Name: Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Poznaj metodę pomiaru dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu czujników naprężeń FRET i FRAP. Technika ta dostarcza informacji na poziomie molekularnym o odpowiedzi białek na siły mechaniczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez National Science Foundation CAREER Award (NSF-CMMI-14-54257), a także granty od American Heart Association (16GRNT30930019) i National Institutes of Health (R01GM121739-01) przyznane dr Brentonowi Hoffmanowi oraz stypendium National Science Foundation Graduate Research Fellowship przyznane Katheryn Rothenberg. Za treść odpowiedzialni są wyłącznie autorzy i niekoniecznie reprezentują oficjalne poglądy NSF lub NIH.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda FRET-FRAP pozwala na bezpośredni pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę, właściwości, która była trudna do bezpośredniego zbadania w żywych komórkach. Wrażliwość dynamiki białka na obciążenie molekularne ma kluczowe znaczenie dla funkcji białka jako przekaźnika lub przetwornika siły. Obciążenie jest wymagane do przenoszenia zarówno sił generowanych wewnętrznie, jak i zewnętrznie, zwanych mechanotranskałgencją, oraz do przekształcania tych sił w sygnały wykrywalne biochemicznie, co nazywa się mechanotransdukcją....

Środowisko zewnątrzkomórkowe jest bogatym źródłem zarówno biochemicznych, jak i fizycznych wskazówek, które dyktują zachowanie komórki. W szczególności fizyczna natura mikrośrodowiska może pośredniczyć w kluczowych funkcjach komórkowych, w tym we wzroście, migracji i różnicowaniu komórek1,2,3,4. Rozregulowanie mechaniki mikrośrodowiska jest krytycznym elementem wielu chorób, które nie mają jeszcze odpowiedniego leczenia, takich jak cancer5, atherosclerosis6 i fibrosis7. Pełne zrozumienie, w jaki sposób komórki przekształcają bodźce fizyczne w biochemicznie wykrywalne sygnały, proces określany jako mechanotransdukcja, wymaga wyjaśnienia mechanizmów molekularnych pośredniczących w przenoszeniu siły, zarówno do komórek, jak i z nich oraz w obrębie wielu struktur subkomórkowych.
Wewnątrz struktur subkomórkowych białka nieustannie się przewracają; wiążą się i rozwiązują w zależności od siły ich interakcji z partnerami wiążącymi8. Aby siły mogły być skutecznie przenoszone na odległość fizyczną, musi istnieć nieprzerwany łańcuch interakcji białko-białko, co oznacza, że obrót białka musi być wystarczająco wolny, aby utrzymać i przekazać siłę swojemu partnerowi wiążącemu9. Podczas gdy interakcje białko-białko na ogół składają się z kilku niekowalencyjnych wiązań między domenami białkowymi, interakcja jest często konceptualizowana jako stan związany, który może przejść do stanu niezwiązanego w różnych warunkach10,11. Dla danej interakcji białko-białko możliwe jest, że siła może nie mieć wpływu na czas życia interakcji, znany jako "wiązanie idealne", skracający czas trwania interakcji, znany jako "wiązanie poślizgowe", lub zwiększający czas życia interakcji, znany jako "wiązanie chwytliwe"<klasa sup = "xref">10. Tak więc istnieje skomplikowany związek między obciążeniem białkami a dynamiką białka, który nazywamy dynamiką wrażliwą na siłę.
Aby zrozumieć wpływ obciążenia na dynamikę wiązań, przeprowadzono szereg bardzo pouczających eksperymentów na poziomie pojedynczej cząsteczki. Wykorzystując izolowane białka lub fragmenty białek i techniki manipulacji, takie jak pęseta magnetyczna, pęseta optyczna i mikroskopia sił atomowych, badania te wykazały wrażliwe na siłę interakcje białko-białko dla kilku istotnych białek11,12. Zarówno integryny13, jak i cadherins14, które są białkami transbłonowymi ważnymi dla tworzenia odpowiednio interakcji komórka-macierz i komórka-komórka, wykazały zmiany w dynamice spowodowane obciążeniem. W komórce winkulina jest rekrutowana zarówno do talin15, jak i α-catenina16 w sposób zależny od siły i może tworzyć wiązanie chwytliwe z actin17, co wskazuje na kluczową rolę winkuliny zarówno w zrostach ogniskowych (FA), jak i połączeniach adherens (AJ) pod obciążeniem. Badania pojedynczych cząsteczek pozwalają na wyizolowanie określonych oddziaływań białko-białko i dają jednoznaczne wyniki, ale nie uwzględniają złożoności środowiska komórkowego.
