Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych
2 listopada 2018
Tutaj prezentujemy protokół jednoczesnego użycia czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru obciążenia białkami i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu w celu pomiaru dynamiki białek, umożliwiając pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach.
Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu mechanobiologii, takie jak to, w jaki sposób siły są przenoszone i wyczuwane w komórkach, a także między komórkami a ich środowiskiem. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona dostęp do informacji w skali molekularnej na temat tego, jak białka reagują na siły mechaniczne w natywnym kontekście żywej komórki. Chociaż metoda ta została zastosowana specjalnie do badania ogniskowego białka adhezji winkuliny, można ją również zastosować do innych białek wrażliwych mechanicznie, takich jak talin, kadheryny lub nesprin.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ prawidłowa konfiguracja obrazowania jest trudna, ale niezbędna dla powodzenia analizy. Rozpocznij tę procedurę od stabilnego wyrażenia konstrukcji czujnika napięcia w żądanym typie komórki, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować podłoża do wysiewu komórek, zaopatrz się w cztery naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 milimetrów.
Pracując w kapturze do hodowli komórkowych, w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów, przygotuj cztery mililitry 10 mikrogramów fibronektyny na mililitr w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem lub PBS. Delikatnie odwróć probówkę raz, aby wymieszać i pozostaw roztwór na pięć minut w kapturze do hodowli komórkowych. Następnie naniec pipetą jeden mililitr roztworu fibronektyny na każde naczynie ze szklanym dnem.
Pozostaw roztwór fibronektyny na naczyniach na godzinę w temperaturze pokojowej lub na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odessać roztwór fibronektyny i spłukać raz PBS. Pozostaw jeden mililitr PBS na naczyniach, aż komórki będą gotowe do wysiewu.
Po zliczeniu komórek wysiewaj 30 000 komórek na każdym szklanym naczyniu pokrytym fibronektyną z odpowiednią kompletną pożywką, aby uzyskać końcową objętość 1,5 mililitra. Pozwól komórkom rozprzestrzenić się przez cztery godziny po wysianiu. Po dwóch godzinach rozprowadzania odessać pożywkę wzrostową i raz spłukać pożywką do obrazowania.
Pozostaw 1,5 mililitra nośnika do obrazowania. Przed rozpoczęciem kalibracji rozgrzej mikroskop zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby skalibrować laser FRAP, najpierw otwórz okno konfiguracji lasera.
Ustaw oświetlenie na odpowiednie ustawienia oświetlenia FRAP dla ekspozycji lasera na próbkę. Następnie ustaw ustawienie Iluminacja na ustawienia oświetlenia odpowiednie dla obrazowania tylko fluoroforu akceptora. Wybierz cel do kalibracji w obszarze Ustawienia układu współrzędnych.
Usuń zaznaczenie opcji Ręcznie kliknij punkty kalibracji i zaznacz opcję Wyświetlaj obrazy podczas kalibracji. Ustaw czas przebywania na 10 000 mikrosekund, a liczbę impulsów na 100. Teraz umieść szkiełko kalibracyjne, wykonane z bromku etydyny uszczelnione między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym, w stage adapter stroną z szkiełkiem nakrywkowym do dołu.
Użyj ustawień oświetlenia akceptora, aby ustawić ostrość na powierzchni slajdu, rozpoznawalnej jako płaszczyzna ogniskowa o najjaśniejszym sygnale. Drobne defekty w powłoce będą widoczne, aby pomóc w ustawieniu ostrości. Przesuń slajd do obszaru o jednolitej fluorescencji w poprzek płaszczyzny obrazowania.
Kliknij Utwórz ustawienie dla pierwszej kalibracji lub Aktualizuj ustawienie dla kolejnych kalibracji. Oprogramowanie zainicjuje proces kalibracji, automatycznie wybielając i wykrywając położenie bielonego punktu. Upewnij się, że kalibracja przebiega pomyślnie, oceniając ostateczny obraz, który będzie siatką trzy na trzy wybielonych punktów, które powinny być równomiernie rozłożone i ostre.
