Name: Kalwaryjny model augmentacji kości u królika do oceny wzrostu kości i neowaskularyzacji w materiałach kościozastępczych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj model kalwaryjny u królika do oceny materiałów kościozastępczych pod kątem osteokondukcji, osteoindukcji i neowaskularyzacji. Ta metoda umożliwia badanie regeneracji kości w zastosowaniach klinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni firmie Geistlich AG (Wolhusen, CH) i Fundacji Osteology (Lucerna, CH) (grant nr 18-049) za wsparcie, a także Global D (Brignais, FR) za dostarczenie. Szczególne podziękowania kierujemy do dr B. Schaefera z firmy Geistlich. Jesteśmy również wdzięczni Eliane Dubois i Claire Herrmann za ich doskonałe opracowanie histologiczne i cenne rady. Na koniec serdecznie dziękujemy Xavierowi Belinowi, Sylvie Roulet i całemu zespołowi Pr Walid Habre, "eksperymentalnego chirurga Dpt", za ich niezwykłą pomoc techniczną.

Zgodnie ze szwajcarskimi wymogami prawnymi, protokół został zatwierdzony przez komitet akademicki i nadzorowany przez kantonalne i federalne agencje weterynaryjne (autoryzacje nr GE/165/16 i GE/100/18).
1. Konkretne urządzenia i zwierzęta
<ol>
	<li>Cylindry
	<ol>
		<li>Cylindry maszynowe z bocznymi wypustkami stabilizującymi z PEEK o średnicy wewnętrznej 5 mm, średnicy zewnętrznej 8 mm i wysokości 5 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
		<li>Maszynowe nasadki PEEK o konstrukcji umożliwiającej precyzyjne przypięcie do górnej części cylindra (grubość 1 mm).</li>
		<li>Sterylizuj butle i nakrętki PEEK przez autoklawowanie przed zabiegiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>
	<ol>
		<li>Użyj samowiercących mikrośrub (wykonanych z dostępnego w handlu czystego tytanu (klasa 5)) do zamocowania cylindrów (o średnicy 1,2 mm, długości 4 mm). Sterylizuj w autoklawie przed zabiegiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>zwierzęta
	<ol>
		<li>Kup trzymiesięczne białe króliki nowozelandzkie (samce lub samice) o wadze ~2,5 kg każdy. 
		UWAGA: Króliki uzyskaliśmy poprzez hodowlę na Uniwersytecie Genewskim.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Chirurgia
<ol>
	<li>Taca chirurgiczna 
	<ol>
		<li>Miej w pogotowiu skalpele, nożyczki, dwa kleszcze, podnośnik okostny, strzykawki (1, 2, 5, 50 ml), silnik chirurgiczny, okrągłe wiertła chirurgiczne (średnica 0,8 mm), igły, sterylną sól fizjologiczną, cztery cylindry, osiem i śrubokręt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie przedkliniczne
	<ol>
		<li>Zaaklimatyzować zwierzęta na tydzień przed zabiegiem.</li>
		<li>Profilaktycznie podawać antybiotyk codziennie (5–10 mg/kg doustnie (PO)) od 2 godzin przed zabiegiem do 3 dni po zabiegu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulenie i intubacja
	<ol>
		<li>Uspokoić zwierzęta poprzez domięśniowe wstrzyknięcie ketaminy (25 mg/kg, 50 mg/ml, 0,5 ml/kg) + ksylazyny (3 mg/kg, 20 mg/ml, 0,15 ml/kg). Poczekaj ~20 min, aż zwierzęta zasną 
		głęboko (pełna atonia mięśni). 
		UWAGA: Ta premedykacja pozwoli na prosty, szybki i bezbolesny proces intubacji. Indukowana jest głęboka analgezja i znieczulenie, jak opisano w kroku 2.3.8.</li>
		<li>Umieścić kaniulę dożylną (IV) w żyle brzeżnej z ucha i trzymać ją zamkniętą do czasu zakończenia intubacji. 
		UWAGA: Ta linia dożylna będzie służyć do perfuzji fentanylu i propofolu odpowiednio w celu głębokiego znieczulenia i znieczulenia (patrz krok 2.3.8).</li>
		<li>Utrzymuj znieczulenie, podając 5% sewofluranu w czystym tlenie, aż do wykonania intubacji. 
		UWAGA: Ten krok jest konieczny tylko wtedy, gdy zwierzę wykazuje oznaki przebudzenia (ruchy gałek ocznych, skurcze mięśni).</li>
		<li>Znieczulić tchawicę miejscowo, rozpylając 10% lidokainy. Ułóż królika w pozycji leżącej i utrzymuj jego głowę w pionowym wyprostowaniu.</li>
		<li>Wsuń pierwszą rurkę dotchawiczą o małej średnicy (2,5 mm) do tchawicy królika, aż będzie słyszalny przepływ powietrza w rurce. To otworzy krtań i ułatwi wprowadzenie ostatecznej rurki.</li>
		<li>Wprowadzić prowadnicę (cewnik intubacyjny) do probówki, aby ustalić położenie rurki w tchawicy. Wyjmij rurkę o małej średnicy i wsuń ostateczną rurkę dotchawiczą (4.9 mm) na prowadnicę.</li>
		<li>Zdejmij prowadnicę i napompuj balon na końcu rurki dotchawiczej, aby uszczelnić i zablokować urządzenie w tchawicy. Rurka pozostanie na swoim miejscu, ale można ją zabezpieczyć za pomocą sznurówki zawiązanej wokół czoła. Natychmiast przewietrzyć zwierzę (7 ml/kg, częstotliwość 40/min) 3% sewofluranem w czystym tlenie.</li>
		<li>Ciągłe perfuzje (żyły usznej) fentanylu (0,01 mg/ml, 2–4 ml/h) w celu wywołania znieczulenia, 2–4 mg/kg (2%) propofolu (20 mg/ml, 4–8 ml/h) w celu wywołania znieczulenia i 4 ml/kg/h octanu Ringera w celu utrzymania warunków izowolumetrycznych.</li>
		<li>Umieść sondę temperatury w odbycie. Monitoruj również czynność serca, temperaturę i nasycenie tlenem podczas całego procesu.</li>
