Name: Mikromanipulacja krążącymi komórkami nowotworowymi w celu dalszej analizy molekularnej i oceny potencjału przerzutowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Naucz się mikromanipulacji krążących komórek nowotworowych w celu analizy molekularnej i oceny potencjału przerzutowego. Ta metoda umożliwia izolację pojedynczych CTC z wysoką czystością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim pacjentom, którzy oddali krew do naszego badania, a także wszystkim zaangażowanym klinicystom i pielęgniarkom prowadzącym badanie. Dziękujemy Jensowi Eberhardtowi, Uwe Birke i dr Katharinie Uhlig z ALS Automated Lab solutions GmbH za nieustanne wsparcie. Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Aceto za opinie i dyskusje. Badania w laboratorium Aceto są wspierane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych, Unię Europejską, Szwajcarską Narodową Fundację Nauki, Szwajcarską Ligę Walki z Rakiem, Bazylejską Ligę Walki z Rakiem, dwa kantony Bazylei za pośrednictwem ETH Zürich oraz Uniwersytet w Bazylei.

<ol><li>Talmadge, J. E., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AACR+centennial+series%3A+the+biology+of+cancer+metastasis%3A+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">AACR centennial series: the biology of cancer metastasis: historical perspective.</a> Cancer Research. 70 (14), 5649-5669 (2010).</li>
<li>Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Biological+Principles+of+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Emerging Biological Principles of Metastasis.</a> Cell. 168 (4), 670-691 (2017).</li>
<li>Aceto, N., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((En+Route+to+Metastasis%3A+Circulating+Tumor+Cell+Clusters+and+Epithelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">En Route to Metastasis: Circulating Tumor Cell Clusters and Epithelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Trends in Cancer. 1 (1), 44-52 (2015).</li>
<li>Hong, Y., Fang, F., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+clusters%3A+What+we+know+and+what+we+expect+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell clusters: What we know and what we expect (Review).</a> International Journal of Oncology. 49 (6), 2206-2216 (2016).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nature Review Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+molecular+insights+and+evolving+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li>
<li>Pantel, K., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The biology of circulating tumor cells.</a> Oncogene. 35 (10), 1216-1224 (2016).</li>
<li>Hou, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+molecular+characteristics+of+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+microemboli+in+patients+with+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and molecular characteristics of circulating tumor cells and circulating tumor microemboli in patients with small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 30 (5), 525-532 (2012).</li>
<li>Long, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+expression+of+TRF2%2C+SOX10%2C+and+CD10+in+circulating+tumor+microemboli+detected+in+metastatic+melanoma+patients.+A+potential+impact+for+the+assessment+of+disease+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">High expression of TRF2, SOX10, and CD10 in circulating tumor microemboli detected in metastatic melanoma patients. A potential impact for the assessment of disease aggressiveness.</a> Cancer Medicine. 5 (6), 1022-1030 (2016).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinally+collected+CTCs+and+CTC-clusters+and+clinical+outcomes+of+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Longitudinally collected CTCs and CTC-clusters and clinical outcomes of metastatic breast cancer.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 161 (1), 83-94 (2017).</li>
<li>Mu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+assessment+of+the+prognostic+value+of+circulating+tumor+cells+and+their+clusters+in+patients+with+advanced-stage+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Prospective assessment of the prognostic value of circulating tumor cells and their clusters in patients with advanced-stage breast cancer.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 154 (3), 563-571 (2015).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+microemboli+%28CTM%29+and+vimentin%2B+circulating+tumor+cells+%28CTCs%29+detected+by+a+size-based+platform+predict+worse+prognosis+in+advanced+colorectal+cancer+patients+during+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor microemboli (CTM) and vimentin+ circulating tumor cells (CTCs) detected by a size-based platform predict worse prognosis in advanced colorectal cancer patients during chemotherapy.</a> Cancer Cell International. 17, 6(2017).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+Microemboli+in+Gastric+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Detection of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor Microemboli in Gastric Cancer.</a> Translational Oncology. 10 (3), 431-441 (2017).</li>