Zapisz obraz kalibracyjny do wykorzystania w przyszłości. Wyjmij szkiełko kalibracyjne i bezpiecznie przechowuj. Kalibrację należy przeprowadzić przed rozpoczęciem każdego eksperymentu, ale nie trzeba jej wykonywać między próbkami.
Przygotuj zestaw mikroskopowy do obrazowania żywych komórek, najlepiej z podgrzewanym stolikiem i obiektywem, a także kontrolą dwutlenku węgla. Pozostawić do zrównoważenia przez 20 minut. Teraz umieść jedną z wygenerowanych próbek komórek wyrażających czujnik napięcia w uchwycie mikroskopu w celu obrazowania.
Pozwól komórkom zrównoważyć się przez 10 minut. Aby zapewnić zdrowie obrazowanych komórek, należy utrzymywać temperaturę 37 stopni Celsjusza w komorze obrazowania. Użyj pompy perystaltycznej, aby przepuścić nawilżony 5% dwutlenek węgla przez próbki z prędkością 15 mililitrów na minutę, aby utrzymać pH.
Otwórz narzędzie Multi-Dimensional Acquisition (MDA) i skonfiguruj je z parametrami obrazowania FRET, w tym różnymi zestawami filtrów. Zapisz ten MDA w folderze eksperymentalnym o nazwie MDA_FRET_date. Skonfiguruj kolejny MDA z parametrami obrazowania FRAP, w tym różnymi zestawami filtrów, ustawieniami Timelapse i Journalem, aby impulsować laser po akwizycji przed wybielaczem.
Zapisz ten MDA w folderze eksperymentalnym o nazwie MDA_FRAP_date. Na pasku narzędzi u góry ekranu wybierz pozycję Dziennik, Rozpocznij nagrywanie. Otwórz okno MDA, załaduj stan MDA_FRET_date i naciśnij Pobierz.
Następnie załaduj stan MDA_FRAP_date i naciśnij Pobierz. Po zakończeniu pozyskiwania na pasku narzędzi u góry ekranu wybierz pozycję Dziennik, Zatrzymaj nagrywanie. Zapisz ten dziennik w folderze eksperymentalnym o nazwie FRETFRAP_date i dodaj go do paska narzędzi, aby mieć do niego łatwy dostęp.
Zamknij okno MDA. Poruszaj się po próbce, korzystając z akwizycji obrazu w obszarze Pozyskiwanie, Pozyskiwanie z minimalnym czasem ekspozycji i filtrem o neutralnej gęstości, aby zidentyfikować interesujące Cię komórki. Ustaw ciągły autofokus, przechodząc do Urządzenia, Ostrość.
Ręcznie ustaw ostrość na próbce, aż osiągniesz właściwą płaszczyznę obrazowania. Kliknij Ustaw ciągłe ustawianie ostrości i poczekaj, aż system się dostosuje. Gdy system się dostosuje, kliknij przycisk Start Continuous Focus (Rozpocznij ciągłe ustawianie ostrości).
Następnie znajdź komórkę wyrażającą czujnik napięcia z wyraźną lokalizacją w interesującej Cię strukturze i zrób zdjęcie. Narysuj prostokątny obszar zainteresowania (ROI), aby podkreślić miejsce, w którym chcesz wybielić. Zapisz tę lokalizację zwrotu z inwestycji.
Teraz zainicjuj dziennik FRETFRAP_date, który rozpocznie pobieranie obrazów FRET, a następnie inicjalizację timelapse FRAP. Powtarzaj te kroki, aż uzyskasz od 10 do 15 zestawów obrazów. Następnie przeanalizuj dane FRET-FRAP zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki obrazowania FRET czujnika napięcia winkuliny, po segmentacji i maskowaniu w celu wyizolowania zrostów ogniskowych. Przestrzenna zmienność obciążenia winkuliną jest widoczna w całej komórce. Na obrazowanie i analizę FRAP może mieć wpływ stabilność adhezji ogniskowej.
