Charakterystyka komórek nowotworowych za pomocą przewodu medycznego do wychwytywania krążących komórek nowotworowych: podejście 3D oparte na immunofluorescencji i DNA FISH
21 grudnia 2017
Prezentujemy nowe podejście do charakterystyki komórek nowotworowych. Połączyliśmy immunofluorescencję z fluorescencyjną hybrydyzacją DNA in situ, aby ocenić komórki wychwycone przez funkcjonalizowany przewód medyczny zdolny do wzbogacania in vivo CTC bezpośrednio z krwi pacjenta.
Ogólnym celem tego protokołu jest połączenie barwienia immunofluorescencyjnego z fluorescencyjną hybrydyzacją DNA in situ na funkcjonalizowanym przewodzie 3D oraz identyfikacja sygnałów immunofenotypu i FISH na podporze przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie charakterystyki wydzielania komórek nowotworowych, takie jak identyfikacja celów związanych z terapią na krążących komórkach niedrobnokomórkowego raka płuc. Główną zaletą tego protokołu jest umożliwienie jednoczesnej identyfikacji parametrów fenotypowych, takich jak dodatni wynik testu EpCAM i zmian cytosomatycznych, takich jak status genu ARC, w celu wykrycia przypuszczalnych CTC.
Chociaż metoda ta została specjalnie zaprojektowana, aby zapewnić cechy CTC raka insuliny in situ, może być również stosowana do badania innych nowotworów, takich jak rak piersi. Opracowaliśmy ten protokół podczas pracy z przewodem do bezpośredniego immunofenotypowania i wykrywania CTC. Aby uzyskać więcej danych, powiązaliśmy protokół immunofenotypowania z protokołem hybrydyzacji fluorescencji DNA in situ.
Obsługa drutu nie jest łatwa, głównie dlatego, że funkcjonalna końcówka jest delikatna. Demonstracja wizualna sprawi, że czytelnicy odtworzą kroki. Aby rozpocząć eksperyment, należy ponownie zawiesić całą zawartość kolby T75, która jest w 80% zbieżności, w pięciomililitrowej fiolce przy użyciu czterech mililitrów kompletnego podłoża.
Następnie wyjmij drut ze szklanego opakowania. Zanurz funkcjonalizowaną złotą część drutu w fiolce, upewniając się, że druciany korek jest wodoszczelnie dopasowany do pięciomililitrowej fiolki. Uszczelnij drut folią laboratoryjną.
Następnie inkubuj drut w rotatorze rurkowym przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po obróceniu przepłucz drut trzy razy w jednokrotnym roztworze PBS za pomocą trzech różnych czystych fiolek i poczekaj, aż drut wyschnie. Po wysuszeniu drutu na powietrzu przez 10 minut w okapie, zamocuj ogniwa, zanurzając drut w 100% roztworze acetonu w pięciomililitrowej probówce na 10 minut w temperaturze pokojowej.
Upewnij się, że na funkcjonalizowanej końcówce nie ma śladu acetonu. Suszyć drut na powietrzu przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie w pięciomililitrowej tubie umyj drut dwukrotnie w jednokrotnym PBS.
Inkubować drut w buforze do rozcieńczania przeciwciał. Przygotować 150 mikrolitrów mieszaniny przeciwciał z rozcieńczeniem pierwszorzędowego przeciwciała monoklonalnego sprzężonego z fluorochromem i buforem do rozcieńczania przeciwciał określonym w karcie katalogowej. Następnie użyj końcówki P200, aby wyciągnąć drut z korka drutu i delikatnie włóż drut przez większy otwór końcówki.
Najpierw włóż niefunkcjonalny koniec i powoli przeciągnij drut przez mniejszy otwór, aż złota część znajdzie się tuż za większym otworem. Delikatnie dodaj 150 mikrolitrów mieszanki przeciwciał do końcówki. Aby uniknąć ryzyka tworzenia się pęcherzyków, delikatnie obracaj drut, aż funkcjonalny koniec zostanie całkowicie zanurzony.
Uszczelnij otwór końcówki i owiń wokół niego folię laboratoryjną. Inkubuj drut pionowo przez noc w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Drugiego dnia zablokuj inkubację przeciwciał, przemywając drut dwukrotnie w jednokrotnym PBS.
Włóż drut ponownie do korka drutu. Trzy godziny przed protokołem DNA-FISH ustaw piec hybrydyzacyjny na 75 stopni Celsjusza i ustaw suchy piekarnik grzewczy na 37 stopni Celsjusza. Schłodzić 0,4-krotny roztwór SSC do czterech stopni Celsjusza.
Umyj drut trzy razy w lodowatym 0,4-krotnym roztworze SSC. Suszyć drut w ciemności pod dygestoriami przez 10 minut. Po 10 minutach wiruj i obracaj sondą przez pięć sekund.