Przełomowe eksperymenty wykazały, że kilka struktur subkomórkowych, w tym FA i AJ, są mechanowrażliwe i wykazują zwiększoną składanie w odpowiedzi na obciążenia generowane wewnętrznie lub zewnętrznie18,19,20,21,22. Ponadto kilka modeli teoretycznych sugeruje, że mechanoczuły montaż może być napędzany przez dynamikę białek wrażliwych na siłę23,24,25. Aby zbadać tę wrażliwą na siłę dynamikę w żywych komórkach, podjęto kilka pośrednich podejść. FRAP i pokrewne techniki zapewniają stosunkowo prostą metodologię pomiaru dynamiki białek w komórkach26,27,28,29. Jednak pomiar obciążenia białkami był bardziej ograniczony. Typowym podejściem jest porównanie dynamiki białek w komórkach z ekspozycją na inhibitor cytoszkieletu stosowany w celu zmniejszenia ogólnej kurczliwości komórek i bez niego8,30,31. Koncepcyjnie jest to porównanie stanu wysokiego i niskiego obciążenia. Jednak nie ma kwantyfikacji obciążenia białka w żadnym z tych stanów i mogą wystąpić niezamierzone efekty biochemiczne inhibitora, takie jak utrata kluczowych miejsc wiązania wzdłuż filamentu F-aktyny. Inne podejście, specyficzne dla FA, polegało na zmierzeniu całkowitej siły wywieranej na podłoże przez FA za pomocą mikroskopii sił trakcyjnych w celu przybliżenia obciążenia molekularnego i zbadania związku z dynamiką pojedynczego białka w klasie FA<sup="xref">32. Chociaż podejście to pozwala na ilościowe określenie całkowitej siły, nie dostarcza informacji specyficznych molekularnie. FA składają się z ponad 200 różnych białek, z których wiele może wytrzymać load33. W związku z tym pomiar całkowitej siły wyjściowej FA potencjalnie zaciemnia możliwość wielu ścieżek przenoszenia siły i nie zapewnia wiarygodnego pomiaru obciążenia określonego białka.
W przeciwieństwie do poprzednich podejść w mechanobiologii, pojawienie się czujników napięcia opartych na FRET umożliwia bezpośredni pomiar obciążeń doświadczanych przez określone białka wewnątrz żywych komórek34,35,36. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który łączy czujniki napięcia oparte na FRET z pomiarem dynamiki białek opartym na FRAP. Technikę tę nazywamy FRET-FRAP. Takie podejście umożliwia jednoczesny pomiar obciążenia białkami i dynamiki białek, umożliwiając w ten sposób ocenę wrażliwej na siłę dynamiki białek w żywych komórkach (ryc. 1). Technika FRET-FRAP została już zastosowana do badania wrażliwej na siłę dynamiki mechanicznego białka łącznikowego vinculin37. Czujniki napięcia zostały opracowane dla wielu białek, które są istotne w różnych strukturach subkomórkowych. Na przykład czujniki zostały opracowane dla vinculin34 i talin38,39 w FA, kadherynach i kateninach w AJs40,41,42, nesprin w jądrowym kompleksie LINC43, α-aktynina44 i filamin36 w cytoszkielecie, oraz MUC-1 w Glycocalyx45, między innymi46. Podobnie, FRAP jest powszechnie stosowaną techniką stosowaną na białkach wrażliwych mechanicznie w obrębie zrostów ogniskowych8,31, adherens junctions47, actin cortex26, and nucleus48. Idąc dalej, technika FRET-FRAP powinna mieć szerokie zastosowanie do każdego z tych istniejących czujników lub nowo opracowanych czujników, umożliwiając pomiary dynamiki wrażliwej na siłę w wielu różnych strukturach i kontekstach subkomórkowych. W tym celu udostępniamy szczegółowy, uogólniony protokół implementacji techniki FRET-FRAP mającej zastosowanie w tych różnych systemach. Miejmy nadzieję, że umożliwi to przeprowadzenie szerokiej gamy eksperymentów wyjaśniających rolę różnych białek wrażliwych na mechanoterapię w regulacji przenoszenia siły i pośredniczeniu w zachowaniu komórek.