Kalwaryjny model augmentacji kości u królika do oceny wzrostu kości i neowaskularyzacji w materiałach kościozastępczych

W niniejszej pracy przedstawiono protokół chirurgiczny dla królików, którego celem jest ocena materiałów kościozastępczych pod kątem zdolności regeneracyjnych kości. Podstawową zasadą tego modelu kalwarii królika jest pionowy wzrost nowej tkanki kostnej na szczycie korowej części czaszki. Model ten pozwala na ocenę materiałów substytucyjnych do regeneracji kości jamy ustnej i twarzoczaszki pod kątem wspomagania wzrostu kości i wspomagania neowaskularyzacji.

Model ten ma duże znaczenie dla oceny regeneracji kości, ponieważ mierzy ektopowy wzrost nowej tkanki kostnej powyżej dojrzałej kości. W porównaniu z tradycyjnymi modelami, w których nowa kość regeneruje się, aby wypełnić ubytek, który został sztucznie stworzony, aby ostatecznie wrócić do swojego pierwotnego poziomu. Za pomocą dużych cylindrów przymocowanych do czaszek królików, osteokondukcjacja, osteoindukcja, osteogeneza i unaczynienie wywołane przez materiały mogą być oceniane zarówno na żywych, jak i zabitych zwierzętach.

Procedurę zademonstruje Laurin Marger, pracownik naukowy z naszego laboratorium, oraz ja. Po uśpieniu zwierząt należy umieścić kaniulę dożylną w żyle brzeżnej z ucha i trzymać ją zamkniętą aż do zakończenia intubacji. Ułóż królika w pozycji leżącej i utrzymuj jego głowę w pionowym wyprostowaniu.

Znieczulić tchawicę miejscowo, rozpylając 10% lidokainę. Wsuń rurkę dotchawiczą o małej średnicy do tchawicy królika, aż będzie słyszalny przepływ powietrza w rurce. To otworzy krtań i ułatwi wprowadzenie ostatecznej rurki.

Następnie włóż prowadnicę do rurki, aby ustalić położenie rurki w tchawicy. Wyjmij rurkę o małej średnicy i wsuń ostateczną rurkę dotchawiczą na prowadnicę. Zdejmij prowadnicę i napompuj balon na końcu rurki dotchawiczej, aby uszczelnić i zablokować urządzenie w tchawicy.

Stale obfitie podawaj fentanyl w celu wywołania znieczulenia. Dwa do czterech miligramów na kilogram propofolu w celu wywołania znieczulenia i cztery mililitry na kilogram na godzinę octanu pierścienia w celu utrzymania warunków izowolumetrycznych. Natychmiast przewietrzyć zwierzę 3% sewofluranem w czystym tlenie.

Najpierw umieść królika na podgrzewanej podkładce ustawionej na 39 stopni Celsjusza na stole operacyjnym i umieść sondę temperatury doodbytniczą. Ogol skórę głowy. Szoruj skórę 10% jodem prowidonu, aby zdezynfekować miejsce.

Następnie udrapuj królika sterylną serwetą chirurgiczną i wytnij obszar dostępu do czaszki. Zdezynfekuj miejsce operowane 10% jodem prowidonu po raz drugi. Na początek znieczulenie miejscowe za pomocą podskórnego wstrzyknięcia lidokainy w czaszkę.

Za pomocą skalpela naciąć skórę wzdłuż linii strzałkowej kalwarii od oczodołów do zewnętrznej wypukłości potylicznej, upewniając się, że okostna jest nacięta. Użyj windy okostnej, aby delikatnie podnieść okostną po obu stronach nacięcia. Spłucz miejsce sterylną solą fizjologiczną.

Najpierw zlokalizuj media i szwy koronalne na czaszce. Zauważ, że te linie anatomiczne tworzą krzyż. Cylindry zostaną umieszczone w każdym z kwadrantów określonych przez krzyż, upewniając się, że krawędź cylindra nie znajduje się nad szwem.

