Półautomatyczna charakterystyka i liczenie krążących komórek nowotworowych PD-L1 od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca za pomocą immunofluorescencji

Oparta na technologii mikroprzepływowej izolacja i charakterystyka CTC z prawidłowych komórek krwi nie wymaga stosowania specyficznych biomarkerów CTC i jest zgodna z hodowlą komórkową. Protokół ten ułatwia wysoką szybkość ekstrakcji CTC i zapewnia obszerną analizę cytologiczną CTC poprzez ocenę złośliwych cech cytomorfologicznych. Ekspresja PD-L1 przez CTC ma wartość predykcyjną w leczeniu raka płuca.

Poprawa wykrywania choroby za pomocą tego testu może przyczynić się do lepszego leczenia pacjentów w dłuższej perspektywie. Inne zastosowania tego protokołu obejmują wykrywanie aberracji genetycznych za pomocą FISH lub przeprowadzanie analizy transkryptomicznej CTC, a także izolowanie komórek pochodzenia płodowego u matek. Procedurę zademonstruje Julie Balandier, technik z naszego laboratorium.

W celu przedanalitycznego wzbogacenia krążących komórek nowotworowych najpierw zbierz 7,5 mililitra krwi do probówki EDTA potasu i utrzymuj próbkę pod delikatnym mieszaniem, aby uniknąć sedymentacji i krzepnięcia komórek. W ciągu sześciu godzin od pobrania użyj pipety serologicznej pod komorą bezpieczeństwa mikrobiologicznego, aby przenieść do 7,5 mililitra krwi pełnej do nowej 50-mililitrowej probówki wirówkowej i odwirować próbkę przez 10 minut w temperaturze 1600 razy G, w temperaturze pokojowej. Pod koniec wirowania użyj pipety transferowej, aby zebrać frakcję osocza bez naruszania kożucha i rozcieńczyć osocze równoważną objętością PBS, do 7,5 mililitra.

Następnie ostrożnie dodaj bufor do lizy czerwonych krwinek do próbki krwi, do końcowej objętości 30 mililitrów i delikatnie odwróć probówkę do pobierania krwi trzy razy, przed umieszczeniem probówki w temperaturze pokojowej na 10 minut. Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie i ostrożnie usunąć wszystkie oprócz ostatnich czterech do pięciu mililitrów supernatantu. Użyj mikropipety z filtrem, aby usunąć pozostały supernatant, a następnie użyj mikropipety P1000 z końcówką z filtrem, aby dodać jeden mililitr buforu do reprodukcji w dół ścianki probówki.

Aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza, należy ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą delikatnego pipetowania, aż próbka będzie jednorodna. Po ponownym zawieszeniu osadu dodaj dodatkowe trzy mililitry buforu do reprodukcji zawiesiny do ścianki probówki, bez wprowadzania pęcherzyków, i ponownie delikatnie wymieszaj komórki. W przypadku spiralnego wzbogacania krążących komórek nowotworowych urządzenia mikroprzepływowego, najpierw załaduj nowy spiralny chip mikroprzepływowy na urządzenie i załaduj jedną pustą 50-mililitrową probówkę wirówkową do każdego z portów wejściowych i wyjściowych.

Kliknij przycisk zalewania, aby zalać spiralne urządzenie mikroprzepływowe na trzy minuty. Wyjmowanie lamp wejściowych i wyjściowych na końcu cyklu. Załaduj zawieszoną próbkę krwi do portu wejściowego i załaduj przezroczystą stożkową rurkę o pojemności 15 mililitrów do portu wyjściowego.

Następnie kliknij uruchom i wybierz program trzeci, aby zainicjować 31-minutowy program wzbogacania krążących komórek nowotworowych. Pod koniec cyklu przenieść probówkę wyjściową do wirówki i użyć pięciomililitrowej pipety serologicznej do usunięcia wszystkich mililitrów supernatantu z wyjątkiem dwóch ostatnich. Następnie użyj mikropipety, aby usunąć wszystkie oprócz ostatnich 100 mikrolitrów supernatantu.

W przypadku barwienia immunofluorescencyjnego policz komórki w hemocytometrze i rozcieńcz wzbogaconą próbkę do jednego razy dziesięć do pięciu komórek na 100 mikrolitrów o stężeniu 0,2% roztworu przeciw wiązaniu. Następnie za pomocą bawełnianego wacika nasączonego 50 mikrolitrami roztworu antywiążącego zwilżyć kontur komory próbki i umieścić szkiełko ze szkła polilizynowego w komorze próbki. Zamknąć komorę i trzykrotnie pipetować w górę i w dół, aby pokryć końcówkę mikropipety roztworem wiążącym przed ponownym wymieszaniem próbki w ostatnich 100 mikrolitrach supernatantu.

