Name: Metoda ulepszonego sieciowania immunoprecypitacyjnego (eCLIP) do skutecznej identyfikacji RNA związanego z białkiem w jądrach myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Poznaj metodę eCLIP do identyfikacji RNA związanego z białkiem w jądrach myszy. Ta niepromieniotwórcza technika umożliwia skuteczną analizę celów RBP podczas spermatogenezy z wysoką specyficznością sygnału.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Ericowi L Van Nostrandowi i Gene'owi W Yeo za pomocne wskazówki dotyczące oryginalnego protokołu. K.Z. był wspierany przez National Key R&D Program of China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) oraz National Natural Science Foundation of China (31771653). L.Y. był wspierany przez National Natural Science Foundation of China (81471502, 31871503) oraz Innovative and Entrepreneurial Program of Jiangsu Province.

<ol><li>Turner, J. M., Mahadevaiah, S. K., Ellis, P. J., Mitchell, M. J., Burgoyne, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pachytene+asynapsis+drives+meiotic+sex+chromosome+inactivation+and+leads+to+substantial+postmeiotic+repression+in+spermatids%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Pachytene asynapsis drives meiotic sex chromosome inactivation and leads to substantial postmeiotic repression in spermatids.</a> Developmental Cell. 10 (4), 521-529 (2006).</li>
<li>Turner, J. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+sex+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Meiotic sex chromosome inactivation.</a> Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).</li>
<li>Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodelling+and+epigenetic+features+of+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells.</a> Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).</li>
<li>Ule, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li>
<li>Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP%3A+a+method+for+identifying+protein-RNA+interaction+sites+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells.</a> Methods. 37 (4), 376-386 (2005).</li>
<li>Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+right+RNA%3A+identification+of+cellular+mRNA+substrates+for+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins.</a> RNA. 5 (8), 1071-1082 (1999).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Acadamy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 97 (26), 14085-14090 (2000).</li>
<li>Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute+HITS-CLIP+decodes+microRNA-mRNA+interaction+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps.</a> Nature. 460 (7254), 479-486 (2009).</li>
<li>Zheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+MOV10L1+associates+with+Piwi+proteins+and+is+an+essential+component+of+the+Piwi-interacting+RNA+%28piRNA%29+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Acadamy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mouse MOV10L1 associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA (piRNA) pathway.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 107 (26), 11841-11846 (2010).</li>
<li>Gregersen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOV10+Is+a+5%27+to+3%27+RNA+helicase+contributing+to+UPF1+mRNA+target+degradation+by+translocation+along+3%27+UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs.</a> Molecular Cell. 54 (4), 573-585 (2014).</li>
<li>Banerjee, S., Neveu, P., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coordinated+local+translational+control+point+at+the+synapse+involving+relief+from+silencing+and+MOV10+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A coordinated local translational control point at the synapse involving relief from silencing and MOV10 degradation.</a> Neuron. 64 (6), 871-884 (2009).</li>
<li>Choi, J., Hwang, S. Y., Ahn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+RNASEH2+and+MOV10+controls+LINE-1+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Interplay between RNASEH2 and MOV10 controls LINE-1 retrotransposition.</a> Nucleic Acids Research. 46 (4), 1912-1926 (2018).</li>
<li>Goodier, J. L., Cheung, L. E., Kazazian, H. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOV10+RNA+helicase+is+a+potent+inhibitor+of+retrotransposition+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">MOV10 RNA helicase is a potent inhibitor of retrotransposition in cells.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1002941(2012).</li>
<li>Haussecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capped+small+RNAs+and+MOV10+in+human+hepatitis+delta+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Capped small RNAs and MOV10 in human hepatitis delta virus replication.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 714-721 (2008).</li>
<li>Kenny, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOV10+and+FMRP+regulate+AGO2+association+with+microRNA+recognition+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements.</a> Cell Reports. 9 (5), 1729-1741 (2014).</li>
<li>Messaoudi-Aubert, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+MOV10+RNA+helicase+in+Polycomb-mediated+repression+of+the+INK4a+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role for the MOV10 RNA helicase in Polycomb-mediated repression of the INK4a tumor suppressor.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 862-868 (2010).</li>
