Mikromanipulacja krążącymi komórkami nowotworowymi w celu dalszej analizy molekularnej i oceny potencjału przerzutowego
14 maja 2019
Tutaj prezentujemy zintegrowany przepływ pracy w celu identyfikacji cech fenotypowych i molekularnych, które charakteryzują krążące komórki nowotworowe (CTC). Łączymy barwienie immunologiczne na żywo i mikromanipulację mikromanipulacją pojedynczych i grupowanych CTC z technikami opartymi na pojedynczych komórkach do dalszej analizy i oceny zdolności do wysiewu przerzutów.
Protokół ten jest szczególnie istotny, ponieważ umożliwia wykrywanie i selekcję pojedynczych komórek z puli komórek mieszanych do późniejszej analizy w rozdzielczości pojedynczej komórki. Główną zaletą tej techniki jest możliwość oddzielenia pojedynczych krążących komórek nowotworowych (CTC) od komórek krwi w celu przeprowadzenia szeregu analiz wymagających wysokiej czystości. Zacznij od uruchomienia oprogramowania mikromanipulatora i włączenia mikromanipulatora.
Podłącz mikromanipulator do komputera i kliknij Podłącz i zainicjalizuj urządzenie, aby zainicjować ramię robota w stoliku mikroskopowym. Oczyść zewnętrzne i wewnętrzne powierzchnie szafy ochronnej etanolem i zamknij szafę ochronną po każdej manipulacji maszyną, aby móc manewrować urządzeniem przez komputer. Zainstaluj nową szklaną kapilarnę o średnicy od 20 do 30 mikrometrów na ramieniu robota i przepłucz olej systemowy przez system, aby usunąć wszelkie pęcherzyki w przewodach.
Napełnij zbiornik sterylizacyjny jeden 70% etanolem, zbiornik sterylizacyjny drugi sterylną wodą wolną od nukleaz, a zbiornik buforowy sterylnym PBS firmy Dulbecco. Wysterylizuj kapilarę dwa razy 70% etanolem i zastąp zbiornik sterylizacyjny jeden zbiornikiem sterylizacyjnym dwa, aby użyć funkcji sterylizacji do umycia kapilary w wodzie co najmniej trzy razy. W oprogramowaniu mikromanipulatora rozpocznij nowy eksperyment i wybierz rodzaj eksperymentu pobierania z trybu wyboru automatycznego i ręcznego.
Skonfiguruj tacę pokładową, aby określić pozycje zbiornika sterylizacyjnego, zbiornika buforowego i tacki deponującej, a także ustaw temperaturę zbiorników na ciecz w wybranej tacy depozytowej na cztery stopnie Celsjusza. Umieść bardzo niską płytkę mocującą zawierającą uwolniony roztwór CTC pod mikroskopem wewnątrz szafki mikromanipulatora. Zdejmij pokrywę z talerza i zamknij szafkę.
Odwirować 384-dołkową płytkę zawierającą 20 mikrolitrów pożywki hodowlanej CTC na studzienkę, aby upewnić się, że pożywka jest sekwestrowana na dnie każdej studzienki i umieścić płytkę w docelowej jednej pozycji z wybranej tacki deponującej o czterech stopniach Celsjusza. Ręcznie wybierz obiektyw mikroskopu do wyboru i czas naświetlania wszystkich niezbędnych kanałów. Wybierz opcję Pokaż nawigator studni, aby wyświetlić i wybrać typ płyty odbioru.
Następnie skalibruj pozycję odbioru w środku studzienki zawierającej roztwór CTC bez komórek w środku pola widzenia. Za pomocą czujnika delikatnie dotknij kapilarną dolnej części płytki i ustaw pozycję odbioru na 0,05 milimetra nad dnem płytki. Ostrożnie opuszczaj ramię robota o 10 mikrometrów na raz, aby uniknąć uszkodzenia kapilary.