Umieść pierwszy cylinder w lewym górnym kwadrancie, układając urządzenie tak płasko, jak to możliwe. Ustal pozycję cylindra silnym naciskiem dłoni i wkręć mikrośrubę, aż poczujesz opór. Upewnij się, że jest zlicowany z klapką cylindra.

Zamocuj drugą zakładkę cylindra w ten sam sposób, aby mocno przymocować cylinder do czaszki. Upewnij się, że cylinder jest hermetycznie przymocowany do kości. Następnie powtórz całą tę procedurę, aby przymocować cylinder do każdego z pozostałych trzech kwadrantów.

Na początek wywierć otwór międzyszpikowy pod irygacją solą fizjologiczną z okrągłym zadziorem na kości pośrodku obszaru opisanego przez cylinder. Upewnij się, że pojawia się krwawienie. Następnie wywierć dwa kolejne otwory międzyszpikowe wzdłuż osi przechodzącej przez dwie z zakładkami na wewnętrznych krawędziach cylindra.

Wzdłuż prostopadłej osi wywierć dwa kolejne otwory międzyszpikowe na wewnętrznych krawędziach cylindra. Powtórz ten proces wiercenia dla trzech pozostałych cylindrów. Następnie napełnij pierwszy cylinder po brzegi próbką materiału.

Zamknij cylinder, zakładając nakrętkę. Powtórz ten proces napełniania dla pozostałych trzech cylindrów. Zamknąć skórę nad cylindrami przerywanym, niewchłanialnym szwem i nałożyć na ranę opatrunek w sprayu.

Następnie przerwij dopływ środka przeciwbólowego i znieczulającego i sprawdź, czy odzyskano autonomiczne oddychanie. Gdy zwierzę odzyska autonomiczne oddychanie, przerwij wentylację. Utrzymuj zwierzę pod czystym tlenem przed całkowitym przebudzeniem.

Chlorowodorek buprenofiny należy wstrzykiwać podskórnie. Powtarzaj wstrzyknięcie co sześć godzin przez trzy dni jako znieruchoność pooperacyjna. Pozwól zwierzęciu całkowicie się obudzić przed przeniesieniem go do zwykłego pomieszczenia z wodą i pełnym karmieniem.

Model opisany w tym filmie jest dedykowany do oceny osteokondukcji, osteoindukcji, osteogenezy i neowaskularyzacji w substytutach kości. Po zakończeniu operacji wzrost kości może być monitorowany w różnych punktach czasowych za pomocą tomografii kości na żywych zwierzętach. Dodatkowa analiza wymaga uśmiercenia zwierząt.

Po eutanazji próbki są dzielone na sekcje, a butle są ostrożnie usuwane. Biopsje są następnie utrwalane roztworem 4% formaldehydu w PBS. Następnie mikrotomografia może być wykorzystana do oceny wzrostu kości.

Próbki mogą być również przetwarzane do barwienia histologicznego. Analiza histomorfometryczna i specyficzne barwienia są wtedy możliwe w celu dokładniejszego zakończenia analizy. Ponieważ protokół ten jest metodą chirurgiczną, wszystkie kroki są krytyczne i muszą być prawidłowo przestrzegane.

Ważne jest, aby zostać przeszkolonym w zakresie eksperymentów na zwierzętach, zwłaszcza w zakresie obchodzenia się z królikami i znieczulenia. Oprócz opisanych metod, komórki mogą być analizowane bardziej szczegółowo za pomocą cytometrii przepływowej. Ewolucję materiału, dojrzewanie tkanki kostnej i mechanikę można również ocenić na przykład za pomocą nano wgłębień.

Za pomocą tego modelu przeprowadzono wiele ocen. Jak na przykład dla koszyków tytanowych lub ceramicznych, błon GBM, czynników osteogennych, podstawników noworodkowych czy mechanizmu neowaskularyzacji podczas procesu regeneracji kości.