<li>Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixture+models+and+wavelet+transforms+reveal+high+confidence+RNA-protein+interaction+sites+in+MOV10+PAR-CLIP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data.</a> Nucleic Acids Research. 40 (20), e160(2012).</li>
<li>Skariah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mov10+suppresses+retroelements+and+regulates+neuronal+development+and+function+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Mov10 suppresses retroelements and regulates neuronal development and function in the developing brain.</a> BMC Biology. 15 (1), 54(2017).</li>
<li>Zheng, K., Wang, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+pachytene+piRNA+biogenesis+reveals+a+novel+requirement+for+maintaining+post-meiotic+germline+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Blockade of pachytene piRNA biogenesis reveals a novel requirement for maintaining post-meiotic germline genome integrity.</a> PLoS Genetics. 8 (11), e1003038(2012).</li>
<li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+MOV10L1+binds+piRNA+precursors+to+initiate+piRNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing.</a> Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).</li>
<li>Hocq, R., Paternina, J., Alasseur, Q., Genovesio, A., Le Hir, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitored+eCLIP%3A+high+accuracy+mapping+of+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Monitored eCLIP: high accuracy mapping of RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Research. 46 (21), 11553-11565 (2018).</li>
<li>Huppertz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP%3A+protein-RNA+interactions+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">iCLIP: protein-RNA interactions at nucleotide resolution.</a> Methods. 65 (3), 274-287 (2014).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li>
<li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP+reveals+the+function+of+hnRNP+particles+in+splicing+at+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).</li>
<li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li>
<li>Maticzka, D., Ilik, I. A., Aktas, T., Backofen, R., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((uvCLAP+is+a+fast+and+non-radioactive+method+to+identify+in+vivo+targets+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">uvCLAP is a fast and non-radioactive method to identify in vivo targets of RNA-binding proteins.</a> Nature Communications. 9 (1), 1142(2018).</li>
<li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+%28eCLIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li>
<li>Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+gateway+system+for+double+shRNA+expression+and+Cre%2Flox+based+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression.</a> BMC Biotechnology. 11, 24(2011).</li>
<li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Customizable+Protocol+for+String+Assembly+gRNA+Cloning+%28STAgR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR).</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li>
<li>Kuhn, R. M., Haussler, D., Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UCSC+genome+browser+and+associated+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The UCSC genome browser and associated tools.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 144-161 (2013).</li>
<li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mili+and+Miwi+target+RNA+repertoire+reveals+piRNA+biogenesis+and+function+of+Miwi+in+spermiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mili and Miwi target RNA repertoire reveals piRNA biogenesis and function of Miwi in spermiogenesis.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 19 (8), 773-781 (2012).</li>
<li>Preitner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC+is+an+RNA-binding+protein%2C+and+its+interactome+provides+a+link+to+neural+development+and+microtubule+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">APC is an RNA-binding protein, and its interactome provides a link to neural development and microtubule assembly.</a> Cell. 158 (2), 368-382 (2014).</li>
<li>Meyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TIA1+RNA-Binding+Protein+Family+Regulates+EIF2AK2-Mediated+Stress+Response+and+Cell+Cycle+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The TIA1 RNA-Binding Protein Family Regulates EIF2AK2-Mediated Stress Response and Cell Cycle Progression.</a> Molecular Cell. 69 (4), 622-635 (2018).</li>
<li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li>
<li>Vourekas, A., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+%28CLIP-Seq%29+for+mouse+Piwi+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP (CLIP-Seq) for mouse Piwi proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1093, 73-95 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wraz z rosnącym zrozumieniem uniwersalnej roli RBP zarówno w kontekście biologicznym, jak i patologicznym, metody CLIP są szeroko stosowane w celu ujawnienia funkcji molekularnej RBP 20,32,33,34,35. Opisany tutaj protokół stanowi dostosowane zastosowanie metody eCLIP do jąder myszy.
Jednym z wyzwań związanych z wykonywaniem eCLIP w ...

