Name: Pomiar aktywności transkrypcyjnej sterowanej przez niekodujący region kontrolny BK-poliomawirusa za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Poznaj metodę pomiaru aktywności transkrypcyjnej BK-poliomawirusa za pomocą cytometrii przepływowej z podwójnym fluorescencyjnym reporterem w komórkach HEK293T. Ta technika umożliwia analizę wpływu związków przeciwwirusowych na ekspresję genów wczesnych i późnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Barbarze Bleekmann za doskonałą pomoc techniczną. Badania te były wspierane przez program IFORES Szkoły Medycznej Uniwersytetu Duisburg-Essen oraz program RIMOUR University Alliance Ruhr and Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). Autorzy dziękują Jürgen-Manchot-Stiftung za stypendium doktoranckie Helene Sertznig i stałe wsparcie. Gromadzenie i wykorzystywanie materiałów dla pacjentów zostało zatwierdzone przez komisję bioetyczną wydziału medycznego Uniwersytetu Duisburg-Essen (14-6028-BO).

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi badań na ludziach, zatwierdzonymi przez komisję etyki wydziału medycznego Uniwersytetu Duisburg-Essen (14-6028-BO).
1. Pobieranie próbek krwi lub moczu i izolacja DNA poliomawirusa
<ol>
	<li> Zbierz co najmniej 3 ml krwi do probówek EDTA lub mocz do probówek akwizycyjnych.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 2 500 x g przez 15 minut. W razie potrzeby należy pipetować osocze do nowej probówki i przechowywać próbki osocza w temperaturze 4 °C przez kilka dni lub zamrażać w temperaturze -20 °C w celu dłuższego przechowywania.</li>
	<li>Przygotować 40 μl proteinazy K do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać 400 μl osocza metodą pipetowania.</li>
	<li>Poddać próbkę lizie przez dodanie 400 μl buforu do lizy, wirować przez 15 s i inkubować przez 10 minut w temperaturze 56 °C.</li>
	<li>Wyizoluj DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji krwi DNA, zgodnie z opisem w instrukcjach producenta. Krótko dodaj alkohol i załaduj lizaty na kolumnę wirową zawierającą błonę na bazie krzemionki wiążącą DNA. Umyj kolumny kilka razy, aby uzyskać czyste DNA.</li>
	<li>Eluować otrzymane DNA w 30-50 μl buforu TE.</li>
</ol>
2. Amplifikacja niekodującego regionu kontrolnego (NCCR)
<ol>
	<li>Wykonaj poniższą procedurę w fizycznie oddzielonych pomieszczeniach. Użyj odizolowanego pomieszczenia do przygotowania odczynników i rozprowadzenia mieszaniny do probówek PCR.</li>
	<li>Przygotować Master Mix do pre-PCR, używając pary starterów A (Tabela 1) w całkowitej objętości 50 μl i użyć wcześniej wyizolowanego DNA z kroku 1.6. Schemat pipetowania służący do przygotowania mieszanki wzorcowej do wstępnego i zagnieżdżonego PCR jest przedstawiony w Tabeli 2.</li>
	<li>Rozprowadzić 45 μl mieszanki wzorcowej do probówek PCR.</li>
	<li>Dodać 5 μl wyizolowanego DNA do probówek PCR. 
	UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, należy użyć innego pomieszczenia niż to, w którym przygotowywana jest mieszanka główna.</li>
	<li>Przeprowadzić PCR w warunkach reakcji, jak pokazano w Tabeli 3. Powtórz denaturację, wyżarzanie i wydłużanie w 35 cyklach.</li>
	<li>Do zagnieżdżonej amplifikacji należy użyć pary starterów B, w której znajdują się miejsca restrykcyjne dla AgeI i SpeI (Tabela 1).</li>
	<li>Uruchom zagnieżdżony PCR z warunkami reakcji opisanymi w krokach od 2.2 do 2.5 przy użyciu 5 μl pre-PCR.</li>
	<li>Wymieszaj 10 μl produktu PCR z 2 μl 6x barwnika ładującego żel. Załaduj 10 μl mieszanki na 1,5% żel agarozowy i uruchom żel na 30 minut w temperaturze 60 mA.</li>
	<li>Wizualizacja żelu za pomocą odpowiedniego systemu dokumentacji UV. 
	UWAGA: Oczekuje się, że rozmiar amplikonu będzie wynosił od 300 do 500 pz w zależności od tego, czy nastąpiły rearanżacje (delecje, insercje czy duplikacje) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Oczyść amplikony PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Eluować amplikony PCR w 30 μl buforu elucyjnego.</li>
	<li>Wyślij amplikony do sekwencjonowania Sangera przy użyciu pary starterów B.</li>
</ol>
3. Klonowanie NCCR do reportera podwójnej fluorescencji
<ol>
	<li>Trawić oczyszczone amplikony (etap 2.10) za pomocą AgeI i SpeI przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, jak opisano w tabeli 4.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.10 i oczyścić strawione amplikony.</li>
	<li>Równolegle trawić również szkielet plazmidowy (1,5 μg) za pomocą AgeI i SpeI przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, jak opisano w tabeli 5. Ten krok należy wykonać tylko raz. W przypadku kolejnych reakcji zamrozić trawienie w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przeanalizuj strawiony szkielet plazmidu na 0,8% niskotopliwym żelu agarozowym. 
	UWAGA: Nie uruchamiaj żelu o prądzie wyższym niż 40 mA. Oczekiwana insercja obszaru dystansowego pierwotnie pochodzącego z plazmidu pEX-K4 2-LTR CD313 wynosi 128 pz (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Wizualizacja fragmentów DNA za pomocą długofalowego światła UV (320 nm) i wycięcie pasma kręgosłupa za pomocą czystego skalpela. Przenieś niskotopliwy fragment żelu do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Unikaj długich czasów ekspozycji na promieniowanie UV, aby zapobiec uszkodzeniu DNA. 
	UWAGA: Ponieważ stosuje się agarozę o niskiej stopie, nie jest konieczne oczyszczanie DNA przed ligacją.</li>
	<li>Podgrzewać szkielet zawierający kawałek niskotopliwej agarozy przez 10 minut w temperaturze 65 °C w celu stopienia kawałka żelu i mieszać co 2 minuty przez delikatne wirowanie. Stopiony żel może być bezpośrednio użyty do podwiązania.</li>
	<li>Związać szkielet i strawiony amplikon za pomocą ligazy DNA T4 przez noc w temperaturze 16 °C, stosując schemat przedstawiony w Tabeli 6.</li>
	<li>Przeprowadź transformację w E. coli metodą szoku cieplnego, płytki bakterii na płytkach LB-amp i hodowlę w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia wybrać trzy dodatnie klony i przygotować przez noc kultury E. coli (5 ml LB-Amp) i hodowlę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wyizoluj plazmid-DNA przy użyciu standardowych protokołów, jak opisano gdzie indziej14, przeprowadź trawienie AgeI i SpeI, aby sprawdzić, czy nie ma pozytywnych klonów i zwizualizuj wycięte fragmenty na 1% żelu agarozowym. Pasma dystansowa (128 pz) zostanie zastąpiona większą sekwencją NCCR (300-500 pz, patrz wyżej).</li>