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehydowa</td><td>mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>60x Obiektyw NA1.35</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 60XO</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Etap zautomatyzowany</td><td>Wcześniejszy</td><td>H117EIX3</td><td></td> naukowy</tr><tr><td>Niestandardowe lustro dichroiczne</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>T450 / 514rpc</td></tr><tr><td>Niestandardowy filtr emisji mTFP1</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>ET485 / 20m</td></tr><tr><td>Niestandardowy filtr wzbudzenia mTFP1</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>ET450/30x</td></tr><tr><td>Niestandardowy filtr wzbudzenia Venus</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>ET514/10x</td></tr><tr><td>DMEM-gfp Medium do wizualizacji komórek na żywo</td><td>Sapphire</td><td>MC102</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Środek Orła firmy Dulbecco&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796</td><td>z L-glutaminą i wodorowęglanem sodu</td></tr><tr><td>Hyklon płodowej surowicy bydlęcej</td><td></td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna, Human</td><td>Corning</td><td>47743-654</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko kalibracyjne FRAPPA</td><td>Andor</td><td></td><td>dostarczany wraz z jednostką FRAPPA</td></tr><tr><td>System FRAPPA z laserem 515 nm</td><td>ior</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naczynia fluorowe ze szklanym dnem</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35</td><td></td></tr><tr><td>HEK293-T Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Bromek heksadimetryny, Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Wysoki poziom glukozy Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle's Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>JMP Pro Oprogramowanie</td><td>SAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lambda 10-3 Zmotoryzowane koła filtracyjne</td><td>Sutter Instruments</td><td>LB10-NW</td><td></td></tr><tr><td>Lampa łukowa LambdaLS z bezozonową żarówką ksenonową 300 W</td><td>Sutter Instruments</td><td>LS/OF30</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph dla Olympus</td><td>System</td> mikronawilżania Olympus <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bioptechs</td><td>130708</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ Sorter komórek</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz obiektywu Medium</td><td>Bioptechs</td><td>150819-13</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G Plazmid kopertowy</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>pRRL Wektor</td><td></td><td></td><td>prezent od dr Kam Leonga (Columbia University)</td></tr><tr><td>psPax2 Opakowanie Plazmid</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Kamera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall Legend XT/XF</td><td>Thermo Fisher 75004505</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stajnia Z Stage Warmer</td><td>Bioptechs</td><td>403-1926</td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisyjny Venus</td><td>Semrock</td><td>FF01-571/72</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Komórki wyczuwają i reagują na fizyczne sygnały w swoim otoczeniu, przekształcając bodźce mechaniczne w biochemicznie wykrywalne sygnały w procesie zwanym mechanotransdukcją. Kluczowym krokiem w mechanotransdukcji jest przenoszenie sił między środowiskiem zewnętrznym i wewnętrznym. Aby przenosić siły, musi istnieć trwałe, nieprzerwane połączenie fizyczne utworzone przez szereg oddziaływań białko-białko. Dla danej interakcji białko-białko obciążenie mechaniczne może albo nie mieć wpływu na oddziaływanie, albo prowadzić do szybszej dysocjacji oddziaływania, albo nawet stabilizować oddziaływanie. Zrozumienie, w jaki sposób obciążenie molekularne wpływa na obrót białek w żywych komórkach, może dostarczyć cennych informacji na temat stanu mechanicznego białka, co z kolei wyjaśni jego rolę w mechanotransdukcji. Istniejące techniki pomiaru dynamiki białek wrażliwych na siłę albo nie mają bezpośrednich pomiarów obciążenia białkami, albo opierają się na pomiarach wykonanych poza kontekstem komórkowym. W tym miejscu opisujemy protokół techniki rezonansowego transferu energii i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (FRET-FRAP), który umożliwia pomiar wrażliwej na siłę dynamiki białek w żywych komórkach. Technika ta jest potencjalnie możliwa do zastosowania w każdym czujniku napięcia opartym na FRET, ułatwiając badanie dynamiki białek wrażliwych na siłę w różnych strukturach subkomórkowych i w różnych typach komórek.