Jądro ssaków reprezentuje doskonały model rozwojowy, w którym skomplikowany program różnicowania komórek przebiega cyklicznie, dając liczne plemniki. Unikalna wartość tego modelu polega na pojawieniu się inaktywacji transkrypcji na określonych etapach spermatogenezy, zazwyczaj gdy dochodzi do inaktywacji mejotycznych chromosomów płciowych (MSCI)1,2 oraz gdy okrągłe plemniki ulegają drastycznemu zagęszczeniu jądrowemu podczas spermiogenezy3. Te nienastępujące po sobie zdarzenia transkrypcyjne wymagają potranskrypcyjnej regulacji genów, w której białka wiążące RNA (RBP) odgrywają kluczową rolę, kształtując transkryptom i utrzymując męską płodność.
Aby zidentyfikować bona fide cele RNA pojedynczego RBP in vivo, opracowano metodę immunoprecypitacji sieciowania (CLIP)4,5, w oparciu o regularną immunoprecypitację RNA (RIP)6,7, poprzez włączenie kluczowych etapów, w tym sieciowania ultrafioletowego (UV), rygorystycznego mycia i transferu żelu w celu poprawy specyficzności sygnału. Zaawansowane zastosowanie CLIP w połączeniu z wysokoprzepustowym sekwencjonowaniem wywołało duże zainteresowanie profilowaniem interakcji białko-RNA na poziomie całego genomu8. Oprócz badań genetycznych nad funkcją RBP, takie metody biochemiczne, które identyfikują bezpośrednie wzajemne oddziaływanie endogennego białka i RNA, były niezbędne do dokładnego wyjaśnienia regulacyjnej roli RBP w zakresie RNA. Na przykład MOV10L1 jest helikazą RNA specyficzną dla jąder, wymaganą dla męskiej płodności i biogenezy RNA oddziałującego z Piwi (piRNA)9. Jego paralog MOV10 jest znany jako wszechobecna i wielofunkcyjna helikaza RNA, która odgrywa role w wielu aspektach biologii RNA10,11,12,13,14,15,16,17,18. Stosując konwencjonalny CLIP-seq, odkryliśmy, że wiąże MOV10L1 i reguluje pierwotne prekursory piRNA, aby zainicjować wczesne przetwarzanie piRNA19,20, oraz że MOV10 wiąże mRNA 3' UTR, a także niekodujące gatunki RNA w komórkach rozrodczych jąder (dane nie pokazane).
Mimo to, CLIP jest pierwotnie pracochłonną, radioaktywną procedurą, po której następuje przygotowanie biblioteki sekwencjonowania z niezwykłą utratą znaczników CLIP. W konwencjonalnym CIN biblioteka cDNA jest przygotowywana przy użyciu adapterów ligowanych na obu końcach RNA. Po trawieniu białek usieciowane krótkie polipeptydy pozostają przyłączone do fragmentów RNA. Ten znak sieciowania częściowo blokuje progresję odwrotnej transkryptazy (RTazy) podczas syntezy cDNA, co skutkuje skróceniem cDNA, które stanowią około 80% biblioteki cDNA21,22. W ten sposób sekwencjonowane są tylko fragmenty cDNA powstałe w wyniku ominięcia RTazy z pominięciem miejsca sieciowania (read-through). Ostatnio zastosowano różne metody CLIP, takie jak PAR-CLIP, iCLIP, eCLIP i uvCLAP, w celu identyfikacji miejsc usieciowania RBP w żywych komórkach. PAR-CLIP polega na zastosowaniu promieniowania UV o długości fali 365 nm i fotoaktywowalnych analogów nukleotydów, a zatem jest przeznaczony wyłącznie do hodowli żywych komórek, a włączenie analogów nukleozydów do nowo zsyntetyzowanych transkryptów jest podatne na powstawanie stronniczości, w której RNA fizycznie oddziałuje z białkiem23,24. W iCLIP tylko pojedynczy adapter jest ligowany do końca 3' usieciowanych fragmentów RNA. Po odwrotnej transkrypcji (RT) zarówno skrócone, jak i odczytane cDNA są uzyskiwane przez wewnątrzcząsteczkową cyrkularyzację i relinearyzację, a następnie amplifikację w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)25,26. Jednak skuteczność cyrkularyzacji wewnątrzcząsteczkowej jest stosunkowo niska. Chociaż starsze protokoły CLIP wymagają znakowania usieciowanego RNA za pomocą radioizotopu, sieciowanie ultrafioletowe i oczyszczanie powinowactwa (uvCLAP), z procesem rygorystycznego oczyszczania powinowactwa tandemowego, nie opiera się na radioaktywności27. Niemniej jednak uvCLAP jest ograniczony do hodowanych komórek, które muszą być transfekowane wektorem ekspresyjnym przenoszącym 3x znacznik FLAG-HBH w celu tandemowego oczyszczania powinowactwa.
W eCLIP, adaptery były najpierw ligowane na końcu 3' RNA, następnie RT, a następnie na końcu 3' cDNA w trybie międzycząsteczkowym. W związku z tym eCLIP jest w stanie przechwycić wszystkie okrojone i odczytane cDNA28. Nie ogranicza się również do znakowania radioaktywnego ani do używania linii komórkowych w oparciu o jego zasadę, przy zachowaniu rozdzielczości pojedynczego nukleotydu.
Tutaj podajemy krok po kroku opis protokołu eCLIP dostosowanego do jąder myszy. Krótko mówiąc, ten protokół eCLIP rozpoczyna się od sieciowania kanalików jądrowych UV, a następnie częściowego trawienia RNazy i immunoprecypitacji przy użyciu przeciwciała specyficznego dla białka. Następnie RNA związane z białkiem jest defosforylowane, a adapter jest ligowany do końca 3'. Po elektroforezie żelu białkowego i transferze żel do błony, RNA izoluje się poprzez przecięcie obszaru błony o oczekiwanym zakresie rozmiarów. Po RT adapter DNA jest ligowany do końca 3' cDNA, a następnie amplifikacja PCR. Badania przesiewowe subklonów przed sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości są traktowane jako kontrola jakości biblioteki. Protokół ten jest skuteczny w identyfikacji głównych gatunków RNA RBP związanych z białkiem, czego przykładem są dwie helikazy RNA wykazujące ekspresję jąder MOV10L1 i MOV10.