	<li>Wyślij plazmid do sekwencjonowania Sangera za pomocą startera EGFP-N lub pary starterów B (Tabela 1).</li>
	<li>Ponieważ mutacje mogą wystąpić spontanicznie, należy porównać wyniki sekwencjonowania z wynikami sekwencjonowania uzyskanymi za pomocą amplikonu. Należy używać wyłącznie klonów zawierających identyczne sekwencje w porównaniu z amplikonem.</li>
	<li>Użyj oprogramowania molekularnego środowiska pracy (np. darmowego GENtle 1.9.4 lub innych programów do edycji sekwencji), aby wyrównać i edytować uzyskane sekwencje (Rysunek 3).</li>
	<li>Uruchom GENtle 1.9.4 i zaimportuj sekwencje DNA, klikając przycisk Importuj (zielona strzałka w dół).</li>
	<li>Następnie kliknij Narzędzie i wybierz Wyrównanie z menu (użyj Ctrl + G jako skrótu) i wybierz sekwencje DNA do wyrównania.</li>
	<li>Dodaj sekwencję do wyrównania, klikając Dodaj lub usuń sekwencję, klikając Usuń. Dołącz archetypiczną sekwencję konsensusu NCCR, taką jak JN19243815, nie używaj sekwencji NCCR z powszechnie używanej klasy Dunlop-strain<sup="xref">16, ponieważ zawiera ona przegrupowania i duplikacje inne niż archetypiczne szczepy BKPyV. 
	UWAGA: NCCR zawiera już translacyjny kodon start (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Wybierz metodę wyrównania, klikając Algorytm na pasku narzędzi i wybierz clustal W. Ustaw parametry wyrównania na 2; kara za wydłużenie odstępu -1; kara za odstęp -2 i kliknij OK, aby uruchomić wyrównanie.</li>
</ol>
4. Przejściowa transfekcja komórek HEK293T plazmidem reporterowym i leczenie potencjalnymi środkami przeciwwirusowymi
<ol>
	<li>Aby przygotować wystarczającą ilość plazmidowego DNA do kolejnych eksperymentów transfekcyjnych, należy przygotować 150 ml kultury przez noc. Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą zestawu do izolacji plazmidu. Alternatywnie można zastosować inne zestawy do oczyszczania plazmidu.</li>
	<li>Wysiew 1 x 105 HEK293T komórek w DMEM zawierających 10% FCS, penicyliny i streptomycyny (1x) na basenik płytki 12-dołkowej 24 godziny przed transfekcją i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu utrzymania aktywnej proliferacji podczas transfekcji. 
	UWAGA: Komórki powinny być w około 80% zlewające się podczas transfekcji.</li>
	<li>Umieścić 250 μl zredukowanej pożywki surowicy w sterylnej probówce i dodać 1 μg każdego reporterowego plazmidowego DNA i delikatnie wymieszać przez pipetowanie.</li>
	<li>Dodać 3 μl odczynnika do transfekcji do mieszaniny DNA, delikatnie wymieszać pipetując i inkubować przez 15 minut. Odczynnik do transfekcji należy wstępnie podgrzać do temperatury otoczenia 22 °C i delikatnie przemieszać przed użyciem.</li>
	<li>Dodaj mieszaninę kroplami do studzienek i delikatnie rozprowadź do studzienki.</li>
	<li>Po 4 godzinach zastąpić supernatant świeżą pożywką zawierającą czynniki testowe i kontrolę rozpuszczalnika. Inkubować w temperaturze 37 °C do czasu analizy. W tym przykładzie zastosowano inhibitory mTOR INK128 (100 ng/ml) i rapamycynę (100 ng/ml).</li>
</ol>
5. Mikroskopia fluorescencyjna i cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Sprawdź komórki pod kątem czerwonej i zielonej fluorescencji pod mikroskopem fluorescencyjnym (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). 
	UWAGA: Czerwona i zielona fluorescencja odpowiadają odpowiednio wczesnej i późnej ekspresji genu BKPyV.</li>
	<li>Po 72 godzinach od transfekcji odessać supernatant i dwukrotnie przemyć komórki 1 ml zimnego PBS.</li>
	<li>Delikatnie dodaj 500 μl trypsyny i lekko obróć płytkę, aby uniknąć przedwczesnego oderwania komórek. Ten krok jest ważny, aby uniknąć dubletów komórek.</li>
	<li>Po dodaniu usuń trypsynę bezpośrednio tą samą końcówką pipety.</li>
	<li>Inkubować komórki przez co najmniej 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Ponownie zawiesić trypsynizowane komórki z 1 ml PBS zawierającego 3% FCS i przenieść zawiesinę do wstępnie znakowanych probówek FACS.</li>
	<li>Dodać DAPI (1 μg/ml) przed analizą FACS.</li>
	<li>Przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego. Dla każdej próbki zmierz co najmniej 10 000 żywych komórek, które są ujemne pod kątem barwienia DAPI.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Zaimportuj dane do oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej i dodaj próbki, klikając i przeciągając do obszaru roboczego.</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie zaimportowany plik i utwórz wykres. Wybierz FSC-A lub SSC-A, klikając osie x i y. Bramkuj główną populację komórek, klikając Wielokąt na pasku narzędzi i obramowując populację komórek (<silna klasa="xfig">Rysunek 5). Nazwij wybraną populację komórek zgodnie z wymaganiami (na przykład "pojedyncze komórki"). "Pojedyncze komórki" pojawią się jako nowy obszar roboczy.</li>
	<li>Kontynuuj bramkowanie "pojedynczych komórek" dla ujemnych DAPI (tj. "żywych komórek"). Aby zidentyfikować żywe komórki, porównaj populację komórek z barwieniem DAPI i bez niego. Na obu wykresach wybierz FSC-A kontra pacific-blue-A.</li>
	<li>Kliknij prostokąt i wybierz ujemną populację komórek DAPI, nazwij wybraną populację komórek "żywymi komórkami" i utwórz nowy wykres kropkowy przedstawiający FITC (eGFP) w porównaniu z PE (tdTomato), jak opisano wcześniej.</li>
	<li>Dodaj ćwiartki w "żywych komórkach", wybierając Quad z paska narzędzi. Bramkowanie populacji odbywa się poprzez przeciągnięcie środka kwadrantu do krawędzi każdej populacji. Ćwiartki reprezentują 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM+, 3) eGFP+tdTOM-, 4) eGFP+tdTOM+. 
	UWAGA: Ze względu na nakładanie widmowe widm emisyjnych między FITC i PE, wstępna kompensacja jest niezbędna do rozróżnienia sygnałów czerwonych i zielonych oraz uzyskania dokładnych wyników.</li>
	<li>Określ średnią intensywność fluorescencji (MIF), klikając prawym przyciskiem myszy kwadrant i wybierając Dodaj statystyki. Wybierz opcję Średnia i kliknij przycisk OK. Średnia MIF jest teraz wyświetlana poniżej populacji w sekcji "statystyki". Ćwiartki 2 i 4 odpowiadają wczesnej ekspresji, podczas gdy ćwiartki 3 i 4 reprezentują późną ekspresję.</li>
