Name: Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Poznaj multipleksowaną platformę przesiewową opartą na lucyferazie do badania transdukcji sygnału P53, WNT i KRAS w komórkach HCT116. Ta metoda umożliwia jednoczesne monitorowanie aktywności szlaków nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie finansowe od CPRIT (RP100119) i Welch Foundation (I-1665).

Cały protokół trwa około 4 dni.
1. Przygotowanie komórek do transfekcji siRNA i reporterowej
Przedstawimy tutaj protokół do przeszukiwania bibliotek siRNA przy użyciu małego zestawu siRNA (384 różne zestawy pul siRNA w formacie 96 dołków, z których każda składa się z 4 siRNA ukierunkowanych na pojedynczy gen) z biblioteki siRNA dla celów ilustracyjnych. W tym konkretnym badaniu wykorzystamy komórki HCT116, które wykazują dewiacyjną sygnalizację Wnt i Kras oraz aktywność p53. Właściwa linia komórkowa w badaniach mających na celu zbadanie innych procesów komórkowych będących przedmiotem zainteresowania będzie musiała zostać zidentyfikowana i oceniona w podobny sposób.
<ol>
	<li>Umyj5 x 10 cm 2 płytki z 80-90% zlewającymi się komórkami HCT116 PBS, a następnie zbierz komórki przez trypsynizację przy użyciu 1 ml roztworu/płytki trypsynizacji, a następnie zneutralizuj 10 ml zmodyfikowanej pożywki orła (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny/płytki.</li>
	<li>Przenieść zawieszone komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy ~130 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml DMEM / 2% FBS / 1% penicyliny / streptomycyny.</li>
	<li>Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek, a następnie przygotuj roztwór komórek z 105 komórkami / ml, zachowaj 150 ml zawiesiny komórek do następnego kroku. Płytka 10:4 komórki (100 μl) w każdym dołku 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej za pomocą automatycznego dozownika płynów Multidrop (zwanego dalej Multidrop). W tym przypadku zawiesina komórek powinna być wystarczająca do posiewu płytek 12 x 96-dołkowych.</li>
	<li>Inkubować płytki z komórkami w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% stężeniem CO2 , przygotowując mieszaninę do transfekcji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu stockowego do konstruowania reportera
<ol>
	<li>Wyizoluj wysokiej jakości DNA reporterowe za pomocą standardowych zestawów midiprep (NucleoBond Xtra Midi produkowane przez Clontech) i rozcieńcz DNA do końcowego stężenia 1 mg / ml dla każdego reportera.</li>
	<li>Przygotować 100 μl roztworu podstawowego do konstruowania reportera, łącząc 30 μl p53-FL, 30 μl 8X TCF-RL, 30 μl Elk1-Gal4, 6 μl UAS-CL i 4 μlH2O, aby uzyskać mieszaninę DNA o końcowym stosunku reporterów 1:1:1:0,2. Końcowe stężenie DNA w tym roztworze podstawowym mieszanki DNA wynosi 0,3 mg/ml.</li>
</ol>
3. Przygotowanie mieszanki do transfekcji siRNA/DNA
W tej części protokołu przygotujemy mieszanki transfekcji siRNA/DNA, które będą wystarczające do transfekcji płytek 12 x 96 dołków. W przypadku tej biblioteki testowej składającej się z 4 x 96-dołkowej płytki siRNA będziemy transfekować każdą pulę siRNA w trzech egzemplarzach. Odczynnik do transfekcji, którego będziemy używać, nazywa się Effectene (Qiagen). W naszych rękach jest to jedyny odczynnik, który działa na rzecz jednoczesnego dostarczania siRNA i DNA do hodowanych komórek.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 80 μl roztworu podstawowego konstruktu reporterowego w 8 ml buforu EC (Effectene Kit) w celu uzyskania roztworu DNA o końcowym stężeniu 3 μg/ml. Ogólnie rzecz biorąc, przygotuj wystarczającą ilość mieszanki roztworów DNA do natychmiastowego użycia.</li>
	<li>Płytkę 20 μl tego roztworu DNA do każdego dołka 96 dołków / płytki. Liczba 96 płytek dołkowych będzie zależała od tego, ile pul siRNA zostanie przetestowanych. Na przykład w tym przypadku będziemy potrzebować 4 x 96 płytek dołkowych, aby ocenić 384 różne pule siRNA.</li>
	<li>SiRNA, które mają być badane, powinny mieć podstawowe stężenie 5 μM. Jeśli nie, można je powieleć i rozcieńczyć do tego stężenia przy użyciu zalecanego buforu rozcieńczającego związanego z każdą biblioteką.</li>