<li>Chang, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Significance+of+Circulating+Tumor+Microemboli+as+a+Prognostic+Marker+in+Patients+with+Pancreatic+Ductal+Adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Clinical Significance of Circulating Tumor Microemboli as a Prognostic Marker in Patients with Pancreatic Ductal Adenocarcinoma.</a> Clinical Chemistry. 62 (3), 505-513 (2016).</li>
<li>Aceto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+clusters+are+oligoclonal+precursors+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis.</a> Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).</li>
<li>Cheung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyclonal+breast+cancer+metastases+arise+from+collective+dissemination+of+keratin+14-expressing+tumor+cell+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Polyclonal breast cancer metastases arise from collective dissemination of keratin 14-expressing tumor cell clusters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (7), E854-E863 (2016).</li>
<li>Giuliano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective+on+Circulating+Tumor+Cell+Clusters%3A+Why+It+Takes+a+Village+to+Metastasize%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Perspective on Circulating Tumor Cell Clusters: Why It Takes a Village to Metastasize.</a> Cancer Research. 78 (4), 845-852 (2018).</li>
<li>Gkountela, S., Aceto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-like+features+of+cancer+cells+on+their+way+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Direct%22%5BJournal%5D)">Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis.</a> Biology Direct. 11, 33(2016).</li>
<li>Gkountela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cell+Clustering+Shapes+DNA+Methylation+to+Enable+Metastasis+Seeding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cell Clustering Shapes DNA Methylation to Enable Metastasis Seeding.</a> Cell. 176 (1-2), 98-112 (2019).</li>
<li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+escort+circulating+tumour+cells+to+enable+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression.</a> Nature. , (2019).</li>
<li>Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+enumeration+by+the+CellSearch+system%3A+the+clinician%27s+guide+to+breast+cancer+treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+Reviews%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment?</a> Cancer Treatment Reviews. 41 (2), 144-150 (2015).</li>
<li>Sarioglu, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+label-free%2C+physical+capture+of+circulating+tumor+cell+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters.</a> Nature Methods. 12 (7), 685-691 (2015).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+Evaluation+of+a+Novel+Size+Based+Circulating+Tumor+Cell+Isolation+System%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System.</a> PLoS One. 10 (9), e0138032(2015).</li>
<li>Stott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).</li>
<li>Ozkumur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+focusing+for+tumor+antigen-dependent+and+-independent+sorting+of+rare+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells.</a> Science Translational Medicine. 5 (179), 179ra147(2013).</li>
<li>Went, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+EpCam+protein+expression+in+human+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Frequent EpCam protein expression in human carcinomas.</a> Human Pathology. 35 (1), 122-128 (2004).</li>
<li>Soysal, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM+expression+varies+significantly+and+is+differentially+associated+with+prognosis+in+the+luminal+B+HER2%28%2B%29%2C+basal-like%2C+and+HER2+intrinsic+subtypes+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">EpCAM expression varies significantly and is differentially associated with prognosis in the luminal B HER2(+), basal-like, and HER2 intrinsic subtypes of breast cancer.</a> British Journal of Cancer. 108 (7), 1480-1487 (2013).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+breast+tumor+cells+exhibit+dynamic+changes+in+epithelial+and+mesenchymal+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition.</a> Science. 339 (6119), 580-584 (2013).</li>
<li>Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial-mesenchymal+transition+generates+cells+with+properties+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells.</a> Cell. 133 (4), 704-715 (2008).</li>
<li>Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+microfilter+device+for+selective+capture%2C+electrolysis+and+genomic+analysis+of+human+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Membrane microfilter device for selective capture, electrolysis and genomic analysis of human circulating tumor cells.</a> Journal of Chromatography A. 1162 (2), 154-161 (2007).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy.+Ex+vivo+culture+of+circulating+breast+tumor+cells+for+individualized+testing+of+drug+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.</a> Science. 345 (6193), 216-220 (2014).</li>
</ol>

N.A. i B.M.S. są wymienieni jako wynalazcy we wnioskach patentowych, które odnoszą się do krążących komórek nowotworowych i leczenia raka. N.A. jest płatnym konsultantem dla firm farmaceutycznych i ubezpieczeniowych zainteresowanych płynną biopsją.

