Metoda ulepszonego sieciowania immunoprecypitacyjnego (eCLIP) do skutecznej identyfikacji RNA związanego z białkiem w jądrach myszy

Białka wiążące RNA są niezbędne dla fizjologii komórki. Co ważne, RBP ulegają silnej ekspresji w trakcie spermatogenezy i zostały dobrze udokumentowane jako niezbędne regulatory potranskrypcyjne na wszystkich etapach komórek rozrodczych. Identyfikacja celów wiążących ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia mechanistycznej roli RBP.

Protokół ten stanowi dostosowane zastosowanie metody eCLIP do wychwytywania endogennych bezpośrednich celów RNA i ustanawia odpowiednią podstawę dla eCLIP w jądrach ssaków. Główną zaletą tej metody jest to, że jest ona nieradioaktywna, mniej czasochłonna i zapewnia silniejszy stosunek sygnału do szumu, ponieważ dopasowane do rozmiaru wejście będzie służyć jako odpowiednie tło dla autentycznych celów. Wreszcie, uważamy, że sekwencjonowanie subklonów na małą skalę jest przydatne do śledzenia głębokiego sekwencjonowania.

Procedurę zademonstruje Xu Qiushi, mój kolega. Aby rozpocząć tę procedurę, zbierz około 100 miligramów jąder od myszy w odpowiednim wieku do każdego eksperymentu immunoprecypitacji. Umieść chusteczki w lodowatym PBS.

Za pomocą pęsety z cienką końcówką delikatnie usuń osłonkę białawą. Dodaj trzy mililitry lodowatego PBS do młynka do chusteczek i użyj luźnego szklanego tłuczka, aby rozcierać tkankę za pomocą łagodnej siły mechanicznej. Następnie przenieś zawiesinę tkankową do naczynia do hodowli komórkowej i dodaj lodowaty PBS do sześciu mililitrów.

Szybko potrząśnij talerzem, aby płyn równomiernie pokrył dno naczynia. Trzykrotnie usieciuj zawiesinę na lodzie z prędkością 400 milidżuli na centymetr kwadratowy przy 254 nanometrach. Upewnij się, że zawiesina została zmieszana między każdym napromieniowaniem.

Następnie zebrać zawiesinę do 15-mililitrowej stożkowej probówki i odwirować w temperaturze 1 200 g i w czterech stopniach przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PBS. Następnie przenieś zawiesinę do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej.

Odwirować w temperaturze 1 000 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie minuty i odrzucić supernatant. Najpierw dodaj 125 mikrolitrów kulek magnetycznych białka A na próbkę do świeżej probówki wirówkowej. Umieść rurkę na magnesie, aby oddzielić kulki od roztworu.

Po 10 sekundach usuń supernatant i dwukrotnie umyj kulki jednym mililitrem lodowatego buforu do lizy. Ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach zimnego buforu do lizy z 10 mikrogramami przeciwciała eCLIP. Obracaj probówki w temperaturze pokojowej przez 45 minut.

Następnie umyj kulki dwukrotnie jednym mililitrem lodowatego buforu do lizy. Na początek ponownie zawieś granulki tkanek w jednym mililitrze buforu do lizy na zimno zawierającego 22 mikrolitry 50-krotnego koktajlu inhibitorów białek wolnych od EDTA i 11 mikrolitrów inhibitora RNazy. Utrzymuj lizę próbek na lodzie przez 15 minut.

Poddaj sonifikację każdej próbki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dodaj cztery mikrolitry DNazy do każdej probówki i dobrze wymieszaj. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, wstrząsając z prędkością 1 200 obr./min.

Następnie dodaj 10 mikrolitrów rozcieńczonej RNazy i dobrze wymieszaj. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut, wstrząsając z prędkością 1 200 obr./min. Następnie odwirować w temperaturze 15 000 g i w czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut, aby usunąć lizat.

Ostrożnie zebrać supernatant i zapisać próbki wejściowe dla próbek RWB i RRI. Najpierw dodaj jeden mililitr lizatu do przygotowanych kulek i obracaj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny lub przez noc. Następnie zbierz koraliki za pomocą stojaka magnetycznego i wyrzuć supernatant.

Umyj kulki dwukrotnie 900 mikrolitrami buforu o wysokiej zawartości soli, a następnie dwukrotnie umyj kulki 900 mikrolitrami buforu do mycia. Następnie umyj kulki raz 500 mikrolitrami 1x buforu defosforylacyjnego. Najpierw wyrzuć supernatant i użyj cienkich końcówek pipet, aby usunąć resztki płynu.