	<li>Dodaj dodatkowe powtórzenia w ten sam sposób, aby uzyskać moc statystyczną.</li>
	<li>W przypadku interpretacji danych wykreślić wartości MIF wczesnych i późnych na wykresie słupkowym:</li>
	<li>Aby porównać aktywność NCCR uzyskaną od różnych dawców lub szczepów wirusa, dodaj archetypiczną kontrolę lub szczep Dunlop sup16 i ustaw jego względne MIF na 100%, a następnie oblicz względne wartości MIF. Powtórzyć te czynności dla każdej kontrpróby i wyznaczyć średnią oraz odchylenie standardowe.</li>
	<li>Aby ocenić wpływ potencjalnych związków na aktywność transkrypcyjną, należy ustawić kontrolę rozpuszczalnika na 100% i wykreślić MFI leczonych komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Drachenberg, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+patterns+of+polyomavirus+nephropathy%3A+correlation+with+graft+outcome+and+viral+load%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplant%22%5BJournal%5D)">Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load.</a> American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).</li>
<li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+low-level+BK+polyomavirus+viremia+on+intermediate-term+renal+allograft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function.</a> Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).</li>
<li>Hirsch, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+perspective+on+human+polyomavirus+infection%2C+replication+and+disease+in+solid+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).</li>
<li>Masutani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Banff+2009+Working+Proposal+for+polyomavirus+nephropathy%3A+a+critical+evaluation+of+its+utility+as+a+determinant+of+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome.</a> American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).</li>
<li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+immune+suppressive+agents+on+the+BK-Polyomavirus+non+coding+control+region%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region.</a> Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).</li>
<li>Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BK+Polyomavirus+Replication+in+Renal+Tubular+Epithelial+Cells+Is+Inhibited+by+Sirolimus%2C+but+Activated+by+Tacrolimus+Through+a+Pathway+Involving+FKBP-12%5BTitle%5D)+AND+%22Amerian+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12.</a> Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).</li>
<li>Sanchez Fructuoso, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+target+of+rapamycin+signal+inhibitors+could+play+a+role+in+the+treatment+of+BK+polyomavirus+nephritis+in+renal+allograft+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients.</a> Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).</li>
<li>Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+control+region+of+naturally+occurring+BK+virus+variants%3A+sequence+comparison+and+functional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Genes%22%5BJournal%5D)">Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis.</a> Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).</li>
<li>Gosert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyomavirus+BK+with+rearranged+noncoding+control+region+emerge+in+vivo+in+renal+transplant+patients+and+increase+viral+replication+and+cytopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).</li>
<li>Bethge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sp1+sites+in+the+noncoding+control+region+of+BK+polyomavirus+are+key+regulators+of+bidirectional+viral+early+and+late+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression.</a> Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).</li>
<li>Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearranged+JC+virus+noncoding+control+regions+found+in+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient+samples+increase+virus+early+gene+expression+and+replication+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).</li>
<li>Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cidofovir+inhibits+polyomavirus+BK+replication+in+human+renal+tubular+cells+downstream+of+viral+early+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression.</a> American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).</li>
<li>Widera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+persistent+viremia+is+frequently+followed+by+episodes+of+low-level+viremia%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+Immunology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia.</a> Medical Microbiology Immunology. , (2017).</li>
<li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiment. (6), 247(2007).</li>
<li>Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+analysis+of+the+complete+genome+of+11+BKV+isolates+obtained+from+allogenic+stem+cell+transplant+recipients+in+Ireland%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland.</a> Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).</li>
<li>Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+human+polyomaviruses+JC+and+BK+in+peripheral+blood+leukocytes+from+immunocompetent+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals.</a> Virology. 198 (1), 59-70 (1994).</li>
<li>Teutsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+identification+of+renal+transplant+recipients+with+high+risk+of+polyomavirus-associated+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+Immunology%22%5BJournal%5D)">Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy.</a> Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).</li>
<li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+detection+of+BKPyV+genotypes+II+and+IV+after+renal+transplantation+as+a+simple+tool+for+risk+assessment+for+PyVAN+and+transplant+outcome+already+at+early+stages+of+BKPyV+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation.</a> Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).</li>
<li>Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivation+of+BKV+and+SV40+early+promoters+by+BKV+and+SV40+T-antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens.</a> Virology. 152 (2), 459-465 (1986).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
</ol>

