Badanie dynamiki adhezji komórkowej i rozprzestrzeniania się komórek nabłonka na fibronektynie podczas stresu oksydacyjnego

Metoda ta umożliwi naukowcom ilościowe określenie wczesnej dynamiki adhezji komórkowej i rozprzestrzeniania się komórek zależnych od zakotwiczenia na białku fibronektyny macierzy zewnątrzkomórkowej podczas stresu oksydacyjnego. Technika ta jest wszechstronna i może być dostosowana do badania dynamiki cytoszkieletu w szerokim zakresie warunków. Ponadto akwizycja i analiza danych odbywa się przy użyciu powszechnie używanego sprzętu laboratoryjnego i ogólnodostępnego oprogramowania.

Zrozumienie mechanizmów działania komórek związanych z przyłączaniem się i rozprzestrzenianiem się w ECM podczas zmian statusu redoks może dostarczyć cennych informacji na temat stanów normalnych i chorobowych, takich jak rak z przerzutami. Metoda ta może być stosowana do badania rozprzestrzeniania się i adhezji komórek w różnych warunkach hodowli komórek, linii komórkowych zależnych od zakotwiczenia i/lub utleniaczy, aby odpowiedzieć na szeroki zakres pytań biologicznych. Do wykonania tej techniki wymaganych jest wiele odczynników.

Dlatego ważne jest, aby wszystkie rozwiązania zostały wykonane z wyprzedzeniem przed rozpoczęciem. W okapie z przepływem laminarnym z certyfikatem BSL-II umieść 24-dołkową płytkę z certyfikatem hodowli tkankowej. Umieść jedno szklane szkiełko nakrywkowe w każdej studzience.

Oznacz tabliczkę zgodnie z rysunkiem 1B w protokole tekstowym. Następnie odpipetuj 500 mikrolitrów roztworu fibronektyny do każdej studzienki. Odpipetować roztwór na każde szkiełko nakrywkowe kilka razy, aby zapewnić równomierne pokrycie i całkowite zanurzenie.

Przykryj talerz pokrywką. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Następnie wyjmij płytkę z inkubatora i odessaj roztwór fibronektyny z dołków.

Umyj studzienki trzy razy, używając 500 mikrolitrów 1X PBS na mycie. Odessać końcowe płukanie 1X PBS i zatkać studzienki 500 mikrolitrami 0,5% zdelipidowanego roztworu BSA w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez co najmniej 15 minut. Najpierw podgrzej potrzebne roztwory w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

W okapie z przepływem laminarnym z certyfikatem BSL-II zacznij od zlewającej się monowarstwy komórek REF52 w naczyniu o powierzchni 10 centymetrów kwadratowych i umyj komórki dwukrotnie sześciomililitrami ciepłego 1X PBS. Surowica głodza komórki przez co najmniej godzinę w sześciu mililitrach ciepłego odlipidowanego roztworu BSA. Następnie umyj komórki sześcioma mililitrami podgrzanego 1X PBS.

Odessać PBS i dodać 1,5 mililitra ciepłego 0,5% roztworu trypsyny-EDTA. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez około dwie minuty. Obserwuj komórki pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że oderwanie jest całkowite.

Jeśli po stuknięciu w płytkę na blacie komórki nadal przylegają, włóż je z powrotem do inkubatora na dodatkowe dwie minuty. Odpipetuj 1,5 mililitra ciepłego roztworu neutralizującego trypsynę, TNS, do naczynia, aby zatrzymać trypsynizację i zebrać oderwane komórki. Kilkakrotnie pipetować roztwór w górę i w dół po dnie płytki, aby usunąć wszystkie pozostałe przylegające komórki.

Jeśli komórki wydają się grudkowate, należy następnie rozcierać zawiesinę komórek, delikatnie pipetując w górę iw dół po tylnej części naczynia. Następnie policz komórki za pomocą wykluczenia błękitu trypana w automatycznym liczniku komórek. Usuń odpowiednią ilość komórek, aby utworzyć zawiesinę komórek o gęstości komórek od 10 000 do 30 000 komórek na mililitr w zdelipidowanym BSA w 15-mililitrowej stożkowej probówce.

Użyj wirnika o stałym kącie w wirówce stołowej, aby odwirować komórki z prędkością 300 razy g przez pięć minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w siedmiu mililitrach ciepłego odlipidowanego roztworu BSA. Następnie równomiernie podziel zawiesinę komórek na dwie 15-mililitrowe stożkowe rurki, jedną do kontroli samego pojazdu, a drugą do Ku55933.

Za pomocą rotatora probówkowego obracaj probówki przez 90 do 120 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza. 30 minut przed posiewem dodaj Ku55933 i DMSO do każdej probówki do końcowego stężenia 10 mikromolów. Zwróć zawiesinę ogniw do rotatora na pozostały czas.

Bezpośrednio przed posiewem komórek należy pobrać płytkę z inkubatora i odessać zdelipidowany roztwór BSA. Następnie należy usunąć 500 mikrolitrów zawiesiny komórek z każdej grupy poddawanej działaniu substancji i dodać każdy z nich do jednego z szkiełek nakrywkowych pokrytych fibronektyną na płytce 24-dołkowej. Kontynuować inkubację płytki i zawiesiny komórek w poprzednich warunkach.