Charakterystyka molekularna CTC daje nadzieję na lepsze zrozumienie procesu przerzutowego i ukierunkowanie rozwoju nowych terapii przeciwprzerzutowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis tych protokołów, które umożliwiają mikromanipulację CTC i dalszą analizę, w tym zarówno testy funkcjonalne oparte na pojedynczych komórkach, analizę ekspresji genów, jak i przeszczep in vivo w celu oceny potencjału przerzutowego20.
Jednym z najbardziej krytycznych eta...

Kliniczna manifestacja przerzutów w odległych narządach reprezentuje końcowy etap progresji raka i odpowiada za ponad 90% zgonów związanych z rakiem1. Przejście od choroby zlokalizowanej do przerzutowej jest procesem wieloetapowym, w którym często pośredniczą krążące komórki nowotworowe (CTC)2,3,4. Komórki te są wydalane z guza pierwotnego do krążenia krwi i są transportowane do odległych narządów, gdzie mogą się wynaczynić i tworzyć zmiany przerzutowe5,6. Chociaż guzy lite mogą uwalniać stosunkowo dużą liczbę CTC, większość CTC jest skazana na śmierć z powodu dużych sił ścinających w krążeniu, śmierci komórek za pośrednictwem anoikis, ataku immunologicznego lub ograniczonych zdolności do przystosowania się do obcego mikrośrodowiska7. Dlatego tak ważne jest opracowanie narzędzi, które umożliwią analizę cech molekularnych tych CTC, które są wyposażone w zdolność do wysiewu przerzutów. Ostatnie badania przedkliniczne i kliniczne sugerują, że obecność i ilość pojedynczych CTC i klastrów CTC wiąże się z gorszym wynikiem u pacjentów z różnymi typami guzów litych8,9,10,11,12,13,14. Klastry CTC to grupy dwóch lub więcej CTC połączonych ze sobą podczas krążenia i są bardziej wydajne w tworzeniu przerzutów w porównaniu z pojedynczymi CTCs3,15,16. Komórki w klastrze utrzymują silną adhezję komórka-komórka poprzez połączenia desmosomów i adherenów, co może pomóc w przezwyciężeniu anoikis17,18. Ostatnio zaobserwowaliśmy, że grupowanie CTC jest związane z hipometylacją miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych związanych z macierzystą i proliferacją, co prowadzi do zwiększonej zdolności do skutecznego inicjowania przerzutów19. Dysocjacja klastrów CTC powoduje przebudowę kluczowych miejsc wiązania, a w konsekwencji zahamowanie ich potencjału przerzutowego19. Oprócz skupisk komórek nowotworowych, CTC mogą również łączyć się z białymi krwinkami (najczęściej neutrofilami) w celu utrzymania wysokiego poziomu proliferacji w krążeniu i zwiększenia ich zdolności do przerzutów20. Jednak biologia CTC jest zrozumiała tylko częściowo i kilka pytań pozostaje otwartych, w tym podstawowe cechy molekularne i podatności pojedynczych i zgrupowanych komórek.
W ostatnich latach ustalono kilka strategii, które wykorzystują wzorce ekspresji na powierzchni komórki, jak również właściwości fizyczne CTC do ich izolacji21,22,23,24,25. Metody izolacji zależnej od antygenu opierają się głównie na ekspresji cząsteczki adhezji komórek nabłonkowych na powierzchni komórki (EpCAM)26. Najczęściej używaną i (obecnie) jedyną zatwierdzoną przez FDA platformą do liczenia CTC, jest system CellSearch, który opiera się na dwuetapowej procedurze izolacji CTCs21. W pierwszym etapie składniki osocza są usuwane przez wirowanie, podczas gdy CTC są wychwytywane za pomocą ferrofluidów magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami anty-EpCAM. W drugim etapie roztwór wzbogacony