Wybierz typ komórki i parametry pobrania. W przypadku pobierania z jednej komórki wybierz tryb ręczny. Użyj joysticka, aby poruszać się po szklanej kapilarze w studni i umieść kapilarnę na pojedynczej interesującej nas komórce w odległości co najmniej jednego milimetra od granicy studzienki.
Następnie ręcznie dodaj cząstki i wybierz opcję Wybierz aktywowane cząstki, aby rozpocząć pobieranie. Po wybraniu wszystkich komórek odwirować płytkę, aby osadzać komórki na dnie każdej studzienki. Barwienie bio-aminowe przeciwciałem przeciwko cząsteczkom adhezyjnym komórek nabłonkowych pozwala na wizualizację komórek rakowych w zawiesinie z dokładnym odróżnieniem od zdarzeń dodatnich CD45.
Precyzyjna izolacja CTC charakteryzuje się aspiracją tylko pożądanego celu bez otaczających komórek zanieczyszczających. Zgodnie z podejrzeniami, klastry CTC wykazują zwiększoną przeżywalność w porównaniu z pojedynczymi CTC, dając początek koloniom komórkowym w ciągu 56 dni od hodowli in vitro. Warto zauważyć, że klastry CTC wykazują również wyższy wskaźnik proliferacji, a tym samym osiągają wyższą końcową liczbę komórek, co wskazuje, że bezpośredni kontakt z innymi komórkami nowotworowymi ma wpływ zarówno na żywotność komórek nowotworowych, jak i szybkość proliferacji.
Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA CTC bezpośrednio izolowanych od pacjentów z rakiem piersi ujawnia stochastyczne osadzanie pojedynczych komórek pochodzących z pojedynczych CTC, klastrów CTC lub klastrów białych krwinek CTC. Należy pamiętać o zainstalowaniu szklanej kapilary w celu usunięcia pęcherzyków powietrza w układzie płynowym mikromanipulatora oraz skalibrowania pozycji poboru, aby zapewnić wydajną kombinację jednokomórkową. Pojedyncze komórki mogą być wysiewane lub dalej przetwarzane do sekwencjonowania nowej generacji, aby umożliwić analizę ex-vivo i charakterystykę CTC w rozdzielczości pojedynczej komórki w celu zbadania procesu przerzutowego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zintegrowany schemat postępowania w celu identyfikacji cech fenotypowych i molekularnych krążących komórek nowotworowych (CTCs). Podejście to łączy immunobarwienie żywych komórek i robotyczną mikromanipulację z technikami analizy pojedynczych komórek w celu przeprowadzenia szczegółowej analizy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Onkologia
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Krążące komórki nowotworowe (CTCs) mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia procesu przerzutowania.
- Izolacja CTCs o wysokiej czystości jest niezbędna do przeprowadzenia dokładnej analizy.
- Robotyczna mikromanipulacja zwiększa precyzję selekcji komórek.
- Analiza pojedynczych komórek dostarcza informacji na temat zachowania poszczególnych CTCs.
Cel badania
- Opracowanie schematu izolacji i analizy CTC.
- Ocena zdolności poszczególnych CTC do tworzenia przerzutów.
- Usprawnienie detekcji cech fenotypowych i molekularnych CTC.
Zastosowane metody
- Immunobarwienie żywych CTC.
- Robotyczna mikromanipulacja w celu selekcji komórek.
- Techniki oparte na pojedynczych komórkach w analizach końcowych.
- Ocena zdolności do inicjowania przerzutów.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja pojedynczych CTC z mieszanych populacji komórek.
- Osiągnięcie wysokiej czystości niezbędnej do dalszych analiz.
- Identyfikacja kluczowych cech fenotypowych i molekularnych CTC.
- Wgląd w potencjał przerzutowy pojedynczych CTC.
Wnioski
- Zintegrowany przepływ pracy usprawnia badanie CTC.
- Robotyczna mikromanipulacja jest skuteczna w izolacji pojedynczych komórek.
- To podejście może prowadzić do lepszego zrozumienia przerzutowania nowotworów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikromanipulacja pojedynczymi krążącymi komórkami nowotworowymi (CTCs) umożliwia izolację o wysokiej czystości oraz późniejszą analizę molekularną, które są kluczowe dla zrozumienia mechanizmów przerzutowania. Ten schemat postępowania zwiększa pewność predykcyjną w identyfikacji szlaków istotnych dla przerzutów i wspiera wczesną selekcję portfela badań poprzez analizę heterogeniczności wewnątrz klastrów. Takie podejście pozycjonuje charakterystykę CTC jako strategiczny zasób w onkologii translacyjnej i przy podejmowaniu decyzji o dalszym rozwoju projektów w oparciu o analizę ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie potencjału przerzutowego na poziomie pojedynczych komórek w celu funkcjonalnej walidacji celów terapeutycznych.
- Wspiera proces ograniczania ryzyka biologicznego poprzez rozróżnianie zdolności do przeżycia i proliferacji w subpopulacjach CTC.
- Ułatwia identyfikację celów terapeutycznych dzięki profilowaniu molekularnemu wyizolowanych CTC.
- Zapewnia wgląd w mechanizmy oddziaływań międzykomórkowych w obrębie skupisk CTC.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Przygotowuje zwalidowane układy jednokomórkowe oraz pochodne od klastrów do późniejszych analiz fenotypowych i molekularnych.
- Standaryzuje izolację i przetwarzanie CTC w celu zapewnienia powtarzalności i ilościowych wyników.
- Umożliwia rzetelny screening kultur pochodnych z CTC pod kątem wskaźników przeżywalności i proliferacji.
- Wspiera ponowne wykorzystanie platformy dla różnych typów nowotworów i próbek pochodzących od pacjentów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje badania CTC ex vivo i in vivo z modelami przerzutowymi istotnymi dla danej choroby.
- Zapewnia ciągłość translacyjną od próbek pacjenta po przedkliniczną walidację czynników napędzających przerzutowanie.
- Umożliwia podejmowanie decyzji w oparciu o ocenę ryzyka poprzez kwantyfikację potencjału przerzutowego w różnych fenotypach CTC.
- Wspiera odkrywanie biomarkerów służących do przewidywania przerzutów oraz celowania terapeutycznego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten schemat mikromanipulacji i analizy łączy wczesne etapy odkrywania, identyfikację związków wiodących oraz badania translacyjne, umożliwiając precyzyjną izolację i charakterystykę CTC.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów przerzutowania i heterogeniczności wewnątrz klastrów.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych danych o przeżywalności i proliferacji wyizolowanych CTC.
- Analityka: Zapewnia odczyty molekularne na poziomie pojedynczych komórek i klastrów do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy dane o CTC pochodzących od pacjentów z przedklinicznymi modelami przerzutowania.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Ustanawia platformę do analizy CTC możliwą do ponownego wykorzystania w różnych programach onkologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w ocenie ryzyka przerzutowania i walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację pojedynczych komórek oraz późniejsze etapy analizy w celu zapewnienia skalowalności.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wyjaśnienie czynników napędzających przerzutowanie oraz słabych punktów nowotworu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację zasobów onkologicznych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wiedzę uzyskaną z CTC.
Kwestie implementacyjne
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikromanipulacji, immunubarwienia i analityki pojedynczych komórek.
- Wymaga specjalistycznej aparatury do robotycznego wyłapywania komórek oraz późniejszych analiz molekularnych.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Metoda jest dostosowalna do różnych typów nowotworów i próbek CTC pochodzących od pacjentów po optymalizacji protokołu.
- Wyniki analizy zależne są od jakości próbki oraz liczebności CTC dla uzyskania wiarygodnych wyników analizy.