Johannes Korth otrzymał dotacje na honorarium prelegenta i zwrot kosztów podróży od Astellas i Novartis. Marek Widera otrzymał wynagrodzenie za usługi doradcze od Novartis. Oliver Witzke otrzymał granty na badania kliniczne, honorarium prelegenta, honoraria i zwrot kosztów podróży od Amgen, Alexion, Astellas, Basilea, Biotest, Bristol-Myers-Squibb, Correvio, Chiesi, Gilead, Hexal, Janssen, Dr. F. Köhler Chemie, MSD, Novartis, Roche, Pfizer, Sanofi i TEVA.

W artykule przedstawiono powszechnie stosowaną metodę, która pozwala na analizę wczesnej i późnej aktywności promotora BKPyV w niekodującym regionie kontrolnym (NCCR). Aktywność NCCR może być mierzona jednocześnie i nie wymaga lizy transfekowanych komórek. Ponadto można analizować stosunkowo dużą liczbę komórek i nie jest konieczna kotransfekcja dodatkowych markerów do normalizacji wartości fluorescencji.
Kluczową częścią tej metody jest to, że sklonowany NCCR powinien zawierać dokładnie te sa...

Poliomawirusy reprezentują niezależną rodzinę małych wirusów o dwuniciowym DNA (dsDNA) z wirusem Simian 40 (SV40) jako gatunkiem prototypowym. Pierwotne zakażenie występuje głównie w dzieciństwie, które zwykle przebiega bez objawów chorobowych i zwykle powoduje utajone infekcje u gospodarzy kompetentnych immunologicznie. Poliomawirus BK (BKPyV) utrzymuje się głównie w komórkach kanalików nerkowych, nie powodując nefropatologii, jednak w przypadku upośledzenia kompetencji immunologicznej po przeszczepieniu nerki wirus może się reaktywować i powodować poważne uszkodzenia i upośledzenie funkcji przeszczepu po osiągnięciu wysokiej wiremii (1 x 104 kopie DNA BKPyV/ml)1,2. U około 10% biorców przeszczepu nerki reaktywacja wirusa BK-polyomavirus (BKPyV) powoduje nefropatię związaną z poliomawirusem (PyVAN), która była do 80% związana z wysokim ryzykiem niewydolności alloprzeszczepu nerkowego3,4. Ponieważ nie są dostępne żadne zatwierdzone leki przeciwwirusowe, obecna terapia opiera się na zmniejszeniu immunosupresji. Co ciekawe, inhibitory mTOR wydają się mieć działanie przeciwwirusowe; w związku z tym zmiana terapii immunosupresyjnej na immunosupresję opartą na mTOR może stanowić alternatywne podejście do zapobiegania progresji wiremii BKPyV5,6,7. Jednak mechanizm przeciwwirusowy oparty na mTOR jest obecnie nadal nie w pełni poznany. W związku z tym potrzebne są metody mierzące wpływ potencjalnych środków przeciwwirusowych w klinicznie istotnych stężeniach.
Okrągły genom BKPyV składa się z około 5 kb, w którym znajduje się niekodujący region kontrolny (NCCR), który służy jako początek replikacji i jednocześnie dwukierunkowy promotor napędzający ekspresję transkryptów mRNA wczesnej i późnej fazy. Ponieważ spontanicznie występujące rearanżacje, delecje i duplikacje NCCR występują w patogennych BKPyV8 i znacząco kumulują się u pacjentów cierpiących na PVAN5,9, porównanie archetypicznych (wt) i przeorganizowanych (rr) aktywności NCCR jest pomocne w scharakteryzowaniu replikacyjnej sprawności wirusa.
Jak podsumowano na rysunku 1, ten protokół opisuje powszechnie stosowaną metodę pomiaru aktywności transkrypcyjnej BKPyV NCCR poprzez ilościowe określenie fluorescencji dwóch fluoroforów tdTomato i eGFP wyrażonych z plazmidu reporterowego5,9,10,11. Zabieg wykonywany jest w obecności dużego antygenu T SV40 (lTAg), co pozwala na analizę wpływu potencjalnych środków przeciwwirusowych na wczesną i późną aktywność NCCR oddzielnie5. Test ten dalej analizuje wpływ przegrupowań na aktywność NCCR i porównanie z wt-NCCRs5,9. Plazmid reporterowy zawiera sygnał późnej poliadenylacji SV40 za każdą otwartą ramką odczytu fluoroforu, aby zapewnić porównywalne i wydajne przetwarzanie obu transkryptów odpowiednio dla tdTomato i eGFP. W porównaniu z metodami opartymi na qRT-PCR5,12, to podejście oparte na FACS stanowi alternatywę o niskich kosztach i wysokiej przepustowości, ponieważ nie są potrzebne skomplikowane protokoły ekstrakcji dla hodowli zakażonych komórek ani drogie przeciwciała do barwienia fluorescencji immunologicznej. Ponadto, ponieważ określona liczba komórek fluorescencyjnych jest analizowana za pomocą cytometrii przepływowej, analiza środków hamujących cykl komórkowy jest również możliwa w sposób ilościowy.