CTC jest barwiony pod kątem komórek jądrzastych (DAPI-dodatnich) eksprymujących cytokerynę (CK)8,18,19, podczas gdy białe krwinki (WBC) są identyfikowane za pomocą markera panleukocytów CD45. Na koniec wychwycone komórki umieszcza się na zintegrowanej platformie przesiewowej, a CTC identyfikuje się poprzez ekspresję EpCAM, CKs i DAPI, podczas gdy są ujemne dla CD45. Chociaż jest to uważane za złoty standard w liczeniu CTC, dalsza analiza molekularna jest wyzwaniem w przypadku tej technologii ze względu na nieodłączne ograniczenia w wyszukiwaniu CTC. Dodatkowo, biorąc pod uwagę procedurę izolacji, CellSearch może faworyzować wzbogacanie CTC o wyższe poziomy EpCAM w porównaniu z CTC o niższej ekspresji EpCAM, na przykład ze względu na heterogeniczność raka27 lub regulację w dół markerów nabłonkowych28,29. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, pojawiły się niezależne od antygenu technologie wzbogacania CTC. Na przykład CTC-iChip integruje hydrodynamiczną separację komórek jądrzastych, w tym CTC i WBC od pozostałych składników krwi, a następnie immunomagnetyczne zubożenie WBC znakowanych przeciwciałami, umożliwiając oczyszczanie nieoznakowanych i żywotnych CTC w solution25. Dodatkowo, fakt, że większość CTC jest nieco większa niż czerwone krwinki (RBC) lub WBC, doprowadził do opracowania technologii wzbogacania CTC opartych na rozmiarze23,30 (np. system Parsortix (ANGLE)), który wykorzystuje technologię opartą na mikroprzepływach, obejmującą zwężający się kanał w poprzek kasety separacyjnej, prowadzący komórki do końcowej przerwy 10, 8, 6,5 lub 4,5 μm (dostępne są różne rozmiary w zależności od oczekiwanej średnicy docelowych komórek nowotworowych). Większość komórek krwi przechodzi przez wąską szczelinę, podczas gdy CTC zostają uwięzione ze względu na swój rozmiar (ale także ze względu na mniejszą odkształcalność) i dlatego są zatrzymywane w kasecie. Odwrócenie kierunku przepływu umożliwia uwolnienie wychwyconych CTC, które są w stanie zdolnym do użycia i nadają się do dalszej analizy. Jednak niezależnie od wybranego protokołu izolacji CTC, typowe procedury po wzbogaceniu nadal dają CTC, które są mieszane ze stosunkowo niewielką liczbą krwinek czerwonych i krwinek czerwonych, co sprawia, że analiza czystych pojedynczych lub masowych CTC jest trudna. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy przepływ pracy, który umożliwia manipulację CTC bez potencjalnego odchylenia spowodowanego zanieczyszczeniami komórek krwi. Wcześniejsze dodanie barwienia immunologicznego ze zmiennymi kombinacjami przeciwciał odróżnia CTC od komórek krwi, a nawet pozwala zidentyfikować podgrupy CTC o różnych profilach ekspresji markerów powierzchniowych. Ta wysoce konfigurowalna procedura może być następnie dalej łączona z określonymi aplikacjami końcowymi.
Tutaj opisujemy przepływ pracy, który zaczyna się od produktu wzbogaconego CTC (uzyskanego za pomocą dowolnej technologii wzbogacania CTC) i łączy kilka podejść do uzyskania wglądu w biologię CTC w rozdzielczości pojedynczej komórki. Krótko mówiąc, nasz przepływ pracy umożliwia identyfikację pojedynczych CTC, klastrów CTC i klastrów CTC-WBC za pomocą barwienia immunologicznego na żywo, a następnie mikromanipulacji pojedynczymi komórkami i dalszej analizy przy użyciu protokołów hodowli ex vivo, sekwencjonowania pojedynczych komórek i testów przerzutów in vivo.