	<li>Przenieść 2 μl każdego zasobnika siRNA o wielkości 5 μM do odpowiedniego dołka płytki PCR zawierającej rozcieńczony materiał podstawowy DNA za pomocą automatycznego urządzenia do obsługi cieczy Biomek. W zależności od skali badania może wystarczyć pipetor wielokanałowy.</li>
	<li>Teraz dodamy 1 μl roztworu Enhancer (zestaw Effectene) do każdego dołka płytki DNA/siRNA. Również w tym przypadku można to osiągnąć za pomocą automatycznego urządzenia do obsługi cieczy lub pipetatora wielokanałowego.</li>
	<li>Pozostawić reakcję wzmacniacza w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie dodać 3 μl odczynnika do transfekcji Effectene do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 10 minut.</li>
	<li>Aby zatrzymać tworzenie się kompleksu transfekcji, dodaj 10 μl DMEM / 2% FBS / 1% penicyliny / streptomycyny do każdego dołka płytki PCR.</li>
	<li>Przenieść 10 μl mieszanki transfekcyjnej do każdego dołka z 96-dołkowej płytki zawierającej komórki (pobranej z inkubatora komórkowego). Ponieważ każda transfekcja będzie wykonywana w trzech powtórzeniach, ta sama mieszanina zostanie nałożona na dwie dodatkowe 96-dołkowe płytki zawierające komórki.</li>
	<li>Inkubować komórki z mieszaninami transfekcji dodanymi w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku z 5% CO2 przez 36 godzin.</li>
</ol>
4. Określ aktywność lucyferazy na podstawie próbek komórek
Po 36 godzinach, aktywność lucyferazy jest gotowa do pomiaru w transfekowanych komórkach. Punkt końcowy powinien być określany dla każdego eksperymentu. W naszym badaniu 36-godzinny czas inkubacji dał wcześniej wystarczająco silny sygnał do określenia znaczenia. Ponieważ badanie to obejmuje wiele reporterów (jeden wydzielany do pożywki hodowlanej, a dwa inne ulegają ekspresji w cytoplazmie komórki), uzyskamy pomiary zarówno z pożywki hodowlanej, jak i lizatu komórkowego.
<ol>
	<li>Wykrywanie aktywności CL w pożywce hodowlanej:
	<ol>
		<li>20 μl pożywki hodowlanej umieszcza się w postaci repliki na białej, nieprzezroczystej płytce 96-dołkowej (przy użyciu płynu do obsługi Biomek lub pipetora wielokanałowego).</li>
		<li>Dodać 20 μl buforu do oznaczania CL (systemy celowania) do każdej studzienki.</li>
		<li>Dodać 10 μl substratu lucyferyny Cypridina (systemy celownicze) do każdej studzienki i wykryć aktywność CL za pomocą luminometru (na przykład czytnika płytek Pherastar produkowanego przez BMG).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie aktywności FL i RL:
	<ol>
		<li>Poddać komórki lizie, usuwając najpierw pożywkę hodowlaną. Można to szybko osiągnąć, odwracając talerz do góry nogami i wrzucając medium do zlewu. Pozostały nośnik można usunąć, delikatnie stukając odwróconą płytką o ręczniki papierowe. Dodaj 30 μl 1X Passive Lysis Buffer (Promega) do każdej studzienki komórek za pomocą Multidrop i umieść na kołysce platformy (Bellco jest jedną z firm, która je produkuje) ustaw średnią prędkość na 5 minut w RT.</li>
		<li>Dodać 20 μl odczynnika do oznaczania lucyferazy II (część zestawu Promega Dual Luciferazy) za pomocą Multidrop i natychmiast zmierzyć aktywność FL za pomocą luminometru. Następnie dodaj odczynnik Stop & Glo (Promega), który wygasi aktywność FL i umożliwi pomiar aktywności RL. Uwaga: o ile nie używasz mieszanek substratów, które pozwalają na wydłużenie czasu trwania sygnału (takich jak zestawy Dual-Glo Lucyferazy firmy Promega), użycie zestawów flash wymaga szybkiego pomiaru po dodaniu substratu (w ciągu 5 minut).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescent+and+bioluminescent+reporter+gene+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays.</a> Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).</li>
<li>Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+light%3A+luminescent+reporter+gene+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+%26+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Seeing the light: luminescent reporter gene assays.</a> Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 14, 648-657 (2011).</li>
