Charakterystyka komórek nowotworowych za pomocą przewodu medycznego do wychwytywania krążących komórek nowotworowych: podejście 3D oparte na immunofluorescencji i DNA FISH

Ogólnym celem tego protokołu jest połączenie barwienia immunofluorescencyjnego z fluorescencyjną hybrydyzacją DNA in situ na funkcjonalizowanym przewodzie 3D oraz identyfikacja sygnałów immunofenotypu i FISH na podporze przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie charakterystyki wydzielania komórek nowotworowych, takie jak identyfikacja celów związanych z terapią na krążących komórkach niedrobnokomórkowego raka płuc. Główną zaletą tego protokołu jest umożliwienie jednoczesnej identyfikacji parametrów fenotypowych, takich jak dodatni wynik testu EpCAM i zmian cytosomatycznych, takich jak status genu ARC, w celu wykrycia przypuszczalnych CTC.

Chociaż metoda ta została specjalnie zaprojektowana, aby zapewnić cechy CTC raka insuliny in situ, może być również stosowana do badania innych nowotworów, takich jak rak piersi. Opracowaliśmy ten protokół podczas pracy z przewodem do bezpośredniego immunofenotypowania i wykrywania CTC. Aby uzyskać więcej danych, powiązaliśmy protokół immunofenotypowania z protokołem hybrydyzacji fluorescencji DNA in situ.

Obsługa drutu nie jest łatwa, głównie dlatego, że funkcjonalna końcówka jest delikatna. Demonstracja wizualna sprawi, że czytelnicy odtworzą kroki. Aby rozpocząć eksperyment, należy ponownie zawiesić całą zawartość kolby T75, która jest w 80% zbieżności, w pięciomililitrowej fiolce przy użyciu czterech mililitrów kompletnego podłoża.

Następnie wyjmij drut ze szklanego opakowania. Zanurz funkcjonalizowaną złotą część drutu w fiolce, upewniając się, że druciany korek jest wodoszczelnie dopasowany do pięciomililitrowej fiolki. Uszczelnij drut folią laboratoryjną.

Następnie inkubuj drut w rotatorze rurkowym przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po obróceniu przepłucz drut trzy razy w jednokrotnym roztworze PBS za pomocą trzech różnych czystych fiolek i poczekaj, aż drut wyschnie. Po wysuszeniu drutu na powietrzu przez 10 minut w okapie, zamocuj ogniwa, zanurzając drut w 100% roztworze acetonu w pięciomililitrowej probówce na 10 minut w temperaturze pokojowej.

Upewnij się, że na funkcjonalizowanej końcówce nie ma śladu acetonu. Suszyć drut na powietrzu przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie w pięciomililitrowej tubie umyj drut dwukrotnie w jednokrotnym PBS.

Inkubować drut w buforze do rozcieńczania przeciwciał. Przygotować 150 mikrolitrów mieszaniny przeciwciał z rozcieńczeniem pierwszorzędowego przeciwciała monoklonalnego sprzężonego z fluorochromem i buforem do rozcieńczania przeciwciał określonym w karcie katalogowej. Następnie użyj końcówki P200, aby wyciągnąć drut z korka drutu i delikatnie włóż drut przez większy otwór końcówki.

Najpierw włóż niefunkcjonalny koniec i powoli przeciągnij drut przez mniejszy otwór, aż złota część znajdzie się tuż za większym otworem. Delikatnie dodaj 150 mikrolitrów mieszanki przeciwciał do końcówki. Aby uniknąć ryzyka tworzenia się pęcherzyków, delikatnie obracaj drut, aż funkcjonalny koniec zostanie całkowicie zanurzony.

Uszczelnij otwór końcówki i owiń wokół niego folię laboratoryjną. Inkubuj drut pionowo przez noc w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Drugiego dnia zablokuj inkubację przeciwciał, przemywając drut dwukrotnie w jednokrotnym PBS.

Włóż drut ponownie do korka drutu. Trzy godziny przed protokołem DNA-FISH ustaw piec hybrydyzacyjny na 75 stopni Celsjusza i ustaw suchy piekarnik grzewczy na 37 stopni Celsjusza. Schłodzić 0,4-krotny roztwór SSC do czterech stopni Celsjusza.

Umyj drut trzy razy w lodowatym 0,4-krotnym roztworze SSC. Suszyć drut w ciemności pod dygestoriami przez 10 minut. Po 10 minutach wiruj i obracaj sondą przez pięć sekund.