FRET-FRAP stanowi połączenie dwóch technik fluorescencyjnych: FRET i FRAP. Ponieważ skupiliśmy się na efektach obciążenia białka, zastosowaliśmy sensory napięcia oparte na FRET34,46. Sensory te opierają się często na module wykrywającym napięcie, który składa się z dwóch białek fluorescencyjnych, takich jak mTFP1 i VenusA206K, połączonych linkerem flagelliform (Rycina 1A). Gdy moduł ten zostanie umies...

Tutaj prezentujemy protokół jednoczesnego użycia czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru obciążenia białkami i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu w celu pomiaru dynamiki białek, umożliwiając pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach.

Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu mechanobiologii, takie jak to, w jaki sposób siły są przenoszone i wyczuwane w komórkach, a także między komórkami a ich środowiskiem. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona dostęp do informacji w skali molekularnej na temat tego, jak białka reagują na siły mechaniczne w natywnym kontekście żywej komórki. Chociaż metoda ta została zastosowana specjalnie do badania ogniskowego białka adhezji winkuliny, można ją również zastosować do innych białek wrażliwych mechanicznie, takich jak talin, kadheryny lub nesprin.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ prawidłowa konfiguracja obrazowania jest trudna, ale niezbędna dla powodzenia analizy. Rozpocznij tę procedurę od stabilnego wyrażenia konstrukcji czujnika napięcia w żądanym typie komórki, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować podłoża do wysiewu komórek, zaopatrz się w cztery naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 milimetrów.Pracując w kapturze do hodowli komórkowych, w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów, przygotuj cztery mililitry 10 mikrogramów fibronektyny na mililitr w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem lub PBS. Delikatnie odwróć probówkę raz, aby wymieszać i pozostaw roztwór na pięć minut w kapturze do hodowli komórkowych. Następnie naniec pipetą jeden mililitr roztworu fibronektyny na każde naczynie ze szklanym dnem.Pozostaw roztwór fibronektyny na naczyniach na godzinę w temperaturze pokojowej lub na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odessać roztwór fibronektyny i spłukać raz PBS. Pozostaw jeden mililitr PBS na naczyniach, aż komórki będą gotowe do wysiewu.Po zliczeniu komórek wysiewaj 30 000 komórek na każdym szklanym naczyniu pokrytym fibronektyną z odpowiednią kompletną pożywką, aby uzyskać końcową objętość 1,5 mililitra. Pozwól komórkom rozprzestrzenić się przez cztery godziny po wysianiu. Po dwóch godzinach rozprowadzania odessać pożywkę wzrostową i raz spłukać pożywką do obrazowania.Pozostaw 1,5 mililitra nośnika do obrazowania. Przed rozpoczęciem kalibracji rozgrzej mikroskop zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby skalibrować laser FRAP, najpierw otwórz okno konfiguracji lasera.Ustaw oświetlenie na odpowiednie ustawienia oświetlenia FRAP dla ekspozycji lasera na próbkę. Następnie ustaw ustawienie Iluminacja na ustawienia oświetlenia odpowiednie dla obrazowania tylko fluoroforu akceptora. Wybierz cel do kalibracji w obszarze Ustawienia układu współrzędnych.Usuń zaznaczenie opcji Ręcznie kliknij punkty kalibracji i zaznacz opcję Wyświetlaj obrazy podczas kalibracji. Ustaw czas przebywania na 10 000 mikrosekund, a liczbę impulsów na 100. Teraz umieść szkiełko kalibracyjne, wykonane z bromku etydyny uszczelnione między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym, w stage adapter stroną z szkiełkiem nakrywkowym do dołu.Użyj ustawień oświetlenia akceptora, aby ustawić ostrość na powierzchni slajdu, rozpoznawalnej jako płaszczyzna ogniskowa o najjaśniejszym sygnale. Drobne defekty w powłoce będą widoczne, aby pomóc w ustawieniu ostrości. Przesuń slajd do obszaru o jednolitej fluorescencji w poprzek płaszczyzny obrazowania.Kliknij Utwórz ustawienie dla pierwszej kalibracji lub Aktualizuj ustawienie dla kolejnych kalibracji. Oprogramowanie zainicjuje proces kalibracji, automatycznie wybielając i wykrywając położenie bielonego punktu. Upewnij się, że kalibracja przebiega pomyślnie, oceniając ostateczny obraz, który będzie siatką trzy na trzy wybielonych