<table><tbody><tr>Przeciw-ludzka <td>technologia sygnalizacji komórkowej</td> <td>EpCAM-AF488</td><td>CST5198</td><td>klon: VU1D9</td></tr><tr><td>1X DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190169</td><td>bez wapnia, bez magnisium</td></tr><tr><td>6-dołkowe Ultra-niska płytka mocująca</td><td>Klon 304041 Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD45-BV605</td><td>Biolegend</td><td></td>: <td>HI30</td></tr><tr><td>Anti-human EGFR-FITC&nbsp;</td><td>Klon GeneTex</td><td>GTX11400</td><td>: ICR10</td></tr><tr><td>Anti-human HER2-AF488&nbsp;</td><td>Klon Biolegend</td><td>324410</td><td>: 24D2</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45-BV605</td><td>Klon 103139 Biolegend</td><td></td><td>: 30-F11</td></tr><tr><td>BD Vacutainer K2EDTA</td><td>BD</td><td>366643</td><td>do pobierania krwi ludzkiej</td></tr><tr><td>Jednostka główna Cell Celector</td><td>ALS</td><td>CC1001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie CellD</td><td>ALS</td><td></td><td>wersja 3.0</td></tr><tr><td>Cultrex PathClear Obniżony czynnik wzrostu BME, typ 2</td><td>R& D Systems</td><td>3533-005-02</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówka 1,3 ml K3EDTA</td><td>Sarstedt</td><td>41.3395.005</td><td>do probówek PCR do pobierania krwi myszy</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>RLT Plus</td><td>Quiagen</td><td>1053393</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase&nbsp; W inhibitorze RNazy</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM2696</td><td>&nbsp; 1 U/&mikro; L&nbsp;</td></tr></tbody></table>

mikromanipulacja krążącymi komórkami nowotworowymi w celu dalszej analizy molekularnej i oceny potencjału przerzutowego

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Przerzuty krwiopochodne odpowiadają za większość zgonów związanych z rakiem i obejmują krążące komórki nowotworowe (CTC), które skutecznie tworzą nowe guzy w odległych miejscach. CTC znajdują się w krwiobiegu pacjentów jako pojedyncze komórki (pojedyncze CTC) lub jako agregaty wielokomórkowe (klastry CTC i klastry CTC-białe krwinki), przy czym te ostatnie wykazują większą zdolność przerzutową. Poza wyliczeniem, analiza fenotypowa i molekularna jest niezwykle ważna dla analizy biologii CTC i identyfikacji podatnych na działania. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis przepływu pracy, który obejmuje barwienie immunologiczne i mikromanipulację CTC, hodowlę ex vivo w celu oceny zdolności proliferacyjnych i przeżywalności poszczególnych komórek oraz testy tworzenia przerzutów in vivo. Dodatkowo udostępniamy protokół umożliwiający dysocjację klastrów CTC na poszczególne komórki i badanie niejednorodności wewnątrz klastra. Dzięki tym podejściom, na przykład, precyzyjnie określamy ilościowo przeżywalność i potencjał proliferacyjny pojedynczych CTC i pojedynczych komórek w klastrach CTC, co prowadzi nas do obserwacji, że komórki w klastrach wykazują lepszą przeżywalność i proliferację w hodowlach ex vivo w porównaniu z pojedynczymi CTC. Ogólnie rzecz biorąc, nasz przepływ pracy oferuje platformę do analizy charakterystyki CTC na poziomie pojedynczej komórki. mające na celu identyfikację szlaków istotnych dla przerzutów i lepsze zrozumienie biologii CTC.

