Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu mechanobiologii, takie jak to, w jaki sposób siły są przenoszone i wyczuwane w komórkach, a także między komórkami a ich środowiskiem. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona dostęp do informacji w skali molekularnej na temat tego, jak białka reagują na siły mechaniczne w natywnym kontekście żywej komórki. Chociaż metoda ta została zastosowana specjalnie do badania ogniskowego białka adhezji winkuliny, można ją również zastosować do innych białek wrażliwych mechanicznie, takich jak talin, kadheryny lub nesprin.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ prawidłowa konfiguracja obrazowania jest trudna, ale niezbędna dla powodzenia analizy. Rozpocznij tę procedurę od stabilnego wyrażenia konstrukcji czujnika napięcia w żądanym typie komórki, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować podłoża do wysiewu komórek, zaopatrz się w cztery naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 milimetrów.

Pracując w kapturze do hodowli komórkowych, w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów, przygotuj cztery mililitry 10 mikrogramów fibronektyny na mililitr w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem lub PBS. Delikatnie odwróć probówkę raz, aby wymieszać i pozostaw roztwór na pięć minut w kapturze do hodowli komórkowych. Następnie naniec pipetą jeden mililitr roztworu fibronektyny na każde naczynie ze szklanym dnem.

Pozostaw roztwór fibronektyny na naczyniach na godzinę w temperaturze pokojowej lub na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odessać roztwór fibronektyny i spłukać raz PBS. Pozostaw jeden mililitr PBS na naczyniach, aż komórki będą gotowe do wysiewu.

Po zliczeniu komórek wysiewaj 30 000 komórek na każdym szklanym naczyniu pokrytym fibronektyną z odpowiednią kompletną pożywką, aby uzyskać końcową objętość 1,5 mililitra. Pozwól komórkom rozprzestrzenić się przez cztery godziny po wysianiu. Po dwóch godzinach rozprowadzania odessać pożywkę wzrostową i raz spłukać pożywką do obrazowania.

Pozostaw 1,5 mililitra nośnika do obrazowania. Przed rozpoczęciem kalibracji rozgrzej mikroskop zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby skalibrować laser FRAP, najpierw otwórz okno konfiguracji lasera.

Ustaw oświetlenie na odpowiednie ustawienia oświetlenia FRAP dla ekspozycji lasera na próbkę. Następnie ustaw ustawienie Iluminacja na ustawienia oświetlenia odpowiednie dla obrazowania tylko fluoroforu akceptora. Wybierz cel do kalibracji w obszarze Ustawienia układu współrzędnych.

Usuń zaznaczenie opcji Ręcznie kliknij punkty kalibracji i zaznacz opcję Wyświetlaj obrazy podczas kalibracji. Ustaw czas przebywania na 10 000 mikrosekund, a liczbę impulsów na 100. Teraz umieść szkiełko kalibracyjne, wykonane z bromku etydyny uszczelnione między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym, w stage adapter stroną z szkiełkiem nakrywkowym do dołu.

Użyj ustawień oświetlenia akceptora, aby ustawić ostrość na powierzchni slajdu, rozpoznawalnej jako płaszczyzna ogniskowa o najjaśniejszym sygnale. Drobne defekty w powłoce będą widoczne, aby pomóc w ustawieniu ostrości. Przesuń slajd do obszaru o jednolitej fluorescencji w poprzek płaszczyzny obrazowania.

Kliknij Utwórz ustawienie dla pierwszej kalibracji lub Aktualizuj ustawienie dla kolejnych kalibracji. Oprogramowanie zainicjuje proces kalibracji, automatycznie wybielając i wykrywając położenie bielonego punktu. Upewnij się, że kalibracja przebiega pomyślnie, oceniając ostateczny obraz, który będzie siatką trzy na trzy wybielonych punktów, które powinny być równomiernie rozłożone i ostre.

Zapisz obraz kalibracyjny do wykorzystania w przyszłości. Wyjmij szkiełko kalibracyjne i bezpiecznie przechowuj. Kalibrację należy przeprowadzić przed rozpoczęciem każdego eksperymentu, ale nie trzeba jej wykonywać między próbkami.

Przygotuj zestaw mikroskopowy do obrazowania żywych komórek, najlepiej z podgrzewanym stolikiem i obiektywem, a także kontrolą dwutlenku węgla. Pozostawić do zrównoważenia przez 20 minut. Teraz umieść jedną z wygenerowanych próbek komórek wyrażających czujnik napięcia w uchwycie mikroskopu w celu obrazowania.

