Ocena dostępności minerałów w paszach dla ryb przy użyciu metod uzupełniających zademonstrowanych na przykładzie w łososiu atlantyckim

Badaliśmy dostępność rozpuszczalności mikrometali, takich jak, selen, w różnych formach chemicznych lub źródłach, jak to nazywamy, w kontekście zmieniającego się składu paszy. W zestawie radionuklidów odważyć około 0,2 grama zmielonych próbek paszy dla łososia atlantyckiego i wymieszać je z radioznacznikiem o znanej aktywności specyficznej w probówce z próbką o objętości pięciu mililitrów. Przygotować sześć innych podwielokrotności buforu i dodać do każdego z wymienionych tutaj aminokwasów, aby osiągnąć końcowe stężenie molowe wynoszące pięć milimolów.

Dodać słodkowodny bufor luminalny jelita, aby nakarmić próbkę. Następnie dodać słodkowodny bufor luminalny jelita do podwielokrotności buforu zawierającego aminokwasy. Zamknij rurki i kręć je na obrotowym kołpaku z prędkością 25 obr./min przez 30 minut.

Następnie odwirować przy 1,157 x g przez 10 minut, aby oddzielić frakcje rozpuszczalne i nierozpuszczalne. Użyj kasjera gamma, aby zmierzyć liczbę na minutę radioznacznika we frakcjach rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych. Przemyj linię komórek jelitowych pochodzących z pstrąga tęczowego dwukrotnie jednym mililitrem roztworu EDTA i odsysaj roztwór po każdym płukaniu za pomocą pipety.

Potraktuj umyte komórki 0,25% roztworem trypsyny. Delikatnie obracać kolbę pod ostrymi kątami przez dwie minuty. Następnie dodaj 10 mililitrów pożywki L-15 zawierającej 5% FBS, aby zneutralizować trypsynę.

Za pomocą sterylnej pipety zdekantować powstałą zawiesinę komórek do probówki wirówki ze stożkowym dnem. Wirować przy 130 x G przez trzy minuty. Następnie za pomocą hemocytometru określ gęstość pobranych komórek przez ręczne liczenie.

Zasiaj komórki na 24 dołkach o gęstości komórek 50 000 komórek na mililitr na dołek i inkubuj płytki w temperaturze 19 stopni Celsjusza w normalnej atmosferze przez 48 godzin przed eksperymentami. Po karmieniu ryb przez 11 dni i ich eutanazji, zbierz zebraną próbkę kału ryby, rozbierając się od płetwy brzusznej do odbytu i umieść ją na talerzu. Za pomocą szpatułki przenieś kał z płytki do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

Próbki należy natychmiast przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza. W tym badaniu dostępność minerałów w paszy dla ryb jest oceniana przy użyciu szeregu uzupełniających się metod. Reprezentatywna analiza paszy dla łososia atlantyckiego za pomocą metody spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie z wyłączeniem wielkości dostarcza danych na temat związków chemicznych występujących we frakcji rozpuszczalnej.

W tej frakcji można zobaczyć pięć pików zawierających, z których każdy ma inną masę cząsteczkową. Związki chemiczne znajdujące się we frakcji rozpuszczalnej mogą mieć różne źródła, ponieważ stosowana pasza zawiera zarówno składniki pochodzenia morskiego, jak i roślinnego i jest uzupełniana. Zakres masy cząsteczkowej tych gatunków sugeruje, że związki te mogą być metaloproteinami.

O ile rozpuszczalność suplementowanego 65 zwiększa obecność wszystkich badanych aminokwasów, o tyle wyższą rozpuszczalność stwierdza się w przypadku histydyny i lizyny. Na wierzchołkowy wychwyt w komórkach Arteca GC istotny wpływ ma obecność L-Met lub DL-Met w dwóch milimolowych stężeniach. Ponadto na wpływ metioniny na pobieranie negatywnie wpływa obecność BCH.

Główną zaletą tego protokołu jest to, że staraliśmy się połączyć różne podejścia w badaniach wizualnych, analitycznych i invivo, aby porównywać i uzupełniać się nawzajem, jeśli chodzi o badanie dostępności minerałów.