		<li>Kontroluj głębokość znieczulenia, monitorując autonomiczne oddychanie; jeśli zwierzę wykazuje oznaki autonomicznego oddychania, podaj mały bolus propofolu i fentanylu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie strony
	<ol>
		<li>Umieść królika na podgrzewanej podkładce (39 °C) przykrytej podkładką pod materac (aby uniknąć poparzeń) na stole operacyjnym. Ogol skórę głowy.</li>
		<li>Nałóż żel nawilżający na oczy, aby uniknąć podrażnień i wysuszenia. Zdezynfekuj miejsce, szorując skórę jodonem powidonu (10%). Następnie ułóż królika sterylną serwetą chirurgiczną i wytnij obszar dostępu do czaszki.</li>
		<li>Zdezynfekuj miejsce operowane jodem powidonu (10%) po raz drugi. Nałóż żel nawilżający na oczy, aby uniknąć podrażnień i wysuszenia.</li>
		<li>Przygotuj udrapowany stół (sterylną serwetę), na którym umieścisz całą tacę chirurgiczną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwarcie pola operacyjnego
	<ol>
		<li>Znieczulenie miejscowe za pomocą podskórnego (SC) wstrzyknięcia lidokainy 2% (1 ml) w czaszkę.</li>
		<li>Naciąć skórę (skalpelem) wzdłuż linii strzałkowej kalwarii, od oczodołów do zewnętrznej wypukłości potylicznej (~4 cm długości). Upewnij się, że okostna jest nacięta.</li>
		<li>Delikatnie podnieś okostną (z windą okostną) po obu stronach nacięcia. Spłucz miejsce sterylną solą fizjologiczną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmieszczenie cylindrów
	<ol>
		<li>Zlokalizuj szwy środkowe i czołowe na czaszce (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A,B). Zauważ, że te linie anatomiczne tworzą krzyż. Cylindry zostaną umieszczone w każdym z kwadrantów zdefiniowanych przez krzyż, upewniając się, że krawędź cylindra nie znajduje się nad szwem (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C).</li>
		<li>Umieść pierwszy cylinder w lewym górnym kwadrancie (lewa kość czołowa) i spróbuj położyć urządzenie płasko. Zamocuj w pozycji z silnym naciskiem dłoni i wkręć mikrośrubę, aż poczujesz opór. Upewnij się, że jest równo z powierzchnią zaczepu cylindra.</li>
		<li>Powtórz tę samą procedurę na drugiej zakładce, aby mocno przymocować cylinder do czaszki. Upewnij się, że cylinder jest hermetycznie przymocowany do kości.</li>
		<li>Powtórz procedurę na prawej górnej ćwiartce (prawa kość czołowa), lewej dolnej ćwiartce (lewa kość ciemieniowa) i prawej dolnej ćwiartce (prawa kość ciemieniowa).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wiercenie w kości 5 otworów śródszpikowych w obszarze opisanym przez cylindry (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
	<ol>
		<li>Wywierć otwór śródszpikowy pod irygacją solą fizjologiczną (średnica 0,8 mm, głębokość ~1 mm) z okrągłym wiertłem na kości, pośrodku obszaru opisanego przez cylinder. Upewnij się, że pojawia się krwawienie.</li>
		<li>Wywierć dwa dodatkowe otwory śródszpikowe wzdłuż osi przechodzącej przez dwie z zakładką, na wewnętrznych krawędziach cylindra. Wzdłuż prostopadłej osi wywierć jeszcze dwa otwory śródszpikowe na wewnętrznych krawędziach cylindra. Upewnij się, że pojawia się krwawienie.</li>
		<li>Powtórz operację w trzech pozostałych cylindrach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napełnianie butli próbkami materiału i zakręcanie (rysunek 3)
	<ol>
		<li>Przygotuj żądany materiał kościozastępczy zgodnie z instrukcjami producenta lub specyfikacjami materiału.</li>
		<li>Napełnij pierwszy cylinder po brzegi próbką materiału i zamknij cylinder, zakładając nakrętkę. Powtórz ten proces w pozostałych 3 cylindrach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamknięcie pola operacyjnego
	<ol>
		<li>Zamknij skórę nad cylindrami za pomocą przerywanego, niewchłanialnego szwu.</li>
		<li>Na ranę nałożyć opatrunek w sprayu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Leczenie pooperacyjne
<ol>
	<li>Zatrzymaj dopływ analgezji i znieczulenia (zatrzymanie perfuzji propofolu i fentanylu) i sprawdź, czy odzyskanie autonomicznego oddychania.</li>
	<li>Zatrzymaj wentylację, gdy zwierzę odzyska autonomiczne oddychanie. Utrzymuj zwierzę pod czystym tlenem przed całkowitym przebudzeniem.</li>
	<li>Wstrzyknąć chlorowodorek buprenorfiny SC (0,02 mg/kg, 0,03 mg/ml, 0,67 ml/kg) i powtarzać wstrzyknięcie co 6 godzin przez 3 dni jako analgezja pooperacyjna.</li>
	<li>Przenieś zwierzę do jego zwykłego pomieszczenia z wodą i pełnym karmieniem.</li>
	<li>Szwy należy usunąć po około 10 dniach od zagojenia się rany.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj model jest prosty i powinien być dość łatwo opracowany, o ile wszystkie kroki są wykonane, a sprzęt jest odpowiedni. Ponieważ opisany protokół jest metodą chirurgiczną, wszystkie kroki wydają się krytyczne i muszą być prawidłowo wykonane. Bardzo ważne jest, aby zostać przeszkolonym w zakresie eksperymentów na zwierzętach, zwłaszcza w zakresie obchodzenia się z królikami i znieczulenia. Nie wahaj się poprosić o profesjonalną pomoc anestezjologa i weterynarza. Bardzo ważne jest, aby nalegać na codzienny monit...