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw mysom MOV10&nbsp;</td><td>Proteintech, Chiny</td><td>10370-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw myszym MOV10L1</td><td>Zheng i wsp.20109</td><td>poliklonalne surowice odpornościowe UP2175</td><td>dostarczone przez P. Jeremy Wang lab, University of Pennsylvania</td></tr><tr><td>HRP Goat Anti-Rabbit IgG&nbsp;</td><td>ABclonal</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>Beyotime, Chiny</td><td>A7016</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka sprzętowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td>5242R</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy sonifier</td><td>BRANSON, USA</td><td>BBV12081048A</td><td>450 watów; 50/60 Hz</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnes</td><td>Invitrogen, USA</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini Moduł Blot</td><td>Invitrogen, USA</td><td>B1000</td><td></td></tr><tr><td>Mini zbiornik żelowy</td><td>Invitrogen, USA</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td>Komfort termomiksera&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Młynek do tkanek, Dounce</td><td>PYREX, tylko USA</td><td>1234F35</td><td>&nbsp; w tym protokole używany jest "luźny" tłuczek</td></tr><tr><td>Norma regionalna 96 Gradient</td><td>Biometra, Niemcy</td><td>Nr seryjny: 2604323</td><td></td></tr><tr><td>Rewolwer rurowy&nbsp;</td><td>Kryształ, USA</td><td>nr seryjny: 3406051</td><td></td></tr><tr><td>Sieciownik UV</td><td>UVP, USA</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC Naczynie hodowlane</td><td>Corning, USA</td><td>430167</td><td>100 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki</td><td>Corning, USA</td><td>430791</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Mikroprobówki</td><td>AXYGEN , USA</td><td>MCT-150-C</td><td>1,5 mL&nbsp;</td></tr><tr><td><silne>odczynniki&nbsp; </mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwaśny fenol/chloroform/alkohol izoamylowy&nbsp;</td><td>Solarbio, Chiny</td><td>P1011</td><td>25:24:01</td></tr><tr><td>AffinityScript</td><td>Enzyme Agilent, USA</td><td>600107</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwutleniacz</td><td>Invitrogen, USA</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alfa; kompetentne bakterie</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>18265017</td><td>te ekonomiczne komórki dają >1 x 106 transformanty/&mikro; g kontrolne DNA na 50 &mikro; Reakcja L.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder</td><td>Invitrogen, Stany Zjednoczone</td><td>10416014</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>DNTP100-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Białko A&nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik ECL</td><td>Vazyme, Chiny</td><td>E411-04</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA</td><td>Roche, USA</td><td>04693132001</td><td>dodaj świeży</td></tr><tr><td>Exo-SAP-IT</td><td>Affymetrix, USA</td><td>78201</td><td>Odczynnik do czyszczenia produktu PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Enzym FastAP</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>EF0652</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do próbek LDS</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>MetaPhor Agaroza&nbsp;</td><td>lonza, Szwajcaria</td><td>50180</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen, Stany Zjednoczone</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakcja żelu MiniElute</td><td>QIAGEN, Niemcy</td><td>28604</td><td>kolumna przechowywać przy 4 Ω; bufor QG=bufor do rozpuszczania żelu; bufor PE= bufor do płukania (dla kroku 14)</td></tr><tr><td>Koraliki silanowe MyONE</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>37002D</td><td>Ekstrakcja kwasów nukleinowych kulki magnetyczne</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Invitrogen,USA</td><td>AM9759 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco, Stany Zjednoczone</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris Żele białkowe</td><td>Invitrogen, USA</td><td>NP0336BOX</td><td>4%&ndash; 12%,1,5 mm, 15-dołkowy</td></tr><tr><td>zestaw buforowy NuPAGE MOPS SDS&NBSP;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>NP0050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco, USA</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Żel Phase-Locked (PLG) ciężka tuba&nbsp; &nbsp;</td><td>TIANGEN, Chiny</td><td>WM5-2302831</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems, USA</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>NEB, Nowa Anglia&nbsp;</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 PCR master mix&nbsp;</td><td>NEB, Nowa Anglia&nbsp;</td><td>M0492L</td><td></td></tr><tr><td>Bufor RLT</td><td>QIAGEN, Niemcy</td><td>79216</td><td>Bufor do lizy oczyszczania RNA&nbsp;</td></tr><tr><td>RNA Czyste & Koncentrator-5 kolumn&nbsp;</td><td>ZYMO RESEARCH, USA</td><td>R1016</td><td>Kolumny do oczyszczania i zagęszczania RNA</td></tr><tr><td>RNaza I&nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy</td><td>Promega, USA</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 DNaza</td><td>Promega, USA</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>Środek redukujący próbkę</td><td>Invitrogen, USA</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór SDS</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15553027</td><td>10%</td></tr> <tr><td>deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>30970</td><td>chronić przed lekki</td></tr><tr><td>enzym T4 PNK</td><td>NEB, Nowa Anglia&nbsp;</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza RNA 1 o wysokim stężeniu</td><td>NEB, Nowa Anglia&nbsp;</td><td>M0437M</td><td></td></tr><tr><td>TA/Blunt-Zero Cloning Mix</td><td>Vazyme, Chiny</td><td>C601-01</td><td></td></tr><tr><td></td><td>TBE Invitrogen, USA</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCI Buffer</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech, Chiny</td><td>A600198&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech, Chiny</td><td>A600560</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Filmy rentgenowskie</td><td>Caresteam, Kanada</td><td>6535876</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda ulepszonego sieciowania immunoprecypitacyjnego (eclip) do skutecznej identyfikacji rna związanego z białkiem w jądrach myszy

Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis

Spermatogeneza definiuje wysoce uporządkowany proces różnicowania męskich komórek rozrodczych u ssaków. W jądrach transkrypcja i translacja są rozłączone, co podkreśla znaczenie potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów koordynowanej przez RBP. Aby wyjaśnić mechanistyczne role RBP, można zastosować metodologię immunoprecypitacji sieciowania (CLIP) w celu uchwycenia jego endogennych bezpośrednich celów RNA i zdefiniowania rzeczywistych miejsc interakcji. Ulepszony CLIP (eCLIP) to nowo opracowana metoda, która oferuje kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnymi CLIPs. Jednak do tej pory zastosowanie eCLIP było ograniczone do linii komórkowych, co wymagało rozszerzonych zastosowań. W tym przypadku wykorzystaliśmy eCLIP do zbadania MOV10 i MOV10L1, dwóch znanych helikaz wiążących RNA, w jądrach myszy. Zgodnie z oczekiwaniami stwierdzamy, że MOV10 głównie wiąże się z nieulegającymi translacji regionami 3' (UTR) mRNA i MOV10L1 selektywnie wiąże się z transkryptami prekursorowymi RNA oddziałującego z Piwi (piRNA). Nasza metoda eCLIP pozwala na szybkie określenie głównych gatunków RNA związanych przez różne RBP poprzez sekwencjonowanie subklonów na małą skalę, a tym samym dostępność kwalifikowanych bibliotek, co stanowi gwarancję kontynuowania głębokiego sekwencjonowania. Badanie to stanowi podstawę do zastosowania eCLIP w jądrach ssaków.

Procedura i wyniki eCLIP zostały przedstawione na Rysunku 1, Rysunku 2, Rysunku 3, Rysunku 4. Myszy uśpiono dwutlenkiem węgla, a następnie za pomocą nożyc chirurgicznych wykonano niewielkie nacięcie w dolnej części brzucha (Rysunek 2A,<stron...

Tutaj prezentujemy protokół eCLIP do określania głównych celów RNA kandydatów na RBP w jądrach.

Metoda ulepszonego sieciowania immunoprecypitacyjnego (eCLIP) do skutecznej identyfikacji RNA związanego z białkiem w jądrach myszy

Spermatogenesis defines a highly ordered process of male germ cell differentiation in mammals. In testis, transcription and translation are uncoupled, ...