<table><tbody><tr><td>Drabina 100 pz</td><td>NEB</td><td>N3231</td><td>Każda drabina o zasięgu do 1 kb może być zastąpiona</td></tr><tr><td>Drabina 2-kłodowa</td><td>NEB</td><td>N0550</td><td>Można zastąpić dowolną drabinę o zakresie do 10 kb</td></tr><tr><td>Agar-Agar, Kobe I</td><td>Carl Roth</td><td>5210.3</td><td></td></tr><tr><td>AgeHF</td><td>NEB</td><td>R3552</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin Natriumsalz Cellpure</td><td>Carl Roth</td><td>HP62.1</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad iniectabilia</td><td>Bbraun</td><td>2351744</td><td>może być zastąpiony przez dowolnego producenta</td></tr><tr><td>BD FACSCanto&trade; II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>DFC450C moduł kamery</td><td>Leica</td><td></td><td>Można użyć dowolnej kamery</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td>może być zastąpiony przez dowolnego producenta</td></tr><tr><td>Mikroskop LED DMIL</td><td>Leica</td><td></td><td>Dowolny mikroskop fluorescencyjny może być używany</td></tr><tr><td>DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>może być zastąpiony przez dowolnego producenta</td></tr><tr><td>E.coli DH5alpha Competent Cells</td><td>Thermo Scientific</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior</td><td>MerckMillipore</td><td>50615</td><td>Można użyć dowolnego FBS</td></tr><tr><td>FlowJo v10.5.3</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td>Można użyć dowolnego oprogramowania do cytometrii przepływowej FBS</td></tr><tr><td>Barwnik ładujący żel, fioletowy (6X)&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7024</td><td>Dowolny barwnik o 6-krotnym obciążeniu może być podstawiony</td></tr><tr><td>HEK293T komórek</td><td>ATCC</td><td>11268</td><td>Komórki te konstytutywnie wyrażają duży antygen T wirusa małpiego 40 (SV40), a klon 17 został wybrany specjalnie ze względu na jego wysoką transfekcję.</td></tr><tr><td>Inkubator CO2 HERAcell&reg; 240i</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>może być zastąpiony przez dowolnego producenta</td></tr><tr><td>Zestaw HotStar PCR</td><td>Qiagen</td><td>203203</td><td></td></tr><tr><td>Intas System dokumentacji żelu</td><td>Intas</td><td></td><td>Można zastosować dowolny system wizualizacji barwionego DNA zawierającego żele agarozowe</td></tr><tr><td>Niskotopliwy 850081 Agaroza</td><td>może</td><td></td><td>być zastąpiony przez dowolnego producenta</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985070</td><td>może być zastąpiony przez dowolnego producenta</td></tr><tr><td>pBKV (34-2)</td><td>ATCC</td><td>45025</td><td>Plazmid zawierający pełnowymiarowy genom BKPyV szczepu Dunlop; był stosowany jako kontrola pozytywna; Sekwencja DNA Uwagi: KP412983</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>produkt wycofany z produkcji</td><td>Można użyć dowolnego termocyklera</td></tr><tr><td>PCR Nucleotide Mix, 10 mM</td><td>Promega</td><td>#C1145</td><td>może być zastąpiony przez dowolnego producenta</td></tr><tr><td>PCR1 i PCR2 Primers</td><td>metabion</td><td>nie dotyczy</td><td>Odsolone. Rozcieńczyć do (10 &mikro; M) z wodą klasy PCR</td></tr><tr><td>PenStrep (100x)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>może być zastąpiony przez dowolnego producenta</td></tr><tr><td>Roti&reg;-GelStain</td><td>Carl Roth</td><td>3865</td><td>Barwnik na bazie fluorescencji do pomiaru stężenia dsDNA</td></tr><tr><td>SpeI-HF</td><td>NEB</td><td>R3133</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza T4-DNA</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>TransIT LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR2300</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 0,05% - EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>może być zastąpiony przez dowolnego producenta</td></tr><tr><td>ZymoPURE II Plasmid Kit</td><td>Zymo</td><td>D4201</td><td>może być zastąpiony przez dowolnego producenta</td></tr></tbody></table>

pomiar aktywności transkrypcyjnej sterowanej przez niekodujący region kontrolny bk-poliomawirusa za pomocą cytometrii przepływowej