Model augmentacji kości kalwarycznej został opracowany w latach 90-tych w celu optymalizacji koncepcji sterowanej regeneracji kości (GBR) w chirurgii jamy ustnej i twarzoczaszki. Podstawową zasadą tego modelu jest wzrost nowej tkanki kostnej pionowo na szczycie korowej części czaszki. W tym celu do czaszki mocuje się reaktor (np. tytanową kopułę, cylinder lub klatkę), aby chronić regenerację kości prowadzoną przez przeszczep (np. hydrożel, substytut kości itp.). Za pomocą tego modelu klatki tytanowe lub ceramiczne 1,2,3,4,5,6, membrany GBR7,8,9,10, czynniki osteogenne11,12,13,14,15,16,17, nowe substytuty kości12,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 lub mechanizm neowaskularyzacji podczas procesu regeneracji kości30 zostało ocenionych.
Z translacyjnego punktu widzenia, model kalwaryczny reprezentuje wadę jednościenną, którą można porównać do wady IV klasy w szczęce31. Celem jest wyhodowanie nowej kości powyżej obszaru korowego, bez żadnego bocznego wsparcia ze strony endogennych ścian kostnych. Model jest zatem niezwykle rygorystyczny i ocenia rzeczywisty potencjał osteoprzewodnictwa pionowego w obrębie korowej części kości. Jeśli opisany tu model jest przede wszystkim przeznaczony do oceny osteokondukcji w substytutach kości, można również ocenić osteogenezę i/lub osteoindukcję, a także waskulogenezę1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30.
Zasadniczo z powodów etycznych, praktycznych i ekonomicznych, u królika opracowano model kalwaryjny, u którego metabolizm i struktura kości są dość istotne w porównaniu do human32. Spośród 30 odniesień przytoczonych powyżej, 80% korzystało z modelu kalwaryjnego królika1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,17,22,23,26,27,28,29,30,33, co pokazuje znaczenie tego modelu zwierzęcego. W 2008 r. grupa Busenlechnera przeniosła model kalwarii na świnię, aby umożliwić jednoczesne porównanie ośmiu substytutów kości 20 (w porównaniu z dwoma substytutami kości u królika). Z drugiej strony, nasza grupa przeniosła model kalwarii królika na owce. Krótko mówiąc, tytanowe kopuły zostały umieszczone na czaszkach owiec, aby scharakteryzować osteoprzewodnictwo nowego substytutu kości wydrukowanego w 3D. Badania te pozwoliły nam opracować i opanować model kalwarii oraz jego analizę16,21.
Ostatnie trzy cytowane badania16,20,21, wraz z kilkoma innymi badaniami12,17,18,19,22,23,24, 26,27,28,29, potwierdził ogromny potencjał modelu kalwaryjnego jako modelu przesiewowego i charakteryzacyjnego. Jednak, mimo że uzyskane wyniki były całkiem zadowalające, zwrócili również uwagę na pewne ograniczenia: (1) zastosowanie tytanowych kopułek, które zapobiegały dyfuzji promieniowania rentgenowskiego, a co za tym idzie, stosowanie mikrotomografii komputerowej na żywo. Nie można było ich usunąć przed obróbką histologiczną, co zmusiło naukowców do osadzenia próbek w żywicy poli(metakrylanu metylu) (PMMA). Uzyskane w ten sposób analizy w dużej mierze ograniczały się do topografii. (2) Wysokie koszty finansowe, w szczególności ze względu na koszty zwierząt oraz koszty związane z logistyką, utrzymaniem i chirurgią zwierząt. (3) Trudności w uzyskaniu zatwierdzeń etycznych dla dużych zwierząt.
Niedawne badanie przeprowadzone przez Polo, et al.26 znacznie poprawiło model królika. Kopuły tytanowe zostały zastąpione zamykanymi cylindrami, które można było napełniać stałą objętością materiału. Cztery z tych cylindrów umieszczone były na czaszkach królików. Po zakończeniu prac butle można było wyjąć, dzięki czemu biopsje nie zawierały metalu, co wprowadziło znacznie większą elastyczność w przetwarzaniu próbek. Model kalwarii królika stał się atrakcyjny ze względu na jednoczesne testowanie przy niższych kosztach, łatwej obsłudze zwierząt i ułatwieniu przetwarzania próbek. Korzystając z tych ostatnich osiągnięć, jeszcze bardziej ulepszyliśmy model, zastępując tytan PEEK do produkcji cylindrów, umożliwiając w ten sposób dyfuzję promieniowania rentgenowskiego i zastosowanie mikrotomografii na żywych zwierzętach.
W tym artykule opiszemy procesy anestezjologiczne i chirurgiczne oraz pokażemy przykłady wyników, które można uzyskać za pomocą tego protokołu, tj. (immuno-)histologia, histomorfometria, mikrotomografia na żywo i ex vivo w celu oceny mechanizmów regeneracji kości i ilościowego określenia nowej syntezy kości wspieranej przez materiały substytucyjne kości.