punktów, które powinny być równomiernie rozłożone i ostre.Zapisz obraz kalibracyjny do wykorzystania w przyszłości. Wyjmij szkiełko kalibracyjne i bezpiecznie przechowuj. Kalibrację należy przeprowadzić przed rozpoczęciem każdego eksperymentu, ale nie trzeba jej wykonywać między próbkami.Przygotuj zestaw mikroskopowy do obrazowania żywych komórek, najlepiej z podgrzewanym stolikiem i obiektywem, a także kontrolą dwutlenku węgla. Pozostawić do zrównoważenia przez 20 minut. Teraz umieść jedną z wygenerowanych próbek komórek wyrażających czujnik napięcia w uchwycie mikroskopu w celu obrazowania.Pozwól komórkom zrównoważyć się przez 10 minut. Aby zapewnić zdrowie obrazowanych komórek, należy utrzymywać temperaturę 37 stopni Celsjusza w komorze obrazowania. Użyj pompy perystaltycznej, aby przepuścić nawilżony 5% dwutlenek węgla przez próbki z prędkością 15 mililitrów na minutę, aby utrzymać pH.Otwórz narzędzie Multi-Dimensional Acquisition (MDA) i skonfiguruj je z parametrami obrazowania FRET, w tym różnymi zestawami filtrów. Zapisz ten MDA w folderze eksperymentalnym o nazwie MDA_FRET_date. Skonfiguruj kolejny MDA z parametrami obrazowania FRAP, w tym różnymi zestawami filtrów, ustawieniami Timelapse i Journalem, aby impulsować laser po akwizycji przed wybielaczem.Zapisz ten MDA w folderze eksperymentalnym o nazwie MDA_FRAP_date. Na pasku narzędzi u góry ekranu wybierz pozycję Dziennik, Rozpocznij nagrywanie. Otwórz okno MDA, załaduj stan MDA_FRET_date i naciśnij Pobierz.Następnie załaduj stan MDA_FRAP_date i naciśnij Pobierz. Po zakończeniu pozyskiwania na pasku narzędzi u góry ekranu wybierz pozycję Dziennik, Zatrzymaj nagrywanie. Zapisz ten dziennik w folderze eksperymentalnym o nazwie FRETFRAP_date i dodaj go do paska narzędzi, aby mieć do niego łatwy dostęp.Zamknij okno MDA. Poruszaj się po próbce, korzystając z akwizycji obrazu w obszarze Pozyskiwanie, Pozyskiwanie z minimalnym czasem ekspozycji i filtrem o neutralnej gęstości, aby zidentyfikować interesujące Cię komórki. Ustaw ciągły autofokus, przechodząc do Urządzenia, Ostrość.Ręcznie ustaw ostrość na próbce, aż osiągniesz właściwą płaszczyznę obrazowania. Kliknij Ustaw ciągłe ustawianie ostrości i poczekaj, aż system się dostosuje. Gdy system się dostosuje, kliknij przycisk Start Continuous Focus (Rozpocznij ciągłe ustawianie ostrości).Następnie znajdź komórkę wyrażającą czujnik napięcia z wyraźną lokalizacją w interesującej Cię strukturze i zrób zdjęcie. Narysuj prostokątny obszar zainteresowania (ROI), aby podkreślić miejsce, w którym chcesz wybielić. Zapisz tę lokalizację zwrotu z inwestycji.Teraz zainicjuj dziennik FRETFRAP_date, który rozpocznie pobieranie obrazów FRET, a następnie inicjalizację timelapse FRAP. Powtarzaj te kroki, aż uzyskasz od 10 do 15 zestawów obrazów. Następnie przeanalizuj dane FRET-FRAP zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki obrazowania FRET czujnika napięcia winkuliny, po segmentacji i maskowaniu w celu wyizolowania zrostów ogniskowych. Przestrzenna zmienność obciążenia winkuliną jest widoczna w całej komórce. Na obrazowanie i analizę FRAP może mieć wpływ stabilność adhezji ogniskowej.Zrost ogniskowy, który ulega szybkiemu przemieszczeniu w okresie obrazowania, może być trudny do dokładnego śledzenia. Często jest to wskazywane przez krzywą FRAP, która zawiera nieciągłości i jest niemożliwa do zinterpretowania. W przypadku winkuliny typu dzikiego istnieje odwrotna korelacja między obciążeniem białkiem a szybkością obrotu, co wskazuje, że winkulina jest stabilizowana siłą.Wprowadzenie mutacji w winkulinie w celu spowodowania jej wiązania z taliną powoduje odwrócenie korelacji, co wskazuje, że winkulina, która nie jest w stanie związać taliny, jest destabilizowana siłą. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o prawidłowym przygotowaniu próbek, upewnieniu się, że komórki wyrażają czujnik na poziomie endogennym i starannym doborze parametrów obrazowania. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunofluorescencja, pomiar dynamiki skali komórkowej lub wyzwanie dla komórek za pomocą różnych inhibitorów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób białko będące przedmiotem zainteresowania oddziałuje z innymi składnikami subkomórkowymi w celu koordynowania odpowiedzi na siłę.