Następnie pozwól komórkom przylegać do szkiełka nakrywkowego przez żądany czas. Po upływie pożądanego czasu przylegania należy odessać roztwór komórek z każdego szkiełka nakrywkowego w płytce. Delikatnie dozuj 500 mikrolitrów 3,7% roztworu paraformaldehydu na każde szkiełko nakrywkowe, pipetując boki studzienek i odczekaj 10 do 15 minut.

Następnie usuń roztwór paraformaldehydu i umyj każde szkiełko nakrywkowe dwukrotnie 1X PBS przy użyciu 500 mikrolitrów PBS na pranie. Odessać PBS i przepuszczalne komórki na każdym szkiełku nakrywkowym za pomocą 500 mikrolitrów 0,2% Triton X-100 i 1X PBS przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj każde szkiełko nakrywkowe trzykrotnie 1X PBS, używając 500 mikrolitrów PBS na pranie.

Zablokuj komórki na każdym szkiełku nakrywkowym za pomocą 500 mikrolitrów buforu blokującego immunofluorescencję na 30 do 60 minut. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało anty-paksyliny w buforze blokującym w stosunku jeden do 250. Dobrze wymieszaj i dodaj 200 mikrolitrów roztworu przeciwciała do każdego szkiełka nakrywkowego.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej godzinę. Następnie odessać roztwór przeciwciała i przemyć każde szkiełko nakrywkowe 500 mikrolitrami 1X PBS przez 10 minut. Od tego momentu należy chronić próbki przed światłem.

Rozcieńczyć sondę F-aktyny falloidyny sprzężoną z czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym Alexa 594 i fluorescencyjnym przeciwciałem drugorzędowym przeciwko myszom 488 w tym samym blokującym roztworze buforowym. Dobrze wymieszaj i dodaj 200 mikrolitrów roztworu przeciwciał do każdego szkiełka nakrywkowego przez 30 minut. Odessać roztwór przeciwciała i przemyć każde szkiełko nakrywkowe 500 mikrolitrami 1X PBS przez 10 minut.

Zassać PBS i spłukać szkiełka nakrywkowe raz 500 mikrolitrami wody dejonizowanej. Następnie przymocuj szkiełka nakrywkowe do szkiełek mikroskopowych za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu zawierającego DAPI. Po utrwaleniu i wybarwieniu przeciwciałem anty-paksylinowym uzyskuje się fluorescencyjne 8-bitowe obrazy komórek REF52 w skali szarości.

Po zakończeniu wszystkich etapów przetwarzania obrazu, poszczególne zrosty ogniskowe powinny być widoczne, ostre i łatwe do odróżnienia od siebie. Obrazy fluorescencyjne w skali szarości komórek barwionych sondą F-aktyny anty-paksyliny i falloidyny są następnie wykonywane po posiewie na fibronektynie. Wyraźne zrosty ogniskowe i włókna naprężeniowe powinny być łatwo widoczne w komórkach REF52 po pozostawieniu ich na fibronektynie przez 20 do 30 minut.

Falbany wzbogacone w F-aktynę na przedniej krawędzi błon komórkowych są oznaczone strzałką. Podobne obrazy fluorescencyjne sondy F-aktyny falloidyny i barwienia anty-paksyliny są analizowane pod kątem procentowej zawartości włókien stresowych w rozprzestrzenianiu się komórek. Warto zauważyć, że leczenie utleniaczami powoduje znaczny wzrost tworzenia włókien stresowych we wszystkich badanych punktach adhezji oraz zmniejszenie rozprzestrzeniania się komórek po 15 minutach przylegania komórek do fibronektyny.

Posiewanie przy większej gęstości komórek prowadzi do stłoczenia komórek, co uniemożliwia komórkom pełne rozprzestrzenianie się z powodu nadmiernej konfluencji. Zwróć uwagę, że krawędzie komórek są nie do odróżnienia od sąsiednich komórek. W rezultacie wykluczona jest kwantyfikacja poszczególnych komórek i nie można dokładnie określić obwodu rozprzestrzeniania się.

Oddzielna linia komórkowa mysich fibroblastów embrionalnych jest utrzymywana w zawiesinie, a następnie posiewana na fibronektynie przez 30 minut. Komórki zostały następnie utrwalone i wybarwione przeciwciałem anty-paksyliny. Zwróć uwagę na komórki, które nie są ostre.

Ponadto reaktywność krzyżowa przeciwciała anty-paksyliny ze szczątkami komórkowymi zmieni progi podczas ilościowej analizy obrazu i nie powinna być uwzględniana w analizie. Podczas przetwarzania obrazu użyj narzędzia wyszukiwania na Fidżi, aby sprawdzić histogram obrazu, jednocześnie dostosowując jasność/kontrast, aby uniknąć pułapek związanych z nasyceniem sygnału. Zmiany w adhezji i rozprzestrzenianiu się mogą wpływać na migrację komórek.

Metody śledzenia migracji pojedynczych komórek, gojenia się ran lub testów inwazji chemotaksji mogą określić, czy zachodzą zmiany w migracji. GTPazy z rodziny Rho regulują dynamikę adhezji komórek poprzez ich specyficzną przestrzenną aktywację czasową. Zmiany fenotypowe w adhezji i rozprzestrzenianiu się podczas stresu oksydacyjnego mogą sugerować dalsze role regulacyjne tych białek.

Metoda ta wymaga użycia linii komórkowych BSL-II i niebezpiecznych odczynników chemicznych. Naukowcy muszą odbyć szkolenie w zakresie bezpieczeństwa chemicznego i biologicznego, zgodnie z ustaleniami biura ds. zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego ich instytucji.