<table><tbody><tr><td>Drugs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enrofloksacyna Baytril 10%</td> <td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk Fentanyl</td><td>Bischel</td><td></td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Ketalar 50mg/ml</td><td>Pfizer</td><td></td><td>Ketamina do znieczulenia</td></tr><tr><td>Lidohex</td><td>Bichsel</td><td></td><td>Żel nawilżający do oczu</td></tr><tr><td>Opsite</td><td>Smith i Siostrzeniec</td><td>66004978</td><td>Opatrunek w sprayu</td></tr><tr><td>Powidon jod 10%, Betadine</td><td>Mundipharma</td><td></td><td>środek przeciwinfekcyjny</td></tr><tr><td>Propofol 2%</td><td>Braun</td><td>3538710</td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Rapidocain 2%</td><td>sintetica</td><td></td><td>Znieczulenie miejscowe</td></tr><tr><td>Octan Ringera</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>Kompensacja objętości</td></tr><tr><td>Rompun 2%</td><td>Bayer</td><td></td><td>Xylazin do znieczulenia</td></tr><tr><td>Sevoflurane 5%</td><td>Abbvie</td><td></td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Sterylna sól fizjologiczna</td><td>Sintetica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temgesic</td><td>Reckitt Benckiser</td><td></td><td>Chlorowodorek buprenorfiny, analgezja</td></tr><tr><td>Thiopental Inresa</td><td>Ospediala</td><td></td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Xylocaine 10% spray</td><td>Astra Zeneca</td><td></td><td>Do intubacji</td></tr><tr><td>Nazwa<</td><td>strong>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fresenius Vial pilot C</td><td>Imexmed</td><td></td><td>Pompa infuzyjna</td></tr><tr><td>Podgrzewana podkładka</td><td>Aparat</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>HarvardaSsanie dominujące 50</td><td>Medela</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurka ssąca Optimus</td><td>Promedical</td><td>80342.2</td><td></td></tr><tr><td>Silnik chirurgiczny</td><td>Schick dental</td><td>Qube</td><td>Wiercenie otworów śródszpikowych</td></tr><tr><td>Wentylacja</td><td>Maquet Servo1</td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy </td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Materiał</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cylindry i nasadki</td><td>Boutyplast</td><td>Dostosowany</td><td>skład: PEEK (polieteroeteroketon)</td></tr><tr><td>Ręczny wałek samopodtrzymujący</td><td>GlobalD</td><td>ACT1K</td><td></td></tr><tr><td>Ruchomy uchwyt do wału samopodtrzymującego</td><td>GlobalD</td><td>MTM</td><td></td></tr><tr><td>Samowiercący </td><td>GlobalD</td><td>VA1.2KL4</td><td>z napędem krzyżowym wykonane z tytanu grade5, ISO 5832-3</td></tr><tr><td><mocny>Nazwa</mocny></td><td><silny>Firma</mocny></td><td><silny>Numer katalogowy</mocny></td><td><silny>Komentarze</td></tr><tr><td><mocny>Taca chirurgiczna</mocna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurka dotchawicza Shiley średnica 2,5mm</td><td>Covidien</td><td>86233</td><td>Do intubacji</td></tr><tr><td>Rurka dotchawicza Shiley średnica 4,9mm</td><td>Covidien</td><td>107-35G</td><td>Do intubacji</td></tr><tr><td>Ethicon prolene 4-0</td><td>Ehticon</td><td>8581H</td><td>Kleszcze do szwów niewchłanialnych</td></tr><tr><td></td><td>Marcel Blanc</td><td>BD027R</td><td>145 mm</td></tr><tr><td>Cewnik do intubacji</td><td>Przewodnik medyczny</td><td></td> Cook <td>dotyczący intubacji</td></tr><tr><td>Uchwyt na igłę</td><td>Marcel Blanc</td><td>BM008R</td><td></td></tr><tr><td>Igły BD Microlance3</td><td>Becton Dickinson</td><td>300300/304622</td><td>26G; 18G</td></tr><tr><td>Periosteal</td><td>HU-Friedy</td><td>P9X</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe wiertła chirurgiczne</td><td>Patterson</td><td>78000</td><td>o średnicy 0,8 mm, Wiercenie otworów śródszpikowych</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Swann-Morton</td><td></td><td>n&deg; 10 oraz n&deg; 15</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Marcel Blanc</td><td>00657</td> Strzykawki <td>180 mm</td></tr><tr><td>Omnifix</td><td>Braun</td><td>4616057V</td><td>5ml, 10ml i 50ml</td></tr><tr><td>Venflon G22</td><td>Braun</td><td>42690985-01</td><td>Vasofix bezpieczeństwo dla linii dożylnej ucha</td></tr></tbody></table>

