Generowanie i obrazowanie organoidów nabłonkowych myszy i ludzi z normalnej i nowotworowej tkanki sutka bez pasażowania

Protokół ten jest istotny dla produkcji organoidów nabłonka pamięci, które są generowane bez pasażowania. Główną zaletą tej techniki jest to, że organoidy można wyizolować z ludzkiej i mysiej piersi i tkanki pamięci po trawieniu enzymatycznym. Przeprowadzamy szereg etapów wirowania różnicowego, które izolują organoidy nabłonkowe bez konieczności pasażowania komórek.

Osoba wykonująca tę technikę może napotkać wyzwania podczas osadzania tkanek w kolagenie lub macierzy i powlekania ich w 96-dołkowej płytce. Co więcej, użycie odpowiednio spolimeryzowanego kolagenu i poszycia stabilnych kopuł jest kluczem do zobaczenia inwazji. Na początek zbierz tkankę sutkową myszy poddanej eutanazji, rozkładając kończyny myszy i używając czterech igieł o rozmiarze 19, przypnij mysz łapami do deski pokrytej chłonną wkładką ze stroną brzuszną skierowaną do góry.

Spryskaj 70% etanolem, aby wygładzić sierść i zdezynfekować skórę oraz zetrzeć kał gazikiem lub chusteczką. Zaczynając tuż nad okolicą odbytu i narządów płciowych, odetnij w górę od linii środkowej za pomocą nożyczek chirurgicznych, uważając, aby nie przebić otrzewnej. Po dotarciu do podbródka wykonaj boczne nacięcia w obu obojczykach i w dół tylnych nóg oraz przypnij skórę myszy napiętą do deski, aby odsłonić poduszeczki tłuszczowe sutka.

Po zlokalizowaniu pachwinowych i piersiowych poduszek tłuszczowych u myszy typu dzikiego, użyj kleszczy, aby podnieść poduszeczkę tłuszczową sutka. Używając końca ostrych, nożyczek, utwórz kieszeń pod poduszką tłuszczową sutka z dala od skóry i odetnij poduszeczkę tłuszczową sutka w jednym kawałku. Po usunięciu poduszeczek tłuszczowych sutka spłucz PBS przed umieszczeniem ich w sterylnym naczyniu do hodowli tkankowych, a następnie szybko przenieś do kaptura do hodowli tkankowych.

Zmiel guzy sutka skalpelem numer 10 lub numer 11, aby rozluźnić tkankę, aż osiągnie konsystencję pasty. Przenieś zmieloną tkankę do stożkowej probówki zawierającej od 10 do 30 mililitrów roztworu kolagenazy za pomocą skalpela. Aby upewnić się, że cała tkanka została pobrana, odpipetuj jeden mililitr roztworu kolagenazy na płytkę do hodowli tkankowej i z powrotem do stożkowej probówki.

Umieść stożkową rurkę w inkubatorze laboratoryjnym, aż tkanka stanie się żylasta, a roztwór kolagenazy stanie się mętny. Odwiruj 50 mililitrów roztworu przez pięć do 10 minut przy 1,500 obr./min. Odessać supernatant i dodać 12 mililitrów podłoża podstawowego i wymieszać, pipetując w górę i w dół trzy do czterech razy lub delikatnie obrócić nadgarstek, trzymając probówkę 15 razy.

Ponownie odwirować odsysany supernatant, dodać podłoże podstawowe i wymieszać przez pipetowanie lub obracanie probówki, jak pokazano wcześniej. Gdy najcięższe fragmenty tkanek osiądą na dnie, należy pobrać supernatant za pomocą pipety serologicznej i przenieść go do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Po każdym odwirowaniu upewnij się, że osad staje się coraz bardziej nieprzezroczysty

Podwielokrotność odpowiedniej zawiesiny organoidów w probówkach do mikrowirówek zgodnie z gęstością organoidów w stosunku do ilości BECM na studzienkę. Odwirować probówki do mikrowirówek przez 10 minut w temperaturze 300 G w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant z probówek. Przenieść probówki z granulkami organoidów do lodu i dodać odpowiednią objętość BECM do każdej probówki do mikrowirówki.

Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić organoidy w BECM, uważając, aby nie wytworzyć pęcherzyków. Powoli i ostrożnie pipetować organoidy zawieszone w BECM na powierzchni posiewu i napełnić wszystkie puste studzienki PBS, aby utrzymać wilgotność. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę, aby BECM zastygł, a następnie przykryj odpowiednią ilością pożywki.

Aby przygotować roztwór kolagenu, połącz 375 mikrolitrów o stężeniu 10-krotności stężenia DMEM, 100 mikrolitrów jednego normalnego wodorotlenku sodu i trzy mililitry roztworu kolagenu z ogona szczura I w 15-mililitrowej stożkowej probówce. Odpipetować mieszać, uważając, aby nie powstały pęcherzyki, i miareczkować roztwór do pH 7,2 do 7,4 niewielką ilością wodorotlenku sodu lub 10-krotnym stężeniem DMEM, w zależności od potrzeb. Pokryj dno studzienek minimalną ilością kolagenu wymaganą do pełnego pokrycia dna studzienki, umieszczając niewielką ilość kolagenu i kołysz płytką z boku na bok, aby pokryć.

Pozwól podkładom kolagenowym zastygnąć w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut do dwóch godzin. Podwielokrotną porcję odpowiedniej zawiesiny organoidów do probówek do mikrowirówek zgodnie z gęstością organoidów w stosunku do ilości kolagenu w basenie. Przechowuj roztwór kolagenu w temperaturze czterech stopni Celsjusza i monitoruj polimeryzację, sprawdzając pod mikroskopem co 10 minut, czy tworzą się włókna.

Odwirować probówki do mikrowirówek o stężeniu 300 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant z probówek. Przenieś granulki organoidów na lód i dodaj odpowiednią objętość kolagenu do każdej probówki mikrowirówki. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby ponownie zawiesić organoidy w kolagenie, uważając, aby nie wytworzyć pęcherzyków.

Powoli i ostrożnie pipetować organoidy zawieszone w kolagenie na powierzchni poszycia. Immunofluorescencyjne obrazy organoidów osadzonych w podstawowej macierzy zewnątrzkomórkowej lub kolagenie uzyskano w celu zbadania podobieństw składu tkanek międzygatunkowych. Organoidy osadzone w macierzy kolagenowej można wykorzystać do testu inwazji i przeanalizować poprzez śledzenie ekspansji wąsów rozgałęziających się z samego organoidu, albo poprzez etykietowanie pomidorów błonowych, albo barwienie falloidyną aktyny.

Wreszcie, barwienie hematoksyliną i eozyną organoidów osadzonych w parafinie pokazuje, że organoidy utrzymują tę samą histologię raka piersi. Bardzo ważne jest, aby podczas pipetowania żelowych kopułek BECM i kolagenu utrzymywały niską temperaturę, aby uniknąć przedwczesnej polimeryzacji. Dodatkowo, długotrwałe mocowanie kopuł w PFA doprowadzi do powstania żelowego roztworu w przypadku barwienia immunofluorescencyjnego.

Organoidy mogą być również stosowane w procedurach in vitro i in vivo, takich jak badania przesiewowe leków i mysie modele przerzutów. Metody te mogą dostarczyć informacji na temat wrażliwości terapeutycznej tkanki nowotworowej, właściwości przerzutowych i interakcji immunologicznych.