Wrzuć 10 mikrolitrów sondy do szklanych mikroprobówek, a następnie przykryj je folią laboratoryjną. Zawiń mikroprobówki w suchy papier chłonny. Umieść w 50-mililitrowej tubie i krótko je zakręć.

Ostrożnie umieść wysuszony drut w mikroprobówce i włóż korek do drutu. Następnie uszczelnij korek drutu cementem gumowym. Umieść drut w ciemnej, wilgotnej komorze w piecu do hybrydyzacji na osiem minut w temperaturze 75 stopni Celsjusza, aby uzyskać całkowitą denaturację DNA.

Po ośmiu minutach przenieś wilgotną komorę do suchego piekarnika grzewczego w temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc. Umieść słoik do barwienia szkiełek z 0,4-krotnym roztworem SSC w łaźni wodnej o temperaturze 72 stopni Celsjusza. Sprawdź 0,4-krotną temperaturę roztworu SSC, aż osiągnie 72 plus minus jeden stopień Celsjusza.

Następnie przygotuj dwie szklane zlewki. Jeden z podwójnym roztworem SSC plus 0,05% Tween i drugi z wodą destylowaną. Wyjmij wilgotną komorę do suchego piekarnika grzewczego.

Użyj pęsety, aby ostrożnie usunąć cement gumowy z korka drucianego i przeciągnij niepowlekany koniec drutu przez korek końcowy, uważając, aby nie uszkodzić funkcjonalnej końcówki. Zanurz drut w 0,4-krotnym roztworze SSC na dwie minuty w temperaturze 72 stopni Celsjusza. Umyj drut w podwójnym roztworze SSC plus 0,05% Tween przez 30 sekund w temperaturze pokojowej.

Następnie umyj drut w wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej. Wysuszyć drut pod wyciągiem przez 10 minut w ciemności. Inkubować funkcjonalizowaną końcówkę drutu z wcześniej przygotowanym roztworem DAPI w dwumililitrowej fiolce.

Opłucz drut dwukrotnie w jednym składanym PBS i wysusz drut na powietrzu. Umieść drut w uchwycie drutu i ostrożnie włóż funkcjonalną końcówkę przez punkt wejścia specjalnego uchwytu, aż końcówka dopasuje się do punktu złącza. Umieść specjalny uchwyt na stoliku mikroskopu.

Dostosuj ostrość mikroskopu za pomocą 20-krotnego obiektywu. Najpierw z grubsza skoncentruj się na specjalnym podparciu, a następnie dokładnie dostosuj komórki, które wydają się jasne w kanale DAPI. Skupiaj się tylko na komórkach znajdujących się centralnie w obiektywie i rejestruj obrazy za pomocą 12-bitowej kamery cyfrowej w obiektywach 20x i 40x z odpowiednimi filtrami dla sond czerwonych, zielonych i niebieskich.

Na koniec przygotuj drut do długotrwałego przechowywania, pakując drut obok funkcjonalizowanej końcówki i ostrożnie włóż drut do szklanej rurki. Przechowuj drut pionowo lub poziomo w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Barwienie immunofluorescencyjne nie zakłócało sygnałów DNA-FISH.

Kiedy test immuno-DNA-FISH został przeprowadzony na funkcjonalizowanym przewodzie 3D, barwienie EpCam było wyraźnie widoczne. Sonda ALK ujawniła delecję genu. Linia komórkowa NCI-H3122 wykazywała nieprawidłowy status genu LAK w przeciwieństwie do NCI-H1975 z ALKG typu dzikiego.

Po opanowaniu tego protokołu można go wykonać w ciągu dziewięciu godzin pracy w ciągu trzech dni. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie dotykać funkcjonalnej części drutu, aby zapobiec uszkodzeniom. Zgodnie z tym protokołem można stosować różne przeciwciała i sondy FISH, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak identyfikacja komórek za pomocą innych markerów fenotypowych i innych zmian cytogenetycznych, takich jak amplifikacja genu NAT lub HAR2.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak jednocześnie identyfikować domniemane CTC na podstawie parametrów fenotypowych, takich jak dodatni wynik EpCAM, oraz wykrywać zmiany cytogenetyczne, takie jak status genu ARC. Nie zapominaj, że praca z acetonem i piekarnikiem może być bardzo niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachowywać środki ostrożności, takie jak obchodzenie się z acetonem w kapturze i noszenie rękawic ochronnych.