Przenieść roztwór komórki do komory na próbkę i cytowirować próbkę w dedykowanej wirówce z prędkością 400 obrotów na minutę przez cztery minuty, przy niskim przyspieszeniu. Pod koniec wirowania umieścić izolator silikonowy wokół obszaru osadzania i pozostawić szkiełko do wyschnięcia pod komorą bezpieczeństwa mikrobiologicznego na dwie minuty, następnie utrwalić próbkę cytospunu za pomocą 100 mikrolitrów 4% paraformaldehydu przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie trzy dwuminutowe płukania z 200 mikrolitrami PBS na pranie, w temperaturze pokojowej. Po ostatnim przemyciu zablokować wszelkie niespecyficzne wiązania za pomocą 30-minutowej inkubacji w odczynniku blokującym w temperaturze pokojowej, a następnie znakować 100 mikrolitrami roztworu przeciwciała, który jest przedmiotem zainteresowania.

Umieść oznakowane szkiełko na szalce Petriego o wymiarach 100 na 15 mililitrów na kawałku chłonnego papieru zwilżonego dwoma mililitrami sterylnej wody i umieść naczynie zamknięte w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, chronione przed światłem. Następnego ranka przemyć próbkę trzykrotnie PBS, jak pokazano, i umieścić próbkę w 10 mikrolitrach odpowiedniego roztworu montażowego i szklanym szkiełku nakrywkowym. Następnie uszczelnij szkiełko nakrywkowe bezbarwnym lakierem do paznokci.

Aby zobrazować próbki cytospunowe, załaduj szkiełko do prostego mikroskopu fluorescencyjnego z platformą zmotoryzowaną XY i wybierz obiektyw 20x i odpowiednie kanały zgodnie z fluoroforami używanymi do znakowania przeciwciał. Włącz lampę rtęciową i dostosuj mikroskop oraz powiązane oprogramowanie do półautomatycznego fotografowania. Gdy lampa jest gotowa, w menu akwizycji zdefiniuj cztery kanały, ustaw czas ekspozycji i zdefiniuj kafelki do skanowania.

Kliknij kafelki, a następnie eksperyment zaawansowany, a następnie zdefiniuj obszar do skanowania. Następnie dostosuj fokus na ekranie i kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment. Na końcu eksperymentu wyeksportuj pliki TIF dla każdego kanału i nazwij plik, aby zawierał próbkę, liczbę razy, barwnik i liczbę kafelków podrzędnych.

Aby przeprowadzić analizę obrazu, otwórz oprogramowanie do analizy obrazu ze strony internetowej Broad Institute i kliknij file, pipeline from file i analysis four channels CTC. Upuść pliki na listę plików i zaktualizuj metadane, aby pogrupować pliki według kafelków. Następnie kliknij przycisk Analizuj obrazy, aby otworzyć plik arkusza kalkulacyjnego odpowiadający parametrom intensywności pomiaru.

Bez zoptymalizowanego protokołu dekontaminacji już po 24 godzinach obserwuje się wysokie zanieczyszczenie bakteryjne w hodowlach tkankowych wzbogaconych linii komórkowych A549, powodując śmierć i zmiany cytomorfologiczne w komórkach eukariotycznych. Natomiast po protokole czyszczenia, żywe komórki A549 uzyskuje się w kulturach 2D po 10 godzinach hodowli tkankowej i usunięciu pożywki, w warunkach hodowli 3D oraz w próbkach pacjentów. Stosując ciekły test barwienia immunofluorescencyjnego lub test barwienia immunofluorescencyjnego na szkiełkach pokrytych polilizyną z cytospiną, można zaobserwować wyraźną różnicę w liczbie jąder wyliczonych między tymi dwoma testami.

Bez etapu cytospinowego trudno jest odróżnić białe krwinki od komórek nowotworowych ze względu na niewyraźne kontury w preparatach komórek niecytospinowych. W tym przypadku można zaobserwować różne reprezentatywne wyniki z różnych próbek pobranych od pacjentów, przy czym liczba resztkowa białych krwinek jest w szczególności silnie zmienna i zależna od próbki krwi pełnej. Dużą zmienność zaobserwowano również w uzyskanych subpopulacjach krążących komórek nowotworowych.

Każda komórka na cytospinie jest identyfikowana przez oprogramowanie do analizy obrazu i umożliwia śledzenie komórki oraz ręczne potwierdzanie wyników w razie potrzeby. Rzeczywiście, analiza pilotażowa wykazała zgodność między ręcznym wyliczaniem a wyliczaniem za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Konfiguracja zaprojektowanej przez nas wilgotnej szalki Petriego do hybrydyzacji białka i przeciwciała ma kluczowe znaczenie, ponieważ urządzenie pozostaje wystarczająco wilgotne przez cały czas inkubacji.