<li>McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+systems+in+Drosophila%3A+a+synthesis+of+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space.</a> Trends in Genetics: TIG. 20, 384-391 (2004).</li>
<li>Smirnova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Neh2-luciferase+reporter+and+its+application+for+high+throughput+screening+and+real-time+monitoring+of+Nrf2+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of Neh2-luciferase reporter and its application for high throughput screening and real-time monitoring of Nrf2 activators.</a> Chem. Biol. 18, 752-765 (2011).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-mediated+disruption+of+Wnt-dependent+signaling+in+tissue+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer.</a> Nat. Chem. Biol. 5, 100-107 (2009).</li>
<li>Tang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+RNAi+screen+for+Wnt%2Fbeta-catenin+pathway+components+identifies+unexpected+roles+for+TCF+transcription+factors+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A genome-wide RNAi screen for Wnt/beta-catenin pathway components identifies unexpected roles for TCF transcription factors in cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9697-9702 (2008).</li>
<li>Multiplexed Luciferase Reporter Assay Systems. United States patent. , (2012).</li>
<li>Funk, W. D., Pak, D. T., Karas, R. H., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptionally+active+DNA-binding+site+for+human+p53+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes.</a> Mol. Cell Biol. 12, 2866-2871 (1992).</li>
<li>DasGupta, R., Kaykas, A., Moon, R. T., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+the+Wnt-wingless+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of the Wnt-wingless signaling pathway.</a> Science. 308, 826-833 (2005).</li>
<li>Korinek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+epithelial+stem-cell+compartments+in+the+small+intestine+of+mice+lacking+Tcf-4%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4.</a> Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).</li>
<li>Korinek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+members+of+the+Tcf+family+implicated+in+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+during+embryogenesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two members of the Tcf family implicated in Wnt/beta-catenin signaling during embryogenesis in the mouse.</a> Mol. Cell Biol. 18, 1248-1256 (1998).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+characterization+of+human+colon+and+rectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer.</a> Nature. 487, 330-337 (2012).</li>
<li>Koboldt, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. , (2012).</li>
<li>Wood, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+landscapes+of+human+breast+and+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers.</a> Science. 318, 1108-1113 (2007).</li>
<li>Berndt, J. D., Biechele, T. L., Moon, R. T., Major, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+genome-wide+RNA+interference+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of genome-wide RNA interference screens.</a> Science Signaling. 2, pt4(2009).</li>
<li>Falschlehner, C., Steinbrink, S., Erdmann, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+to+dissect+cellular+pathways%3A+a+how-to+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening to dissect cellular pathways: a how-to guide.</a> Biotechnology Journal. 5, 368-376 (2010).</li>
<li>Boutros, M., Bras, L. P., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell-based+RNAi+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell-based RNAi screens.</a> Genome Biology. 7, R66(2006).</li>
<li>Gilbert, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multiplex+cell+viability+assay+for+high-throughput+RNAi+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening.</a> PLoS ONE. 6, e28338(2011).</li>
</ol>