Zrost ogniskowy, który ulega szybkiemu przemieszczeniu w okresie obrazowania, może być trudny do dokładnego śledzenia. Często jest to wskazywane przez krzywą FRAP, która zawiera nieciągłości i jest niemożliwa do zinterpretowania. W przypadku winkuliny typu dzikiego istnieje odwrotna korelacja między obciążeniem białkiem a szybkością obrotu, co wskazuje, że winkulina jest stabilizowana siłą.
Wprowadzenie mutacji w winkulinie w celu spowodowania jej wiązania z taliną powoduje odwrócenie korelacji, co wskazuje, że winkulina, która nie jest w stanie związać taliny, jest destabilizowana siłą. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o prawidłowym przygotowaniu próbek, upewnieniu się, że komórki wyrażają czujnik na poziomie endogennym i starannym doborze parametrów obrazowania. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunofluorescencja, pomiar dynamiki skali komórkowej lub wyzwanie dla komórek za pomocą różnych inhibitorów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób białko będące przedmiotem zainteresowania oddziałuje z innymi składnikami subkomórkowymi w celu koordynowania odpowiedzi na siłę.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje jednoczesne wykorzystanie czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansowej Fёрstera oraz metody fluorescencyjnego powrotu po fotobleachingu w celu badania dynamiki i obciążenia białek w żywych komórkach. Metoda ta dostarcza wiedzy na temat mechanobiologii, w szczególności w zakresie reakcji białek na siły mechaniczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mechanobiologia
- Biologia komórki
- Dynamika białek
Wstęp
- Technika ta pozwala na pomiar dynamiki białek wrażliwych na siły wewnątrz żywych komórek.
- Została ona zastosowana konkretnie w przypadku białka adhezji ogniskowej – winkuliny.
- Za pomocą tej metody można badać również inne białka wrażliwe mechanicznie, takie jak talina, kadheryny i nespryna.
- Prawidłowa konfiguracja obrazowania jest kluczowa dla sukcesu analizy.
Cel badania
- Zrozumienie sposobu, w jaki siły są przenoszone i wykrywane wewnątrz komórek oraz pomiędzy nimi.
- Pozyskanie informacji w skali molekularnej na temat odpowiedzi białek na siły mechaniczne.
- Przedstawienie wizualnej demonstracji metody w celu lepszego zrozumienia.
Zastosowane metody
- Stabilna ekspresja konstruktów sensora napięcia w wybranych typach komórek.
- Przygotowanie podłoży do wysiewu komórek z wykorzystaniem naczyń z szklanym dnem.
- Jednoczesny pomiar obciążenia i dynamiki białek.
- Konfiguracja obrazowania dla właściwej analizy.
Główne wyniki
- Dostęp do informacji w skali molekularnej dotyczących dynamiki białek.
- Wgląd w zachowanie białek wrażliwych na bodźce mechaniczne.
- Wykazanie możliwości zastosowania tej metody w odniesieniu do różnych białek.
- Opracowanie niezawodnego protokołu obrazowania do analizy.
Wnioski
- Ta metoda jest cennym narzędziem w badaniach nad mechanobiologią.
- Umożliwia ona lepsze zrozumienie dynamiki białek w żywych komórkach.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć różne białka wrażliwe na bodźce mechaniczne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach umożliwia mechanistyczną ocenę ryzyka w odniesieniu do celów zaangażowanych w szlaki mechanotransdukcji. Podejście to zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez powiązanie odpowiedzi mechanicznych w skali molekularnej z fenotypami komórkowymi. Wspiera ono wczesne decyzje w procesie odkrywania białek, w których modulacja siły wpływa na wyniki sygnalizacji istotne dla włóknienia, przerzutów nowotworowych oraz chorób układu sercowo-naczyniowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Badanie wpływu obciążeń mechanicznych na stabilność oddziaływań białko-białko w celu wyjaśnienia mechanizmu działania celu w natywnym kontekście komórkowym.