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Poliomawirusy, takie jak BK-poliomawirus (BKPyV), mogą powodować poważne patologie u pacjentów z obniżoną odpornością. Ponieważ jednak wysoce skuteczne leki przeciwwirusowe nie są obecnie dostępne, potrzebne są metody pomiaru wpływu potencjalnych środków przeciwwirusowych. W tym przypadku skonstruowano reporter z podwójną fluorescencją, który umożliwia analizę wczesnej i późnej aktywności promotora napędzanej przez niekodujący region kontrolny (NCCR) BKPyV, aby określić ilościowo wpływ potencjalnych leków przeciwwirusowych na ekspresję genów wirusa poprzez ekspresję tdTomato i eGFP. Ponadto, klonując amplikony BKPyV-NCCR, które w tym protokole zostały wzorcowo uzyskane z DNA pochodzącego z krwi pacjentów po przeszczepieniu nerki z obniżoną odpornością, można określić wpływ rearanżacji NCCR na ekspresję genów wirusa. Po sklonowaniu amplikonów pochodzących od pacjenta, HEK293T komórki transfekowano plazmidami reporterowymi i leczono potencjalnymi środkami przeciwwirusowymi. Następnie komórki poddano analizie FACS w celu pomiaru średniej intensywności fluorescencji 72 godziny po transfekcji. Do przetestowania również analizy leków, które mają potencjalne działanie hamujące cykl komórkowy, stosuje się tylko komórki transfekowane, a tym samym fluorescencyjne. Ponieważ test ten jest wykonywany w dużych komórkach z ekspresją antygenu T, wpływ wczesnej i późnej ekspresji może być analizowany w sposób wzajemnie niezależny.

W tym reprezentatywnym eksperymencie aktywność transkrypcyjną sterowaną przez niekodujący region kontrolny poliwirusa BK zmierzono za pomocą cytometrii przepływowej. Dodatkowo przetestowano inhibitor mTOR, który mógłby być stosowany w leczeniu pacjentów po reaktywacji BKPyV, pod kątem hamowania ekspresji wczesnych genów wirusowych. W tym celu zastosowano podwójny fluorescencyjny test reporterowy, zgodnie z wcześniejszą publikacją5. Ogólny schemat przepływu pracy w ...

W tym manuskrypcie przedstawiono protokół do wykonywania pomiarów aktywności transkrypcyjnej BK-poliomawirusa opartego na FACS przy użyciu komórek HEK293T transfekowanych dwukierunkowym plazmidem reporterowym wykazującym ekspresję tdTomato i eGFP. Metoda ta pozwala ponadto na ilościowe określenie wpływu nowych związków na transkrypcję wirusa.

Pomiar aktywności transkrypcyjnej sterowanej przez niekodujący region kontrolny BK-poliomawirusa za pomocą cytometrii przepływowej

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...