kalwaryjny model augmentacji kości u królika do oceny wzrostu kości i neowaskularyzacji w materiałach kościozastępczych

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

Podstawową zasadą modelu kalwarii królika jest pionowy wzrost nowej tkanki kostnej na szczycie korowej części czaszki. Model ten pozwala na ocenę materiałów kościozastępczych do regeneracji kości jamy ustnej i twarzoczaszki pod kątem wzrostu kości i wspomagania neowaskularyzacji. Po znieczuleniu i wentylacji zwierząt (intubacja dotchawicza), cztery cylindry wykonane z polieteroeteroketonu (PEEK) są przykręcane do czaszki, po obu stronach szwów środkowych i koronalnych. Pięć otworów śródszpikowych jest wierconych w obszarze kości ograniczonym przez każdy cylinder, umożliwiając napływ komórek szpiku kostnego. Próbki materiału umieszcza się w cylindrach, które są następnie zamykane. Na koniec miejsce operacji jest zszywane, a zwierzęta są budzone. Wzrost kości można ocenić na żywych zwierzętach za pomocą mikrotomografii. Po uśmierceniu zwierząt wzrost kości i neowaskularyzacja mogą być oceniane za pomocą mikrotomografii, immunohistologii i immunofluorescencji. Ponieważ ocena materiału wymaga maksymalnej standaryzacji i kalibracji, model kalwaryjny wydaje się idealny. Dostęp jest bardzo łatwy, kalibracja i standaryzacja są ułatwione dzięki zastosowaniu zdefiniowanych cylindrów, a cztery próbki mogą być oceniane jednocześnie. Ponadto można zastosować tomografię na żywo i ostatecznie można spodziewać się dużego spadku liczby zwierząt poddawanych eutanazji.