Białka wiążące RNA są niezbędne dla fizjologii komórki. Co ważne, RBP ulegają silnej ekspresji w trakcie spermatogenezy i zostały dobrze udokumentowane jako niezbędne regulatory potranskrypcyjne na wszystkich etapach komórek rozrodczych. Identyfikacja celów wiążących ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia mechanistycznej roli RBP.Protokół ten stanowi dostosowane zastosowanie metody eCLIP do wychwytywania endogennych bezpośrednich celów RNA i ustanawia odpowiednią podstawę dla eCLIP w jądrach ssaków. Główną zaletą tej metody jest to, że jest ona nieradioaktywna, mniej czasochłonna i zapewnia silniejszy stosunek sygnału do szumu, ponieważ dopasowane do rozmiaru wejście będzie służyć jako odpowiednie tło dla autentycznych celów. Wreszcie, uważamy, że sekwencjonowanie subklonów na małą skalę jest przydatne do śledzenia głębokiego sekwencjonowania.Procedurę zademonstruje Xu Qiushi, mój kolega. Aby rozpocząć tę procedurę, zbierz około 100 miligramów jąder od myszy w odpowiednim wieku do każdego eksperymentu immunoprecypitacji. Umieść chusteczki w lodowatym PBS.Za pomocą pęsety z cienką końcówką delikatnie usuń osłonkę białawą. Dodaj trzy mililitry lodowatego PBS do młynka do chusteczek i użyj luźnego szklanego tłuczka, aby rozcierać tkankę za pomocą łagodnej siły mechanicznej. Następnie przenieś zawiesinę tkankową do naczynia do hodowli komórkowej i dodaj lodowaty PBS do sześciu mililitrów.Szybko potrząśnij talerzem, aby płyn równomiernie pokrył dno naczynia. Trzykrotnie usieciuj zawiesinę na lodzie z prędkością 400 milidżuli na centymetr kwadratowy przy 254 nanometrach. Upewnij się, że zawiesina została zmieszana między każdym napromieniowaniem.Następnie zebrać zawiesinę do 15-mililitrowej stożkowej probówki i odwirować w temperaturze 1 200 g i w czterech stopniach przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PBS. Następnie przenieś zawiesinę do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej.Odwirować w temperaturze 1 000 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie minuty i odrzucić supernatant. Najpierw dodaj 125 mikrolitrów kulek magnetycznych białka A na próbkę do świeżej probówki wirówkowej. Umieść rurkę na magnesie, aby oddzielić kulki od roztworu.Po 10 sekundach usuń supernatant i dwukrotnie umyj kulki jednym mililitrem lodowatego buforu do lizy. Ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach zimnego buforu do lizy z 10 mikrogramami przeciwciała eCLIP. Obracaj probówki w temperaturze pokojowej przez 45 minut.Następnie umyj kulki dwukrotnie jednym mililitrem lodowatego buforu do lizy. Na początek ponownie zawieś granulki tkanek w jednym mililitrze buforu do lizy na zimno zawierającego 22 mikrolitry 50-krotnego koktajlu inhibitorów białek wolnych od EDTA i 11 mikrolitrów inhibitora RNazy. Utrzymuj lizę próbek na lodzie przez 15 minut.Poddaj sonifikację każdej próbki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dodaj cztery mikrolitry DNazy do każdej probówki i dobrze wymieszaj. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, wstrząsając z prędkością 1 200 obr./min.Następnie dodaj 10 mikrolitrów rozcieńczonej RNazy i dobrze wymieszaj. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut, wstrząsając z prędkością 1 200 obr./min. Następnie odwirować w temperaturze 15 000 g i w czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut, aby usunąć lizat.Ostrożnie zebrać supernatant i zapisać próbki wejściowe dla próbek RWB i RRI. Najpierw dodaj jeden mililitr lizatu do przygotowanych kulek i obracaj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny lub przez noc. Następnie zbierz koraliki za pomocą stojaka magnetycznego i wyrzuć supernatant.Umyj kulki dwukrotnie 900 mikrolitrami buforu o wysokiej zawartości soli, a następnie dwukrotnie umyj kulki 900 mikrolitrami buforu do mycia. Następnie umyj kulki raz 500 mikrolitrami 1x buforu defosforylacyjnego. Najpierw wyrzuć supernatant i użyj cienkich końcówek pipet, aby