Pomiar aktywności transkrypcyjnej sterowanej przez niekodujący region kontrolny BK-poliomawirusa za pomocą cytometrii przepływowej

Ogólnym celem tego protokołu jest pomiar aktywności transkrypcyjnej sterowanej przez niekodujący region kontrolny BK-poliomawirusa poprzez pomiar podwójnych komórek fluorescencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej. Poliomawirus BK może powodować poważne patologie u pacjentów z obniżoną odpornością, zwłaszcza u biorców przeszczepu nerki. Ponieważ jednak wysoce skuteczne programy antywirusowe nie są obecnie dostępne, potrzebne są metody mierzące potencjalny wpływ przeciwwirusowy innych związków.

Metoda ta pozwala wirusologom analizować wpływ potencjalnych środków przeciwwirusowych na aktywność transkrypcyjną BK-poliomawirusa napędzaną przez niekodujący region kontrolny. Test ten pozwala dodatkowo badać wpływ rearanżacji na aktywność promotora w porównaniu z archetypicznymi niekodującymi regionami kontrolnymi. Zaletą badania aktywności promotora wirusa za pomocą raportu podwójnej fluorescencji jest to, że wczesna i późna ekspresja genów może być analizowana w sposób niezależny od siebie.

Co więcej, trudna perforacja zapasów wirusa i długoterminowe eksperymenty z zakaźnymi hodowlami komórkowymi nie są konieczne, ponieważ analizowane są tylko komórki transfekowane i fluorescencyjne, można również badać leki zmniejszające żywotność komórek i perforację. Protokół ten jest zgodny z wytycznymi badań na ludziach zatwierdzonymi przez komisję etyczną wydziału medycznego Uniwersytetu Duisburg-Essen. Pierwszym krokiem jest pobranie próbek krwi do izolacji DNA poliomawirusa.

Zbierz co najmniej trzy mililitry krwi w probówkach do akwizycji EDTA. Odwirować próbkę o sile 2 500 G przez 15 minut i pipetować osocze do nowej probówki. Przygotuj 40 mikrolitrów białka SK do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i dodaj 400 mikrolitrów osocza przez pipetowanie.

Wyizoluj DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA blot zgodnie z opisem w instrukcjach producenta. Przygotuj mieszankę wzorcową do pre-PCR, używając pary starterów A w łącznej objętości 50 mikrolitrów i użyj wcześniej wyizolowanego DNA. Rozprowadzić 45 mikrolitrów mieszanki głównej do probówek PCR.

Dodać pięć mikrolitrów wyizolowanego DNA do probówek PCR i przeprowadzić PCR w warunkach reakcji, jak pokazano w tabeli trzeciej. Powtórz denaturację, wyżarzanie i wydłużanie w 35 cyklach. W przypadku aplikacji zagnieżdżonej użyj pary starterów B, zawierającej miejsca ograniczeń do klonowania.

Wymieszaj 10 mikrolitrów produktu PCR z dwoma mikrolitrami sześciokrotnego barwnika ładującego żel. Załaduj 10 mikrolitrów mieszanki na 1,5% żel agarozowy i uruchom żel na 30 minut przy 60 miliamperach. Wizualizacja żelu za pomocą odpowiedniego systemu dokumentacji UV.

Oczyść amplikony PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Trawić oczyszczone amplikony za pomocą wskaźnikowych enzymów restrykcyjnych przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Powtórz etapy oczyszczania, aby oczyścić strawione amplikony.

Równolegle trawić również szkielet plazmidu. Przeanalizuj strawiony szkielet plazmidu na 0,8% żelu agarozowym o niskim mocowaniu. Nie uruchamiaj żelu przy prądzie wyższym niż 40 miliamperów.

Wizualizuj fragmenty DNA za pomocą długofalowego światła UV i wytnij zgięty kręgosłup za pomocą czystego skalpela. Unikaj długich czasów ekspozycji na promieniowanie UV, aby zapobiec uszkodzeniom DNA. Ogrodzenie dla kawałka fragmentu żelu flomelowego do nowej 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej.

Podgrzewaj szkielet zawierający kawałek agarozy w trybie niskim przez 10 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza, aby stopić kawałek żelu i mieszaj co dwie minuty przez delikatne wirowanie. Stopiony żel może być bezpośrednio użyty do podwiązania. Zliguj szkielet i strawiony amplikon za pomocą ligazy DNA T4 przez noc w temperaturze 16 stopni Celsjusza.