Ogólnym celem tego protokołu jest pomiar aktywności transkrypcyjnej sterowanej przez niekodujący region kontrolny BK-poliomawirusa poprzez pomiar podwójnych komórek fluorescencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej. Poliomawirus BK może powodować poważne patologie u pacjentów z obniżoną odpornością, zwłaszcza u biorców przeszczepu nerki. Ponieważ jednak wysoce skuteczne programy antywirusowe nie są obecnie dostępne, potrzebne są metody mierzące potencjalny wpływ przeciwwirusowy innych związków.Metoda ta pozwala wirusologom analizować wpływ potencjalnych środków przeciwwirusowych na aktywność transkrypcyjną BK-poliomawirusa napędzaną przez niekodujący region kontrolny. Test ten pozwala dodatkowo badać wpływ rearanżacji na aktywność promotora w porównaniu z archetypicznymi niekodującymi regionami kontrolnymi. Zaletą badania aktywności promotora wirusa za pomocą raportu podwójnej fluorescencji jest to, że wczesna i późna ekspresja genów może być analizowana w sposób niezależny od siebie.Co więcej, trudna perforacja zapasów wirusa i długoterminowe eksperymenty z zakaźnymi hodowlami komórkowymi nie są konieczne, ponieważ analizowane są tylko komórki transfekowane i fluorescencyjne, można również badać leki zmniejszające żywotność komórek i perforację. Protokół ten jest zgodny z wytycznymi badań na ludziach zatwierdzonymi przez komisję etyczną wydziału medycznego Uniwersytetu Duisburg-Essen. Pierwszym krokiem jest pobranie próbek krwi do izolacji DNA poliomawirusa.Zbierz co najmniej trzy mililitry krwi w probówkach do akwizycji EDTA. Odwirować próbkę o sile 2 500 G przez 15 minut i pipetować osocze do nowej probówki. Przygotuj 40 mikrolitrów białka SK do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i dodaj 400 mikrolitrów osocza przez pipetowanie.Wyizoluj DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA blot zgodnie z opisem w instrukcjach producenta. Przygotuj mieszankę wzorcową do pre-PCR, używając pary starterów A w łącznej objętości 50 mikrolitrów i użyj wcześniej wyizolowanego DNA. Rozprowadzić 45 mikrolitrów mieszanki głównej do probówek PCR.Dodać pięć mikrolitrów wyizolowanego DNA do probówek PCR i przeprowadzić PCR w warunkach reakcji, jak pokazano w tabeli trzeciej. Powtórz denaturację, wyżarzanie i wydłużanie w 35 cyklach. W przypadku aplikacji zagnieżdżonej użyj pary starterów B, zawierającej miejsca ograniczeń do klonowania.Wymieszaj 10 mikrolitrów produktu PCR z dwoma mikrolitrami sześciokrotnego barwnika ładującego żel. Załaduj 10 mikrolitrów mieszanki na 1,5% żel agarozowy i uruchom żel na 30 minut przy 60 miliamperach. Wizualizacja żelu za pomocą odpowiedniego systemu dokumentacji UV.Oczyść amplikony PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Trawić oczyszczone amplikony za pomocą wskaźnikowych enzymów restrykcyjnych przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Powtórz etapy oczyszczania, aby oczyścić strawione amplikony.Równolegle trawić również szkielet plazmidu. Przeanalizuj strawiony szkielet plazmidu na 0,8% żelu agarozowym o niskim mocowaniu. Nie uruchamiaj żelu przy prądzie wyższym niż 40 miliamperów.Wizualizuj fragmenty DNA za pomocą długofalowego światła UV i wytnij zgięty kręgosłup za pomocą czystego skalpela. Unikaj długich czasów ekspozycji na promieniowanie UV, aby zapobiec uszkodzeniom DNA. Ogrodzenie dla kawałka fragmentu żelu flomelowego do nowej 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej.Podgrzewaj szkielet zawierający kawałek agarozy w trybie niskim przez 10 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza, aby stopić kawałek żelu i mieszaj co dwie minuty przez delikatne wirowanie. Stopiony żel może być bezpośrednio użyty do podwiązania. Zliguj szkielet i strawiony amplikon za pomocą ligazy DNA T4 przez noc w temperaturze 16 stopni Celsjusza.Po standardowej procedurze klonowania należy wyizolować DNA osocza. Przeprowadź trawienie enzymem restrykcyjnym, aby sprawdzić, czy nie ma dodatnich klonów i zwizualizować strawione fragmenty na 1% żelu agarozowym. Wysiewaj 100 000 HEK293T komórek na studzienkę 12-dołkowej płytki 24 godziny przed transfekcją i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, utrzymuj aktywną proliferację podczas transfekcji.Komórki powinny znajdować się w przybliżeniu w 80% zbiegu podczas transfekcji. Umieścić 250 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy w sterylnej probówce i dodać jeden mikrogram każdego zgłoszonego DNA osocza i delikatnie wymieszać przez pipetowanie. Dodać trzy mikrolitry odczynnika do transfekcji do mieszaniny DNA i delikatnie wymieszać pipetując i inkubować przez 15 minut w temperaturze 22 stopni Celsjusza.Dodaj mieszaninę kroplami do dołka i delikatnie rozprowadź do dołka. Po czterech godzinach zastąpić supernatant świeżą pożywką zawierającą czynniki testowe i kontrolę rozpuszczalnika. W tym przykładzie zastosowano inhibitory mTOR INK-128 i rapamycynę.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza do czasu analizy. Sprawdź komórki pod kątem czerwonej i zielonej fluorescencji pod mikroskopem fluorescencyjnym. Czerwona i zielona fluorescencja odpowiadają odpowiednio wczesnej i późnej ekspresji genu BK-poliomawirusa.72 godziny po transfekcji ostrożnie zaaspiruj supernatant. Umyj komórki dwukrotnie jednym mililitrem zimnego PBS. Delikatnie dodaj 500 mikrolitrów trypsyny i lekko obróć płytkę, aby uniknąć przedwczesnego oderwania komórek.Ten krok jest ważny, aby uniknąć dubletów komórek. Po dodaniu trypsynę usuwa się bezpośrednio za pomocą tej samej końcówki pipety. Inkubować komórki przez co najmniej pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Ponownie zawiesić komórki trypsyny S za pomocą jednego mililitra PBS zawierającego 3% FCS i przenieść zawiesinę do wstępnie znakowanych probówek FACS. Dodaj DAPI w stężeniu jednego mikrograma na mililitr przed analizą FACS. Przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego.Dla każdej próbki należy zmierzyć co najmniej 10 000 żywych komórek. Początkowa kompensacja jest niezbędna do rozróżnienia sygnałów czerwonych i zielonych w celu uzyskania dokładnych wyników. Niekodujący regent kontrolny został amplifikowany przy użyciu zagnieżdżonego protokołu PCR przy użyciu wewnętrznej pary starterów, która zawiera miejsca ograniczeń do klonowania.Weryfikację amplikonu przeprowadzono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, podczas gdy amplikony pochodzące z archetypicznych sekwencji NCCR o jednorodnym rozkładzie wielkości w żelu, te pochodzące z przegrupowanych NCCR z insercjami i delecjami różniły się wielkością. Selekcja dodatnich klonów zawierających NCCR została zweryfikowana za pomocą analizy restrykcji. Mały obszar dystansowy został zastąpiony większymi fragmentami NCCR wskazującymi na dodatnie klony.Plazmidowe DNA wyizolowane ze zweryfikowanych klonów wysłano do pirosekwencjonowania. W tym przykładzie wykryto usunięcie w bloku P i podstawienie w bloku O. HEK293T komórki były przejściowo transfekowane z poszanowaniem konstruktu raportowanego, a aktywność NCCR monitorowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.Czerwone i zielone fluorescencje odpowiadały odpowiednio wczesnej i późnej ekspresji genów BK-poliomawirusa. Pierwszy NCCR wykazywał silną późną ekspresję genu, podczas gdy drugi przykład miał stosunkowo silną wczesną, ale umiarkowaną późną ekspresję genu. Ujemne komórki DAPI bramkowano i utworzono wykres kropkowy pokazujący eGFP w porównaniu z tdTomato.Do analizy włączono próbki, które były ujemne, a także te dodatnie tylko dla tdTomato lub eGFP. Średnie intensywności fluorescencji uzyskano z każdego badanego klonu. W tym przykładzie leczenie podwójnym inhibitorem mTOR INK128 znacznie zmniejszyło tdTomato MFI, co oznacza, że wczesna ekspresja została zahamowana.Metoda ta pozwala na identyfikację aktualnie stosowanych i innych związków do wykrywania poliomawirusa BK poprzez aktywność transkrypcyjną. We wczesnej ekspresji genów zdecydowanie determinuje to implikacje wirusowe. Krople hamujące mogą być uważane za stosowane jako leki u pacjentów z obniżoną odpornością w przypadku reaktywacji BK-poliomawirusa.

measurement-bk-polyomavirus-non-coding-control-region-driven

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film demonstruje test do pomiaru zależnego od przeciwciał wzmocnienia (ADE) infekcji wirusem dengi za pomocą surowicy rekonwalescencyjnej wirusa Zika. Test wykorzystuje cząstki reporterowe wirusa dengi (RVP) kodujące zielone białko fluorescencyjne. Przeciwciała w surowicy przeciwko wirusowi Zika reagują krzyżowo z RVP, tworząc kompleks. Związane przeciwciała zwiększają wychwyt RVP przez komórki wyrażające receptor Fc, który jest wykrywany za pomocą cytometrii przepływowej.