Opisany tutaj model jest przeznaczony do oceny osteokondukcji w substytutach kostnych. Można również oceniać osteogenezę i/lub osteoindukcję substytutów kostnych (pre-)scelularyzowanych lub obciążonych cząsteczkami bioaktywnymi, a także waskulogenezę1,2,3,4,5,6,7</...

Tutaj prezentujemy protokół chirurgiczny u królików, którego celem jest ocena materiałów zastępczych kości pod kątem zdolności do regeneracji kości. Za pomocą cylindrów PEEK przymocowanych do czaszek królików, osteokondukcja, osteoindukcja, osteogeneza i waskulogeneza wywołane przez materiały mogą być oceniane zarówno na żywych, jak i uśpionych zwierzętach.

Kalwaryjny model augmentacji kości u królika do oceny wzrostu kości i neowaskularyzacji w materiałach kościozastępczych

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

W niniejszej pracy przedstawiono protokół chirurgiczny dla królików, którego celem jest ocena materiałów kościozastępczych pod kątem zdolności regeneracyjnych kości. Podstawową zasadą tego modelu kalwarii królika jest pionowy wzrost nowej tkanki kostnej na szczycie korowej części czaszki. Model ten pozwala na ocenę materiałów substytucyjnych do regeneracji kości jamy ustnej i twarzoczaszki pod kątem wspomagania wzrostu kości i wspomagania neowaskularyzacji.Model ten ma duże znaczenie dla oceny regeneracji kości, ponieważ mierzy ektopowy wzrost nowej tkanki kostnej powyżej dojrzałej kości. W porównaniu z tradycyjnymi modelami, w których nowa kość regeneruje się, aby wypełnić ubytek, który został sztucznie stworzony, aby ostatecznie wrócić do swojego pierwotnego poziomu. Za pomocą dużych cylindrów przymocowanych do czaszek królików, osteokondukcjacja, osteoindukcja, osteogeneza i unaczynienie wywołane przez materiały mogą być oceniane zarówno na żywych, jak i zabitych zwierzętach.Procedurę zademonstruje Laurin Marger, pracownik naukowy z naszego laboratorium, oraz ja. Po uśpieniu zwierząt należy umieścić kaniulę dożylną w żyle brzeżnej z ucha i trzymać ją zamkniętą aż do zakończenia intubacji. Ułóż królika w pozycji leżącej i utrzymuj jego głowę w pionowym wyprostowaniu.Znieczulić tchawicę miejscowo, rozpylając 10% lidokainę. Wsuń rurkę dotchawiczą o małej średnicy do tchawicy królika, aż będzie słyszalny przepływ powietrza w rurce. To otworzy krtań i ułatwi wprowadzenie ostatecznej rurki.Następnie włóż prowadnicę do rurki, aby ustalić położenie rurki w tchawicy. Wyjmij rurkę o małej średnicy i wsuń ostateczną rurkę dotchawiczą na prowadnicę. Zdejmij prowadnicę i napompuj balon na końcu rurki dotchawiczej, aby uszczelnić i zablokować urządzenie w tchawicy.Stale obfitie podawaj fentanyl w celu wywołania znieczulenia. Dwa do czterech miligramów na kilogram propofolu w celu wywołania znieczulenia i cztery mililitry na kilogram na godzinę octanu pierścienia w celu utrzymania warunków izowolumetrycznych. Natychmiast przewietrzyć zwierzę 3% sewofluranem w czystym tlenie.Najpierw umieść królika na podgrzewanej podkładce ustawionej na 39 stopni Celsjusza na stole operacyjnym i umieść sondę temperatury doodbytniczą. Ogol skórę głowy. Szoruj skórę 10% jodem prowidonu, aby zdezynfekować miejsce.Następnie udrapuj królika sterylną serwetą chirurgiczną i wytnij obszar dostępu do czaszki. Zdezynfekuj miejsce operowane 10% jodem prowidonu po raz drugi. Na początek znieczulenie miejscowe za pomocą podskórnego wstrzyknięcia lidokainy w czaszkę.Za pomocą skalpela naciąć skórę wzdłuż linii strzałkowej kalwarii od oczodołów do zewnętrznej wypukłości potylicznej, upewniając się, że okostna jest nacięta. Użyj windy okostnej, aby delikatnie podnieść okostną po obu stronach nacięcia. Spłucz miejsce sterylną solą fizjologiczną.Najpierw zlokalizuj media i szwy koronalne na czaszce. Zauważ, że te linie anatomiczne tworzą krzyż. Cylindry zostaną umieszczone w każdym z kwadrantów określonych przez krzyż, upewniając się, że krawędź cylindra nie znajduje się nad szwem.Umieść pierwszy cylinder w lewym górnym kwadrancie, układając urządzenie tak