Wrzuć 10 mikrolitrów sondy do szklanych mikroprobówek, a następnie przykryj je folią laboratoryjną. Zawiń mikroprobówki w suchy papier chłonny. Umieść w 50-mililitrowej tubie i krótko je zakręć.
Ostrożnie umieść wysuszony drut w mikroprobówce i włóż korek do drutu. Następnie uszczelnij korek drutu cementem gumowym. Umieść drut w ciemnej, wilgotnej komorze w piecu do hybrydyzacji na osiem minut w temperaturze 75 stopni Celsjusza, aby uzyskać całkowitą denaturację DNA.
Po ośmiu minutach przenieś wilgotną komorę do suchego piekarnika grzewczego w temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc. Umieść słoik do barwienia szkiełek z 0,4-krotnym roztworem SSC w łaźni wodnej o temperaturze 72 stopni Celsjusza. Sprawdź 0,4-krotną temperaturę roztworu SSC, aż osiągnie 72 plus minus jeden stopień Celsjusza.
Następnie przygotuj dwie szklane zlewki. Jeden z podwójnym roztworem SSC plus 0,05% Tween i drugi z wodą destylowaną. Wyjmij wilgotną komorę do suchego piekarnika grzewczego.
Użyj pęsety, aby ostrożnie usunąć cement gumowy z korka drucianego i przeciągnij niepowlekany koniec drutu przez korek końcowy, uważając, aby nie uszkodzić funkcjonalnej końcówki. Zanurz drut w 0,4-krotnym roztworze SSC na dwie minuty w temperaturze 72 stopni Celsjusza. Umyj drut w podwójnym roztworze SSC plus 0,05% Tween przez 30 sekund w temperaturze pokojowej.
Następnie umyj drut w wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej. Wysuszyć drut pod wyciągiem przez 10 minut w ciemności. Inkubować funkcjonalizowaną końcówkę drutu z wcześniej przygotowanym roztworem DAPI w dwumililitrowej fiolce.
Opłucz drut dwukrotnie w jednym składanym PBS i wysusz drut na powietrzu. Umieść drut w uchwycie drutu i ostrożnie włóż funkcjonalną końcówkę przez punkt wejścia specjalnego uchwytu, aż końcówka dopasuje się do punktu złącza. Umieść specjalny uchwyt na stoliku mikroskopu.
Dostosuj ostrość mikroskopu za pomocą 20-krotnego obiektywu. Najpierw z grubsza skoncentruj się na specjalnym podparciu, a następnie dokładnie dostosuj komórki, które wydają się jasne w kanale DAPI. Skupiaj się tylko na komórkach znajdujących się centralnie w obiektywie i rejestruj obrazy za pomocą 12-bitowej kamery cyfrowej w obiektywach 20x i 40x z odpowiednimi filtrami dla sond czerwonych, zielonych i niebieskich.
Na koniec przygotuj drut do długotrwałego przechowywania, pakując drut obok funkcjonalizowanej końcówki i ostrożnie włóż drut do szklanej rurki. Przechowuj drut pionowo lub poziomo w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Barwienie immunofluorescencyjne nie zakłócało sygnałów DNA-FISH.
Kiedy test immuno-DNA-FISH został przeprowadzony na funkcjonalizowanym przewodzie 3D, barwienie EpCam było wyraźnie widoczne. Sonda ALK ujawniła delecję genu. Linia komórkowa NCI-H3122 wykazywała nieprawidłowy status genu LAK w przeciwieństwie do NCI-H1975 z ALKG typu dzikiego.
Po opanowaniu tego protokołu można go wykonać w ciągu dziewięciu godzin pracy w ciągu trzech dni. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie dotykać funkcjonalnej części drutu, aby zapobiec uszkodzeniom. Zgodnie z tym protokołem można stosować różne przeciwciała i sondy FISH, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak identyfikacja komórek za pomocą innych markerów fenotypowych i innych zmian cytogenetycznych, takich jak amplifikacja genu NAT lub HAR2.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak jednocześnie identyfikować domniemane CTC na podstawie parametrów fenotypowych, takich jak dodatni wynik EpCAM, oraz wykrywać zmiany cytogenetyczne, takie jak status genu ARC. Nie zapominaj, że praca z acetonem i piekarnikiem może być bardzo niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachowywać środki ostrożności, takie jak obchodzenie się z acetonem w kapturze i noszenie rękawic ochronnych.
Przegląd
Niniejsza praca naukowa wprowadza nową metodę charakteryzacji komórek nowotworowych poprzez połączenie immunofluorescencji z DNA barwnikową hybrydyzacją in situ (FISH). Podejście to wykorzystuje funkcjonalizowany drut medyczny do wzbogacania krążących komórek nowotworowych (CTC) bezpośrednio z krwi pacjenta, ułatwiając identyfikację kluczowych markerów immunophenotypowych i genetycznych.