Pozwól komórkom zrównoważyć się przez 10 minut. Aby zapewnić zdrowie obrazowanych komórek, należy utrzymywać temperaturę 37 stopni Celsjusza w komorze obrazowania. Użyj pompy perystaltycznej, aby przepuścić nawilżony 5% dwutlenek węgla przez próbki z prędkością 15 mililitrów na minutę, aby utrzymać pH.

Otwórz narzędzie Multi-Dimensional Acquisition (MDA) i skonfiguruj je z parametrami obrazowania FRET, w tym różnymi zestawami filtrów. Zapisz ten MDA w folderze eksperymentalnym o nazwie MDA_FRET_date. Skonfiguruj kolejny MDA z parametrami obrazowania FRAP, w tym różnymi zestawami filtrów, ustawieniami Timelapse i Journalem, aby impulsować laser po akwizycji przed wybielaczem.

Zapisz ten MDA w folderze eksperymentalnym o nazwie MDA_FRAP_date. Na pasku narzędzi u góry ekranu wybierz pozycję Dziennik, Rozpocznij nagrywanie. Otwórz okno MDA, załaduj stan MDA_FRET_date i naciśnij Pobierz.

Następnie załaduj stan MDA_FRAP_date i naciśnij Pobierz. Po zakończeniu pozyskiwania na pasku narzędzi u góry ekranu wybierz pozycję Dziennik, Zatrzymaj nagrywanie. Zapisz ten dziennik w folderze eksperymentalnym o nazwie FRETFRAP_date i dodaj go do paska narzędzi, aby mieć do niego łatwy dostęp.

Zamknij okno MDA. Poruszaj się po próbce, korzystając z akwizycji obrazu w obszarze Pozyskiwanie, Pozyskiwanie z minimalnym czasem ekspozycji i filtrem o neutralnej gęstości, aby zidentyfikować interesujące Cię komórki. Ustaw ciągły autofokus, przechodząc do Urządzenia, Ostrość.

Ręcznie ustaw ostrość na próbce, aż osiągniesz właściwą płaszczyznę obrazowania. Kliknij Ustaw ciągłe ustawianie ostrości i poczekaj, aż system się dostosuje. Gdy system się dostosuje, kliknij przycisk Start Continuous Focus (Rozpocznij ciągłe ustawianie ostrości).

Następnie znajdź komórkę wyrażającą czujnik napięcia z wyraźną lokalizacją w interesującej Cię strukturze i zrób zdjęcie. Narysuj prostokątny obszar zainteresowania (ROI), aby podkreślić miejsce, w którym chcesz wybielić. Zapisz tę lokalizację zwrotu z inwestycji.

Teraz zainicjuj dziennik FRETFRAP_date, który rozpocznie pobieranie obrazów FRET, a następnie inicjalizację timelapse FRAP. Powtarzaj te kroki, aż uzyskasz od 10 do 15 zestawów obrazów. Następnie przeanalizuj dane FRET-FRAP zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki obrazowania FRET czujnika napięcia winkuliny, po segmentacji i maskowaniu w celu wyizolowania zrostów ogniskowych. Przestrzenna zmienność obciążenia winkuliną jest widoczna w całej komórce. Na obrazowanie i analizę FRAP może mieć wpływ stabilność adhezji ogniskowej.

Zrost ogniskowy, który ulega szybkiemu przemieszczeniu w okresie obrazowania, może być trudny do dokładnego śledzenia. Często jest to wskazywane przez krzywą FRAP, która zawiera nieciągłości i jest niemożliwa do zinterpretowania. W przypadku winkuliny typu dzikiego istnieje odwrotna korelacja między obciążeniem białkiem a szybkością obrotu, co wskazuje, że winkulina jest stabilizowana siłą.

Wprowadzenie mutacji w winkulinie w celu spowodowania jej wiązania z taliną powoduje odwrócenie korelacji, co wskazuje, że winkulina, która nie jest w stanie związać taliny, jest destabilizowana siłą. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o prawidłowym przygotowaniu próbek, upewnieniu się, że komórki wyrażają czujnik na poziomie endogennym i starannym doborze parametrów obrazowania. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunofluorescencja, pomiar dynamiki skali komórkowej lub wyzwanie dla komórek za pomocą różnych inhibitorów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób białko będące przedmiotem zainteresowania oddziałuje z innymi składnikami subkomórkowymi w celu koordynowania odpowiedzi na siłę.