiesiny komórek do następnego kroku za pomocą automatycznej płytki dozującej płyn z wieloma kroplami. 100 mikrolitrów lub 10 do czwartej komórki w każdym dołku 96-dołkowej płytki hodowlanej.

Zawiesina komórek w tym przypadku powinna być wystarczająca do posiewu 1296. Płytki studzienne inkubują płytki z komórkami w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla, przygotowując mieszaninę transfekcyjną. Zastosowany tutaj wysokiej jakości konstrukt reporterowy DNA został wyizolowany przy użyciu standardowych zestawów przygotowawczych MIDI i rozcieńczony do końcowego stężenia jednego miligrama na mililitr.

Dla każdego reportera przygotuj 100 mikrolitrów roztworu podstawowego do konstruowania reportera, łącząc następujące 30 mikrolitrów P 53, FL 30 mikrolitrów ośmiu X-T-C-F-R-L, 30 mikrolitrów łosia jeden G, cztery sześć mikrolitrów U-A-S-C-L i cztery mikrolitry H dwa oh. Spowoduje to powstanie mieszaniny DNA o końcowym stosunku jeden do jednego do jednego do 0,2 reporterów i końcowym stężeniu DNA wynoszącym 0,3 miligrama na mililitr. Następnie przygotuj mieszaniny transfekcyjne I-R-N-A-D-N-A wystarczające do transektowania 1296.

Płytki studzienkowe rozcieńczają 80 mikrolitrów reporterowego roztworu podstawowego w ośmiu mililitrach buforu EC z zestawu do efektowania QIAGEN, aby uzyskać roztwór DNA o końcowym stężeniu trzech mikrogramów na płytkę mililitrową. 20 mikrolitrów roztworu DNA do każdej studzienki 96-dołkowej płytki PCR. Liczba 96 płytek dołkowych będzie zależała od tego, ile basenów irna ma zostać przetestowanych.

Na przykład w tym przypadku do oceny będziemy potrzebować 4 96-dołkowych płytek. 384 różne pule sir a za pomocą automatycznego urządzenia do obsługi płynów biomu przenoszą dwa mikrolitry każdego z pięciu mikromolowych siRNA do odpowiedniego dołka płytki PCR zawierającej rozcieńczony zapas DNA. Następnie dodaj jeden mikrolitr roztworu wzmacniacza do każdej studzienki płytki siRNA DNA.

Pozwól, aby reakcja wzmacniacza zaszła w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodaj trzy mikrolitry odczynnika do transfekcji do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 10 minut. Aby zatrzymać tworzenie się kompleksu transfekcji, dodaj 10 mikrolitrów DMEM zawierającego 2% FBS i 1% streptomycyny penicyliny do każdego dołka płytki PCR.

Pobrać z inkubatora 1296 płytek dołkowych zawierających HCT 16 komórek. Przenieść 10 mikrolitrów mieszaniny transfekcyjnej do każdego dołka 96-dołkowej płytki zawierającej komórki, ponieważ każda transfekcja zostanie wykonana w trzech powtórzeniach. Ta sama mieszanina zostanie nałożona na dwie dodatkowe 96-dołkowe płytki zawierające komórki.

Inkubować komórki z mieszaninami transfekcji w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym środowisku z 5% dwutlenkiem węgla przez 36 godzin. 36 godzin po transfekcji komórek. Aktywność lucyferazy jest gotowa do pomiaru.

Ponieważ badanie to obejmuje wiele reporterów, z których jeden wydziela się do pożywki hodowlanej, a dwa inne ulegają ekspresji w cytoplazmie komórki. Pomiary zostaną uzyskane zarówno z pożywki hodowlanej, jak i lizatu komórkowego w celu wykrycia lucyferazy Cipro Dina lub aktywności CL w kulturze. Średnia płyta repliki.

20 mikrolitrów pożywki hodowlanej na białą, nieprzezroczystą płytkę 96-dołkową. Za pomocą multi drop dodaj 20 mikrolitrów buforu testowego CL do każdej studzienki. Następnie dodaj 10 mikrolitrów Cipro Dina Lucifer i substratu do każdej studzienki i wykryj aktywność CL za pomocą luminometru, aby wykryć aktywność lucyferazy świetlików i lucyferazy waniliowej, najpierw należy wykonać lizaty komórkowe.

Usuń pożywkę hodowlaną z komórek, odwracając każdą płytkę do góry nogami i wrzucając pożywkę do zlewu. Usuń pozostałe podłoże, delikatnie stukając odwróconą płytką o ręczniki papierowe. Dodaj 30 mikrolitrów jednego x pasywnego buforu do lizy do każdej studzienki komórek.

Umieść talerze na bujaku platformy ustawionym na średnią prędkość na pięć minut w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach dodaj 20 mikrolitrów odczynnika do oznaczania lucyferazy do każdej studzienki komórek i natychmiast zmierz aktywność lucyferazy świetlika za pomocą luminometru. Następnie dodaj odczynnik stop and glow, aby ugasić aktywność lucyferazy świetlika, a następnie zmierz aktywność lucyferazy.

Przed multipleksowaniem indywidualnie oceniano solidność trzech różnych platform przesiewowych. Wskazane linie komórkowe raka jelita grubego transfekowano ośmioma konstruktami reporterowymi XTCF, PP, 53, ta, Luke lub ALK, jednym konstruktem reporterowym kodującym lucyferazy Firefly wraz z pulami siRNA ukierunkowanymi odpowiednio na WINT beta-kateninę, P 53 lub KAS. Wskazano genotypy istotne dla szlaku dla każdej linii komórkowej.

Wytrzymałość każdej platformy przesiewowej oceniono na podstawie odtwarzalności tych indukowanych efektów na odpowiedni szlak transdukcji sygnału. Jak wykazano w tych reprezentatywnych wynikach, betaina i siRNA nie mają wpływu na aktywność ośmiu reporterów XTCF w komórkach RKO. W przeciwieństwie do DLD one i HCT one 16 komórek, które mają odpowiednio niedobór szlaku A PC, białka supresorowego i wyrażają aktywowaną formę beca teniny.

Następnie wykazano, że reportery te mogą być używane razem do jednoczesnych pomiarów aktywności genów szlaków transdukcji sygnału wiatru beta-kateniny P 53 i KRAS przy użyciu wskazanych pul IRNA na tych wykresach. Względna aktywność lucyferazy jest pokazana na osi Y, a siRNA ukierunkowane na wskazany gen zainteresowania są pokazane na osi X. Na przykład pula siRNA ukierunkowana na beta-kateninę zmniejsza aktywność szlaku beta-kateniny wiatru, nie wpływając jednocześnie znacząco na szlaki P 53 i KRA S.

Próbując opracować system reporterowy multipleksu, ważne jest, aby zoptymalizować linię komórkową zainteresowania pod kątem regionu transfekcji i intencji sygnału reporterowego.