O.K. i L.L są autorami oczekującego patentu dotyczącego technologii multipleksowanej lucyferazy.

Istnieje kilku dostawców systemów reporterowych opartych na lucyferazie (takich jak Promega, Targeting Systems, New England BIolabs i Thermo Fisher), którzy zapewniają przydatne zasoby on-line dla tych, którzy po raz pierwszy bawią się ekranem o wysokiej przepustowości. Ponadto pomocny powinien być szereg doskonałych przeglądów dotyczących optymalizacji wykorzystania wysokoprzepustowych badań przesiewowych do odkrywania genów oraz tego, w jaki sposób wyniki badań przesiewowych opartych na RNAi można zintegrować z innymi ...

Na rynku dostępne są różne reportery oparte na lucyferazie do monitorowania różnorodnych procesów biologicznych komórek. Większość tych konstruktów DNA koduje białka lucyferazy, które są indukowane do ekspresji przez określone bodźce komórkowe lub perturbacje. Najbardziej wytrzymałe reportery oparte na transkrypcji umieszczają ekspresję enzymu lucyferazy pod kontrolą syntetycznych elementów wzmacniających lub regionów promotora genów, dobrze znanych ze względu na ich niezawodność w zgłaszaniu fizjologicznie istotnego zdarzenia transkrypcyjnego1,2. Istnieją również systemy lucyferazy transreporterowej, które wykorzystują GAL4-UAS do napędzania ekspresji białka lucyferazy. Gal4 jest aktywatorem transkrypcji drożdży, a UAS jest wzmacniaczem, z którym Gal4 specyficznie się wiąże, aby aktywować transkrypcję sekwencji genów umieszczonych poniżej niego3. Tego typu systemy lucyferazy są zazwyczaj wspierane przez dwa plazmidy DNA - jeden koduje białko GAL4 połączone z częścią regulatorową białka będącego przedmiotem zainteresowania, a drugi koduje białko lucyferazy umieszczone pod kontrolą jednej lub więcej sekwencji UAS. W ten sposób sygnał lucyferazy komórkowej odzwierciedla poziom aktywności białka będącego przedmiotem zainteresowania. Innym powszechnym zastosowaniem reporterów opartych na lucyferazy jest monitorowanie stabilności białek, w którym białko będące przedmiotem zainteresowania jest łączone z enzymem lucyferazy4. Niezależnie od typu reportera, odnotowuje się tu zastrzeżenie emptor, ponieważ nie można zakładać, że specyfika któregokolwiek z reporterów została dobrze przesłuchana. W związku z tym wymagana jest należyta staranność przy włączaniu nowych konstruktów reporterskich do każdej strategii badawczej.
Wybór odczytu enzymu lucyferazy może być równie ważny, jak wiarygodność elementów DNA, które kontrolują jego ekspresję. Podczas gdy lucyferazy świetlików (FL) są najczęściej stosowanym enzymem w dostępnych na rynku konstruktach, pojawienie się nowych systemów reporterowych lucyferazy, które nie wymagają ATP (jak w przypadku reakcji opartych na FL) lub zawierają bardziej stabilne enzymy, które emitują silniejsze sygnały, obiecuje poprawę wydajności i niezawodności tej platformy badawczej. Ważną uwagą dotyczącą wyboru reporterów lucyferazy w badaniach chemicznych jest podatność FL na hamowanie chemiczne, które może prowadzić do fałszywych doniesień. Z naszego doświadczenia wynika, że inne enzymy, takie jak lucyferazy Renilla lub Gaussia (odpowiednio RL i GL), które wykorzystują koelennterazinę jako substrat, są mniej łatwo hamowane przez małe cząsteczki5.
Najczęstszym formatem do multipleksowania odczytów lucyferazy jest użycie FL i RL, głównie ze względu na dostępność łatwych w użyciu zestawów z możliwością sekwencyjnego pomiaru aktywności enzymatycznej z pojedynczej próbki. W większości zestawów próbki są najpierw wystawiane na działanie lucyferyny, aby ujawnić poziomy aktywności FL, a następnie odczynnik hartujący, który jest jednocześnie osadzany z koelennterazyną, aby uzyskać wtórny sygnał RL. Wraz z dodaniem innych lucyferazy, które mogą być wydzielane, takich jak GL lub które wykorzystują jeszcze inny substrat, taki jak lucyferazy Cypridina (CL), pojawiła się większa liczba możliwości generowania danych o wysokiej zawartości przy użyciu lucyferazy. Przykład badania przesiewowego RNAi całego genomu przy użyciu tej techniki można znaleźć tutaj6. Ten postęp technologiczny z kolei pobudził rozwój specyficznych mechanizmów wygaszania każdego typu enzymu lucyferazy w celu ograniczenia przesłuchów7. W naszych rękach zauważamy większą częstotliwość "efektów brzegowych" (niewytłumaczalnych trendów w aktywności komórkowej związanych z krawędzią płytek hodowlanych o wysokim mianie), z wydzielanymi lucyferazy, takimi jak GL lub CL. Z drugiej strony, takie wydzielane lucyferazy są przydatne w testach kinetycznych, ponieważ umożliwiają pobieranie próbek sygnału bez zafałszowania żywotności komórek.
Na potrzeby naszego badania przedstawionego tutaj, będziemy jednocześnie monitorować aktywność trzech procesów komórkowych istotnych dla raka: szlaków transdukcji sygnału p53, Kras i Wnt. Reporterzy uwzględnieni w naszym badaniu to reporter pp53-TA-Luc FL firmy Clontech (zwany dalej reporterem p53-FL)8, system reporterski Elk1-GAL4/UAS-CL (zwany dalej reporterem Elk-1; Agilent) i reporter 8X TCF RL, który zawiera wiele syntetycznych elementów wzmacniających rozpoznawanych przez regulatory transkrypcji szlaku Wnt, znane jako czynniki komórek T (lub TCF)9-11.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>PathDetect Elk1 Trans-Reporting System</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td></td><td></td>219005</tr><tr><td>System profilowania szlaków lucyferazy 4 pp53-TA-Luc Vector</td><td>Clontech Lab Inc.</td><td></td><td></td>631914</tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Effectene</td><td>Qiagen Inc.</td><td></td><td></td>301427</tr><tr><td>System do oznaczania reporterowego z podwójnym lucyferazy</td>, <td>Promega Corp.</td><td>E1960</td><td></td></tr><tr><td>Cypridina Odczynnik do oznaczania lucyferazy</td><td>Systemy celowania</td><td>VLAR-1</td><td></td></tr><tr><td>HCT116 komórki</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td></td></tr><tr><td>Test cytotoksyczności CytoTox-Fluo</td><td>Promega Corp.</td><td>G9260</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>MultiFlo Dozownik mikropłytek</td><td>Labsystems Inc.</td><td>Model 832</td><td></td></tr><tr><td>Stacja robocza automatyzacji laboratorium Biomek FXP</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>A31842</td><td></td></tr><tr><td>PHERAstar FS-wielomodowy czytnik mikropłytek HTS</td><td>BMG Labtech Inc.</td><td>0471-101A</td> Hemacytometry <td></td></tr><tr><td>Reichert Bright-Line</td><td>Hausser Scientific Company</td><td>1490</td><td></td></tr></tbody></table>

multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Badanie funkcji genu na skalę genomu za pomocą interferencji RNA (RNAi) daje ogromne nadzieje na szybką identyfikację chemicznie podatnych na uszkodzenia komórek rakowych. Ograniczeniem potencjału tej technologii jest niemożność szybkiego określenia mechanistycznych podstaw wyników fenotypowych, a tym samym poinformowania o rozwoju molekularnie ukierunkowanych strategii terapeutycznych. Przedstawiamy tutaj metody dekonstrukcji fenotypów komórkowych indukowanych przez celowanie genowe za pośrednictwem RNAi przy użyciu multipleksowanych systemów reporterowych, które umożliwiają monitorowanie kluczowych procesów związanych z komórkami rakowymi. Ta metodologia badań przesiewowych o wysokiej zawartości jest wszechstronna i może być łatwo dostosowana do badań przesiewowych innych typów dużych bibliotek molekularnych.

Pomimo postępów w mapowaniu krajobrazu mutacyjnego różnych nowotworów dzięki masowemu sekwencjonowaniu genomów12-14, wciąż brakuje systematycznego podejścia pozwalającego na przełożenie tych obserwacji na strategie interwencyjne. W raku jelita grubego (CRC) mutacje, które według przewidywań wpływają na komponenty trzech procesów komórkowych – sygnalizacji Wnt/β-catenin, p53 oraz Kras – występują w 99% wszystkich guzów, co sugeruje, że są one kluczowymi czynnikami transformacji komórkowej w jelitach13</sup...