usunąć resztki płynu.Dodać 25 mikrolitrów głównej mieszanki ligacyjnej z trzema liczbami głównymi do każdej próbki i ostrożnie odpipetować do wymieszania. Do każdej próbki dodać 2,5 mikrolitra adaptera RNA X1A i 2,5 mikrolitra adaptera RNA X1B. Dokładnie wymieszać, pipetując lub trzepając.Inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 75 minut, pamiętając, aby przesuwać probówkę do mieszania co 10 minut. Umyj koraliki raz 500 mikrolitrami buforu do mycia na zimno. Następnie umyj kulki raz 500 mikrolitrami zimnego buforu o wysokiej zawartości soli, a następnie 500 mikrolitrami buforu do mycia na zimno.Powtórz oba te prania jeszcze raz. Magnetycznie oddziel kulki i użyj cienkich końcówek pipet, aby usunąć wszelkie pozostałości płynu. Ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach buforu do mycia na zimno i przenieść 20 mikrolitrów do nowych probówek jako próbki RWB.Do pozostałych próbek dodać 7,5 mikrolitra 4x buforu do próbek LDS i trzy mikrolitry 10x środka redukującego próbki. Inkubować w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut, wstrząsając z prędkością 1 200 obr./min. Następnie schłodzić próbki na lodzie przez jedną minutę i odwirować w temperaturze 1 000 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę.W przypadku żelu RWB umieść rurki na magnesie i oddziel eluat białka od kulek. Załaduj 15 mikrolitrów próbki do każdej studzienki. Następnie dodaj 500 mikrolitrów przeciwutleniacza do 500 mililitrów 1x buforu do biegania SDS.Uruchom żel pod napięciem 200 woltów, 1x bufor do pracy SDS przez 50 minut lub do momentu, gdy przód barwnika znajdzie się na dole. Przenieś kompleksy białko-RNA z żelu do membrany nitrocelulozowej przy napięciu 10 woltów przez 70 minut w 1x buforze transferowym z 10% metanolem. Zablokuj membranę RWB w 5% mleku w TBST w temperaturze pokojowej na jedną godzinę.Przepłukać błonę w TBST i inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem w TBST przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj dwukrotnie TBST, przy czym każde pranie trwa pięć minut. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym w TBST w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Następnie umyj membranę trzykrotnie za pomocą TBST. Następnie wymieszać równe objętości buforu A i buforu B. Dodać tę mieszaninę do błony i inkubować przez jedną minutę. Przykryj membranę folią i wystaw ją na kliszę rentgenowską w temperaturze pokojowej przez dwie do trzech minut przed wywołaniem filmu.W tym badaniu MOV10 eCLIP w jądrach od dorosłych myszy typu dzikiego z RNazą I traktującą usieciowany lizat, docelowe białko, które ma około 114 kilodaltonów, jest z powodzeniem wzbogacane. Wyniki qPCR cDNA rozcieńczonego od 1 do 10 z różnych próbek ujawniają, że próbki nieusieciowane wykazują zmniejszoną regenerację RNA. Obserwuje się, że wartości Ct w grupie nieusieciowanej są na ogół pięciokrotnie wyższe niż w grupie usieciowanej UV.Reprezentatywne wyniki amplifikacji PCR i doboru wielkości za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym przedstawiono tutaj. Produkt primer-dimer pojawia się przy około 140 parach zasad. Widok UCSC Genome Browser dwóch reprezentatywnych sekwencji subklonów pokazuje, że znaczniki eCLIP związane z MOV10 znajdują się w obrębie trzech pierwszych UTR genu Fto.Przybliżona częstość trzech głównych celów UTR wynosi 75%, jest zgodna z większością celów MOV10 w komórkach HEK293 i jądrach. W przeciwieństwie do tego, stwierdzono, że znaczniki eCLIP związane z MOV10L1 znajdują się w klastrze piRNA, co wskazuje, MOV10L1 celuje w prekursory piRNA. Przybliżony odsetek docelowych prekursorów piRNA wynosi 42%, co odzwierciedla trend z poprzednich badań.MOV10L1 eCLIP z mineralizacją RNazy I 40 jednostek na mililitr daje stosunkowo więcej sekwencji z mniej niż 20 parami zasad. Opisany tutaj protokół reprezentuje zastosowanie metody eCLIP w reprodukcji, obszarze, w którym wiedza na temat interakcji RNA-RBP jest raczej niewystarczająca.