measurement-force-sensitive-protein-dynamics-living-cells-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film demonstruje użycie spektroskopii fluktuacji fluorescencji do wykrywania interakcji między białkami na powierzchni komórki na styku komórka-komórka. Poprzez ekspresję transbłonowego receptora adhezyjnego będącego przedmiotem zainteresowania znakowanego białkiem fluorescencyjnym i mieszanie dwóch różnych populacji komórek zawierających dwie spektralnie oddzielone znaczniki fluorescencyjne, trans-interakcja między receptorami dwóch sąsiednich komórek o różnej fluorescencji jest oceniana...

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania interakcji białek w kontaktach komórkowych

Film demonstruje metodę oceny sił receptorów wywieranych przez komórki odpornościowe za pomocą nanocząsteczek złota zakotwiczonych w glikolu polietylenowym i sond napinających spinki do włosów DNA. Interakcje limfocytów T CD8-dodatnich powodują rozwijanie sondy, emitując fluorescencję, podczas gdy nici blokujące podtrzymują sygnał do ilościowego określania sił wywieranych przez komórki odpornościowe.

Wykorzystanie sond napięcia opartych na DNA do oceny sił receptorowych wywieranych przez komórki odpornościowe

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

Ostatnio opracowano wiele biosensorów siły opartych na FRET, które umożliwiają specyficzne dla białek rozwiązywanie siły wewnątrzkomórkowej. W tym protokole pokazujemy, w jaki sposób jeden z tych czujników, zaprojektowany dla łącznika białka kompleksu nukleoszkielet-cytoszkielet (LINC) Nesprin-2G, może być wykorzystany do pomiaru sił aktomiozyny w jądrowym kompleksie LINC.

Protokół wykorzystania biosensorów Förster Resonance Energy Transfer (FRET) do pomiaru sił mechanicznych w jądrowym kompleksie LINC

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) pomiędzy dwiema cząsteczkami fluoroforu może być wykorzystany do badania interakcji białek w żywej komórce. W tym miejscu przedstawiono protokół pomiaru FRET w żywych komórkach poprzez wykrywanie uczulonej emisji akceptora i wygaszanie cząsteczki donorowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Ocena interakcji białek w żywych komórkach z emisją uwrażliwioną na FRET

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Ten artykuł przedstawia metodę analizy czasoprzestrzennej mobilnych, jednocząsteczkowych sond opartych na transferze energii rezonansu Förstera (smFRET) przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Nowo opracowany zestaw narzędzi programowych umożliwia wyznaczanie śladów czasowych smFRET poruszających się sond, w tym prawidłowej wydajności FRET i pozycji molekularnych, jako funkcji czasu.

Zautomatyzowana dwuwymiarowa analiza czasoprzestrzenna mobilnych jednocząsteczkowych sond FRET

Poznaj metodę pomiaru dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu czujników naprężeń FRET i FRAP. Technika ta dostarcza informacji na poziomie molekularnym o odpowiedzi białek na siły mechaniczne.

Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Przeglądaj więcej filmów