Przedstawiony schemat pracy umożliwia przygotowanie pojedynczych CTC, pochodzących albo z pojedynczych komórek CTC, albo odseparowanych z klastrów CTC. CTC od pacjentów lub myszy z nowotworem są wzbogacane z krwi pełnej przy użyciu dostępnych metod wzbogacania CTC, a następnie barwione przeciwciałami przeciwko markerom związanym z nowotworami (np. EpCAM, zielony) oraz markerom specyficznymi dla WBC (np. CD45, czerwony) (Rycina 1A). Obarwiony produkt CTC jest ...

Tutaj prezentujemy zintegrowany przepływ pracy w celu identyfikacji cech fenotypowych i molekularnych, które charakteryzują krążące komórki nowotworowe (CTC). Łączymy barwienie immunologiczne na żywo i mikromanipulację mikromanipulacją pojedynczych i grupowanych CTC z technikami opartymi na pojedynczych komórkach do dalszej analizy i oceny zdolności do wysiewu przerzutów.

Mikromanipulacja krążącymi komórkami nowotworowymi w celu dalszej analizy molekularnej i oceny potencjału przerzutowego

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Protokół ten jest szczególnie istotny, ponieważ umożliwia wykrywanie i selekcję pojedynczych komórek z puli komórek mieszanych do późniejszej analizy w rozdzielczości pojedynczej komórki. Główną zaletą tej techniki jest możliwość oddzielenia pojedynczych krążących komórek nowotworowych (CTC) od komórek krwi w celu przeprowadzenia szeregu analiz wymagających wysokiej czystości. Zacznij od uruchomienia oprogramowania mikromanipulatora i włączenia mikromanipulatora.Podłącz mikromanipulator do komputera i kliknij Podłącz i zainicjalizuj urządzenie, aby zainicjować ramię robota w stoliku mikroskopowym. Oczyść zewnętrzne i wewnętrzne powierzchnie szafy ochronnej etanolem i zamknij szafę ochronną po każdej manipulacji maszyną, aby móc manewrować urządzeniem przez komputer. Zainstaluj nową szklaną kapilarnę o średnicy od 20 do 30 mikrometrów na ramieniu robota i przepłucz olej systemowy przez system, aby usunąć wszelkie pęcherzyki w przewodach.Napełnij zbiornik sterylizacyjny jeden 70% etanolem, zbiornik sterylizacyjny drugi sterylną wodą wolną od nukleaz, a zbiornik buforowy sterylnym PBS firmy Dulbecco. Wysterylizuj kapilarę dwa razy 70% etanolem i zastąp zbiornik sterylizacyjny jeden zbiornikiem sterylizacyjnym dwa, aby użyć funkcji sterylizacji do umycia kapilary w wodzie co najmniej trzy razy. W oprogramowaniu mikromanipulatora rozpocznij nowy eksperyment i wybierz rodzaj eksperymentu pobierania z trybu wyboru automatycznego i ręcznego.Skonfiguruj tacę pokładową, aby określić pozycje zbiornika sterylizacyjnego, zbiornika buforowego i tacki deponującej, a także ustaw temperaturę zbiorników na ciecz w wybranej tacy depozytowej na cztery stopnie Celsjusza. Umieść bardzo niską płytkę mocującą zawierającą uwolniony roztwór CTC pod mikroskopem wewnątrz szafki mikromanipulatora. Zdejmij pokrywę z talerza i zamknij szafkę.Odwirować 384-dołkową płytkę zawierającą 20 mikrolitrów pożywki hodowlanej CTC na studzienkę, aby upewnić się, że pożywka jest sekwestrowana na dnie każdej studzienki i umieścić płytkę w docelowej jednej pozycji z wybranej tacki deponującej o czterech stopniach Celsjusza. Ręcznie wybierz obiektyw mikroskopu do wyboru i czas naświetlania wszystkich niezbędnych kanałów. Wybierz opcję Pokaż nawigator studni, aby wyświetlić i wybrać typ płyty odbioru.Następnie skalibruj pozycję odbioru w środku studzienki zawierającej roztwór CTC bez komórek w środku pola widzenia. Za pomocą czujnika delikatnie dotknij kapilarną dolnej części płytki i ustaw pozycję odbioru na 0,05 milimetra nad dnem płytki. Ostrożnie opuszczaj ramię robota o 10 mikrometrów na raz, aby uniknąć uszkodzenia kapilary.Wybierz typ komórki i parametry pobrania. W przypadku pobierania z jednej komórki wybierz tryb ręczny. Użyj joysticka, aby poruszać się po szklanej kapilarze w studni i umieść kapilarnę na pojedynczej interesującej nas komórce w odległości co najmniej jednego milimetra od granicy studzienki.Następnie ręcznie dodaj cząstki i wybierz opcję Wybierz aktywowane cząstki, aby rozpocząć pobieranie. Po wybraniu wszystkich komórek odwirować płytkę, aby osadzać komórki na dnie każdej studzienki. Barwienie bio-aminowe przeciwciałem przeciwko cząsteczkom adhezyjnym komórek nabłonkowych pozwala na wizualizację komórek rakowych w zawiesinie z dokładnym odróżnieniem od zdarzeń dodatnich CD45.Precyzyjna izolacja CTC charakteryzuje się aspiracją tylko pożądanego celu bez otaczających komórek zanieczyszczających. Zgodnie z podejrzeniami, klastry CTC wykazują zwiększoną przeżywalność w porównaniu z pojedynczymi CTC, dając początek koloniom komórkowym w ciągu 56 dni od hodowli in vitro. Warto zauważyć, że klastry CTC wykazują również wyższy wskaźnik proliferacji, a tym samym osiągają wyższą końcową liczbę komórek, co wskazuje, że bezpośredni kontakt z innymi komórkami nowotworowymi ma wpływ zarówno na żywotność komórek nowotworowych, jak i szybkość proliferacji.Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA CTC bezpośrednio izolowanych od pacjentów z rakiem piersi ujawnia stochastyczne osadzanie pojedynczych komórek pochodzących z pojedynczych CTC, klastrów CTC lub klastrów białych krwinek CTC. Należy pamiętać o zainstalowaniu szklanej kapilary w celu usunięcia pęcherzyków powietrza w układzie płynowym mikromanipulatora oraz skalibrowania pozycji poboru, aby zapewnić wydajną kombinację jednokomórkową. Pojedyncze komórki mogą być wysiewane lub dalej przetwarzane do sekwencjonowania nowej generacji, aby umożliwić analizę ex-vivo i charakterystykę CTC w rozdzielczości pojedynczej komórki w celu zbadania procesu przerzutowego.