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Ogólnym celem poniższego protokołu jest umożliwienie badania funkcji genów w skali całego genomu poprzez jednoczesne monitorowanie wielu odczytów komórkowych. W tej demonstracji reportery oparte na lucyferazach Firefly RAN i Cipro Dina są wykorzystywane odpowiednio do monitorowania aktywności szlaków P 53, WINT i KRAS. Trzy te reportery są współtransfekowane wraz z irna skierowanym przeciwko wybranemu genowi do komórek HCT one 16, linii komórkowej raka jelita grubego.Następnie w lizatach komórkowych mierzy się aktywności lucyferazy świetlika i waniliowej, natomiast aktywność lucyferazy Cipro DEA, która jest enzymem wydzielanym, mierzy się w pożywce hodowlanej. Uzyskane wyniki wykazują powtarzalność systemu analizy oraz zdolność do ujawniania wspólnych i unikalnych działań genów w obrębie tych trzech ścieżek istotnych dla procesów nowotworowych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikromacierze czy sondy wielokolorowe, jest to, że stanowi ona przystępny, uniwersalny i kosztowo efektywny sposób analizy komórkowych produktów transkrypcji. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na pytania w badaniach nad nowotworami, takie jak opracowanie strategii terapeutycznych ukierunkowanych molekularnie. Choć nasz protokół transfekcji przejściowej wymaga nakładu IL i minimalnego czasu przygotowawczego do konfiguracji przesiewu, prawdopodobnie zwiększy on zmienność sygnału między poszczególnymi studniami, co można zniwelować poprzez analizę stosunków raportowych zamiast wartości bezwzględnych z poszczególnych studni. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przemyć PBS pięć płytek o wymiarach 10 cm² z komórkami HCT 116 o konfluencji 80-90%, a następnie zebrać komórki z każdej płytki poprzez trypsynizację.Użyj jednego mililitra roztworu trypsyny, a następnie zneutralizuj go 10 mililitrami DMEM zawierającego 2% FBS i 1% penicyliny. Streptomyciny. Przenieś zawiesinę komórek do probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów i wiruj przy około 130 G przez pięć minut. Odlej supernatant i resuspenduj osad komórkowy w 10 mililitrach pożywki.Policz komórki za pomocą licznika komórek, a następnie przygotuj zawiesinę komórkową o stężeniu 10⁵ komórek/ml. Odmierz 150 ml zawiesiny komórkowej do kolejnego etapu, używając automatycznego dozownika cieczy MultiDrop do płytek. Do każdej studzienki 96-dołkowej płytki hodowlanej nanieś 100 µl, co odpowiada 10⁴ komórek na studzienkę.Zawiesina komórkowa w tym przypadku powinna być wystarczająca do wysiania w 1296 studzienkach. Płytki z komórkami należy inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 podczas przygotowywania mieszaniny do transfekcji. Wykorzystany tutaj wysokiej jakości DNA konstruktu reporterowego został wyizolowany przy użyciu standardowych zestawów MIDI prep i rozcieńczony do stężenia końcowego 1 mg/mL.Dla każdego reportera przygotować 100 µL roztworu zapasu konstruktu reporterowego, łącząc następujące składniki: 30 µL P 53, FL, 30 µL eight X-T-C-F-R-L, 30 µL elk one G, 4 µL U-A-S-C-L oraz 4 µL H₂O. W wyniku tego powstanie mieszanina DNA z końcowym stosunkiem reporterów wynoszącym 1:1:1:0,2 i końcowym stężeniem DNA wynoszącym 0,3 mg/mL. Następnie przygotować mieszaniny do transfekcji I-R-N-A-D-N-A w ilości wystarczającej do transfekcji 1296.W płytkach do hodowli rozcieńczamy 80 µL roztworu zapasu konstruktu reporterowego w 8 mL buforu EC z zestawu QIAGEN, aby otrzymać roztwór DNA o końcowej stężeniu 3 µg/mL na płytkę. Następnie przenosimy 20 µL roztworu DNA do każdego dołka płytki PCR z 96 dołkami. Liczba płytek 96-dołkowych zależy od liczby testowanych pul irna.Na przykład w tym przypadku będziemy potrzebować 4 płytek 96-dołkowych do oceny 384 różnych pul siRNA. Używając zautomatyzowanego systemu do pipetowania Biome, przenieś 2 µL każdego siRNA o stężeniu 5 µM do odpowiedniego dołka płytki PCR zawierającej rozcieńczony zapas