płasko, jak to możliwe. Ustal pozycję cylindra silnym naciskiem dłoni i wkręć mikrośrubę, aż poczujesz opór. Upewnij się, że jest zlicowany z klapką cylindra.Zamocuj drugą zakładkę cylindra w ten sam sposób, aby mocno przymocować cylinder do czaszki. Upewnij się, że cylinder jest hermetycznie przymocowany do kości. Następnie powtórz całą tę procedurę, aby przymocować cylinder do każdego z pozostałych trzech kwadrantów.Na początek wywierć otwór międzyszpikowy pod irygacją solą fizjologiczną z okrągłym zadziorem na kości pośrodku obszaru opisanego przez cylinder. Upewnij się, że pojawia się krwawienie. Następnie wywierć dwa kolejne otwory międzyszpikowe wzdłuż osi przechodzącej przez dwie z zakładkami na wewnętrznych krawędziach cylindra.Wzdłuż prostopadłej osi wywierć dwa kolejne otwory międzyszpikowe na wewnętrznych krawędziach cylindra. Powtórz ten proces wiercenia dla trzech pozostałych cylindrów. Następnie napełnij pierwszy cylinder po brzegi próbką materiału.Zamknij cylinder, zakładając nakrętkę. Powtórz ten proces napełniania dla pozostałych trzech cylindrów. Zamknąć skórę nad cylindrami przerywanym, niewchłanialnym szwem i nałożyć na ranę opatrunek w sprayu.Następnie przerwij dopływ środka przeciwbólowego i znieczulającego i sprawdź, czy odzyskano autonomiczne oddychanie. Gdy zwierzę odzyska autonomiczne oddychanie, przerwij wentylację. Utrzymuj zwierzę pod czystym tlenem przed całkowitym przebudzeniem.Chlorowodorek buprenofiny należy wstrzykiwać podskórnie. Powtarzaj wstrzyknięcie co sześć godzin przez trzy dni jako znieruchoność pooperacyjna. Pozwól zwierzęciu całkowicie się obudzić przed przeniesieniem go do zwykłego pomieszczenia z wodą i pełnym karmieniem.Model opisany w tym filmie jest dedykowany do oceny osteokondukcji, osteoindukcji, osteogenezy i neowaskularyzacji w substytutach kości. Po zakończeniu operacji wzrost kości może być monitorowany w różnych punktach czasowych za pomocą tomografii kości na żywych zwierzętach. Dodatkowa analiza wymaga uśmiercenia zwierząt.Po eutanazji próbki są dzielone na sekcje, a butle są ostrożnie usuwane. Biopsje są następnie utrwalane roztworem 4% formaldehydu w PBS. Następnie mikrotomografia może być wykorzystana do oceny wzrostu kości.Próbki mogą być również przetwarzane do barwienia histologicznego. Analiza histomorfometryczna i specyficzne barwienia są wtedy możliwe w celu dokładniejszego zakończenia analizy. Ponieważ protokół ten jest metodą chirurgiczną, wszystkie kroki są krytyczne i muszą być prawidłowo przestrzegane.Ważne jest, aby zostać przeszkolonym w zakresie eksperymentów na zwierzętach, zwłaszcza w zakresie obchodzenia się z królikami i znieczulenia. Oprócz opisanych metod, komórki mogą być analizowane bardziej szczegółowo za pomocą cytometrii przepływowej. Ewolucję materiału, dojrzewanie tkanki kostnej i mechanikę można również ocenić na przykład za pomocą nano wgłębień.Za pomocą tego modelu przeprowadzono wiele ocen. Jak na przykład dla koszyków tytanowych lub ceramicznych, błon GBM, czynników osteogennych, podstawników noworodkowych czy mechanizmu neowaskularyzacji podczas procesu regeneracji kości.

calvarial-model-bone-augmentation-rabbit-for-assessment-bone-growth

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ludzkie okołonaczyniowe komórki macierzyste (PSCs) stanowią nową klasę komórek macierzystych do regeneracji tkanek szkieletowych, podobnie jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs). PSCs można wyizolować za pomocą FACS (sortowania komórek aktywowanego fluorescencją) z tkanki tłuszczowej pobranej podczas standardowych procedur liposukcji, a następnie połączyć z rusztowaniem osteoindukcyjnym w celu uzyskania formowania kości in vivo.

Zastosowanie ludzkich peryvaskularnych komórek macierzystych w regeneracji kości

W tym filmie opisujemy procedurę chirurgiczną polegającą na wygenerowaniu modelu kalwaryjnego królika w celu oceny zdolności do regeneracji kości interesujących materiałów do substytucji próbek kości.