micromanipulation-circulating-tumor-cells-for-downstream-molecular

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Krążące komórki nowotworowe są izolowane z krwi pacjentów onkologicznych bez powodowania uszkodzeń komórkowych. Izolacja komórek nowotworowych jest realizowana przy użyciu bimolekularnej powierzchni E-selectiny oraz przeciwciał przeciwko markerom nabłonkowym. Powłoka z nanorurek specyficznie wspomaga adhezję komórek rakowych, co skutkuje wysoką czystością wychwytu.

Szybka izolacja żywych krążących komórek nowotworowych z próbek krwi pacjentów

Wykazano, że Wykazano, że krążące komórki nowotworowe (CTC) odgrywają ważną rolę w przerzutach nowotworowych. W tym miejscu opisano metodę izolacji i namnażania CTC z krwi pełnej syngenicznego modelu guza myszy z przerzutami raka wątrobowokomórkowego (HCC).

Izolacja i rozmnażanie krążących komórek nowotworowych z mysiego modelu raka

Ten manuskrypt opisuje metodę ilościowego określania akumulacji komórek nowotworowych w płucach w zwierzęcym modelu przerzutów nowotworowych.

Test rekrutacji komórek nowotworowych płuc

Ten protokół opisuje konfigurowalną funkcjonalizację powierzchni systemu destiobiotyny, streptawidyny i APTES w celu wyizolowania określonych typów komórek. Ponadto w niniejszym manuskrypcie omówiono zastosowania, optymalizację i weryfikację tego procesu.