enhanced-crosslinking-immunoprecipitation-eclip-method-for-efficient

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przestrzenne rozmieszczenie białek wiążących RNA na transkrypcie jest kluczowym czynnikiem regulacji potranskrypcyjnej. Opracowaliśmy zatem metodę sieciowania promieniami UV i immunoprecypitacji z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu (iCLIP), która umożliwia precyzyjne mapowanie w całym genomie miejsc wiązania białka wiążącego RNA.

iCLIP – Mapowanie oddziaływań białko-RNA w całym transkryptomie z rozdzielczością pojedynczych nukleotydów

Protokół krok po kroku dotyczący izolacji i identyfikacji kompleksów związanych z RNA za pomocą metody RIP-Chip.

Metoda izolacji i identyfikacji mRNA, mikroRNA oraz komponentów białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych z wykorzystaniem techniki RIP-Chip

Ten film demonstruje metodę ulepszonego sieciowania immunoprecypitacyjnego (eCLIP) do identyfikacji białek wiążących RNA w jądrach myszy. eCLIP umożliwia precyzyjną identyfikację miejsc wiązania, w których białka wiążące RNA (RBP) oddziałują ze swoimi docelowymi RNA.

Ulepszona metoda immunoprecypitacji sieciowania do skutecznej identyfikacji RNA związanego z białkiem w jądrach myszy

Ten manuskrypt opisuje podejście do izolacji wybranych pokrewnych RNP powstałych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane na oligonukleotydy. Wykazujemy możliwość zastosowania tego podejścia poprzez wyizolowanie pokrewnego RNP związanego z retrowirusowym regionem 5' bez translacji, który składa się z helikazy DHX9 / RNA A.

Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami

Opisujemy protokół do identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących RNA w żywych komórkach za pomocą fotosieciowania za pośrednictwem UV i spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych miejsc wiązania RNA lub "śladów" kompleksów RNA:białko (RNP) z komórek ssaków. Podejście to obejmuje dwie immunoprecypitacje podjednostek RNP i dlatego nazywa się immunoprecypitacją RNA w tandemie (RIPiT).

Identyfikacja śladów RNA:Kompleksy białkowe poprzez immunoprecypitację RNA w tandemie, a następnie sekwencjonowanie (RIPiT-Seq)

Tutaj prezentujemy zmodyfikowany protokół CLIP-seq o nazwie FbioCLIP-seq z tandemowym oczyszczaniem FLAG-biotyna w celu określenia celów RNA białek wiążących RNA (RBP) w komórkach ssaków.

Profilowanie interakcji białko-RNA w całym transkryptomie poprzez sieciowanie krzyżowe i immunoprecypitację za pośrednictwem tandemowego oczyszczania FLAG-biotyna

Tutaj opisujemy immunoprecypitację rybosomów i związanego z nimi RNA z wybranych populacji dorosłych męskich komórek rozrodczych myszy za pomocą systemu RiboTag. Strategiczna hodowla i staranna immunoprecypitacja skutkują czystymi, powtarzalnymi wynikami, które informują o translatomie komórek rozrodczych i dostarczają wglądu w mechanizmy zmutowanych fenotypów.

Immunoprecypitacja RiboTag w komórkach rozrodczych samca myszy

Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę in vitro do odkrywania, ilościowego i walidacji interaktorów białkowych specyficznych sekwencji RNA, przy użyciu całkowitego ekstraktu białkowego z komórek ludzkich, kulek streptawidyny pokrytych biotynylowanym RNA oraz analizy spektrometrii mas.

Zoptymalizowana ilościowa analiza typu pull-down białek wiążących RNA przy użyciu krótkiego biotynylowanego RNA

Metoda ChIRP oparta na UV do identyfikacji bezpośrednich interakcji lncRNA-białko.

Metoda ChIRP oparta na UV do zweryfikowanej identyfikacji białek, które bezpośrednio współpracują z LncRNA: Od hodowanych komórek do jąder mysich

Poznaj metodę eCLIP do identyfikacji RNA związanego z białkiem w jądrach myszy. Ta niepromieniotwórcza technika umożliwia skuteczną analizę celów RBP podczas spermatogenezy z wysoką specyficznością sygnału.

Metoda ulepszonego sieciowania immunoprecypitacyjnego (eCLIP) do skutecznej identyfikacji RNA związanego z białkiem w jądrach myszy (Wideo) | JoVE Journal

Metoda ulepszonego sieciowania immunoprecypitacyjnego (eCLIP) do skutecznej identyfikacji RNA związanego z białkiem w jądrach myszy

Przeglądaj więcej filmów