Generowanie modelu ubytku kości nazębnej królika: zabieg chirurgiczny mający na celu utworzenie okrągłych ubytków w górnej części czaszki królika w celu oceny materiałów substytucyjnych kości pod kątem zdolności regeneracji kości

Implantacja autologicznych i allogenicznych przeszczepów kostnych stanowi akceptowane metody leczenia dużych ubytków kości twarzoczaszki. Jednak wpływ składu przeszczepu na wzajemne oddziaływanie między neowaskularyzacją, różnicowaniem komórek i tworzeniem kości jest niejasny. Przedstawiamy protokół obrazowania multimodalnego, którego celem jest wyjaśnienie współzależności angiogenezy i osteogenezy w pobliżu przeszczepu.

Tomografia komputerowa i obrazowanie optyczne sprzężenia osteogeneza-angiogeneza w celu oceny integracji autoprzeszczepów kości czaszki i alloprzeszczepów

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji tworzenia naczyń krwionośnych in vivo i w czasie rzeczywistym na rusztowaniach 3D za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Angiogenezę w genetycznie zmodyfikowanych rusztowaniach badano w mysim modelu krytycznego ubytku kości kalwarycznej. W grupie leczonej wykryto więcej nowych naczyń krwionośnych niż w grupie kontrolnej.

Wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości calowej

Celem tego protokołu jest wygenerowanie modelu złamania kompresyjnego kręgów związanego z osteoporozą u nagich szczurów, który może być oceniany in vivo za pomocą półautomatycznej ilościowej analizy strukturalnej opartej na mikrotomografii komputerowej.

Półautomatyczna ilościowa analiza strukturalna oparta na mikrotomografii komputerowej nagiego szczura Model złamania kręgów związanego z osteoporozą

To badanie przedstawia ulepszony model królika zakażonego Staphylococcus aureus poprzez blokowanie tej samej ilości bakterii w szpiku kostnym. Siarczan wapnia obciążony wankomycyną i autogenna kość są stosowane w leczeniu antybiotykami i naprawą kości. Protokół może być pomocny w badaniu infekcji i regeneracji kości.

Leczenie siarczanem wapnia obciążonym wankomycyną i autogenną kością w ulepszonym króliczym modelu infekcji kości

Liczba nowatorskich biomateriałów zaprojektowanych do naprawy dużych uszkodzeń kości stale rośnie, mając na celu przyspieszenie gojenia kości i przezwyciężenie komplikacji związanych z przeszczepem kości. W tym miejscu przedstawiamy multidyscyplinarną strategię przedklinicznych badań biokompatybilności biomateriałów do naprawy kości.

Profil zgodności biologicznej biomateriałów do regeneracji kości

Hodowla ex vivo eksplantatów kostnych może być cennym narzędziem do badania fizjologii kości i potencjalnej oceny leków w przebudowie kości i chorobach kości. Prezentowany protokół opisuje przygotowanie i hodowlę kalwarii wyizolowanych z czaszek nowonarodzonych myszy, a także jej zastosowania.

Pomiar przebudowy kości i odtworzenie mikrośrodowiska guz-kość przy użyciu kokultury kalwarii i histomorfometrii

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia defektu w tkance trzonu kości udowej szczura. Model ten może oceniać wydajność biomateriału pod wpływem stresu biomechanicznego i badać mechanizmy regeneracji kości związane z osteogenezą błoniastą.

Tworzenie modelu ubytku ubytku ubytku w kości korowej kości udowej szczura

Proponowany protokół zakłada globalne podejście do oceny procesu tworzenia się kości w kontekście regeneracji kości za pomocą analiz multimodalnych. Ma on na celu dostarczenie jakościowych i ilościowych informacji na temat tworzenia się nowych kości, zwiększenie rygoru i trafności badań podstawowych i przedklinicznych.

Kompleksowa charakterystyka mineralizacji tkanek w modelu ex vivo

Badanie to ustanowiło model defektu półsegmentalnego szczura kości udowej do oceny mechanicznej i osteogenicznej wydajności materiałów zastępczych kości w warunkach nośnych, bez użycia wewnętrznego lub zewnętrznego fiksacji.

Model defektu kości dwułopowatej półsegmentalnej u szczurów do oceny wydajności substytucji kości w obszarach nośnych

Poznaj model kalwaryjny u królika do oceny materiałów kościozastępczych pod kątem osteokondukcji, osteoindukcji i neowaskularyzacji. Ta metoda umożliwia badanie regeneracji kości w zastosowaniach klinicznych.

Kalwaryjny model augmentacji kości u królika do oceny wzrostu kości i neowaskularyzacji w materiałach kościozastępczych

Przeglądaj więcej filmów