Kluczowe Elementy Badań
Dziedzina Nauki
- Onkologia
- Biologia Komórkowa
- Metody Diagnostyczne
Tło
- Charakteryzacja krążących komórek nowotworowych jest kluczowa dla diagnozy i leczenia nowotworów.
- Obecne metody często nie posiadają możliwości jednoczesnej oceny wielu parametrów.
- Celem niniejszego badania jest poprawa wykrywania i analizy CTC w niedrobnokomórkowym raku płuc.
- Protokół można również dostosować do innych typów nowotworów, takich jak rak piersi.
Cel Badania
- Opracowanie protokołu łączącego immunofluorescencję i DNA-FISH do charakteryzacji CTC.
- Identyfikacja celów terapeutycznych na CTC.
- Wzbogacenie zrozumienia biologii komórek nowotworowych poprzez jednoczesną analizę cech fenotypowych i genetycznych.
Wykorzystane Metody
- Funkcjonalizowany drut do wychwytywania CTC z próbek krwi.
- Barwienie immunofluorescencyjne w celu oceny immunofenotypu.
- DNA-FISH do analizy zmian genetycznych.
- Mikroskopia do obrazowania i gromadzenia danych.
Główne Wyniki
- Pomyślna identyfikacja CTC z określonymi markerami immunophenotypowymi.
- Wykrycie zmian genetycznych związanych z cechami nowotworu.
- Wyrażona wykonalność metody dla różnych typów nowotworów.
- Protokół umożliwia powtarzalność i łatwość użytkowania w warunkach laboratoryjnych.
Wnioski
- Połączona metoda immunofluorescencji i DNA-FISH jest skuteczna do charakteryzacji CTC.
- Podejście to może dostarczyć informacji na temat biologii nowotworu i celów leczenia.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować inne nowotwory złośliwe niż rak płuc.
Najczęściej zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method addresses the critical challenge of rare circulating tumor cell (CTC) detection by enabling high-volume blood sampling and simultaneous phenotypic and genetic analysis. By integrating immunofluorescence and DNA FISH on a 3D functionalized wire, it provides a scalable approach for CTC enrichment and characterization directly from peripheral blood. The workflow supports early discovery efforts by delivering multiplexed data on cell surface markers and chromosomal alterations, informing target validation and patient stratification strategies in oncology drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic targets through simultaneous detection of EpCAM positivity and ALK gene translocation in captured CTCs.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking by correlating phenotypic markers with cytogenetic alterations in a single workflow.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing multiplexed data on putative CTCs for hypothesis-driven target validation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by capturing CTCs from large blood volumes (1.5–3 L) via 30-minute wire incubation.
- Reproducibility: Standardizes CTC isolation and immuno-DNA FISH processing on a 3D support, enabling consistent phenotypic and genetic readouts.
- Quantitative Output: Generates measurable immunofluorescence and FISH signals detectable via conventional widefield fluorescence microscopy.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Demonstrated feasibility in NSCLC cell lines (NCI-H3122 and NCI-H1975) for EpCAM and ALK status, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Enables risk-adjusted advancement decisions by linking CTC phenotype to genotype in disease-relevant models.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in CTC characterization by co-localizing protein expression and gene status on individual cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, offering a reusable capability for CTC analysis across oncology indications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling simultaneous phenotypic and genetic profiling of rare CTC populations.
- Screening: Delivers assay-ready CTC samples with standardized isolation and staining protocols for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative readouts (EpCAM intensity, ALK FISH signals) that allow comparative analysis across conditions and timepoints.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation through disease-relevant CTC characterization in NSCLC models.
- Enterprise Reuse: Functions as a platform technology adaptable to multiple cancer types (e.g., breast cancer) and diverse antibody/FISH probe combinations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in CTC biomarker studies by reducing mechanistic ambiguity through correlated phenotyping and genotyping.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability via a wire-based system compatible with conventional microscopy and standard reagents.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering multiparametric CTC data that inform target specificity and patient selection.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates based on CTC phenotype-genotype concordance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, DNA FISH, and delicate handling of functionalized wire tips to prevent damage.
- Depends on access to a conventional widefield fluorescence microscope with appropriate filter sets for DAPI, FITC, and Cy3/Cy5 equivalents.
- Necessitates cross-team standardization of wire preparation, incubation, and imaging protocols to ensure reproducibility across sites.
- Involves adaptation considerations when extending the protocol to different cancer types or alternative phenotypic/genetic markers.
- Includes practical limitations such as the fragility of the wire’s functionalized tip and the need for hazardous material precautions (acetone, ovens).
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:34
Immuno-DNA FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) on Wire
2:35
Fixation, Permeabilization, and Immunofluorescence
4:25
3D DNA FISH Day 2
6:08
3D DNA FISH Day 3
7:51
3D Microscope Observation and Analysis
9:01
Results: No Interference Bewteen Immunofluorescence and DNA FISH Signals
9:38
Conclusion