Test in vitro w celu zbadania zależnego od przeciwciał wzmocnienia infekcji wirusowej

Opisano protokół analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej do oceny nanocząstek dostarczających geny polimerowe. NTA wykorzystuje się do scharakteryzowania rozkładu wielkości cząstek nanocząstek i rozkładu plazmidu na cząstkę. Wysokoprzepustowa cytometria przepływowa umożliwia ilościową ocenę skuteczności transfekcji dla biblioteki biomateriałów dostarczających geny.

Ocena nanocząstek dostarczających geny polimerowe za pomocą analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji dostarcza wysokoprzepustową metodę ilościową do badania interakcji białko-białko. Metodologia ta może być stosowana do mapowania miejsc wiązania białek oraz do badań przesiewowych czynników regulujących interakcję białko-białko.

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji: wysokoprzepustowa metoda ilościowa do badania interakcji białko-białko

Ta metoda opisuje użycie chemii kliknięć do pomiaru zmian w transkrypcji komórek gospodarza po zakażeniu wirusem gorączki doliny Rift (RVFV) szczepem MP-12. Wyniki można wizualizować jakościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub uzyskiwać ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej. Ta metoda można dostosować do użytku z innymi wirusami.

Wykorzystanie chemii kliknięć do pomiaru wpływu infekcji wirusowej na syntezę RNA komórki gospodarza

Opisujemy użycie fluorescencyjnego wirusa krowianki reporterowej, który umożliwia pomiar zakaźności wirusa i ekspresji genów w czasie rzeczywistym poprzez specyficzną dla etapu ekspresję spektralnie odrębnych fluoroforów reporterowych. Szczegółowo opisujemy metodę opartą na płytkach do dokładnej identyfikacji etapu, na którym replikacja wirusa jest zaburzona w odpowiedzi na hamowanie małych cząsteczek.

Wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów

Prezentujemy protokół opisujący półilościową metodę pomiaru zarówno przyczepiania wirusa grypy A do komórek A549, jak i internalizacji cząsteczek wirusa do komórek docelowych za pomocą cytometrii przepływowej.

Pomiar przyczepiania i internalizacji wirusa grypy A w komórkach A549 za pomocą cytometrii przepływowej

Wirusy lub pęcherzyki zewnątrzkomórkowe były wychwytywane immunologicznie za pomocą nanocząsteczek magnetycznych 15 nm sprzężonych z przeciwciałami rozpoznającymi antygeny powierzchniowe. Uchwycone wiriony lub pęcherzyki znakowano fluorescencyjnymi przeciwciałami przeciwko innym antygenom powierzchniowym. Powstałe kompleksy rozdzielono w silnym polu magnetycznym i przeanalizowano za pomocą konwencjonalnych cytometrów przepływowych wyzwalanych fluorescencją.

Wirometria przepływowa do analizy widm antygenowych wirionów i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Opisujemy protokół wykorzystujący fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) do wizualizacji wielu herpeswirusowych RNA w litycznych infekowanych komórkach ludzkich, zarówno w zawiesinie, jak i w adherentach. Protokół ten obejmuje kwantyfikację fluorescencji wytwarzającą stosunek nukleocytoplazmatyczny i może być rozszerzony o jednoczesną wizualizację białek gospodarza i wirusa za pomocą immunofluorescencji (IF).

Ilościowa fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i immunofluorescencja (IF) specyficznych produktów genowych w komórkach zakażonych KSHV

Opisana tutaj jest sprawdzona metoda określania stopnia ograniczenia HIV-1 przez komórkowe białko hamujące SAMHD1. Ludzkie komórki linii szpikowej U937 są transdukowane wektorem ekspresyjnym SAMHD1 współwyrażającym YFP, różnicowane, a następnie prowokowane HIV-RFP. Poziom restrykcji określa się za pomocą analizy cytometrii przepływowej.

Analiza ograniczenia SAMHD1 za pomocą cytometrii przepływowej w ludzkich komórkach szpikowych U937

Ten artykuł opisuje identyfikację komórek piropotycznych za pomocą cytometrii przepływowej po podwójnym barwieniu przeciwciałami przeciwko N-końcowemu fragmentowi kurczaka GSDME (chGSDME-NT) i jodkowi propidyny (PI).

Badanie piroptozy metodą cytometrii przepływowej

Precyzyjna kwantyfikacja kopii genomu wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jest kluczowa, ale standardowy protokół nie został jeszcze ustalony. Protokół ten opisuje zwalidowaną metodę przygotowania oczyszczonych próbek AAV i przeprowadzenia cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (dd_PCR) w celu wiarygodnego ilościowego określenia miana genomu wirusa.

Kwantyfikacja genomów wirusów związanych z adenowirusami w oczyszczonych próbkach wektorów za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Poznaj metodę pomiaru aktywności transkrypcyjnej BK-poliomawirusa za pomocą cytometrii przepływowej z podwójnym fluorescencyjnym reporterem w komórkach HEK293T. Ta technika umożliwia analizę wpływu związków przeciwwirusowych na ekspresję genów wczesnych i późnych.

Pomiar aktywności transkrypcyjnej sterowanej przez niekodujący region kontrolny BK-poliomawirusa za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar aktywności transkrypcyjnej sterowanej przez niekodujący region kontrolny BK-poliomawirusa za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów