Mikromanipulacja krążącymi komórkami nowotworowymi w celu dalszej analizy molekularnej i oceny potencjału przerzutowego

Protokół ten jest szczególnie istotny, ponieważ umożliwia wykrywanie i selekcję pojedynczych komórek z puli komórek mieszanych do późniejszej analizy w rozdzielczości pojedynczej komórki. Główną zaletą tej techniki jest możliwość oddzielenia pojedynczych krążących komórek nowotworowych (CTC) od komórek krwi w celu przeprowadzenia szeregu analiz wymagających wysokiej czystości. Zacznij od uruchomienia oprogramowania mikromanipulatora i włączenia mikromanipulatora.

Podłącz mikromanipulator do komputera i kliknij Podłącz i zainicjalizuj urządzenie, aby zainicjować ramię robota w stoliku mikroskopowym. Oczyść zewnętrzne i wewnętrzne powierzchnie szafy ochronnej etanolem i zamknij szafę ochronną po każdej manipulacji maszyną, aby móc manewrować urządzeniem przez komputer. Zainstaluj nową szklaną kapilarnę o średnicy od 20 do 30 mikrometrów na ramieniu robota i przepłucz olej systemowy przez system, aby usunąć wszelkie pęcherzyki w przewodach.

Napełnij zbiornik sterylizacyjny jeden 70% etanolem, zbiornik sterylizacyjny drugi sterylną wodą wolną od nukleaz, a zbiornik buforowy sterylnym PBS firmy Dulbecco. Wysterylizuj kapilarę dwa razy 70% etanolem i zastąp zbiornik sterylizacyjny jeden zbiornikiem sterylizacyjnym dwa, aby użyć funkcji sterylizacji do umycia kapilary w wodzie co najmniej trzy razy. W oprogramowaniu mikromanipulatora rozpocznij nowy eksperyment i wybierz rodzaj eksperymentu pobierania z trybu wyboru automatycznego i ręcznego.

Skonfiguruj tacę pokładową, aby określić pozycje zbiornika sterylizacyjnego, zbiornika buforowego i tacki deponującej, a także ustaw temperaturę zbiorników na ciecz w wybranej tacy depozytowej na cztery stopnie Celsjusza. Umieść bardzo niską płytkę mocującą zawierającą uwolniony roztwór CTC pod mikroskopem wewnątrz szafki mikromanipulatora. Zdejmij pokrywę z talerza i zamknij szafkę.

Odwirować 384-dołkową płytkę zawierającą 20 mikrolitrów pożywki hodowlanej CTC na studzienkę, aby upewnić się, że pożywka jest sekwestrowana na dnie każdej studzienki i umieścić płytkę w docelowej jednej pozycji z wybranej tacki deponującej o czterech stopniach Celsjusza. Ręcznie wybierz obiektyw mikroskopu do wyboru i czas naświetlania wszystkich niezbędnych kanałów. Wybierz opcję Pokaż nawigator studni, aby wyświetlić i wybrać typ płyty odbioru.

Następnie skalibruj pozycję odbioru w środku studzienki zawierającej roztwór CTC bez komórek w środku pola widzenia. Za pomocą czujnika delikatnie dotknij kapilarną dolnej części płytki i ustaw pozycję odbioru na 0,05 milimetra nad dnem płytki. Ostrożnie opuszczaj ramię robota o 10 mikrometrów na raz, aby uniknąć uszkodzenia kapilary.

Wybierz typ komórki i parametry pobrania. W przypadku pobierania z jednej komórki wybierz tryb ręczny. Użyj joysticka, aby poruszać się po szklanej kapilarze w studni i umieść kapilarnę na pojedynczej interesującej nas komórce w odległości co najmniej jednego milimetra od granicy studzienki.

Następnie ręcznie dodaj cząstki i wybierz opcję Wybierz aktywowane cząstki, aby rozpocząć pobieranie. Po wybraniu wszystkich komórek odwirować płytkę, aby osadzać komórki na dnie każdej studzienki. Barwienie bio-aminowe przeciwciałem przeciwko cząsteczkom adhezyjnym komórek nabłonkowych pozwala na wizualizację komórek rakowych w zawiesinie z dokładnym odróżnieniem od zdarzeń dodatnich CD45.

Precyzyjna izolacja CTC charakteryzuje się aspiracją tylko pożądanego celu bez otaczających komórek zanieczyszczających. Zgodnie z podejrzeniami, klastry CTC wykazują zwiększoną przeżywalność w porównaniu z pojedynczymi CTC, dając początek koloniom komórkowym w ciągu 56 dni od hodowli in vitro. Warto zauważyć, że klastry CTC wykazują również wyższy wskaźnik proliferacji, a tym samym osiągają wyższą końcową liczbę komórek, co wskazuje, że bezpośredni kontakt z innymi komórkami nowotworowymi ma wpływ zarówno na żywotność komórek nowotworowych, jak i szybkość proliferacji.

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA CTC bezpośrednio izolowanych od pacjentów z rakiem piersi ujawnia stochastyczne osadzanie pojedynczych komórek pochodzących z pojedynczych CTC, klastrów CTC lub klastrów białych krwinek CTC. Należy pamiętać o zainstalowaniu szklanej kapilary w celu usunięcia pęcherzyków powietrza w układzie płynowym mikromanipulatora oraz skalibrowania pozycji poboru, aby zapewnić wydajną kombinację jednokomórkową. Pojedyncze komórki mogą być wysiewane lub dalej przetwarzane do sekwencjonowania nowej generacji, aby umożliwić analizę ex-vivo i charakterystykę CTC w rozdzielczości pojedynczej komórki w celu zbadania procesu przerzutowego.