- Wartość operacyjna: Umożliwienie bezpośredniego pomiaru zależnego od siły obrotu białek bez konieczności ekstrahowania ich z rodzimego mikrośrodowiska.
- Wartość prognostyczna: Ustalenie korelacji między siłą a odpowiedzią, co pozwala określić, czy cel jest stabilizowany czy destabilizowany przez stres mechaniczny, wskazując odpowiednie strategie modulacji.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych komórek wykazujących ekspresję sensorów napięcia do ilościowej oceny wpływu związków na sygnalizację sił w żywych komórkach.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja odczytów FRET-FRAP w różnych warunkach w celu umożliwienia powtarzalnego porównania dynamiki białek.
- Skalowalność: Zastosowanie metody do różnych struktur wewnątrzkomórkowych (adherezje ogniskowe, połączenia międzykomórkowe) oraz typów komórek w celu wsparcia przesiewania panelowego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ocena wpływu środowisk mechanicznych istotnych dla danej choroby (np. sztywności włóknistej) na dynamikę docelowych białek w celu dostosowania do warunków patofizjologicznych.
- Wartość operacyjna: Zachowanie ciągłości od odkrycia mechanizmów molekularnych po walidację przedkliniczną z wykorzystaniem spójnych odczytów czułości na siłę.
- Łagodzenie ryzyka: Identyfikacja celów, których funkcja jest upośledzona pod wpływem obciążenia mechanicznego, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach z powodu nieprzewidzianego kontekstu mechanobiologicznego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od testowania hipotez dotyczących celu molekularnego po identyfikację związku wiodącego – dostarczając wglądu w mechanizmy, które stanowią podstawę do przesiewania i optymalizacji związków.
- Biologia odkrywcza: Badanie wpływu siły na angażowanie celu i aktywność szlaków w żywych komórkach, co pozwala na zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej.
- Przesiewanie: Generowanie ilościowych wskaźników FRET i powrotu (recovery) w celu porównania wpływu związków na dynamikę białek wrażliwych na siłę.
- Analityka: Wyodrębnianie korelacji między obciążeniem siłą a szybkością wymiany (turnover rate) w celu stratyfikacji związków pod kątem wpływu mechanistycznego na cele mechanowrażliwe.
- Badania translacyjne: Powiązanie odpowiedzi na siłę in vitro z mechanicznymi właściwościami tkanek w celu zwiększenia relewantności modeli przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Wdrożenie przepływu pracy FRET-FRAP jako platformy wielokrotnego użytku dla wielu celów mechanowrażliwych (winkulina, talina, kadheryny, nespryna).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Pewność predykcyjna w walidacji celu dzięki bezpośredniej obserwacji zachowania białek zależnego od siły w żywych systemach.
- Wartość operacyjna: Standaryzowane, powtarzalne pomiary dynamiki białek, które zmniejszają zmienność w ocenie celu.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji typu go/no-go poprzez identyfikację celów, których funkcja jest mechanistycznie upośledzona pod wpływem siły fizjologicznej.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie profili odpowiedzi na siłę, co zmniejsza inwestycje w cele mechanistycznie niestabilne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Doświadczenie w klonowaniu molekularnym w celu ekspresji konstruktów czujników napięcia na poziomach endogennych.
- Dostęp do mikroskopii konfokalnej z kalibracją lasera FRAP i kontrolą środowiskową (37°C, 5% CO2).
- Standaryzacja parametrów obrazowania i wyboru ROI dla różnych użytkowników i linii komórkowych.
- Kwestie adaptacyjne dla różnych projektów czujników napięcia i wzorców lokalizacji subkomórkowej.
- Ograniczenie praktyczne: dokładność FRAP zależy od stabilnych struktur subkomórkowych; szybko przemieszczające się ogniska mogą prowadzić do nieinterpretowalnych krzywych regeneracji.