Metoda celowanej izolacji komórek poprzez funkcjonalizację powierzchni szkła

Przedstawiono protokół wykorzystania mikrofiltra pokrytego poli(N-izopropylolakrylamidem) (PIPAAm) do skutecznego wychwytywania i termoresponsywnego uwalniania żywotnych krążących komórek nowotworowych (CTC). Metoda ta umożliwia wychwycenie CTC z krwi pacjenta, a następnie uwolnienie żywego CTC do dalszej hodowli poza chipem, analiz i charakterystyki.

Wychwytywanie i uwalnianie żywotnych krążących komórek nowotworowych z krwi

Opisujemy powstawanie ortotopowych guzów jelita grubego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych lub organoidów do jelita ślepego myszy i późniejszą izolację krążących komórek nowotworowych (CTC) z tego modelu.

Izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego

Ten protokół ma na celu odzyskanie i przygotowanie rzadkich komórek docelowych z mieszaniny z komórkami tła niebędącymi celem, do molekularnej charakterystyki genetycznej na poziomie pojedynczej komórki. Jakość DNA jest równa jakości pojedynczych komórek niepoddanych działaniu metody i pozwala na zastosowanie pojedynczych komórek (zarówno w oparciu o badania przesiewowe, jak i analizę celowaną).

Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu w celu dalszej charakterystyki pojedynczej komórki

To jest skuteczna metoda do wykrywania supresorów lub czynników powodujących przerzuty raka. Komórki, transdukowane biblioteką ekspresji, są wstrzykiwane do układu naczyniowego błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w celu utworzenia kolonii przerzutowych. Kolonie o zmniejszonej lub zwiększonej inwazyjności są wycinane, namnażane, ponownie wstrzykiwane w celu potwierdzenia ich fenotypu, a na koniec analizowane przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.

Odkrycie regulatorów przerzutów przy użyciu szybkiego i ilościowego modelu błony nazębiowej przyżyciowej kurcząt

Hodowla CTC pozwala na głębszą funkcjonalną charakterystykę raka, poprzez badanie specyficznej ekspresji markerów oraz ocenę oporności na leki i zdolności do kolonizacji wątroby. Ogólnie rzecz biorąc, hodowla CTC może być obiecującym narzędziem klinicznym dla medycyny spersonalizowanej w celu poprawy wyników leczenia pacjentów.

Krążące linie komórek nowotworowych: innowacyjne narzędzie do badań podstawowych i translacyjnych

Tutaj udostępniamy protokół krok po kroku, z poradami dotyczącymi generowania ksenoprzeszczepów i wytycznymi do analizy zachowania guza, immunofluorescencji całego montażu i kwantyfikacji obrazowania konfokalnego.

Generowanie ksenoprzeszczepów larw danio pręgowanego i analiza zachowania guza

Komórki nowotworowe krążące (CTC) są kluczowe dla badania postępu nowotworów i przerzutów. Niniejszy artykuł przedstawia wysokoprzepustowy, zintegrowany protokół wzbogacania CTC oraz sekwencjonowania pojedynczego CTC, poprawiający efektywność przechwytywania i czystość CTC, jednocześnie zmniejszając koszty zanieczyszczenia i sekwencjonowania, co przyczynia się do rozwoju badań i zastosowań klinicznych w precyzyjnej onkologii.

Technologia sortowania komórek nowotworowych o wysokiej przepustowości i sekwencjonowania pojedynczych komórek oparta na mikrofluidice

Naucz się mikromanipulacji krążących komórek nowotworowych w celu analizy molekularnej i oceny potencjału przerzutowego. Ta metoda umożliwia izolację pojedynczych CTC z wysoką czystością.

Mikromanipulacja krążącymi komórkami nowotworowymi w celu dalszej analizy molekularnej i oceny potencjału przerzutowego

Przeglądaj więcej filmów