DNA. Następnie dodaj 1 µL roztworu wzmacniającego (enhancer solution) do każdego dołka płytki z DNA i siRNA.Pozostawić reakcję wzmacniania w temperaturze pokojowej na pięć minut. Następnie dodać trzy µL odczynnika do transfekcji do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez kolejne 10 minut. Aby przerwać tworzenie kompleksów transfekcyjnych, dodać 10 µL DMEM zawierającego 2% FBS oraz 1% penicyliny i streptomycyny do każdego dołka płytki PCR.Wyjąć z inkubatora płytki 96-dołkowe zawierające komórki HCT 116. Przenieść 10 µL mieszaniny do transfekcji do każdego dołka płytki 96-dołkowej z komórkami, ponieważ każda transfekcja będzie przeprowadzona w trzech powtórzeniach. Tą samą mieszaninę należy nanieść na dwie dodatkowe płytki 96-dołkowe zawierające komórki.Inkubuj komórki z mieszaninami do transfekcji w temperaturze 37°C w środowisku nawilżonym z 5% carbon dioxide przez 36 godzin. 36 godzin po transfekcji komórek aktywność lucyferazy jest gotowa do pomiaru.Ponieważ badanie to obejmuje wiele reporterów, z czego jeden jest wydzielany do pożywki hodowlanej, a dwa pozostałe są ekspresyjne w cytoplazmie komórkowej, pomiary będą wykonywane zarówno w pożywce hodowlanej, jak i w lizacie komórkowym w celu wykrycia aktywności lucyferazy Cipro Dina lub CL w hodowli. Płyta powtórna pożywki.20 µL pożywki hodowlanej do białej nieprzezroczystej płytki 96-dołkowej. Za pomocą dozownika wielokanałowego dodaj 20 µL buforu do analizy CL do każdego dołka. Następnie dodaj 10 µL Cipro Dina Lucifer i substratu do każdego dołka i zmierz aktywność CL za pomocą luminometru w celu wykrycia aktywności lucyferazy świetlika oraz lucyferazy vanilla; uprzednio należy przygotować lizaty komórkowe.Usuń pożywkę z hodowli komórkowych, odwracając każdą płytkę do góry dnem i wylewając pożywkę do zlewu. Pozostałą pożywkę usuń, delikatnie stukując odwróconą płytkę o ręczniki papierowe. Do każdego dołka z komórkami dodaj 30 µL jednokrotnego buforu do pasywnej lizy.Umieść płytki na platformie kołyszącej ustawionej na średnią prędkość na pięć minut w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach dodaj 20 µL odczynnika do analizy lucyferazy do każdej studni z komórkami i natychmiast zmierz aktywność lucyferazy świetlikowej za pomocą luminometru. Następnie dodaj odczynnik stop and glow, aby wygasić aktywność lucyferazy świetlikowej, a następnie zmierz aktywność lucyferazy.Przed zastosowaniem multipleksowania indywidualnie oceniono odporność trzech różnych platform przesiewowych. Wskazane linie komórkowe raka jelita grubego przetransfekowano ośmioma konstruktami reporterowymi kodującymi Firefly Luciferase dla XTCF, PP 53, ta Luke lub ALK1, wraz z pulami siRNAs celujących odpowiednio w WINT, beta-Catenin, P 53 lub KAS. Dla każdej linii komórkowej wskazano genotypy istotne dla danej ścieżki sygnałowej.Skuteczność każdej platformy przesiewowej oceniono na podstawie powtarzalności tych indukowanych efektów w odpowiednim szlaku transdukcji sygnału. Jak pokazują te reprezentatywne wyniki, betaina i siRNA nie wpływają na aktywność ośmiu reporterów XTCF w komórkach RKO. Jest to kontrast w stosunku do komórek DLD1 i HCT116, które odpowiednio wykazują niedobór w szlaku APC, białka supresorowego oraz ekspresują aktywowaną formę β-kateniny.Następnie wykazano, że reportery te mogą być stosowane wspólnie do jednoczesnych pomiarów aktywności genów w szlakach transdukcji sygnału beta-catenin, P 53 oraz KRAS z wykorzystaniem pul siRNA wskazanych na tych wykresach. Względna aktywność lucyferazy jest przedstawiona na osi Y, natomiast na osi X znajdują się siRNA celujące w wskazane geny zainteresowania. Na przykład pula siRNA celująca w beta-catenin redukuje aktywność szlaku beta-catenin, nie wpływając znacząco na szlaki P 53 i KRAS.Podczas próby opracowania multipleksowego systemu reporterowego ważne jest zoptymalizowanie wybranej linii komórkowej pod kątem regionu transfekcji oraz zamierzonego sygnału reporterowego.