Po standardowej procedurze klonowania należy wyizolować DNA osocza. Przeprowadź trawienie enzymem restrykcyjnym, aby sprawdzić, czy nie ma dodatnich klonów i zwizualizować strawione fragmenty na 1% żelu agarozowym. Wysiewaj 100 000 HEK293T komórek na studzienkę 12-dołkowej płytki 24 godziny przed transfekcją i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, utrzymuj aktywną proliferację podczas transfekcji.

Komórki powinny znajdować się w przybliżeniu w 80% zbiegu podczas transfekcji. Umieścić 250 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy w sterylnej probówce i dodać jeden mikrogram każdego zgłoszonego DNA osocza i delikatnie wymieszać przez pipetowanie. Dodać trzy mikrolitry odczynnika do transfekcji do mieszaniny DNA i delikatnie wymieszać pipetując i inkubować przez 15 minut w temperaturze 22 stopni Celsjusza.

Dodaj mieszaninę kroplami do dołka i delikatnie rozprowadź do dołka. Po czterech godzinach zastąpić supernatant świeżą pożywką zawierającą czynniki testowe i kontrolę rozpuszczalnika. W tym przykładzie zastosowano inhibitory mTOR INK-128 i rapamycynę.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza do czasu analizy. Sprawdź komórki pod kątem czerwonej i zielonej fluorescencji pod mikroskopem fluorescencyjnym. Czerwona i zielona fluorescencja odpowiadają odpowiednio wczesnej i późnej ekspresji genu BK-poliomawirusa.

72 godziny po transfekcji ostrożnie zaaspiruj supernatant. Umyj komórki dwukrotnie jednym mililitrem zimnego PBS. Delikatnie dodaj 500 mikrolitrów trypsyny i lekko obróć płytkę, aby uniknąć przedwczesnego oderwania komórek.

Ten krok jest ważny, aby uniknąć dubletów komórek. Po dodaniu trypsynę usuwa się bezpośrednio za pomocą tej samej końcówki pipety. Inkubować komórki przez co najmniej pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Ponownie zawiesić komórki trypsyny S za pomocą jednego mililitra PBS zawierającego 3% FCS i przenieść zawiesinę do wstępnie znakowanych probówek FACS. Dodaj DAPI w stężeniu jednego mikrograma na mililitr przed analizą FACS. Przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego.

Dla każdej próbki należy zmierzyć co najmniej 10 000 żywych komórek. Początkowa kompensacja jest niezbędna do rozróżnienia sygnałów czerwonych i zielonych w celu uzyskania dokładnych wyników. Niekodujący regent kontrolny został amplifikowany przy użyciu zagnieżdżonego protokołu PCR przy użyciu wewnętrznej pary starterów, która zawiera miejsca ograniczeń do klonowania.

Weryfikację amplikonu przeprowadzono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, podczas gdy amplikony pochodzące z archetypicznych sekwencji NCCR o jednorodnym rozkładzie wielkości w żelu, te pochodzące z przegrupowanych NCCR z insercjami i delecjami różniły się wielkością. Selekcja dodatnich klonów zawierających NCCR została zweryfikowana za pomocą analizy restrykcji. Mały obszar dystansowy został zastąpiony większymi fragmentami NCCR wskazującymi na dodatnie klony.

Plazmidowe DNA wyizolowane ze zweryfikowanych klonów wysłano do pirosekwencjonowania. W tym przykładzie wykryto usunięcie w bloku P i podstawienie w bloku O. HEK293T komórki były przejściowo transfekowane z poszanowaniem konstruktu raportowanego, a aktywność NCCR monitorowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Czerwone i zielone fluorescencje odpowiadały odpowiednio wczesnej i późnej ekspresji genów BK-poliomawirusa. Pierwszy NCCR wykazywał silną późną ekspresję genu, podczas gdy drugi przykład miał stosunkowo silną wczesną, ale umiarkowaną późną ekspresję genu. Ujemne komórki DAPI bramkowano i utworzono wykres kropkowy pokazujący eGFP w porównaniu z tdTomato.

Do analizy włączono próbki, które były ujemne, a także te dodatnie tylko dla tdTomato lub eGFP. Średnie intensywności fluorescencji uzyskano z każdego badanego klonu. W tym przykładzie leczenie podwójnym inhibitorem mTOR INK128 znacznie zmniejszyło tdTomato MFI, co oznacza, że wczesna ekspresja została zahamowana.

Metoda ta pozwala na identyfikację aktualnie stosowanych i innych związków do wykrywania poliomawirusa BK poprzez aktywność transkrypcyjną. We wczesnej ekspresji genów zdecydowanie determinuje to implikacje wirusowe. Krople hamujące mogą być uważane za stosowane jako leki u pacjentów z obniżoną odpornością w przypadku reaktywacji BK-poliomawirusa.