Dodać 25 mikrolitrów głównej mieszanki ligacyjnej z trzema liczbami głównymi do każdej próbki i ostrożnie odpipetować do wymieszania. Do każdej próbki dodać 2,5 mikrolitra adaptera RNA X1A i 2,5 mikrolitra adaptera RNA X1B. Dokładnie wymieszać, pipetując lub trzepając.

Inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 75 minut, pamiętając, aby przesuwać probówkę do mieszania co 10 minut. Umyj koraliki raz 500 mikrolitrami buforu do mycia na zimno. Następnie umyj kulki raz 500 mikrolitrami zimnego buforu o wysokiej zawartości soli, a następnie 500 mikrolitrami buforu do mycia na zimno.

Powtórz oba te prania jeszcze raz. Magnetycznie oddziel kulki i użyj cienkich końcówek pipet, aby usunąć wszelkie pozostałości płynu. Ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach buforu do mycia na zimno i przenieść 20 mikrolitrów do nowych probówek jako próbki RWB.

Do pozostałych próbek dodać 7,5 mikrolitra 4x buforu do próbek LDS i trzy mikrolitry 10x środka redukującego próbki. Inkubować w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut, wstrząsając z prędkością 1 200 obr./min. Następnie schłodzić próbki na lodzie przez jedną minutę i odwirować w temperaturze 1 000 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę.

W przypadku żelu RWB umieść rurki na magnesie i oddziel eluat białka od kulek. Załaduj 15 mikrolitrów próbki do każdej studzienki. Następnie dodaj 500 mikrolitrów przeciwutleniacza do 500 mililitrów 1x buforu do biegania SDS.

Uruchom żel pod napięciem 200 woltów, 1x bufor do pracy SDS przez 50 minut lub do momentu, gdy przód barwnika znajdzie się na dole. Przenieś kompleksy białko-RNA z żelu do membrany nitrocelulozowej przy napięciu 10 woltów przez 70 minut w 1x buforze transferowym z 10% metanolem. Zablokuj membranę RWB w 5% mleku w TBST w temperaturze pokojowej na jedną godzinę.

Przepłukać błonę w TBST i inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem w TBST przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj dwukrotnie TBST, przy czym każde pranie trwa pięć minut. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym w TBST w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Następnie umyj membranę trzykrotnie za pomocą TBST. Następnie wymieszać równe objętości buforu A i buforu B. Dodać tę mieszaninę do błony i inkubować przez jedną minutę. Przykryj membranę folią i wystaw ją na kliszę rentgenowską w temperaturze pokojowej przez dwie do trzech minut przed wywołaniem filmu.

W tym badaniu MOV10 eCLIP w jądrach od dorosłych myszy typu dzikiego z RNazą I traktującą usieciowany lizat, docelowe białko, które ma około 114 kilodaltonów, jest z powodzeniem wzbogacane. Wyniki qPCR cDNA rozcieńczonego od 1 do 10 z różnych próbek ujawniają, że próbki nieusieciowane wykazują zmniejszoną regenerację RNA. Obserwuje się, że wartości Ct w grupie nieusieciowanej są na ogół pięciokrotnie wyższe niż w grupie usieciowanej UV.

Reprezentatywne wyniki amplifikacji PCR i doboru wielkości za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym przedstawiono tutaj. Produkt primer-dimer pojawia się przy około 140 parach zasad. Widok UCSC Genome Browser dwóch reprezentatywnych sekwencji subklonów pokazuje, że znaczniki eCLIP związane z MOV10 znajdują się w obrębie trzech pierwszych UTR genu Fto.

Przybliżona częstość trzech głównych celów UTR wynosi 75%, jest zgodna z większością celów MOV10 w komórkach HEK293 i jądrach. W przeciwieństwie do tego, stwierdzono, że znaczniki eCLIP związane z MOV10L1 znajdują się w klastrze piRNA, co wskazuje, MOV10L1 celuje w prekursory piRNA. Przybliżony odsetek docelowych prekursorów piRNA wynosi 42%, co odzwierciedla trend z poprzednich badań.

MOV10L1 eCLIP z mineralizacją RNazy I 40 jednostek na mililitr daje stosunkowo więcej sekwencji z mniej niż 20 parami zasad. Opisany tutaj protokół reprezentuje zastosowanie metody eCLIP w reprodukcji, obszarze, w którym wiedza na temat interakcji RNA-RBP jest raczej niewystarczająca.