a-multiplexed-luciferase-based-screening-platform-for-interrogating

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wielofunkcyjna platforma przesiewowa oparta na luciferase dla badania transmisji sygnałów związanych z rakiem w hodowanych komórkach

Zegary okołodobowe funkcjonują w obrębie poszczególnych komórek, tzn. są autonomiczne komórkowo. W niniejszej pracy opisujemy metody tworzenia autonomicznych komórkowo modeli zegara z wykorzystaniem nieinwazyjnej technologii bioluminescencji w czasie rzeczywistym opartej na lucyferazie. Komórki reporterowe stanowią praktyczne, funkcjonalne systemy modelowe do badania biologii okołodobowej.

Monitorowanie komórkowych autonomicznych rytmów okołodobowych ekspresji genów z wykorzystaniem reporterów bioluminescencyjnych lucyferazy

W tym filmie opisujemy metodę podkreślającą użyteczność testu bioluminescencyjnego do czułych i szybkich badań przesiewowych leków. Leki te mogą być testowane samodzielnie lub w połączeniu w celu oceny synergizmu w ich sposobie działania.

Test oparty na bioluminescencji komórkowej: wysokoprzepustowa metoda kombinatorycznych badań przesiewowych leków

W tym filmie demonstrujemy szybki, jednorazowy test do oceny żywotności komórek w organoidach pochodzących od pacjenta po leczeniu czynnikiem testowym wykorzystującym wewnątrzkomórkowe poziomy ATP jako marker komórkowej aktywności metabolicznej. Wewnątrzkomórkowe poziomy ATP mierzy się za pomocą reakcji lucyferazy/lucyferyny, gdzie natężenie emitowanego światła wskazuje na żywotność komórki, a co za tym idzie, na siłę hamującą wzrost badanego czynnika.

Test żywotności lucyferazy oparty na ATP: jednorodna metoda oceny potencjału hamującego wzrost badanych czynników na organoidach nowotworowych

Film demonstruje test lucyferazy używany do ilościowego oznaczania białek znakowanych lucyferazy. W teście wykorzystuje zmodyfikowany enzym lucyferazy składający się z dużego fragmentu, który wiąże się z małym fragmentem, który jest sprzężony z interesującym białkiem. Związane podjednostki tworzą aktywny enzym, który w obecności substratu uwalnia sygnał luminescencyjny. Sygnał ten jest następnie oznaczany ilościowo za pomocą luminometru.

Test lucyferazy: wysokoprzepustowy test do pomiaru sygnałów luminescencyjnych przy użyciu zaprojektowanych bioreporterów opartych na systemie nanolucyferazy

Prezentujemy szybką i tanią metodę przesiewową do identyfikacji regulatorów transkrypcji za pomocą wysokoprzepustowych transfekcji robotycznych i domowego testu lucyferazy o podwójnym świeceniu.  Protokół ten szybko generuje bezpośrednie dane funkcjonalne dla tysięcy genów i można go łatwo modyfikować w celu ukierunkowania na dowolny gen będący przedmiotem zainteresowania.

Wysokoprzepustowe funkcjonalne badania przesiewowe przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Tutaj prezentujemy biosensor oparty na lucyferazie, który pozwala określić ilościowo aktywność kinazy dużego supresora nowotworów (LATS) - centralnej kinazy w szlaku sygnałowym Hippo. Ten bioczujnik ma różnorodne zastosowania w badaniach podstawowych i translacyjnych mających na celu zbadanie regulatorów szlaku hipopotama in vitro i in vivo.

Monitorowanie aktywności szlaku sygnałowego hipopotama za pomocą biosensora LATS (Large Tumor Suppressor) opartego na lucyferazie

Aby zidentyfikować nowe regulatory czynników transkrypcyjnych, opracowaliśmy podejście do badania przesiewowego bibliotek RNAi lentiwirusowych lub retrowirusowych za pomocą testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazie. Takie podejście oferuje szybki i stosunkowo niedrogi sposób na przebadanie przesiewowe setek kandydatów w jednym eksperymencie.

Identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie

Protokół ten opisuje półautomatyczną metodę średnioprzepustowych i wysokoprzepustowych badań leków organoidów oraz niezależne od mikroskopu, zautomatyzowane oprogramowanie do analizy obrazów służące do ilościowej i wizualizacji wieloparametrycznej, pojedynczej odpowiedzi lekowej w celu uchwycenia heterogeniczności wewnątrznowotworowej.

Wieloparametryczne badanie leków na leki w nowotworach organoidalnych z wykorzystaniem obrazowania szerokopolowego z użyciem żywych komórek do analizy objętości i pojedynczych organoidów

Organoidy nowotworowe pochodzące od pacjentów są wyrafinowanym systemem modelowym do badań podstawowych i translacyjnych. Ten artykuł dotyczący metod szczegółowo opisuje zastosowanie multipleksowanego obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek do jednoczesnej oceny kinetycznej różnych fenotypów organoidów.

Multipleksowane obrazowanie żywych komórek w celu uzyskania odpowiedzi na leki w organoidalnych modelach raka pochodzących od pacjenta

Głównym wyzwaniem przy opracowywaniu nowych terapii raka płuc jest modelowanie mikrośrodowiska guza w miarę postępu choroby regionalnej w kierunku choroby przerzutowej. Tutaj opisujemy prostą metodę ustanowienia ortotopowego modelu syngeneicznego raka płuc, który pozwala na śledzenie chorób in vivo w czasie.

Minimalnie inwazyjna metoda tworzenia syngeneicznego ortotopowego modelu myszy raka płuc

Poznaj multipleksowaną platformę przesiewową opartą na lucyferazie do badania transdukcji sygnału P53, WNT i KRAS w komórkach HCT116. Ta metoda umożliwia jednoczesne monitorowanie aktywności szlaków nowotworowych.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach (Wideo) | JoVE Journal

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Przeglądaj więcej filmów